专利名称：颅内动脉瘤液体栓塞剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种颅内动脉瘤液体栓塞剂及其制备方法。
二，背景技术颅内动脉瘤是神经外科常见疾病，死亡的主要原因为出血及早期并发症[Hop JW等人，“Stroke”，第28卷，第660-664页(1997年)]。以往治疗的唯一方法是采用外科开颅手术夹闭动脉瘤。然而外科开颅手术的缺点十分明显1，可接受手术患者比例有限或因年龄、健康不适合者，或多次SAH、HH分级偏高者，或有血管痉挛者，手术风险都极大；2，外科手术夹闭具有很大的盲区对于后循环或巨大动脉瘤等难以接近或完全无法进行夹闭；3，外科手术康复慢，复发率高，给患者带来痛苦大。而近二十年来，随着血管内介入治疗的日趋成熟，越来越多的医师开始选择这种低风险，微创伤，并有效弥补手术治疗盲区的新方法。至1992年为止，在欧洲国家80％的动脉瘤都已经不需要采用开颅手术而仅用介入栓塞治疗[Vinuela等人，“Interventional Neuroradiology”，第63-75页(1992年)]。
已经被用作介入治疗的基本方法主要有三种可脱卸球囊，电解可脱卸弹簧圈(GDC)，和液体栓塞剂。最早被起用的球囊可以对一些难以手术夹闭的动脉瘤进行栓塞，但其缺陷也很明显1，不能针对瘤形状进行栓塞，易导致动脉瘤破裂；2，球囊易回缩，其内必须充填硅胶液或固化剂(HEMO)；3，球囊及输送导管柔韧性差，难以操作。而目前已得到国内外临床应用的GDC则具有两个较大的技术性限制1，GDC压缩与动脉瘤复发，并可引起脑实质或颅神经的压迫症状，这在宽颈和大或巨大动脉瘤中更常出现；2，GDC金属材料具有生物学惰性，瘤内血栓不易形成[张鑫等人，“介入放射学杂志”，第12卷第3期，第233-235页(2003年)]。液体栓塞剂的治疗原理是通过进入瘤腔与瘤腔的血液接触，溶剂迅速弥散，栓塞物质在很短时间内凝聚成固体栓塞动脉瘤。相比起以上两种方法，液体栓塞剂拥有易流动，易控制，生物相容性好等许多不可替代的优势，合适液体栓塞材料的开发成为了介入放射学的前沿课题。
一种理想的液体栓塞剂应具备以下条件1，良好的生物相容性；2，能产生有效的血管栓塞并诱发血栓形成；3，无毒、无致畸、致癌作用；4，低浓度，低粘度，易控制，易通过不同规格的导管；5，在X线下可显影；6，进入瘤腔后不向远端漂移。近年来实验及临床使用的血管内液体栓塞材料品种繁多，报道较多的是氰基丙烯酸正丁酯(NBCA)、醋酸纤维素聚合物(cellulose acetate polymer，CAP)、聚丙烯氰(polyacrylonitrile，PAN)、乙烯和乙烯醇聚合物EVAL(ethylene vinyl copolymer)及EVOH(ethylene vinyl alcoholcopolymer)几种。这些材料的应用缺点也很明显如NBCA具有粘附性，易使微导管与血管粘连，每次栓塞病灶量少等缺点；传统的CAP溶液没有很好的解决控制瘤腔内远端漂移的技术难题。目前最为成熟的液体栓塞剂ONYX，则是以次乙烯醇异分子聚合物(EVOH)、二甲亚砜溶剂和微粒化钽粉三者组成的混合物。它有较强的聚合性，且基本不粘连导管，在国内外均有栓塞成功的病例报道。但ONYX本身同样存在无法控制瘤腔内远端漂移的问题，在已经临床应用的进口产品中，则是采用了在动脉瘤颈口的载瘤动脉放置封堵球囊来解决，这样既加大了成本，又在体内引入了新的异物。此外，ONYX不能应用于无法用球囊封闭的动脉瘤，而对于非常宽颈的动脉瘤时还要首先在瘤颈处放置支架治疗，然后再放置球囊封堵瘤颈后注射，这都大大限制了该液体栓塞剂的应用范围。[宋冬雷等人，“中国临床神经科学”，第11卷4期，第383-386页(2003年)]。
三，发明内容本发明所要解决的技术问题是公开一种用于颅内动脉瘤介入治疗的液体栓塞剂，它包含有效栓塞成分为天然药物白芨的多糖提取物与二醋酸纤维素聚合物，显影成分为碘海醇，溶剂成分为二甲亚砜。
