全鳖护肝胶囊及其配制方法

专利名称：全鳖护肝胶囊及其配制方法
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及的是以全鳖为主药治疗肝脏疾病有特殊疗效的全鳖护肝胶囊及其配制方法。
背景技术：
中华鳖，俗称甲鱼，团鱼，水鱼、王八、神守等，自古以来就是鲜美的佳肴和滋补佳品，除了具有极高的营养价值外，其身体的各个部位甲、骨、肉、血、头、内脏等各有其特殊的医疗功效；利用全鳖与中草药进行配伍，应用先进的加工方法制成具有保肝护肝功能的专用保健食品，是我们多年来的心愿。

发明内容
木发明的目的是提供一种以全鳖为主药能够对治疗肝脏疾病有特殊疗效的全鳖护肝胶囊及其配制方法。
木发明的目的是用以下技术方案实现的一种全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖1.0-5.0份枸杞0.5-3.4份黄 精0.5-2.6份郁金0.5-3.0份百合0.6-3.2份鸡内金0.6-2.8份。
上述全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖2.0-4.0份枸杞0.7-1.4份黄 精0.8-1.6份郁金1.0-2.0份百合1.1-2.2份鸡内金0.9-1.8份。
上述全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖2.2-3.5份枸杞1.0-1.2份黄 精1.0-1.4份郁金1.2-1.8份百合1.1-2.0份鸡内金0.9-1.5份。
一种上述全鳖护肝胶囊的配制方法的加工工艺流程为①首先是鳖加工选出活鳖～暂养净化～流水清洗～真空冷冻干燥～粉碎～低温冷藏～按原料配比称出低温备用；②中药加工选出各原料中药～烘干～破碎～按照各原料重量比称出混舍备用；③再将上述备用的鳖粉与中草药粉混合～低温研磨～细胞级粉碎～紫外灭菌～后添加植物抗氧化剂后高效混合～胶囊罐装～装瓶～封口～贴签～装箱～检验入库全鳖护肝胶囊中各味原料药的性能如下全鳖咸、寒。入肝、脾、肾经。功效养阴退热，软坚散结。
枸杞甘、平。入肝、肾经。功效补肾益精，养肝明目。
黄精甘、平。入脾、肺经。功效补脾益肺。
郁金辛、苦、寒。入心、肺、肝经。功效行气通滞，清心安神，利胆退黄。
百合甘、微寒。入心、肺经。功效润肺止咳，养心安神。
鸡内金甘、平。入开、脾、胃、小肠、膀胱经。功效消食化积，缩尿止溺。
由上述各原料药的性能可看出是无毒的，多是养阴散结、养肝补脾、清心利胆对护肝是绝对有利。
本发明的效果很显著，本发明开题定名为“康立特护肝胶囊”，由于开题慎重，主研究人员都是中医药专家，严格全面按照医药规范进行，效果是肯定的1、该项目首次研究并提出了全鳖与中草药配伍的适宜组方，药食两用中草药的采用使该产品既可以作为肝病的治疗药物，又可以作为保健品；2、该发明。特别是采用了冷冻干燥、细胞级粉碎等先进的加工工艺，既保持了中华鳖及其他中草药的活性成分，又使其药效得到充分释放和吸收，从而提高了疗效或保健效果；3、该研究对实验性免疫性肝损伤小鼠肝组织和血清中的炎症介质和凋亡相关因子的干预，该药可以有效地通过降低血清中IL-18、肝组织中的TNFα、MDA含量和Fas、FasL的表达，增加SOD的含量，减少肝组织中的炎症反应，进而减少肝细胞坏死和凋亡，并表现出疗效的明显随剂量增加而提高；4、本发明对30例乙型病毒性肝炎患者的临床疗效，发现对患者的血清指标、症状体征、影像学指标均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝损伤、防止肝纤维化形成的作用。临床总有效率达84.3％，且未发现各安全指标的异常变化；总之，充分证明了本发明组方科学，工艺合理、先进，效果显著、肯定，服用安全可靠，


下面通过附图对本发明作进一步说明。
图1为本发明生产工艺流程图上述全鳖护肝胶囊实施例例1、一种全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖18g、枸杞5g、黄精6g、郁金8g、百合917g、鸡内金7g。
例2、一种全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖20g、枸杞7g、黄精8g、郁金10g、百合11g、鸡内金9g。
例3、一种全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖2.2g、枸杞1.0g、黄精12g、郁金1.2g、百合12g、鸡内金11g。
