专利名称：一种苏木乙酸乙酯提取物及其作用的制作方法
技术领域：
本发明属于一种苏木的乙酸乙酯提取物及其作用，具体是在抗免疫抑制方面的作用。
背景技术：
随着医学的发展和免疫学研究的不断深入，人们逐渐认识到免疫系统异常与人类众多疾病的发生均有密切的关系。临床工作中常常需要使用大量的免疫抑制剂，尤其是接受器官移植的病人，需要终生服用。
临床开展器官移植已有40余年的历史，在早期因为排斥反应的困扰进展缓慢。自1978年环孢素A在临床上应用之后，使器官移植发生了革命性变化。现在临床常用的免疫抑制剂有4大类①化学合成细胞毒类(抗代谢剂和烷化剂)，主要代表为硫唑嘌呤、霉酚酸酯(MMF)；②抗生素类(微生物产生的制剂)；③肾上腺皮质激素类；④生物制剂类，国内外应用的免疫抑制剂是以环胞素A(CsA)、雷帕霉素、他克莫司(FK506)为代表的生物制剂类药物。虽然西药免疫抑制剂的陆续开发上市为器官移植和免疫性疾病的临床治疗开创了新局面，但是目前临床上应用的这些药物大多缺乏选择性和特异性，对正常和异常的免疫反应均有抑制作用，对初次免疫应答反应抑制作用较强，对再次免疫应答反应抑制作用较弱。长期应用，一方面容易降低机体抵抗力而诱发严重感染及恶性肿瘤；另一方面，免疫抑制剂对机体及移植器官本身具有毒性作用，造成相应器官或移植器官的功能障碍，甚至丧失其功能。而且常规免疫抑制剂的剂量难以控制，剂量小不足以保护移植物不受排斥，剂量大则机体难以耐受，虽然近期疗效大为提高，但远期效果仍不理想。此外，有些药物目前仍需进口，价格昂贵，加重了患者的经济负担。
对祖国医学来讲，抗器官移植免疫排斥是个新课题，在急性排斥反应中移植物在被排斥时常出现血管内皮细胞肿胀变性、血管周围炎性细胞浸润、水肿、出血、小血管管壁增厚、管腔狭窄、甚至血栓形成等一系列小血管病理损害和微循环障碍。这种病变与祖国医学理论中的“瘀血”较为相似。由于我国中草药资源丰富、价格低廉、毒副作用低等特点，自70年代末以来，对中药复方和单味药的抗免疫排斥作用进行了大量的研究工作，显示了一定疗效。其中，对雷公藤多甙的研究比较深入，虽然已经证实雷公藤多甙对细胞免疫和体液免疫均有一定的抑制作用，但美中不足的是它同时带来的明显的毒副作用，如胃肠道反应、白细胞及血小板的减少、闭经和肝损害等，限制了它的临床应用。对冬虫夏草的研究也较深入，其主要表现为不同的提取方法，显示出不同的药理作用，因此，应用于临床还需做大量的工作。因此，人们期待能从中草药中寻找出一种高效低毒、选择性强的免疫抑制剂，从而达到代替或部分代替目前应用的西药免疫抑制剂而更好的应用于临床。
研究表明，活血化瘀药物具有减轻血小板聚集、调整血管壁通透性的紊乱、扩张血管、调整血液粘度、防止凝血及促进纤溶等作用，因而可改善排斥反应所导致的移植物微循环障碍，使移植物的存活期延长。另外，活血化瘀药物可抑制机体产生抗体。本发明可延长移植心脏的存活时间，减轻排斥反应对器官所致的免疫损伤，且毒副作用小，价格低廉。苏木为传统中药，具有行血破瘀、消肿止痛的功效。自70年代起，国内外学者开始对苏木及其活性成分进行研究，证实其具有较强的体外抑制肿瘤细胞、抑制血小板和免疫抑制作用。周亚滨教授于1999年完成了苏木抗大鼠同种异位心脏移植急性排斥反应机理的研究，结果表明苏木水提液可以抑制大鼠移植心心肌组织中穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达，降低外周血细胞因子IL-2、IL-6的水平，调节CD4+/CD8+的比值，抑制心肌细胞的过度凋亡。为进一步明确其生物活性成分，在此基础上又先后进行了苏木乙醇提取物、乙醇提取物进一步提取的乙酸乙酯和正丁醇提取物对小鼠免疫活性细胞的抑制作用及对IL-1β、IL-2生成的影响。初步研究结果表明乙酸乙酯提取物具有较强免疫抑制作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗免疫抑制作用的苏木乙酸乙酯提取物，与现有技术相比，毒副作用小，作用更为显著，并且价格低廉、可以作为常规用药。