本发明涉及液体栓塞剂的制备方法。
本发明还涉及液体栓塞剂中显影成分的处理方法。
有效栓塞成分之一的天然药物白芨的多糖提取物来自兰科植物白芨块茎。有关研究表明，白芨多糖具有促进凝血与血栓形成，促进血管内皮生长，血管与消化道溃疡愈合等作用。
本发明中两种有效栓塞成分以混合物形式溶解于有机溶剂二甲亚砜中。
显影成分碘海醇是对商品碘海醇注射液进行处理后得到。处理方法有两种，一种是对商品碘海醇注射液进行冷冻干燥；另一种是对商品碘海醇注射液采用减压蒸馏的方式浓缩。
本发明的液体栓塞剂的配制，包括以下步骤1，白芨多糖纯品制备取天然药物白芨，进行多糖组分初步抽提，并经过除蛋白，离子交换层析与凝胶过滤层析得到白芨多糖提取物纯品；2，显影成分制备将商品碘海醇注射液冻干，得碘海醇白色固体粉末；3，液体栓塞剂配制称取配比范围内的白芨多糖提取物与二醋酸纤维素，加热条件下溶解于有机溶剂二甲亚砜，冷却后加入显影成分，溶解后冷藏备用。
本发明的成分优点是十分显著的白芨多糖在栓塞剂里，一方面利用本身的粘性起到了栓塞作用；另一方面由于具备促凝血的生物特性，加速了血栓的形成；此外白芨多糖还具备促进血管内皮细胞生长的功能，一举多得。二醋酸纤维素聚合物作为经典的液体栓塞材料，具有良好的栓塞效果。显影成分经过处理后去除了商品碘海醇注射液里的水，避免了水对栓塞剂稳定性的破坏。
本发明所采取的配比是发明人进行大量实验摸索总结得出的，各组分用量为在每16毫升二甲亚砜中，含天然药物白芨的多糖提取物0.1-0.3克与二醋酸纤维素聚合物0.5-0.7克，及造影剂液态碘海醇4毫升或固态碘海醇2.0-2.5克。
优选在30℃-40℃下实施本发明。
本发明通过对栓塞条件的摸索，一方面，很好地解决了在无需球囊、支架等辅助材料情况下阻止远端漂移，并在瘤腔范围内形成有效栓塞与诱发血栓形成的技术难题；另一方面，栓塞成分中的天然药物多糖提取物，具有极好的生物相容性和促血栓形成的作用。本发明满足一款理想的液体栓塞剂应当具备的条件，达到了更好的栓塞效果和更高的安全性。
四，
图1(a)为白芨多糖半纯品经凝胶过滤层析得单一洗脱糖峰。
图1(b)为白芨多糖纯品红外光谱图。
图2为DSA监视下的体外模型动脉瘤充盈液体的照片。
图3为DSA监视下对体外模型动脉瘤进行插管栓塞。
图4(a)和图4(b)为体外栓塞结束后动脉瘤模型的外观。
图5(a)和图5(b)为DSA监视下动物模型动脉瘤的照片。
图6为对动物模型动脉瘤插管到位准备进行栓塞的X光照片。
图7为对动物模型动脉瘤进行栓塞时的X光照片。
图8(a)和图8(b)为对动物模型动脉瘤栓塞结束退出导管，瘤腔栓塞充分，载瘤动脉畅通的X光照片。
五，具体实施方式
1液体栓塞剂的制备取市售中药白芨，充分碾碎后水煮3小时，沸腾8-10次，三层纱布过滤取滤液，加入两倍体积无水乙醇，沉淀过夜；离心弃去上清，反复三次后取沉淀抽滤，溶于双蒸水，Sevag法沉淀蛋白杂质[Staub等人，“Carbohydr Chem”，第5卷第5页(1965年)]，反复多次至考马斯亮蓝法检测无蛋白；无水乙醚萃取，取水相冻干得白芨多糖粗品；粗品经DE-52离子交换柱(Whatman产品)层析，蒽酮-硫酸法检测得单一洗脱峰，冻干得白芨多糖半纯品；半纯品经Sephadex G-200凝胶过滤柱(Pharmacia产品)层析，蒽酮-硫酸法检测得单一洗脱峰，见图1(a)。冻干得白芨多糖纯品，红外光谱检测多糖组成为葡萄糖与甘露糖，见图1(b)。
将商品碘海醇注射液冻干，得碘海醇白色固体粉末。在无菌操作条件下，称取白芨多糖纯品与二醋酸纤维素，水浴加热并保持在55℃-65℃下，磁力搅拌使之完全溶解于有机溶剂二甲亚砜。冷却至室温，加入显影成分碘海醇，再次搅拌，至透明均一溶液完全形成。由于液体栓塞剂的栓塞原理是接触水相后，二甲亚砜迅速弥散，有效栓塞物质在很短时间内凝聚成固体，因此操作的整个过程避免栓塞剂与水或水相溶液接触。