具体实施例方式
附图1中的说明原料鳖的选用野生鳖最好区分养殖与野生从形体上看，养殖鳖的裙边、背粗糙，不光滑，裙边较薄，而野生鳖的背甲光洁平滑，裙边厚实；从鳖的爪子上看，养殖鳖爪子不硬不尖，颜色发白，而野生鳖爪子又硬又尖，颜色发黄；从底板的花纹看，养殖鳖的底板发白发红，较嫩，而野生鳖底板发黑，条纹清楚，颜色发暗；从内脏看，野生鳖油脂发黄，而养殖鳖的油脂呈淡白色，油脂比较多；半野生鳖以上达到500克以上可用；选鳖必须无病无伤、反应灵敏、翻盖后能迅速翻身的为佳品。
图1中的暂养净化是指购入的鳖，先放入自来水中暂养3-5天，以吐净使其消化系统的内容物；暂养时，每只容器中只放一只，以避免其互相撕咬受伤，同时，在容器的上口覆盖一层40目的纱网，防止蚊子叮咬导致死亡。
附图1中的低温真空冷冻干燥是指真空技术与冷冻技术相结合的新型干燥脱水技术，冷冻干燥有下列优点低温下(-40℃)进行，对于热敏性的物质特别适用，如蛋白质、微生物之类不会变性或失去生物活力；低温干燥时，挥发性成分损失很小，；冷冻干燥能保持原来的性状；在冻结的状态下进行干燥，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；干燥后的物质疏松多孔，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状；由于干燥在真空下进行，氧气极少，易氧化的物质得到了保护⑦干燥能排除95-99％以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。
图1中采用的细胞级粉碎机是一超微粉碎保质设备，可对任何物料的高粘度、高精度包括固-固、固-液混合作业；可控制粉碎温度，产生的高强度超声波使粉碎物料中的细菌被杀灭；原料的粉碎粒度控制在0.25-4.37μm，达到了细胞级的粒度，使其药效得以充分释放并高效吸收。
图1中的高效混合是指混合的时间控制在3-5min。
下面定供本发明研制技术资料，《全鳖护肝胶囊的研制组》(04年10月8日总结)(一)“康立特胶囊”即全鳖护肝胶囊的中草药组方的研究1、康立特胶囊的处方组成“康立特胶囊”的主要由全鳖、枸杞、黄精、百合、内金、砂仁等药物组成。
(二)康立特胶囊的成分分析1、理化成分分析表1 理化成分

2、功效成分分析 表2 保健功效成分

表3 氨基酸分析结果


3、有毒、有害物质分析表4 有毒、有害物质

4、微生物指标分析表5 微生物指标

(三)康立特胶囊的实验研究康立特胶囊干预免疫性肝损伤小鼠炎症介质及死亡相关因子的研究肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，其长期存在和活动发展往往是导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌发生最重要的始动因素。肝细胞的炎症变性、坏死、凋亡是大多数肝损伤的共同病理学基础，这些变化与多种炎症介质和凋亡相关因子密切相关，本实验以免疫性肝损伤小鼠为模型，通过检测血清中IL-18、ALT、AST，肝组织中TNFα、SOD、MDA、Fas、FasL等炎症介质和凋亡相关因子，观察中药康立特胶囊对免疫性肝损伤模型小鼠肝损伤的干预并分析其机制。
材料与方法1材料1.1动物健康昆明小鼠60只，雄性，体重18±20g，购自山东大学实验动物中心，合格证号010284，鲁动质字20021023。小鼠普通饲料，购自山东大学实验动物中心。
1.2药物康立特胶囊，山东省淡水水产研究所和山东中医药大学联合研制，主要组成野生鳖甲、枸杞、黄精、鸡内金、百合、砂仁等。益肝灵片保肝药，具有改善肝功能，保护肝细胞膜的作用，用于急慢性肝炎及迁延型肝炎，江苏中兴药业有限公司，批号20030409，规格每片含水飞蓟38.5mg，口服，一次2片，一日3次。
1.3主要试剂卡介苗原浆(BCG，1.86×107菌/mg)北京生物制品研究所，批号031030；脂多糖(LPS)，购自北京舒伯伟化工仪器有限责任公司，美国SIGMA公司产品；SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TNFα放免试剂盒，购自中国人民解放军科技开发中心；IL-18酶联试剂盒购自大连泛邦化工技术开发有限公司，Fas、FasL免抗鼠一抗购自北京莱博生物实验材料研究所，二抗购自武汉博士德生物公司2方法2.1造模用BCG+LPS法将BCG和LPS用生理盐水分别稀释为2.5×108菌/ml和50μg/ml，小鼠尾静脉注射配好的BCG液0.2ml/只，(含5×107个菌以上)，致敏10天后，尾静脉注射LPS液0.2ml/只，16小时后摘眼球取血处死，剖腹取肝、脾。饲以普通饲料，自由饮水。