本发明的技术方案是通过下述方法制备方法来实现的采用热回流提取将苏木粗粉(40目)用75％乙醇浸泡4h，加热至85℃，连续回流提取2h，过滤；反复2次，将滤液合并，于旋转蒸发仪中减压浓缩，将浓缩液转入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取物干粉。将乙醇提取物干粉加入双蒸水混悬，用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
此外还可以采用下述方法煎煮法将苏木粗粉(过40目)用8倍量的水浸泡4h，连续回流提取两次，每次2h，过滤，将滤液合并，将滤液浓缩至相对密度1.00-1.05，用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超声振荡提取将苏木粗粉(过40目)用8倍量的75％乙醇浸泡2h，连续超声振荡提取两次，＜50℃每次2h，过滤，将滤液合并，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
渗漉法将苏木粗粉(过40目)用75％乙醇连续渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超临界萃取法苏木粗粉(过80目)SFE条件萃取罐温度40℃，萃取压力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取时间2.5h，夹带剂为95％乙醇比例不超过15％。减压干燥。将提取物研磨至细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
本发明的药物，可延长移植心脏的存活时间，减轻排斥反应对器官所致的免疫损伤，毒副作用小，价格低廉，可以作为常规用药。
实验部分下面通过药理实验数据进一步说明本发明的上述效果实验一苏木有效部位群免疫抑制作用的筛选研究材料与方法一.实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，20～25g；BABL/C小鼠，雄性，20～25g；Wistar大鼠，雄性，160～190g；SD大鼠，雄性，250～300g。Wistar大鼠购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，其余动物购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。实验动物在通风、温度、湿度适宜的动物室内饲养。
二.主要仪器2k-828型真空干燥箱，上海医疗仪器总厂超净工作台，苏州净化设备厂300型CO2培养箱，Sheldon Manufacturing.Inc.
Allegna 21R Centrifuge离心机，Beckman.
SXP-1B型双人双目显微镜，上海光学仪器厂SSW-3型显微手术器械包，上海医疗仪器厂三.实验用药1.苏木有效部位群的制备将苏木粗粉(40目)放入4颈烧杯中，加入75％乙醇浸泡4h，加热至85℃，连续回流提取2h，过滤；反复2次，将滤液合并，一部分抽入旋转蒸发器中水浴蒸干，转入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取干粉。
对剩余的75％乙醇提取物用乙酸乙酯萃取，得到萃取物，连同分离出的水层，分别按照前法制成乙酸乙酯和水溶性成分干粉。
2.苏木灌服液的制备将乙醇提取干粉60g加入双蒸水200ml混悬，制成30％的苏木灌服液备用。
3.实验试剂NBS-RPMI-1640培养液四.试验方法1.药品的制备乙醇、乙酸乙酯水溶性成分干粉水溶，浓缩配成每毫升含主药1g。
2.混合淋巴细胞反应试验(MLR)2.1脾细胞悬液的制备①小鼠放血处死，取脾称重，放入盛有冷的5～10ml HBS平皿中不绣钢网上，剔除脂肪组织和结蹄组织。
②将脾剪成两段，轻轻碾碎，使单个脾细胞经不锈钢网进入溶液中，再经不锈钢网过滤至离心管。
③离心1500r，5分钟后弃上清，低渗处理除去红细胞。
④用HBSS液洗涤细胞2～4次，加入10％NBS-RPMI-1640培养液1～2ml，细胞计数及测定细胞的存活率。
