专利名称：一种Ⅱ型糖尿病动物模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备II型糖尿病动物模型的方法。具体涉及一种用于分析II型糖尿病病理及进行II型糖尿病药物筛选的动物模型的制备方法。
背景技术：
糖尿病是世界上患病率最高的疾病之一，属于内分泌代谢性的慢性终身性疾病，其患病率仅次于肿瘤和心血管疾病，居第三位。II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)是危害人类健康的常见疾病，多见于40岁以上的成年人，糖尿病患者中90％以上为II型糖尿病患者。糖尿病所造成的经济影响巨大，据统计，发展中国家用于糖尿病及其并发症上的费用超过了卫生方面的预算的10％。在美国，1994年花费在糖尿病方面的费用高达204亿美元，最近统计更是高达1000亿美元。
II型糖尿病的病理特征包括外周组织胰岛素抵抗以及胰腺β细胞分泌胰岛素的损伤，其表型包括高空腹血糖、高胰岛素血症、糖耐量低减、肝糖原合成不足及糖异生途径异常活跃等。现在一般认为，II型糖尿病的发病除了遗传因素外，也与环境因素的诱导密切相关。缺乏运动及长期摄取高脂饮食，造成血浆中游离脂肪酸和甘油三酯水平上升，脂肪细胞肥大，进而分泌IL-2、TNF-α等炎症因子，从而诱发机体胰岛素抵抗，对葡萄糖利用效率低下；血浆中高水平的游离脂肪酸进一步造成肝脏脂肪变性，引起肝糖原合成障碍和糖异生途径增强，恶化了高血糖的症状。胰腺β细胞代偿性分泌胰岛素以补偿机体利用胰岛素的低效率，从而造成高胰岛素血症以及胰腺β细胞的损伤，胰岛素分泌产生障碍，最终形成II型糖尿病。目前对II型糖尿病的机理还有很多不明之处，有待进一步研究。
现有的II型糖尿病动物模型如ob/ob、db/db、T-KK、Yellow-KK、NZO小鼠以及ObeseZucker、GK、OLETE大鼠等多为遗传性自发性动物模型，大多需从国外引进，价格昂贵，饲养条件要求高，并且不能很好地模拟人体II型糖尿病的发病过程，不适用于进行大量的化合物筛选和机理研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建II型糖尿病动物模型的制备方法，该方法模拟人类II型糖尿病的发病过程，所制备的动物模型出现高空腹血糖、高胰岛素血症、糖耐量低减、胰岛素抵抗等II型糖尿病的典型症状，能适合于II型糖尿病机理研究和进行大量的药物筛选。
本发明方法的特点为先用高脂高糖饲料诱导动物升高血脂血糖，进而引发肝脏和外周组织中的胰岛素抵抗，此时动物呈肥胖趋势，出现高胰岛素血症。在此基础上，利用腹腔注射中剂量的链脲佐菌素(STZ)破坏胰腺β细胞分泌胰岛素的功能，从而制备得到II型糖尿病动物模型。应用本发明方法制备的动物模型具有与人类II型糖尿病发病相似的过程，出现饮水量升高，空腹血糖水平高于正常、高胰岛素血症、糖耐量低减以及胰岛素耐量减低等II型糖尿病特征，因而是研究II型糖尿病发病机理和进行治疗II型糖尿病药物筛选的理想模型。
本发明方法包括以下步骤1、通过自由摄食的方式，用高脂高糖饲料持续喂养3-4周龄的雄性动物4-6周，诱导动物产生胰岛素抵抗。
2、喂养结束后禁食6-8小时后，以150mg/kg体重的剂量向动物腹腔一次性注射STZ，得到动物模型。
本发明方法中，高脂高糖饲料由普通的商品饲料添加糖、油脂、胆固醇等配制而成，其脂肪含量(以重量计)应为13％～28％，碳水化合物含量(以重量计)应为5％～7％；动物可采用小鼠或大鼠或豚鼠。
本发明中优选的高脂高糖饲料由葡萄糖、胆固醇、玉米油和基础饲料组成，其中葡萄糖的含量为1-5％(以重量计)，胆固醇的含量为0.1-0.5％(以重量计)，玉米油的含量为10-25％(以重量计)，余量为基础饲料。基础饲料可选用市售的符合国家标准的商品饲料，即市售的大小鼠及豚鼠饲料，如上海斯莱克试验动物有限责任公司生产的大小鼠及豚鼠饲料。
