专利名称：连续无血污染脑脊液的采集方法
技术领域：
本发明属于医学领域里的一种样本采集方法，具体地说是一种连续无血污染脑脊液的采集方法。
背景技术：
在研究脂质体包裹神经生长因子通过血屏降的过程中，为保证研究成果的准确性，对采集的脑脊液样本要求甚高。目前通常采用的采集方法中，脑脊液样本的血污染是一个严重的问题。实现无血污染脑脊液的采集，不仅能够保证中枢神经系统的药物代谢的准确性，同时也是研究其它中枢神经系统疾病的重要条件。通过文献检索，国内外均无关于连续无血污染脑脊液的采集方法的报道，经我们研究，得到了利用家兔进行连续无血污染脑脊液的采集方法，由该方法采集的脑脊液样本完全能够满足医学研究要求，也为临床科研工作提供了一种有效的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、连续无血污染脑脊液的采集方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种连续无血污染脑脊液的采集方法，采用动物兔为采集体，其特征在于包括以下步骤A)由兔耳缘静脉注入麻醉剂，待麻醉兔后，将兔俯卧位固定于兔手术台上，颅顶部剪毛，消毒手术野；为保证麻醉效果，麻醉剂可采用20％乌拉坦，麻醉剂量可为7毫升/千克体重，本发明中也可使用死亡时间不超过5分钟的兔作为采集体。
B)沿兔额顶正中线向枕骨隆突处纵形切开皮肤及皮下组织，直至显露出颅骨，并彻底止血；通常切开深度在0.8厘米左右。
C)固定兔头部，在中线距枕骨隆突0.3厘米～0.8厘米的两旁约0.2厘米～0.4厘米处，避开已暴露骨皮质内的血管作为操作点，以牙科钻斜40°～50°方向向下钻开颅骨，用硬膜外导管沿枕骨大孔方向置管，清亮脑脊液顺管内流出时，用血管钳距颅骨3厘米～8厘米处夹管；在实际操作中，可在中线距枕骨隆突0.5厘米的两旁约0.3厘米处作为操作点，牙科钻倾斜角度可为45°，硬膜外导管沿枕骨大孔方向置入深度为带侧孔端进入约2.0厘米，血管钳距颅骨约5厘米。
D)缝合皮肤及皮下组织，将导管与兔毛一同固定，这样可防止兔头部甩动时导管脱落；需要长时间观察时，可将导管残端烧闭后再缝合固定在皮肤上，防止兔清醒后抓挠脱落。若进行外周静脉给药试验，需在置管后5分钟，待被搓破的毛细血管充分闭合后方可进行给药。
E)用剪刀剪除夹闭处，Eppendorf管收集顺管内流出的脑脊液，待采集量达到后继续夹管固定直至下次采集。每次最大采集量为1.2ml，采集过程中不可轻易调整导管、更不可抽吸脑脊液，以防止颅内血管破裂造成血性脑脊液；若每次采集量大于0.8ml，则不要在短时间内重复采集。
将以上装有脑脊液样本的Eppendorf管编号、置于零下70℃冰箱内备用。
对采用以上方法采集得到的脑脊液样本采用肉眼、显微镜直接观察红细胞计数，利用便隐血胶体金检测试纸进行检测，得到结果是肉眼观察所采脑脊液清亮、无色、透明，显微镜未检出红细胞；脑脊液便隐血胶体金检测结果显示为阴性。具体操作方法如下1、取蒸馏水约0.5ml放入事先标记好的小试管中；2、将脑脊液200ul加入已放入试管的蒸馏水中搅拌；3、取出试纸条以标有MAX标记端插入试管中，1-5分钟内判读结果。5分钟后显示结果无效。