2.2MLR实验①刺激淋巴细胞制备C57BL/6小鼠脾细胞做刺激细胞，将淋巴细胞1×106/ml加入丝裂霉素C处理，最终浓度为25μg/ml，于37℃水浴下作用30min，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀细胞用Hanks液洗涤3次。用BALB/c小鼠脾细胞做应答细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。
②将4种药物离心2000rpm，无菌过滤，备用。
③将4种药液分别用1640培养液作倍比稀释1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048。
④取刺激细胞和反应细胞各50μl加入96孔培养板上，加入100μl含药20％NB S-RPMI-1640培养液中，每组均设3各复孔。另以不含药物的1640培养液作为空白对照组。混合细胞在CO2培养箱中培养72h。
⑤收集前4h加入氚标记的胸苷2μCi。
⑥反应终溶液收集到纤维滤纸上，干燥后用液体闪烁器记cpm值。
结果一.苏木有效部位群免疫抑制作用的筛选研究(见表1)苏木乙醇提取部分经有机溶剂提取后得到乙酸乙酯部分和水部位。实验结果表明，苏木各部位群均有一定的免疫抑制作用，其中乙醇组和乙酸乙酯组均呈现良好的平行关系，乙酸乙酯组表现出明显的免疫抑制作用，水提物组虽然具有一定的作用，但是高浓度组与低浓度组的差异性未能显示出有统计学意义。
表1各细对单向混合淋巴细胞培养试验的影响(x±s，n＝3)
各组组内与1∶2048组相比，*P＜0.05；**P＜0.01由于对照组未能出结果，各组之间差异性比较采用同组之间各浓度组与低浓度组比较，方法仍然采用方差分析和Dunnettt检验(q′检验)进行非配对的显著性分析。
实验二苏木有效成分对小鼠淋巴细胞转化功能抑制作用的量效关系研究材料与方法一.实验动物昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，体重18～22g。由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。动物合格证号SCXK(黑)20020002。实验动物在通风、温度、湿度适宜的动物室内饲养。
二.主要仪器设备及药品试剂
RPMI-1640，Gibco公司新生小牛血清(NBS)，上海生物制品所ConA，Sigma公司LPS，Sigma公司MTT，Sigma公司(用0.1mol/L的PBS配成浓度为5mg/ml的MTT液)十二烷基磺酸钠(SDS)，上海化学试剂站红细胞裂解液(将KHCO30.5g，NH4Cl4.15g，EDTA-Na20.185g溶于蒸馏水500ml中配制而成)酶联免疫检测仪，Biocell 2010，Anthos公司CO2培养箱，5410型Napco公司2k-828型真空干燥箱，上海医疗仪器厂三.实验用药苏木，购自黑龙江省药材公司，产地云南，经生药鉴定。
苏木乙酸乙酯提取物的制备采用热回流提取将苏木粗粉(40目)用75％乙醇浸泡4h，加热至85℃，连续回流提取2h，过滤；反复2次，将滤液合并，于旋转蒸发仪中减压浓缩，将浓缩液转入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取物干粉。将乙醇提取物干粉加入双蒸水混悬，用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃，得到乙酸乙酯提取物干粉。
此外还可以采用下述方法煎煮法将苏木粗粉(过40目)用8倍量的水浸泡4h，连续回流提取两次，每次2h，过滤，将滤液合并，将滤液浓缩至相对密度1.00-1.05，用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超声振荡提取将苏木粗粉(过40目)用8倍量的75％乙醇浸泡2h，连续超声振荡提取两次，＜50℃每次2h，过滤，将滤液合并，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