2.2分组及处理方法将小鼠随机分为6组，即A组正常对照组、B组模型组、C组益肝灵对照组、D组康立特高剂量组、E组康立特低剂量组、F组康立特低剂量组，每组各10只。康立特胶囊按成人每日0.3×15＝4.5g，换算成小鼠日给药量4.5g×0.0026＝0.0117g/20g，0.0177×50＝0.585g/kg，0.585g/kg×2＝1.17g/kg，1.17g/kg×4＝4.68g/kg，三个剂量分别为临床用药量的1、2和4倍。益肝灵按成人每日用水飞蓟38.5×6＝231mg，换算成给药量0.231×0.0026＝0.0006g/20g 0.0006×50＝0.03g/kg。康立特胶囊按低、中、高剂量分为三组，用凉开水配成为5.85％、11.7％、23.4％混悬液；益肝灵配成0.015％的混悬液。各组动物处理如下表动物分组及处理情况一览表组别 动物数处理方法生理盐水0.2ml/20g灌胃，8Am喂水，每日一次，A(正常对照组)，10连续10天。
首日小鼠尾静脉注射BCG液0.2ml/只，生理盐水B(模型组)10 0.2ml/20g灌胃，8Am给药，每日一次，连续10天，10天后，尾静脉注射LPS液0.2ml/只C(益肝灵对照 造模方法同上，益肝灵悬液0.2ml/20g灌胃，8Am10组) 给药，每日一次，连续10天D(康立特胶囊 造模方法同上，每日8Am，以康立特胶囊23.4％10高剂量组) 悬液0.2ml/20g灌胃，每日一次，连续10天E(康立特胶囊中造模方法同上，每日8Am，以康立特胶囊11.7％10剂量组) 悬液0.2ml/20g灌胃，每日一次，连续10天F(康立特胶囊低造模方法同上，每0日8Am，以康立特胶囊5.85％10剂量组) 悬液0.2ml/20g灌胃，每日一次，连续10天尾静脉注射LPS 16小时后，称重、摘眼球取血处死，称肝、脾湿重，4℃取肝左叶相同部位组织二段，分别浸于4％戊二醛和10％中性福尔马林中，留作光镜和电镜病理观察；其余肝组织以生理盐水冰水中匀浆，配成25％肝组织匀浆，3000转/分4℃离心，取上清；所取血液离心取血清。所有动物普通饲料饮食，自由饮水，至处死前8小时。
2.3观察项目及检测指标2.3.2血清学检测 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)用全自动生化分析仪检测。IL-18含量，按试剂盒采用酶联免疫法。
2.3.3病理学光镜观察 取新鲜肝左叶相同部位组织，以10％中性福尔马林液充分固定，经各级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚5μm。
2.3.4免疫组织化学染色观察 取上述石蜡切片另两张分别行Fas、FasL的SABC法免疫组织化学染色。微波抗原修复，Fas及FasL的一抗的工作浓度为1∶100，，4℃冰箱保存过夜。用已知阳性切片作阳性对照，PBS液取代一抗作阴性对照。DAB显色。胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒为阳性目标。多媒体彩色病理图文分析系统Image-Pro Plus version 4.0分析显色程度。
2.3.5肝组织匀浆，按试剂盒说明进行TNFα、SOD、MDA的放射免疫定量检测。
2.4 Fas、FasL免疫组化结果半定量判定标准以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片在10×40倍镜随机选择六个视野，每个视野测量其阳性面积和光密度OD值，以其相乘所得数值的平均值定为其免疫组化指数值。
2.5统计方法 将所得数据输入微机经PEMS统计软件(华西医科大学卫生统计学教研室Ver.2.0)处理，数据结果以x±s表示。计量资料采用单因素方差分析。
结果1动物的一般情况及肝脾系数正常组一般情况良好，模型组与各用药组动物饮食量减少，怕冷，不喜活动，个体较小，体重增长较正常组低；由表1可以发现，模型组肝脏系数较正常组明显增大，有显著性差别(P＜0.01)。康立特胶囊高、中、低剂量组及益肝灵组较模型组肝系数小，前两者与模型组相比，有显著差别(P＜0.05)，但后两者较模型组无统计学意义。脾系数各组均小于空白对照组，且除康立特高剂量组外与空白对照组有较显著差异(P＜0.05)，但模型组与各用药组之间无明显差异。