便隐血胶体金检测试纸结果判读标准阳性出现控制线C和反应线T两条红色条带；阴性只出现控制线C一条色带，而无反应线T色带出现；无效控制线C和反应线T均不出现，或只出现反应线T一条色带，应用新条重新测试。
本试验结果显示为只出现控制线C一条色带，而无反应线T)带出现，判定为阴性。
在中枢神经系统疾病的研究中，尤其是考察药物在中枢神经系统的代谢情况时，连续无污染脑脊液的采集至关重要，是保证实验结果具有高度可靠性的重要条件。兔是常用的实验动物之一，它价格便宜，易获得，饲养方便，脑脊液含量较多。由于兔椎间隙狭窄，我们曾采用腰穿、枕骨大孔穿刺、硬膜外置管等方法均不能达到无血污染、连续采集标本的要求。本发明中，利用硬膜外导管由颅顶置入枕大池，让脑脊液自行流出，采集标本量大，可根据时间要求反复采集标本。它的优点是1、硬膜外导管直径略大于颅骨上的钻孔，能够避免板障内的出血渗入脑脊液中；2、而脑膜、脑实质被戳破后也可被其封闭，不至于发生出血；3、脑脊液不需抽吸即可自行流出，避免了抽吸脑脊液的负压引起脑内毛细血管的破裂、出血；4、采集标本量大、易控制、采集时间能够得到保证，少量的采集脑脊液循环能够补充损失量；5、解决了在同一动物体内观察不同时间段脑脊液的成分变化，减少了实验误差；6、避免多次重复操作，降低实验难度。本发明所采集脑脊液经肉眼、显微镜直接观察红细胞计数，利用便隐血胶体金检测试纸检测无红细胞及血红蛋白，满足了无血源性污染脑脊液标本采集的要求。
具体实施例方式
一种本发明所述的连续无血污染脑脊液的采集方法，采用普通级新西兰家兔作为采集体，兔重2.0Kg，雌雄不限，采集前禁食4小时。采集所需材料为兔操作台，7号头皮针，20ml注射器，生理盐水，牙科钻，硬膜外导管，静切包，Eppendorf管，显微镜，便隐血胶体金检测试纸，-70℃冰箱。具体步骤如下A)由兔耳缘静脉注入麻醉剂，麻醉剂采用20％乌拉坦，麻醉剂量为7毫升/千克体重，待麻醉兔后，将兔俯卧位固定于兔手术台上，颅顶部剪毛，消毒手术野；B)沿兔额顶正中线向枕骨隆突处纵形切开皮肤及皮下组织，直至显露出颅骨，通常切开深度在0.8厘米左右，并彻底止血；C)固定兔头部，在中线距枕骨隆突0.5厘米的两旁约0.3厘米处，避开已暴露骨皮质内的血管作为操作点，以牙科钻斜45°方向向下钻开颅骨，用硬膜外导管沿枕骨大孔方向置管，置入深度为带侧孔端进入约2.0厘米，待清亮脑脊液顺管内流出时，用血管钳距颅骨5厘米处夹管；D)缝合皮肤及皮下组织，将导管与兔毛一同固定，这样可防止兔头部甩动时导管脱落；需要长时间观察时，可将导管残端烧闭后再缝合固定在皮肤上，防止兔清醒后抓挠脱落。若进行外周静脉给药试验，需在置管后5分钟，待被搓破的毛细血管充分闭合后方可进行给药。
E)用剪刀剪除夹闭处，Eppendorf管收集顺管内流出的脑脊液，待采集量达到后继续夹管固定直至下次采集。每次最大采集量为1.2ml，采集过程中不可轻易调整导管、更不可抽吸脑脊液，以防止颅内血管破裂造成血性脑脊液；若每次采集量大于0.8ml，则不要在短时间内重复采集。
将以上装有脑脊液样本的Eppendorf管编号、置于零下70℃冰箱内备用。
对采用以上方法采集得到的脑脊液样本进行检测，具体操作方法如下1、采用肉眼、显微镜直接观察脑脊液样本红细胞计数肉眼观察所采脑脊液清亮、无色、透明，显微镜未检出红细胞。