渗漉法将苏木粗粉(过40目)用75％乙醇连续渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超临界萃取法苏木粗粉(过80目)SFE条件萃取罐温度40℃，萃取压力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取时间2.5h，夹带剂为95％乙醇比例不超过15％。减压干燥。将提取物研磨至细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
四.实验分组和给药将104只小鼠随机分成13组，每组8只。其中苏木乙酸乙酯提取物用橄榄油稀释，以相当于原药苏木15、25、35、45g/kg的剂量0.2ml/10g灌胃，分成4个剂量组；乙醇提取物用橄榄油稀释，以相当于原药苏木15、25、35、45g/kg的剂量0.2ml/10g灌胃，分成4个剂量组；苏木水提组，以相当于原药苏木15、25、35、45g/kg的剂量0.2ml/10g灌胃；另设空白对照组，以0.2ml/10g橄榄油灌胃。连续灌胃8天。
五.实验方法小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖实验将小鼠颈椎脱位处死后，置70％乙醇中浸泡3～5min，取出后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，无菌取脾，放在盛有冷的0.9％生理盐水平皿的不锈钢丝网(100目)上，剔除脂肪组织和结缔组织。将脾组织剪成两段，用注射器的针芯轻轻捻脾组织，使单个细胞经网进入溶液中，再经不锈钢网过滤至离心管中，离心(1500r/min，10min)后弃上清。用红细胞裂解液除去红细胞，用冷的0.9％生理盐水洗涤细胞2～4次，离心。最后加入10％NBS-RPMI-1640培养液1～2ml悬浮脾细胞，制备成4～6×106/ml的小鼠脾细胞悬液。以上操作过程，细胞均放置0～4℃环境中。
于96孔培养板中，每孔加入100μl脾细胞悬液。设T、B细胞组，每组分别为3个复孔。在T细胞组中加入ConA，终浓度为5μg/ml；B细胞组中加入LPS，终浓度为10μg/ml。将96孔培养板置于37℃，5％CO2温箱中培养48h。每孔加入10μlMTT溶液再继续培养4h，然后加入100μl 100g/L酸化的SDS，震荡3min，温箱培养3h，室温20min后用酶标仪于波长570nm处测OD值。
结果一.一般情况对照组、15、25、35g/kg苏木乙酸乙酯提取物组、乙醇提取物组及25、35g/kg水提物组小鼠一般状态良好，皮毛光滑，进食及体重逐渐增加；45g/kg乙酸乙酯提取物组、乙醇提取物组及15g/kg、45g/kg水提物组小鼠一般状态较差，懒动，体毛疏松，进食及体重逐渐降低。
二.苏木有效成分对小鼠淋巴细胞转化功能的影响(见表2)表2苏木有效成分对小鼠淋巴细胞转化功能的影响(OD值，x±S)
从表2中可以看出，苏木乙酸乙酯和乙醇提取物、水提物与对照组相比均能明显抑制淋巴细胞的增殖(P＜0.05)。在对T或B淋巴细胞转化功能的影响方面，乙酸乙酯35g/kg、45g/kg与其他实验组相比差异具有显著性(P＜0.05)。
实验三苏木乙酸乙酯提取物对大鼠同种异位心脏移植急性排斥反应心肌FasL mRNA表达的影响材料与方法一.模型的建立与分组
(一)实验动物健康成年雄性，清洁级近交系封闭群大鼠，供者Wistar大鼠，体重160～200g；受者SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重250～300g。均购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。实验动物在通风、温度、湿度适宜的动物室内饲养。动物合格证号SCXK(黑)20020002。