液体栓塞剂配制完毕后冷藏于4℃冰箱，使用前37℃水浴加热10-15分钟。
2液体栓塞剂的体外模型实验(一)体外模型由三部分组成颅内载瘤动脉，动脉瘤与心脏。载瘤动脉由内径为3mm的硅胶管模拟，动脉瘤由4mm的硅胶管所制球型腔体模拟，心脏的泵血功能由水泵模拟，“血管”内血液由生理盐水模拟。载瘤动脉与动脉瘤嵌在薄木板上刻出的曲形沟槽内。
体外模型的搭建方法为首先剪取1.6cm长的内径为4mm的硅胶管，用内径5mm的钢珠烧热后放入使之膨胀，冷却后将钢珠从小段硅胶管的一头取出，再将另一头封口，成为瘤腔；在内径为3mm的硅胶管上剪一小口，将瘤腔开口与之吻合粘连，但要留出导管入口。数分钟后在管内通水检漏。水泵提供管内生理盐水保持流动的压力，要求流速在280ml/min到320ml/min。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，二醋酸纤维素1.1克，不加白芨多糖提取物。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，注射液体栓塞剂，最初0.2-0.5ml栓塞剂可顺利通过导管，之后推动缓慢，栓塞剂胶流动性不佳，有粘连导管的现象。继续推动栓塞剂，在其接触“血液”10-15秒后发生导管堵塞。
3液体栓塞剂的体外模型实验(二)体外模型构建同实施例2。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，二醋酸纤维素0.4克，不加白芨多糖提取物。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，注射液体栓塞剂，可推动性与流动性佳，在其接触“血液”后立即固化，被“血流”冲走而发生远端漂移现象。
4液体栓塞剂的体外模型实验(三)体外模型构建同实施例2。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，白芨多糖提取物0.3克，不加二醋酸纤维素。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，注射液体栓塞剂，可推动性与流动性佳，但在其接触“血液”后不发生固化，立刻被“血流”冲走而发生远端漂移现象。
5液体栓塞剂的体外模型实验(四)体外模型构建同实施例2。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，白芨多糖提取物0.7克，不加二醋酸纤维素。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，注射液体栓塞剂，可推动性与流动性佳，但在其接触“血液”后不发生固化，立刻被“血流”冲走而发生远端漂移现象。
6液体栓塞剂的体外模型实验(五)体外模型构建同实施例2。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，二醋酸纤维素纯品0.4克，白芨多糖提取物0.1克。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，注射液体栓塞剂，可推动性与流动性佳，但在其接触“血液”后立即发生固化，3-5s后被“血流”冲走而发生远端漂移现象。
7液体栓塞剂的体外模型实验(六)体外模型构建同实施例2。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，二醋酸纤维素纯品0.8克，白芨多糖提取物0.3克。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，注射液体栓塞剂，最初推动缓慢，栓塞剂胶流动性不佳，粘连导管的现象明显。很快发生导管堵塞。
8液体栓塞剂的体外模型实验(七)体外模型构建同实施例2。