表1 动物肝脾系数表组别数量 肝系数 脾系数A 10 4.7603±0.5237 0.587±0.0986B 86.4404±0.6407ΔΔ0.7321±0.1446ΔC 86.3533±0.4625ΔΔ0.7168±0.1248ΔD 85.6881±0.6824*ΔΔ0.6348±0.1168E 85.5951±0.7031*Δ0.7091±0.125ΔF 86.1261±0.6433ΔΔ0.7095±0.1999Δ注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
2肝脏大体观察实验结束时，肉眼可见正常组肝脏大小正常，质地光滑柔软，颜色暗红，切面鲜红；模型组肝脏明显肿大，边缘变钝，表面光滑，颜色变浅微黄，包膜变厚，切面可见黄色脂肪变；各治疗组肝脏体积稍大，质地柔软，颜色多数暗红，表面光滑，切面颜色接近正常；尤以中药中剂量组与空白组接近。
3血清相关指标检测3.1转氨酶的检测由表2看出，模型组肝功能明显异常，ALT、AST血清水平异常升高，与正常对照组比较差异均有显著性(P＜0.01)；而各用药组均可明显降低血清中异常升高的ALT水平，与模型组比较差异有显著性差异，其中益肝灵和康立特高剂量组尤为显著(P＜0.01)，后者效果优于前者，两者相比有显著差异(p＜0.05)。康立特高剂量组明显降低AST水平，与模型组相比有显著差异(P＜0.01)，但仍高于空白对照组(P＜0.01)，各康立特治疗组与益肝灵组相比无显著差异。
表2 不同组别大鼠血清肝脏功能测定结果(x±s)组别 例数ALT(IU/L) AST(IU/L)A 8 66.5±15.72**##214.38±33.47**B 8 197.25±64.24ΔΔ438±71.02ΔΔC 8 116.25±38.33**ΔΔ411.63±216.57*ΔD 8 78.875±21.81**#244.75±59.10**E 8 129.75±55.94*ΔΔ327.25±51.06**ΔΔF 8 130.63±48.88*ΔΔ390.5±79.39ΔΔ注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与益肝灵比较#p＜0.05，##p＜0.01(同下表)
3.2 IL-18的酶联免疫检测由表3可以看出，模型组血清IL-18含量比正常对照组明显升高(p＜0.01)，各用药组IL-18血清平均含量均低于模型组，其中康立特胶囊高剂量组可以明显降低肝损伤小鼠血清中IL-18的含量(p＜0.01)，效果优于益肝灵对照组，两组相比差异显著(P＜0.05＝。
表3 小鼠血清IL-18浓度(x±s)组别数量 IL-18(ng/ml)A 849.13±4.61**#B 861.33±10.2ΔΔC 857±7.57ΔD 848.88±5.82**#E 860.13±10.99ΔF 853.5±11.154肝组织中SOD、MDA、TNFα的放射免疫检测由表4可以看出，模型组与正常对照组相比肝组织中TNFα含量明显增加(p＜0.01)，SOD含量明显减少(p＜0.01)，MDA含量明显增加(p＜0.05)；SOD含量各用药组均数均高于模型组，其中康立特高剂量组明显高于模型组(p＜0.01)，MDA含量益肝灵组、康立特高、中剂量组均明显少于模型组，其中益肝灵组与模型组相比有显著差异(p＜0.01)，各治疗组间无显著差异；TNFα的含量康立特高、中剂量组明显少于模型组(前者p＜0.01，后者p＜0.05)且前者效果优于益肝灵组(p＜0.05)。
表4 不同组别小鼠肝组织匀浆中SOD、MDA、TNFα测定结果(x±s)组别例数SOD(NU/mgprot)MDA(NU/mgprot) TNFα(ng/ml)A 8 112.48±6.15**6.05±1.78*2.05±0.35**##B 8 100.09±6.86ΔΔ8.28±1.82Δ3.09±0.84ΔΔC 8 106.7±13.05 5.75±1.50**2.72±0.44ΔΔD 8 108.58±5.39**6.62±1.79*1.83±0.51**##E 8 101.59±10.04Δ6.16±1.88*2.26±0.78*F 8 102.2±11.25Δ8.90±2.94Δ2.49±0.40Δ5光镜HE片观察如图1、图2所示，模型组汇管区、中央静脉周围有较多的淋巴和中性粒细胞浸润，小叶间有较多散在的局灶性炎，汇管区周围可见重度碎屑样坏死，炎症细胞以中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞为主，其间有少量纤维母细胞及变性坏死的肝细胞。肝组织内的肝细胞变性以水样、气球样变为主，远端和周边的肝组织有散在的及片状的嗜酸性变性，偶见点状出血灶。