(二)主要仪器设备及药品试剂2k-828型真空干燥箱，上海医疗仪器厂SXP-1B型双人双目手术显微镜，上海光学仪器厂SSW-3型显微外科手术器械包，上海医疗仪器厂9/0带针医用无损伤缝合线，上海医用缝合针厂戊巴比妥钠(以注射用水配制成1％溶液)肝素钠注射液，2ml12500单位，江苏万邦生化医药股份有限公司。(以生理盐水配制成500u/ml和25u/ml的肝素生理盐水)心脏停搏液，哈尔滨医科大学第二附属医院制剂室提供庆大霉素注射液，北京双鹤制药厂橄榄油(olive oil)，中国医药上海化学试剂公司(三)实验用药1.环孢素A 将环孢素胶囊(华北制药集团新药研究开发有限责任公司生产，每粒含CsA25mg)溶于橄榄油中，稀释至3.5mg/ml浓度，室温保存备用。
2.苏木乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提物制备方法同实验二(四)模型的制备大鼠同种异位心脏移植术，采用改良的Ono术式[141]，将供心的升主动脉和肺主动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉行端侧吻合，为移植心脏提供血液循环。
1.受体手术将SD大鼠用戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定，常规消毒、铺巾。从正中线剪开腹壁，将肠袢推向右侧，用湿生理盐水纱布盖好。用拉钩牵引两侧腹壁切口，在10倍镜下进行操作，打开后腹膜，在腰静脉以下暴露腹主动脉和下腔静脉，稍加游离，用4/0线结扎背侧交通支，用无齿镊提起动脉鞘，在选定吻合口部位两侧分别放置血管夹，完全阻断腹主动脉和下腔静脉。
2.供心切取将Wistar大鼠按戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，固定、消毒、铺巾后，由正中线剪开腹壁，将肠袢推向右侧，剥离出腹主动脉，用注射器注入1ml(500u/ml)肝素生理盐水。待全身肝素化后，沿双侧腋前线从肋缘至锁骨剪开胸腔，暴露心脏，剪开心包，立即向胸腔内及心脏表面加入少量0～4℃生理盐水进行供心表面降温。然后，分离无名动脉，以弯曲针头注射器穿刺主动脉至根部，注入预冷的心脏停跳液15～20ml，心脏迅速停跳。在无名动脉起始部剪断主动脉，在肺动脉分叉处剪断肺动脉。然后用4/0线一次性集束结扎剩余血管，提起心脏，在远心端剪下心脏。取出心脏，置于0～4℃生理盐水中，修剪血管。
3.供心移植用尖刀在受体腹主动脉前壁挑一个小口，用弹簧显微手术剪稍加扩大(2.5～3.0mm)，使之与供心主动脉直径接近。用肝素生理盐水(25u/ml)冲洗管腔内积血，用9/0无损伤线先将供心主动脉与受体腹主动脉吻合口的两端采用间断缝合法吻合，接着分别做右侧壁、左侧壁的连续缝合。针距、边距约为0.4～0.5mm，每侧缝合7～8针。然后在行供心肺动脉与受体下腔静脉的吻合，方法同前。手术期间，每隔4～5min更换冰生理盐水纱布，覆盖在供心的表面，以防心脏复温。
吻合完毕后，先释放尾侧端血管夹，检查静脉吻合口有无漏血。然后再释放头侧端血管夹，检查动脉吻合口，如有出血，可以多次，间断地放松血管夹，同时用明胶海绵轻压吻合口。在去夹1min内，供心自动复跳或由纤颤转为正常心搏，心率200～280次/min，颜色有紫红色转变为正常颜色。然后按原位回纳肠袢，分二层缝合腹壁。最后，从尾静脉注射0.5u庆大霉素。供心总缺血时间平均为35min。
(五)实验分组及处理移植术前1d按分组要求灌胃给药。术后将2h内清醒能站立，手指稍用力便可触及心脏跳动且24h内不停跳者作为实验动物模型，单笼饲养。将上述大鼠随机分为5组，每组8只。第一组为模型对照组，术后24h灌服橄榄油，剂量为10ml/(kg·d)。第二组环孢素A组，术后24h后按35mg/(kg·d)灌服给药。第三组为苏木乙酸乙酯组，术后24h后按生药22g/(kg·d)灌服给药。第四组为苏木乙醇组，术后24h后按生药22g/(kg·d)灌服给药。第五组为苏木水提组，术后24h后按生药22g/(kg·d)灌服给药。
术后大鼠腹腔移植心跳满11d者于当天取供心；不满11d者于腹腔心脏停跳后12h内取供心。移植心脏存活时间以天为计算单位，手术当天按0天就算，不足24h者采用四舍五入法计算。
