专利名称：神经节苷脂GD1b的抗神经细胞凋亡作用及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人体内源性化合物的抗神经细胞调亡作用，更具体地，涉及神经节苷脂GD1b的抗神经细胞调亡作用。另外，本发明还涉及神经节苷脂GD1b在制备预防和治疗神经退行性疾病的抗神经细胞调亡药物中的应用，以及在制备预防和治疗钾离子通道病的药物中的应用。
背景技术：
神经退行性疾病是指人体的神经元发生退行性变化而引起的一系列病症，多发生在老年人群中，包括帕金森氏病(Parkinson’s disease.PD)、老年痴呆(Alzheimer’s disease，AD)、亨廷顿氏病(Huntingtondisease，HD)等疾病。现有的神经退行性疾病机制研究主要集中于胆碱能系统的功能损害，但这种损害很可能是神经元损伤或死亡的结果，而不是起因，现有的治疗方法也均仅为对症治疗。
神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)是维持和促进神经细胞正常生存、生长和分化，在神经损伤情况下促进其再生的一类特定多肽或蛋白质。包括神经生长因子、脑源性神经生长因子等分子成为当前预防和治疗一些神经退行性疾病的一个热点。然而这类分子均为大分子蛋白，不能通过血脑屏障，不宜外周给药。当然也有一些专利介绍一些有机小分子用来治疗这类疾病，例如雷公腾属提取物(中国专利申请号0010779.1)、麦芽酚(中国专利申请号02118497.6)和吡唑并蒽酮类化合物(中国专利申请号02114748.5)等。但是这些化合物是植物提取物或经过化学合成而得到的，均会对人体有不良的毒副作用。
愈来愈多的证据表明神经细胞凋亡在许多病理性神经细胞死亡引起的Alzheimer’s、Parkinson’s、Huntington’s等神经退化性疾病的进展中发挥重要作用(Pettmann 1998，Neuron 20，633-47；Mattson 2000，Nat Rev Mol Cell Biol.1，120-9)。在很多类型的细胞中，细胞凋亡时在细胞形态发生很多变化，如细胞体积缩小、核的浓缩以及细胞膜连接的碎片。其中细胞体积缩小是其凋亡的一个早期现象。大量研究已证明细胞体积缩小是由胞内钾离子通过钾离子通道的外流引起的，提高细胞外的钾离子浓度可以阻止这种离子的外流导致细胞死亡而引起的凋亡(Hughes和Cidlowski，1999，Adv Enzyme Regul 39，157-171)。虽然钾通道异常活性带来的损害发现时间不长，但已经逐渐被越来越多的人认识，并且逐渐有更多的研究显示它与神经元的损伤、凋亡甚至脑萎缩相关。钾离子通道病(ion channel disease)是因钾离子通道功能异常而引起的一组疾病，主要侵及神经和肌肉系统，心脏和肾脏等器官也可受累。
神经节苷脂是存在人体内的鞘脂类化合物家族中含有唾液酸基的一类膜质分子。它们可以形成一种特殊的结构，介导细胞与细胞，细胞与下游效应器之间的相互作用，调节细胞内的蛋白和受体的行为，参与信号传导的过程(Hakomori(2003)Curr Opin Hematol.10，16-24；Miljan和Bremer(2002)Sci STKE.160，RE15)。对于神经系统来说，这类分子的功能包括神经元的生长，细胞营养和保护作用；也就是说神经节苷脂对中枢和外周神经系统的受体的功能，支持系统以及信号传递机制均产生影响(Ledeen和Wu(1992)Trends Glycosci.Glycotech.4.174-187；Misasi等人(1997)Diabetes Metab Rev. 13，163-79)。神经节苷脂类分子包括结构类似的GM1，GM2，GM3，GD1b(双唾液酰神经节苷脂-GM1，单唾液酰神经节苷脂-GM2，单唾液酰神经节苷脂-GM3和单唾液酰神经节苷脂-GD1b)等。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人通过深入的研究发现人体内源性物质-神经节苷脂GD1b(式1)可以通过抑制神经细胞钾离子通道活性抗神经细胞调亡。
式1因此，本发明的目的是提供神经节苷脂GD1b在抗神经细胞调亡中的应用。
本发明另一目的是提供神经节苷脂GD1b在制备预防和治疗神经退行性疾病的抗神经细胞调亡药物中的应用。所述神经退行性疾病包括帕金森氏病、老年痴呆、亨廷顿氏病等。
本发明还有一个目的是提供神经节苷脂GD1b在制备预防和治疗钾离子通道病的药物中的应用。
实验证明，与现有的抗调亡剂相比神经节苷脂GD1b能够以明显较小的量达到相当的抗调亡效果。因此神经节苷脂GD1b是一种新的更有效的调亡抑制剂，并且在制备预防或治疗神经退行性疾病和钾离子通道病的药物中具有潜在应用。由于神经节苷脂是人体内存在的膜脂类分子的一种，因此用这类分子作为药物的毒副作用无疑将会很小。
附图简述
图1.不同神经节苷脂类分子对海马神经细胞钾通道电流的影响。