按照实施例1所述方法配制液体栓塞剂，各组分用量为每16毫升二甲亚砜中含碘海醇白色固体粉末2.4克，二醋酸纤维素纯品0.6克，白芨多糖提取物0.1克。
在体外模型中进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，“血流”充盈“瘤腔”。注射液体栓塞剂，栓塞剂胶可推动性与流动性佳，接触“血液”后于40s-50s时间内完全变白。
打开DSA数字减影造影监视，进行体外栓塞实验。将1.5F导管插入瘤腔，开启水流，测试速度为300ml/min，“血流”充盈“瘤腔”，见图2。开始注射液体栓塞剂，显影效果清晰，栓塞剂胶可推动性与流动性佳，接触“血液”后于17s-24s时间内完全变白。见图3。
总共栓塞二十例动脉瘤模型，每一例都在栓塞80％腔体后选择退出微导管，退出过程迅速，均未发生导管口粘连、栓塞剂载瘤动脉远端漂移或栓塞剂溢出至血管内的现象。栓塞完毕后关闭造影监视，观察“瘤腔”充盈白色胶体，触摸硬度适中，“瘤腔”口无丝状残留，见图4(a)和图4(b)。此结果表明，体外模型中本发明的栓塞效果是理想的。
9液体栓塞剂的动物体内血管瘤模型实验实验动物选取成年健康家兔两只，体重分别为2.6，3.0kg，均为雄性。
方法采用静脉移植法构建动物血管瘤模型，步骤如下取禁食6小时的家兔，耳缘静脉注射1％的戊巴比妥(25mg/kg)使其全麻，采用自甲状软骨下缘到胸骨上缘的正中切口，显露左侧颈总静脉，分离并截取一段1-2cm的静脉，浸泡于肝素盐水中备用。正中切开颈阔肌，显露并分离两侧颈总动脉约3-4cm。左侧颈总动脉远端以临时阻断夹阻断，近端结扎后切断。在气管后方形成隧道，将左侧颈总动脉的近端的断端通过隧道置于右侧。右侧颈总动脉近端和远端暂时阻断。放置手术显微镜，以无创缝合针线进行血管重建，进一步将静脉袋吻合成直径约7-9mm，瘤颈约4-6mm的顶端动脉瘤和侧方动脉瘤两种不同类型的动脉瘤模型。5-7天后进行造影评价。两只兔共形成动脉瘤4个，其中顶端动脉瘤与侧方动脉瘤各两个，均形成良好。
为探索体内适用配方的最大范围，按照实施例6方案配制栓塞剂。
栓塞手术前家兔禁食6小时，用氯胺酮15mg/ml和阿托品0.04mg/ml作为全麻前用药，动物仰卧固定于手术台，耳缘静脉滴注1％的戊巴比妥(25mg/kg)保持全麻。进行造影，再次观察动脉瘤模型，情况良好。一侧腹股沟剪毛，消毒，分离皮下组织和肌肉后，暴露分离股动脉，穿刺股动脉前壁，将导丝与导管送入血管腔内。再次进行造影监视，将导丝导管沿动脉血管送至颈总动脉，寻找模型瘤腔入口并进入。拔出导丝，将微导管口稳定在瘤腔靠里3/4位置。开始以每分钟0.2ml/min的推进速度注射液体栓塞剂。其中一只的顶端动脉瘤与侧方动脉瘤在栓塞剂进入瘤腔后4-5秒钟后，均发生栓塞胶被血流带出瘤腔口并随血流冲走的远端飘溢现象，不宜继续注射；另一只动物的侧方动脉瘤也发生类似现象，但顶端动脉瘤栓塞良好，待瘤腔栓塞80％后选择退出微导管，瘤腔开口处无残留。随后结扎，缝合。缝合完毕对后一只动物作影象观察，发现其顶端动脉瘤仍然存在，其内充盈血液，并没有栓塞胶存在。推测在微导管退出后，注射的胶也发生被血流冲走的现象。
10液体栓塞剂的动物体内血管瘤模型实验实验动物；选取成年健康家兔12只，体重2.5-3.5kg，均为雄性。随机分为甲，乙，丙三组，每组均为4只，分别对应为栓塞后24小时，栓塞后1周与栓塞后2周。
方法按照实施例9的方法构建血管瘤模型，12只兔共形成动脉瘤30个，其中顶端动脉瘤11个，侧方动脉瘤19个，均形成良好。
按照实施例8方案配制栓塞剂。