如图3、图4所示，康立特高剂量组肝组织炎症显著好于模型组，接近正常组，仅在个别汇管区周围见个别散在的炎细胞浸润，部分肝细胞轻度水样变性。其余用药组的病变介于模型组愈康立特高剂量组之间，如图5、6、76肝组织Fas、FasL的免疫组化定量检测如图8至19所示Fas、FasL阳性细胞主要分布于肝组织远端和周边，部分汇管区、中央静脉周围。部分小叶间也有散在及片状分布，在肝细胞死亡后的缺失区周围明显高表达。Fas与FasL在肝组织内的分布基本一致，阳性目标主要在肝细胞浆和细胞膜上表达，FasL在淋巴细胞上也有明显表达。阳性细胞的染色程度与阳性细胞的分布面积的乘积值以模型组最高，正常对照组仅有偶见少量阳性细胞，各用药组介于模型组与正常对照组之间，其中康立特高剂量组的表达最少，其免疫组化指数明显小于模型组(p＜0.01)，康立特中剂量组与模型组相比也有较显著差异(p＜0.05)。各组阳性程度见表5。
表5 不同组别小鼠肝组织Fas/FasL免疫组化指数(x±s)组别例数Fas FasLA 8 0 0B 8 768.28±108.63 816.46±99C 8 685.45±138.12 785.87±120.18D 8 582.63±101.38**602.89±85.9**E 8 657.35±100.32*695.17±116.73*F 8 693.85±108.95 780.963±114.017电镜观察如图20、21、22、23所示，电镜观察发现模型组小鼠肝细胞内线粒体肿胀，嵴模糊不清，核膜模糊，细胞器减少，高尔基体、内质网减少、细胞核内异染色质边聚、常染色质结成团块、肝窦绒毛脱落；康立特高剂量组仅见核膜肿胀、炎症细胞浸润；其他实验组也优于模型组。
综上所述，康立特胶囊可以有效地通过降低血清中IL-18、肝组织中的TNFα、MDA含量和Fas、FasL的表达，增加SOD的含量，减少肝组织中的炎症反应，进而减少肝细胞坏死和凋亡。
(四)康立特胶囊的临床研究康立特胶囊治疗慢性乙型肝炎的临床研究慢性乙型肝炎是一种全世界性的，最常见的传染病之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界约有20亿人已受到过乙肝病毒(HBV)感染，其中有3.5亿以上患者已成为该病毒携带者，每年至少造成200万人死亡，使乙型肝炎成为世界上第九大致死原因。我国成人HBsAg携带率10％，约1.3亿人，其中乙型肝炎患者约2800万，约2000万人将最终死于与乙肝相关疾病，其死亡率，男性为50％，女性为15％。其肝硬化和肝细胞癌的年发病率分别为2％和1％[4]。HBV通过刺激人体的免疫系统攻击受感染的肝细胞引起肝损伤，其持续存在使继发的肝纤维化不断发展，最终发展为结节样增生，形成肝硬化。统计表明，约1/3的慢性乙肝患者进展为肝硬化，乙肝患者发生肝细胞癌的危险性增加100倍以上，严重危害了患者的身心健康，对社会的发展也造成了极大的负面影响。因此阻断这些患者肝损伤的持续发展是提高患者的生活质量，阻断其向肝硬化发展的重要治疗环节。目前西医对病毒性肝炎的治疗尚无良策，拉米夫丁和干扰素为主的抗病毒疗法的适应症不够广泛，干扰素的不良反应、拉米夫丁引起的病毒变异极大地限制了其临床应用。中医药在治疗病毒性肝炎肝损伤方面有相对的优势，为挖掘中医药遗产，探索有效的抗肝损伤的药物，通过学习中医相关理论文献，借鉴国内先进经验并结合我们自己的临床经验，以特定工艺开发了以滋补肝肾、祛瘀散结为主要治则，以全鳖为主药的中药制剂即康立特护肝胶囊。为验证康立特护肝胶囊抗肝损伤的临床疗效，对30名慢性乙型肝炎患者进行临床观察，获得了初步的结论，取得了较好的疗效，现将研究结果总结如下。
1研究对象1.1诊断标准1.1.1西医诊断标准参照2000年(西安)中华医学会传染病学会与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎诊断标准。
1.1.2中医诊断参照1991年中国中医药学会内科肝胆病专业委员会修订的《病毒性肝炎中医辨证标准》(试行)。符合慢性肝炎以肝肾阴虚证为主兼有肝郁脾虚、瘀血阻络的诊断。