图2.神经节苷脂GD1b的抗凋亡作用。(A)神经细胞培养基中不加任何凋亡剂和保护剂时海马神经细胞的照片；(B)神经细胞培养基中加入0.3μM STS培养24小时时海马神经细胞的照片；(C)神经细胞培养基中加入TEA(四乙胺，5.0mM)和0.3μM STS培养24小时海马神经细胞的照片；(D)神经细胞培养基中加入10μM GD1b和0.3μM STS培养24小时海马神经细胞的照片。
图3.神经节苷脂GD1b和TEA对海马神经细胞的抗凋亡作用的统计学比较。
具体实施例方式
下面结合实施例详细描述本发明。
1. 实验材料1)实验动物24小时以内的新生SD(Sprague-Dawley)大鼠，由中国科学院遗传与发育研究所和北京维通利华实验动物技术有限公司提供；2)实验试剂胎牛血清购自美国HyClone公司，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)(高糖)及胰蛋白酶，NeurobasalTM-A培养基、B-27添加剂购自美国Gibco公司，多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、L-谷氨酰胺以及GM1、GM2、GM3和GD1b等神经节苷脂均购自Sigma公司(G7641，G8397，G5642，G8146)，其余试剂均为国产分析纯。
3)实验仪器Double patch clamp(双探头膜片钳)EPC10 HEKA公司膜片钳Cole Parmer CPX-600超声仪，List medical electronic D-1600Darmstadt-13，L/M-3P-A电极拉制仪；List-medical electronic D-64242 ID03 L/M-CPZ101 ZEISS电极抛光仪Axiovert 135 ZEISS(德国)倒置荧光显微镜VS-1300-U洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。
2.实验方法1)海马神经细胞的培养神经细胞的分离与培养是根据文献的无血清培养方法(Brewer等，1993，J Neurosci Res.35，567-76)。首先冰浴出生24小时内的SD大鼠3分钟，75％酒精浸泡3分钟后，断头取脑，随后反相铺置于冰盒的培养皿和滤纸上分离海马组织。用无血清的DMEM培养液浸泡分离出的组织，将组织吸出，加入适量的0.25％胰蛋白酶，37℃温浴7分钟，然后以冰冷的DMEM培养液(含10％胎牛血清)终止消化作用，再加入DMEM培养液(含10％胎牛血清)，用吸管轻轻吹打使细胞分散，经300目筛网过滤。台盼蓝染色观察细胞存活率，并将细胞悬液调至1×105个细胞/mL。用吸管将含有细胞的培养基缓慢加入预先铺有多聚赖氨酸的(37℃过夜)玻璃片上，于37℃，5％CO2培养箱中培养，7小时后换成NeurobasalTM-A培养基、B-27添加剂和L-谷氨酰胺的培养液，隔日换成NeurobasalTM-A培养基、B-27添加剂，以后用NeurobasalTM-A培养基、B-27添加剂培养细胞，待7日后细胞长出轴突即可用于实验。
2)膜片钳的实验操作钾通道全细胞的膜片钳实验是根据文献(Hamill OP，Marty A，NeherE，Sakmann B，Sigworth FJ.Improved patch-clamp techniques forhigh-resolution current recording from cells and cell-freemembrane patches.Pflugers Arch.1981 Aug；391(2)85-100)，使用EPC-10HEKA公司的产品操作的。使用List medical electronic D-1600Darmstadt-13，L/M-3P-A电极拉制仪将K-Series Borosilicate GlassCapillaries(World Precision Instruments)拉成两个电极，随后使用List-medical electronic D-64242电极抛光仪进行热抛光得到电极。电极内液为KCl 140mM，MgCl22mM，CaCl22mM，EGTA 1mM，Na2ATP2mM，Hepes 10mM，用KOH调pH为7.2-7.4，电极外液为NaCl 140mM，KCl 5mM，MgCl22mM，CaCl22mM，Hepes 10mM，葡萄糖10mM，用NaOH调pH为7.2-7.4，电极进入细胞外液时电阻约为4-10MΩ。在实验过程中，控制电压[Holding potential(HP)]-120mV，扫描时间为200ms，控制电压为从-90～70mV(每20mV递增)，检测神经细胞的钾离子通道电流的I-V曲线。所有的实验是在室温下进行的。
3)神经细胞凋亡的检测方法神经细胞的凋亡是用Staurosporine(Sigma S4400，在DMSO中1mM)1μM溶于细胞培养基中来诱导，本文采用两种检测方法来观看神经细胞凋亡后细胞核的变化(Platoshyn等，(2002)，Am J Physiol Cell Physiol.283，C1298-305)。