2、利用便隐血胶体金检测试纸检测脑脊液1)取蒸馏水约0.5ml放入事先标记好的小试管中；2)、将脑脊液200ul加入已放入试管的蒸馏水中搅拌；3)、取出试纸条以标有MAX标记端插入试管中，5分钟内判读结果，5分钟后显示结果无效。。
便隐血胶体金检测试纸结果判读标准阳性出现控制线C和反应线T两条红色条带；阴性只出现控制线C一条色带，而无反应线T色带出现；无效控制线C和反应线T均不出现，或只出现反应线T一条色带，应用新条重新测试。
本试验结果2分钟显示为只出现控制线C一条色带，而无反应线T)带出现，判定为阴性。
本发明中，利用硬膜外导管由颅顶置入枕大池，让脑脊液自行流出，采集标本量大并且无外周血污染，可根据时间要求反复采集标本。本发明在中枢神经系统疾病的研究中，尤其是考察药物在中枢神经系统的代谢情况时，具有极大的实用价值和经济价值，为临床科研工作提供了一种有效的方法。
权利要求
1.一种连续无血污染脑脊液的采集方法，采用动物兔为采集体，其特征在于包括以下步骤A)由兔耳缘静脉注入麻醉剂，待麻醉兔后，将兔俯卧位固定于兔手术台上，颅顶部剪毛，消毒手术野；B)沿兔额顶正中线向枕骨隆突处纵形切开皮肤及皮下组织，直至显露出颅骨，并彻底止血；C)固定兔头部，在中线距枕骨隆突0.3厘米～0.8厘米的两旁约0.2厘米～0.4厘米处，避开已暴露骨皮质内的血管作为操作点，以牙科钻斜40°～50°方向向下钻开颅骨，用硬膜外导管沿枕骨大孔方向置管，清亮脑脊液顺管内流出时，用血管钳距颅骨3厘米～8厘米处夹管；D)缝合皮肤及皮下组织，将导管与兔毛一同固定；E)用剪刀剪除夹闭处，Eppendorf管收集顺管内流出的脑脊液，待采集量达到后继续夹管固定直至下次采集，Eppendorf管内即为采得的无血污染脑脊液样本。
2.根据权利要求1所述的连续无血污染脑脊液的采集方法，其特征是在步骤A)中，麻醉剂可采用20％乌拉坦，麻醉剂量可为7毫升/千克体重。
3.根据权利要求1所述的连续无血污染脑脊液的采集方法，其特征是步骤C)中，可在中线距枕骨隆突0.5厘米的两旁约0.3厘米处作为操作点，牙科钻倾斜角度为45°，硬膜外导管沿枕骨大孔方向置入深度为带侧孔端进入2.0厘米，血管钳距颅骨5厘米。
4.根据权利要求1所述的连续无血污染脑脊液的采集方法，其特征是步骤D)中，可将导管残端烧闭后再缝合固定在皮肤上。
5.根据权利要求1所述的连续无血污染脑脊液的采集方法，其特征是步骤E)中，每次最大采集量为1.2毫升。
6.根据权利要求6所述的连续无血污染脑脊液的采集方法，其特征是采集过程中不可轻易调整导管、更不可抽吸脑脊液。
全文摘要
一种连续无血污染脑脊液的采集方法，采用动物兔为采集体，将兔麻醉后，沿额顶正中线向枕骨隆突处切开皮肤及皮下组织，直至显露出颅骨，利用硬膜外导管由颅顶置入枕大池，缝合皮肤及皮下组织，将导管固定，让脑脊液自行流出，本发明采集标本量大，可根据时间要求反复采集标本，操作简单、易控制，得到的样本满足了无血源性污染脑脊液标本的要求，在中枢神经系统疾病的研究中，具有极大的实用价值和经济价值。
文档编号A61B17/00GK1582856SQ20041004484
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月31日 优先权日2004年5月31日
发明者曹晓建, 刘军, 吕天润, 陈骐, 张宁, 金正帅, 李法卿, 李素芹, 姚乐申 申请人:南京医科大学