主症头晕目涩，腰膝酸软；和/或胁肋胀痛，腹胀便溏，乏力纳呆；或面色晦暗，或见赤缕红丝，胁下痞块，质地较硬1.2临床病例选择标准1.2.1纳入标准符合西医诊断病毒性肝炎，乙型，慢性(轻、中度)；符合中医辨证慢性肝炎以肝肾阴虚证为主或兼有肝郁脾虚、瘀血阻络证；年龄12～65岁；受试者均知情同意。
1.2.2排除标准(包括不适应症或剔除病例)合并有肝癌、肝性脑病，严重的心脑血管、心、肺、肾、内分泌、造血系统等严重原发疾病者，及精神病患者；妊娠、准备妊娠或哺乳期妇女；过敏体质，对多种药物过敏者；凡不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效或安全性判断者。
1.2.3终止实验标准对本药过敏者；实验期间，在一个月内病人病情持续恶化ALT连续两次升高超过100μ/l者。
2一般资料2.1病例来源30例患者，均来自山东中医药大学附属医院肝病门诊，于2003年5月～2004年5月收集。其中男20例，女10例，年龄最大55，最小15，平均年龄37岁。均符合上述临床病例选择标准。发现乙型肝炎病程最长7年，最短6个月，平均14个月。
3治疗方法所有患者在首次检查后即开始口服康立特胶囊，每日3次，每次5片，每6个周观察一次，总疗程12个周；病情持续恶化，而未达排除标准者，给予肌苷、复合维生素B、维生素C静滴营养保肝，继续服用本药；达终止实验标准者，给予甘利欣静滴、阿拓莫兰静注并终止服药，列入排除病例。
4观察指标4.1安全性指标包括一般性体检项目；血、小便、大便常规检查；心电图、肾功能检查；上述检查分别于治疗前后各查一次。
4.2疗效性观测4.2.1主要症状、体征和舌象、脉象参照《中药新药治疗病毒性肝炎的临床研究指导原则》和临床常见症状体征，采用重点症状与体征积分法，将常见主要症状和体征按轻重进行量化，对治疗前后单个症状和体征的积分情况和总积分的情况进行比较，判断康立特胶囊对这些临床表现的疗效。具体积分方法见下表。
表2 重点症状与体征积分症状体征积分0 1 2 3纳呆无食欲减退不思饮食 不能进食伴呕恶腹胀无轻度腹胀，进腹胀不适，进食腹胀更甚，进食2食后半小时减半小时到一小时小时不能好转轻或消失内较甚乏力无体倦，身不欲四肢无力，困倦气短懒言动 欲卧肝区隐痛无偶有发作，隐发作较频，疼痛持续疼痛隐作痛，不影较重响正常工作腰痛无偶有发作发作较频 持续腰痛，伴有双下肢酸软无力肝脾肿大无肋下触及2cm 肋下触及2～ 肋下触及3cm以内，质软，3cm，质韧，有压可有压痛痛4.2.2相关的理化检查肝功ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(门冬氨酸氨基转移酶)、r-GT(r谷氨酰转肽酶)、TBIL(总胆红素)；肝胆脾B超；病毒学指标乙肝五项，HBVDNA(乙肝病毒DNA)；肝纤维化四项HA(透明质酸)、LN(层粘蛋白)、PCIII(III型前胶原)、IV-C(IV型胶原)
以上指标中肝功和B超在治疗前、中、后各检测一次，每两次之间相隔6个月；其余指标在治疗前后各检查一次。
4.3统计数据经PEMS统计软件(华西医科大学卫生统计学教研室Ver.2.0)处理，数据结果以X±s表示，计量资料采用t检验。
5疗效标准参照《中药新药治疗病毒性肝炎的临床研究指导原则》，根据本研究具体需要制定。总疗效标准显效疗程结束后主要症状消失，肝脾恢复正常或回缩，肝功能恢复正常；有效疗程结束后主要症状明显减轻或消失，肝脾肿大不变，肝功能明显好转；无效不符合上述改变者。
证候疗效判定标准疗效按公式(尼莫地平法)[(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分]×100％计算。
临床治愈症状体征基本消失，疗效指数≥90％；症状体征明显改善，疗效指数≥60％，症状体征好转，疗效指数≥30％，症状体征无明显好转，甚或加重，疗效指数≤30％。
安全性评价标准1级安全，无任何不良反应；2级比较安全，如有不良反应，无需处理，可继续用药；3级有安全性问题，中等程度不良反应，处理后可继续治疗；4级因不良反应终止实验。
6治疗结果6.1总有效率临床观察30例，服药3个月，总疗效临床显效7例，占23.3％；有效18例，占60％，总有效率占83.3％；无效5例，占16.7％。
6.2中医证候结果分析用药后患者的症状体征均有明显改善，各症状体征均有明显好转，与治疗前相比均有显著差异(p＜0.01)。其中疗效指数≥90％者，1例；疗效指数≥60％者，18例；≥30％者有10例，无效者1例。即临床痊愈患者占3.3％，明显改善者占60％，好转者占33.3％，无效占3.3％。