(六)标本的采集将动物经戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，常规固定、消毒、铺巾等处理。沿正中线剪开腹壁，快速用180℃、12h处理过的手术剪(0.1％DEPC水处理后)剪取心肌约400mg左右，分别用液氮速冻，-80℃低温冰箱保存，待做逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)；余下心肌剪取心尖部组织0.2～0.3mm3，用10％福尔马林固定，待做光镜检测。
二、病理形态学检查(一)主要试剂(1)甲醛，天津化学试剂研究所(2)二甲苯，哈尔滨新达化工厂(3)苏木精-伊红生物染色剂(HE)，北京化工厂(二)主要仪器(1)切片机，LEICA RM 2135，德国制造。
(2)光学显微镜，日本OLYMPUS公司生产(三)光镜样品的制备将留取的心肌标本在10％福尔马林常温固定24h以上，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察形态学改变。
(四)病理组织学诊断标准采用ISHT[142]标准对移植心急性排斥反应进行病理组织学分级。
①0级无排斥反应。
②1级1A级，局灶性，血管周围或间质内有少量散在淋巴细胞浸润，无心肌坏死。
1B级，弥漫性，血管周围或/及间质内淋巴细胞浸润，无心肌坏死。
③2级灶性成片淋巴细胞浸润，有/无嗜酸性白细胞，或/及心肌坏死。
④3级3A级，多灶性，成片淋巴细胞浸润，有/无嗜酸性白细胞，或/及心肌坏死。
3B级，大量淋巴细胞及嗜酸性白细胞浸润，偶见中性粒细胞，约75％的心肌被淋巴细胞浸润，心肌坏死。
⑤4级弥漫性，大量淋巴细胞、嗜酸性白细胞和中性粒细胞等多种炎细胞浸润，心肌坏死，间质水肿、出血及血管炎。
为便于统计，将1A和1B级合计为1级；3A和3B级合计为3级。
三、RT-PCR法检测心肌FasL mRNA的表达(一)实验试剂(1)Trizol RNA提取试剂， Invitrogen公司(2)二乙基焦碳酸酯(DEPC)，Promega公司(3)RT-PCR试剂盒，Promega公司(4)上、下游引物，大连宝生物公司(5)逆转录酶，Promega公司(6)琼脂糖， Promega公司(7)GoldView染料 Buffer公司(8)三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)， 大连宝生物公司
(二)实验仪器(1)低温高速离心机， HITACHI公司(2)PCR仪， 北京六一仪器厂(3)紫外分光光度计， ALPHA INNOTECH公司(4)电泳凝胶图象分析系统，Backman公司(三)基本操作(1)引物设计[143]FasL上游引物5’-ATAGAGCTGTGGCTACCGGTG-3’下游引物5’-CTCCAGAGATCAAAGCAGTTCC-3’目的基因产物长度534bpβ-actin上游引物5’-GGCTTCGCGGGCGACGATG-3’下游引物5’-CTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3’目的基因产物长度587bp(2)RNA提取①心肌组织匀浆于冰上进行。取100mg心肌组织，放入玻璃匀浆器中，加入Trizol试剂1ml。
②25℃水浴箱中孵育5分钟。
③将匀浆移入1.5ml离心管中，加入氯仿0.2ml，混摇15秒，室温放置5分钟。
④4℃下离心(10000r/min)15分钟⑤将上层无色液相移入1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟后混匀。
⑥4℃下离心(10000r/min)15分钟。
⑦去上清。沉淀中加入75％乙醇1ml。4℃下离心(7500r/min)5分钟。重复该步骤2次。
⑧真空干燥10分钟。
⑨计算所提RNA量，使A260/A280比值保持在1.8以上。-70℃低温冰箱保存。(3)RNA逆转录取上述标本RNA2μg，逆转录成cDNA。