栓塞手术前家兔禁食6小时，用氯胺酮15mg/ml和阿托品0.04mg/ml作为全麻前用药，动物仰卧固定于手术台，耳缘静脉滴注1％的戊巴比妥(25mg/kg)保持全麻。进行造影，再次观察血管瘤模型，情况良好。见图5(a)和图5(b)。一侧腹股沟剪毛，消毒，分离皮下组织和肌肉后，暴露分离股动脉，穿刺股动脉前壁，将导丝与导管送入血管腔内。再次进行造影监视，将导丝导管沿动脉血管送至颈总动脉，寻找模型瘤腔入口并进入。拔出导丝，将微导管口稳定在瘤腔靠里3/4位置，见图6。开始以每分钟0.2ml/min的推进速度注射液体栓塞剂，见图7。待瘤腔栓塞80％后选择退出微导管，瘤腔开口处无残留，见图8(a)和图8(b)。随后结扎，缝合，归笼饲养。
结果
1，动物一般情况无异常改变。
2，影象学观察X光片显示，所有家兔颈动脉瘤腔模型均被完全闭塞，瘤腔开口处未见丝状残留，载瘤动脉远端未见栓塞剂漂移。
3，大体标本观察所有瘤腔均被固体物质牢固填塞，呈乳白色，略带淡黄色。甲组见栓塞剂表面光滑，占据瘤腔体积80％以上，接近瘤腔开口处有血栓形成，硬度比海绵较硬；乙组见栓塞剂与瘤腔结合紧密，占据瘤腔体积90％或充满整个瘤腔，硬度明显增大；丙组见栓塞剂充满整个瘤腔，无间隙，栓塞剂硬度高，瘤腔开口端血栓形成情况明显，但完全没有凸出到载瘤动脉。
4，病理观察光镜下甲组见栓塞剂与瘤腔内部融合良好，与瘤腔颈部之间还有空隙，其内有血栓；乙组栓塞剂与瘤腔内部融合紧密，与瘤腔颈部仅有局部小空隙，并被血栓充满，血栓中可见棱形细胞，同时可见萎缩的内皮细胞；丙组见栓塞剂与瘤腔完全融合，瘤腔颈部可见内皮细胞不连续，有少量炎性细胞浸润，且有胶原纤维细胞。载瘤动脉周围组织无炎性细胞浸润。
结果表明，本发明的液体栓塞剂对于动物体内血管瘤模型栓塞完全，未出现栓塞剂的远端漂移或血管内残留，瘤颈处血栓形成良好，动物无一例死亡或出现异常。液体栓塞剂的动物体内试验安全而有效。
权利要求
1，一种颅内动脉瘤液体栓塞剂，其特征是由天然药物白芨的多糖提取物与二醋酸纤维素聚合物按一定比例混合而成，显影成分为碘海醇，溶剂成分为二甲亚砜。
2，一种权利要求1所述颅内动脉瘤栓塞剂的制备方法，其特征是按以下步骤进行(1)白芨多糖纯品制备取天然药物白芨，进行多糖组分初步抽提，并经过除蛋白，离子交换层析与凝胶过滤层析得到白芨多糖提取物纯品；(2)显影成分制备将商品碘海醇注射液冻干，得碘海醇白色固体粉末；(3)液体栓塞剂配制称取配比范围内的白芨多糖提取物与二醋酸纤维素，加热条件下溶解于有机溶剂二甲亚砜，冷却后加入显影成分，溶解后冷藏备用。
3，一种权利要求2所述白芨多糖提取物的制备方法，其特征是按以下步骤进行取市售中药白芨，充分碾碎后水煮3小时，沸腾8-10次，三层纱布过滤取滤液，加入两倍体积无水乙醇，沉淀过夜；离心弃去上清，反复三次后取沉淀抽滤，溶于双蒸水，Sevag法沉淀蛋白杂质，反复多次至考马斯亮蓝法检测无蛋白；无水乙醚萃取，取水相冻干得白芨多糖粗品；粗品经DE-52离子交换柱(Whatman产品)层析，蒽酮—硫酸法检测得单一洗脱峰，冻干得白芨多糖半纯品；半纯品经Sephadex G-200凝胶过滤柱(Pharmacia产品)层析，蒽酮—硫酸法检测得单一洗脱峰；冻干得白芨多糖纯品备用。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种颅内动脉瘤液体栓塞剂，其特征是由天然药物白芨的多糖提取物与二醋酸纤维素聚合物按一定比例混合而成，显影成分为碘海醇，溶剂成分为有机溶剂二甲亚砜。本发明还涉及该液体栓塞剂的制备方法，其特征是包含白芨多糖纯品制备，显影成分制备与液体栓塞剂配制三个步骤。该液体栓塞剂用于颅内动脉瘤的介入治疗，解决了在无需球囊、支架等辅助材料情况下阻止远端漂移的技术难题，同时具有优良的生物相容性和促血栓形成作用，达到了更好的栓塞效果和更高的安全性。
文档编号A61P35/00GK1634119SQ20041006573
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月16日 优先权日2004年11月16日
发明者孙剑涛, 张峻峰, 王春明, 罗熠 申请人:南京大学, 南京大学医学院附属鼓楼医院