治疗前中后症状体征积分表(x±s)症状体征 治疗前 治疗中 治疗后(疗中总体平均(疗后总体平均疗效指疗效指数)数)
纳呆 1.47±1.04 0.9±0.84*0.43±0.50**(38.6) (70.5)腹胀 1.67±0.90 1±0.73**0.5±0.51**(40) (70)乏力 0.97±0.67 0.76±0.62 0.63±0.49*(20.7) (34.5)肝区隐痛 1.43±0.82 0.93±0.74**0.6±0.50**(34.9) (58.1)腰痛 1.23±0.73 0.83±0.65*0.27±0.45**(32.4) (78.3)肝脾肿大 0.53±0.68 0.5±0.680.36±0.49(6.2)(31.3)总分 8±2.02 5.73±1.78**2.7±1.7**(32.4) (61.6)与治疗前相比，**p＜0.01，*p＜0.056.2肝功的疗效分析用药后6个周，肝功能各项指标均有改善，除总转肽酶和胆红素外，其它指标与治疗前有显著差异(p＜0.01，p＜0.05)；用药12个周，肝功能各项除转肽酶外与治疗前相比均有显著改善(p＜0.01，p＜0.05)。
治疗前中后肝功能比较表(x±s)肝功能 治疗前(U/L) 治疗中(U/L) 治疗后(U/L)ALT 115.89±77.5168.46±34.47**49.15±19.93**AST 80.82±307.7962.43±41.91*60.08±34.72*GGT 64.6±34.96 55.05±29.50 50.27±34.3TBil21.76±12.1 18.4±7.5717.23±6.89*与治疗前相比，**p＜0.01，*p＜0.056.3血清肝纤维化四项的疗效分析经统计学处理，血清纤维化指标除LN外，均有明显改善，其中PCIII、LN与治疗前相比，明显降低(p＜0.05)，IV-C显著降低(p＜0.01)治疗前后血清肝纤维化四项比较表(x±s)肝功能治疗前 治疗后PCIII(mg/ml) 128.33±17.59121.5±12.38*HA(ng/ml) 136.03±29.04134.7±20.46LN(ng/ml) 129.3±9.23 124.67±9.21*IV-C(ng/ml) 71.89±6.49 67.65±6.70**与治疗前相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
6.4 B超的疗效分析原有的患者中有20例B超表现有不同程度的回声增粗，肝脾不同程度的肿大，其余10例B超无明显异常。治疗后，脾脏平均缩小1.02cm，2例肝肿大恢复正常，1例脾脏肿大恢复正常，1例肝脏回声表现转为正常。原有10例B超正常患者，治疗后B超仍无异常。
6.5病毒学指标的疗效分析治疗前后血清病毒指标病毒指标治疗前阳性患者治疗后阳性患者转阴例数(率)例数 例数HBsAg 30291(3.3％)HBeAg 149 5(25％)HBVDNA 29253(10％)6.6安全性分析30例患者的血、尿、大便常规检查均未发现与治疗前相比的异常结果，心电图、肾功能的检查也未获异常结果，安全性指标的检查中未发现该药有明显的毒性。安全性级别为1级。
因此，可以认为康立特胶囊安全有效，经三个月的治疗后患者血清指标、症状体征、影像学指标均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝损伤、防止肝纤维化形成的作用。临床总有效率达83.3％，且未发现各安全指标的异常变化。
(五)结论通过三年的研究，得出以下结论1、该项目充分借鉴现代医学的研究成果，结合多年的临床经验，首次研究并提出了全鳖与中草药配伍的适宜组方，药食两用中草药的采用使该课题研制的产品既可以作为肝病的治疗药物，又可以作为保健品进行开发；2、该项目研究并总结出一套完整的生产全鳖护肝胶囊(康立特护肝胶囊)的工艺流程。特别是冷冻干燥、细胞级粉碎等先进的加工工艺，既保持了中华鳖及其他中草药的活性成分，又使其药效得到充分释放和吸收，从而提高了疗效或保健效果。
3、该研究通过观察康立特胶囊对实验性免疫性肝损伤小鼠肝组织和血清中的炎症介质和凋亡相关因子的干预，证明康立特胶囊可以有效地通过降低血清中IL-18、肝组织中的TNFα、MDA含量和Fas、FasL的表达，增加SOD的含量，减少肝组织中的炎症反应，进而减少肝细胞坏死和凋亡，并表现出疗效的明显随剂量增加而提高。