20μl反应体系5×缓冲液 5μl10mmol/L dNTP 2μl逆转录酶 0.5μl上、下游引物 各0.5μl25mmol/L MgSO41.5μlRNA2μg加入去Rnase的蒸馏水至20μl反应条件42℃温育45分钟合成cDNA；95℃10分钟灭活逆转录酶。
(4)PCRPCR以cDNA为模板行体外扩增。
25μl反应体系模板cDNA10μl5×缓冲液 5μl10mmol/L dNTP 2μlTaq酶 1μl上、下游引物 各0.5μl加入双蒸水至 25μl反应条件变性94℃30秒退火55℃60秒延伸68℃60秒共做30个循环后，72℃延伸5分钟。
(5)RT-PCR产物分析取10μl PCR扩增产物10μl以1.5％琼脂糖凝胶、100V电压电泳60min，GoldView染料染色，在紫外灯下观察结果、拍照。应用凝胶图象分析系统测定PCR产物电泳条带的密度积分，计算FasL产物的相对量。计算公式FasL相对量＝FasL产物电泳条带密度/β-action电泳条带密度×100％。
四.统计学处理数值以均数±标准差表示(x±SD)，用SPSS10.0软件计算。结果之间多样本比较用F检验进行方差分析，两两比较用q检验，P＜0.05为差异具有显著性。
结果一.手术成功率正式实验43例，成功40例，失败3例，其中血管吻合口出血过多致死2例；血管吻合口狭窄致死1例。成功率93.0％。
二.一般情况术后大鼠多在2～4h内清醒，呼吸平稳，心脏搏动规则、有力。4h左右可以进食、饮水。3～4d后刀口愈合。模型对照组一般情况及食欲较差，懒动，体毛疏松，易脱落，移植心存活时间(5.87±0.83)天。环孢素组进食较少，皮毛无光泽。各苏木组一般情况逐日好转，进食及活动量逐渐增加。环孢素组与各苏木组移植心存活时间均超过11天。
三.移植心肌组织病理学改变模型对照组心脏肿大，呈花斑状，质硬色暗，心室肌切面可见心脏壁增厚，松弛。4×镜下可见心肌细胞水肿明显，弥漫性大量淋巴细胞浸润；40×镜下可见心肌细胞结构不完整，肌丝断裂，间质大量淋巴细胞及单核细胞浸润，血管炎性病变，大量心肌细胞坏死。
环孢素组心脏表面光滑，色红质软。4×镜下可见心内膜下见有局灶性淋巴细胞浸润，周围无明显水肿。40×镜下可见心肌细胞结构完整，肌丝无断裂，部分心肌横纹模糊。间质少量淋巴细胞及单核细胞浸润，无心肌坏死。
苏木各组心脏表面光滑红润，质地柔软，体积略有增大。4×镜下可见心肌细胞结构轻微改变，有弥漫性淋巴细胞细胞浸润。40×镜下可见部分心肌横纹模糊或消失，间质少量淋巴细胞、单核细胞浸润，个别心肌细胞坏死。各组移植心脏排斥反应病理组织学分级见表3表3移植心脏排斥反应病理组织学分级
注与对照组比较△P＜0.01，与环孢素组比较#P＞0.05。
从表3中可以看出，环孢素组和各苏木组的病理改变情况与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05)，环孢素组与各苏木组相比差异无显著性(P＞0.05)，其中苏木乙酸乙酯组病理片提示排斥反应最轻。
2.各组心肌组织FasL mRNA相对量表达水平(见表4)表4各组心肌组织FasL mRNA相对量表达水平比较
注与对照组比较△P＜0.01从表4中可以看出，环孢素组和各苏木组FasL mRNA相对量表达水平与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05)，环孢素组与各苏木组相比差异无显著性，(P＞0.05)。其中苏木乙酸乙酯组FasL mRNA相对量表达水平较苏木乙醇组、水提组低。
实验结论1.大鼠同种异位心脏移植模型是研究心脏移植急性排斥反应理想的动物模型。
2.苏木乙酸乙酯提取物可延长心脏移植供心的存活时间，对心肌损伤具有一定的保护作用。
3.苏木乙酸乙酯提取物可明显抑制移植心肌中FasL mRNA的表达水平，在某种程度上抑制细胞毒细胞对靶细胞的杀伤进程，具有一定的抗免疫排斥作用。
4.苏木乙酸乙酯提取物可能是一种很有前途的具有免疫抑制作用的新药。