A)DAPI染色法细胞用多聚赖氨酸固定于玻璃片上，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗一次，随后用95％的乙醇固定5分钟，用一种能够穿透细胞膜的荧光试剂DAPI(4’，6-diamidinophenylindole)(美国Roche公司)(贮液1mM，H2O)染色，DAPI(5μM)溶于PBS中，三分钟后即可用荧光显微镜观看，用激发波长340/380nm的光源，在显微镜下可以看到发射波长为460nm的蓝色光。
B)TUNEL方法吸走培养基加入固定液(4％的多聚甲醛于PBS中，pH7.4)于15-25℃放置一小时，用PBS洗玻璃片上细胞，加入0.1％Triton X-100(溶于0.1％柠檬酸钠溶液)冰浴2分钟(2-8℃)穿破细胞膜，用PBS洗两次，吸走溶液，加入适量TUNEL反应液(Roche公司产品)于样品上，盖上盖玻片，样品放入细胞培养箱孵育60分钟，37℃避光，取出玻璃片，用PBS洗三次，放在荧光显微镜下察看，激发波长为450-500nm(例如488nm)，检测波长为515-565nm(绿色)。
实施例1 神经节苷脂类化合物对海马神经元细胞钾离子通道活性的影响我们首先探索了一些神经节苷脂类化合物对海马神经元细胞钾离子通道电流的影响。本文通过全细胞的实验来研究了一些神经节苷脂类分子对钾通道的电流的影响；依据实验材料和方法所述获得海马神经细胞，我们采用的对海马神经元细胞的刺激电压是从-90到+70mV，待形成全细胞之后稳定电流10-15分钟，向细胞外液中分别加入神经节苷脂类分子GM1、GM2、GM3，发现神经节苷脂GM1、GM2、GM3在相同的浓度时(10μM)对神经细胞的钾离子通道电流的I-V曲线无明显的影响；在相同电压刺激情况下(最大电压刺激时，如图1所示)，加药前后通道的最大电流也无明显变化。然而，尽管分子结构与神经节苷脂GM1、GM2、GM3类似，神经节苷脂GD1b却有明显的钾离子通道活性抑制作用。它对海马神经细胞钾离子通道电流的抑制作用具有一定的浓度依赖性(数据未显示)，在10μM时的抑制作用可以达到30％左右。结果显示，本发明的神经节苷脂GD1b能够有效调节细胞钾离子通道活性，在制备预防和治疗钾离子通道病的药物方面具有重要应用前景。
实施例2 神经节苷脂GD1b对由Staurosporine(STS)引起神经细胞凋亡的保护作用本实施例研究了神经节苷脂类化合物GD1b对神经细胞凋亡的保护作用。在本实验中，依据上述材料和方法所述获得海马神经细胞，以0.3μMSTS来诱导神经细胞凋亡，在加入凋亡剂之前30分钟先分别加入10μMGD1b于细胞培养基中，同时分别以细胞培养基中没有加入相关神经节苷脂类化合物和加入5mM的常规细胞调亡抑制剂TEA分别作空白对照和阳性对照，通过使用DAPI染色方法的照片显示，我们发现加入GD1b一组的神经细胞核要明显比没有加入GD1b的一组的状态要好一些，凋亡小体的数目也要少一些(图2)，表明神经节苷脂GD1b对STS诱导的神经细胞的凋亡具有明显的保护作用。对调亡细胞作统计学计数分析，如图3所示，在0.3μM的STS浓度诱导细胞调亡下，10μM的微摩尔级GD1b即能达到与5mM的毫摩尔级TEA接近的抗神经细胞调亡效果，而在1.0μM更高浓度的STS诱导神经细胞调亡下，10μM的微摩尔级GD1b的抗调亡效果更要优于5mM的毫摩尔级TEA。
综上所述，GD1b是一种新的高效神经细胞调亡抑制剂，其通过抑制钾离子通道活性来抗神经细胞调亡，因此在制备预防或治疗神经退行性疾病的药物中具有潜在应用。另外，GD1b可以调节细胞钾离子通道活性，由此在制备预防和治疗钾离子通道病的药物方面具有重要应用。由于GD1b本身是人体内源物质，因此其不会引起人体不良毒副作用。
权利要求
1.神经节苷脂GD1b在抗神经细胞调亡中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中所述神经节苷脂GD1b通过抑制神经细胞钾离子通道活性来抗神经细胞调亡。
3.神经节苷脂GD1b在制备预防和治疗神经退行性疾病的抗神经细胞调亡药物中的应用。
4.根据权利要求3的应用，其中所述神经节苷脂GD1b通过抑制神经细胞钾离子通道活性来抗神经细胞调亡。
5.根据权利要求3或4的应用，其中所述神经退行性疾病包括帕金森氏病、老年痴呆、亨廷顿氏病。
6.神经节苷脂GD1b在制备预防和治疗钾离子通道病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种人体内源性化合物的抗神经细胞调亡作用，更具体地，涉及调节钾离子通道活性的神经节苷脂GD1b的抗神经细胞调亡作用。另外，本发明还涉及神经节苷脂GD1b在制备预防和治疗神经退行性疾病的抗神经细胞调亡药物中的应用，以及在制备预防和治疗钾离子通道病的药物中的重要应用。
文档编号A61P25/14GK1634090SQ20041008851
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者戚智, 陈雪松, 池少鹏, 杨微, 刘明娜, 卫涛涛, 杨福愉 申请人:中国科学院生物物理研究所