4、该研究通过观察康立特胶囊对30例乙型病毒性肝炎患者的临床疗效，发现康立特胶囊对患者的血清指标、症状体征、影像学指标均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝损伤、防止肝纤维化形成的作用。临床总有效率达84.3％，且未发现各安全指标的异常变化。
权利要求
1.一种全鳖护肝胶囊，是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖1.0-5.0份、枸杞0.5-3.4份、黄精0.5-2.6份、郁金0.5-3.0份、百合0.6-3.2份、鸡内金0.6-2.8份。
2.根据权利要求1所述全鳖护肝胶囊，其持征是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖2.0-4.0份、枸杞0.7-1.4份、黄精0.8-1.6份、郁金1.0-2.0份、百合1.1-2.2份、鸡内金0.9-1.8份。
3.根据权利要求1所述全鳖护肝胶囊，其持征是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖2.2-3.5份、枸杞1.0-1.2份、黄精1.0-1.4份、郁金1.2-1.8份、百合1.1-2.0份、鸡内金0.9-1.5份。
4.根据权利要求1所述全鳖护肝胶囊，其持征是由以下原料按重量比配制而成的胶囊全鳖20g、枸杞7g、黄精8g、郁金10g、百合11g、鸡内金9g。
5.一种上述全鳖护肝胶囊的配制方法的加工工艺流程为①首先是鳖加工选出活鳖～暂养净化～流水清洗～真空冷冻干燥～粉碎～低温冷藏～按原料配比称出低温备用；②中药加工选出各原料中药～烘干～破碎～按照各原料重量比称出混舍备用；③再将上述备用的鳖粉与中草药粉混合～低温研磨～细胞级粉碎～紫外灭菌～后添加植物抗氧化剂后高效混合～胶囊罐装～装瓶～封口～贴签～装箱～检验入库。
6.根据权利要求5所述全鳖护肝胶囊的配制方法，其特征是选鳖是指选野生鳖最佳，家养应500克以上，所选的鳖，必须无病无伤、反应灵敏、翻盖后能迅速翻身。
7.根据权利要求5所述全鳖护肝胶囊的配制方法，其特征是鳖的暂养净化是指购入的鳖，先放入自来水中暂养3-5天，以吐净使其消化系统的内容物；暂养时，每只容器中只放一只，，在容器的上口覆盖一层40目的纱网，防止蚊子叮咬导致死亡。
8.根据权利要求5所述全鳖护肝胶囊的配制方法，其特征低温真空冷冻干燥是指冷冻干燥在低温下(-40℃)进行，是真空技术与冷冻技术相结合的新型干燥脱水技术，能保持原来的性状；保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；干燥后的物质几乎立即恢复原来的性状；易氧化的物质得到了保护；干燥能排除95-99％以上的水份，能长期保存使干燥后产品不变质。
9.根据权利要求5所述全鳖护肝胶囊的配制方法，其特征细胞级粉碎是指采用的超微粉碎作业，可对任何物料的高粘度、高精度包括固-固、固-液混合，可以控制粉碎温度，机内高强度超声波使物料中的细菌被杀灭；原料的粉碎粒度控制在0.25-4.37μm细胞级的粒度，使其药效得以充分释放并高效吸收。
10.根据权利要求5所述全鳖护肝胶囊的配制方法，其特征高效混合是指混合的时间控制在3-5min。
全文摘要
本发明全鳖护肝胶囊及其配制方法含有全鳖、枸杞、黄精、郁金、百合、鸡内金等原料，该项目首次研究并提出了全鳖与中草药配伍的适宜组方，药食两用中草药的采用使该产品既可以作为肝病的治疗药物，又可以作为保健品；既保持了中华鳖及其他中草药的活性成分，又使其药效得到充分释放和吸收，从而提高了疗效或保健效果；该药可以有效地减少肝组织中的炎症反应，进而减少肝细胞坏死和凋亡；本发明对30例乙型病毒性肝炎患者的临床疗效，发现对患者的血清指标、症状体征、影像学指标均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝损伤、防止肝纤维化形成的作用；临床总有效率达84.3％，且未发现各安全指标的异常变化；总之，充分证明了本发明组方科学，工艺合理、先进，效果显著、肯定，服用安全可靠。
文档编号A61P1/16GK1634230SQ200410036258
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月9日 优先权日2004年11月9日
发明者张家国, 尹常健, 杨铂, 郭元春, 杨玲, 彭伟, 崔爱庆, 赵惠琴, 张永, 巩俊霞, 孙建光, 王小利 申请人:山东省淡水水产研究所