实施例实施例1煎煮法将苏木粗粉，过40目筛，用8倍量的水浸泡4h，连续回流提取，两液合并，将滤液浓缩，每次2h，过滤，将滤液浓缩至相对密度1.00-1.05，用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃，得到乙酸乙酯提取物干粉；实施例2超声振荡提取将苏木粗粉，过40目筛，用8倍量的75％乙醇浸泡2h，连续超声振荡提取两次，＜50℃每次2h，过滤，将滤液合并，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物；取75％乙醇提取物，研磨至细粉，过80目筛，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉；
实施例3渗漉法将苏木粗粉，过40目筛，用75％乙醇连续渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物；取75％乙醇提取物，研磨至细粉，过80目筛，，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉；实施例4苏木粗粉，过80目筛；SFE条件萃取罐温度40℃，萃取压力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取时间2.5h，夹带剂为95％乙醇比例不超过15％。减压干燥。将提取物研磨至细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃，得到乙酸乙酯萃取物干粉。
权利要求
1.一种苏木的乙酸乙酯提取物的制备方法，其特征在于该方法包括下述四种方法(1)煎煮法将苏木粗粉，过40目筛，用8倍量的水浸泡4h，连续回流提取，两液合并，将滤液浓缩，每次2h，过滤，将滤液浓缩至相对密度1.00-1.05，用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃，得到乙酸乙酯提取物干粉。(2)超声振荡提取将苏木粗粉，过40目筛，用8倍量的75％乙醇浸泡2h，连续超声振荡提取两次，＜50℃每次2h，过滤，将滤液合并，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。取75％乙醇提取物，研磨至细粉，过80目筛，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉。(3)渗漉法将苏木粗粉，过40目筛，用75％乙醇连续渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物；取75％乙醇提取物，研磨至细粉，过80目筛，，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉。(4)超临界萃取法苏木粗粉，过80目筛；SFE条件萃取罐温度40℃，萃取压力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取时间2.5h，夹带剂为95％乙醇比例不超过15％。减压干燥。将提取物研磨至细粉(过80目)，水混悬后用乙酸乙酯进行萃取，体积比为乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥至恒重，温度为40℃，得到乙酸乙酯萃取物干粉。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制成的苏木的乙酸乙酯提取物。
3.如权利要求2所述的苏木的乙酸乙酯提取物在制备抗免疫抑制的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种苏木乙酸乙酯提取物，该提取物在抗免疫抑制方面有很好的效果。将中药苏木用乙酸乙酯进行提取，得到其乙酸乙酯提取物，经过大量试验研究证明，该提取物能够显著消除器官移植所产生的免疫排斥反应。
文档编号A61P37/00GK1785227SQ20041004411
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者周亚滨 申请人:周亚滨, 王振月