上述方法所得到的动物模型的验证方法包括测定饮水量、体重、空腹血糖水平和血清胰岛素水平等II型糖尿病病症指标；通过口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)和胰岛素耐量试验(insulin tolerance test，ITT)测量动物模型对II型糖尿病的表现程度。
饮水量、体重、空腹血糖水平和血清胰岛素水平采用常规方法测定。OGTT的试验方法为分别将模型组和正常对照组动物禁食18-24小时，测量空腹血糖值，以20％的葡萄糖溶液进行灌胃，葡萄糖溶液的用量为2g/kg体重，分别在15分钟、30分钟、60分钟和120分钟测定各组动物的血糖值。以各个时间点的血糖值做糖耐量曲线，以模型组和正常对照组各点进行t检验，进行统计分析。ITT的试验方法为分别将模型组和正常对照组动物禁食4-8小时，测量空腹血糖值，腹腔注射胰岛素，注射剂量为0.75U/kg体重，分别在5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟测定各组动物的血糖值。以空腹血糖值作为基准，以血糖值的百分数对时间点做胰岛素耐量曲线，以模型组和正常对照组各点进行t检验，进行统计分析。
试验结果表明，模型组动物空腹血糖水平显著高于正常，出现高胰岛素血症，糖耐量和胰岛素耐量试验中与正常组动物存在差异或显著差异。从而验证了本发明以试验手段在动物上建立了II型糖尿病动物模型。
图1为动物饮水量变化趋势图，其中-◆-表示模型组，-■-表示正常对照组；图2为糖耐量试验曲线图，其中-◆-表示模型组，-■-表示正常对照组；图3为胰岛素耐量试验曲线下面积图，其中1表示正常对照组，2表示模型组，■表示曲线下面积(AUC)。
有益效果1、本发明方法制备动物模型时间短，对试验动物损伤少。
2、本发明采用先用高脂高糖饲料诱导胰岛素抵抗，出现高胰岛素血症后腹腔注射中剂量的STZ的方法，致死率低，增加了II型糖尿病的出现概率而不会增加I型糖尿病的出现概率，从而解决了造模成功率不高，STZ使动物致死以及易于造成I型糖尿病的问题。
3、本发明方法操作简单，费用较低，所制备的动物模型具有与人类II型糖尿病发病相似的过程，具有典型的II型糖尿病症状，因而是研究II型糖尿病发病机理及进行治疗II型糖尿病药物筛选的理想模型，具有普遍应用的潜力。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明方法作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例11、试验材料1.1、实验动物清洁级C57BL/6J小鼠，雄性，三至四周龄，从中科院上海试验动物中心购得。动物随机分为模型组和正常对照组，其中模型组30只，正常对照组10只。实验动物采用分笼饲养，每笼5只。
1.2、基础饲料大小鼠饲料(上海斯莱克试验动物有限责任公司)1.3、高脂高糖饲料由80.9％基础饲料、4％葡萄糖、0.1％胆固醇以及15％玉米油配制而成。其碳水化合物含量为6.4％，脂肪含量为18.2％，蛋白质含量为21％，其制备方法为将基础饲料粉碎，按上述配方比例，称取各配料，加入适量水后搅拌均匀，压实并分成小块后于80℃烘干。
1.4、试剂与仪器
STZ购自sigma公司；0.1M柠檬酸缓冲液(0.1mol/L柠檬酸钠56ml，0.1mol/L柠檬酸44ml)胰岛素放射免疫分析试剂盒购自上海放射免疫分析技术有限公司；ONE TOUCH II微量血糖测定仪(美国lifescan公司)。
2、试验方法模型组和正常对照组小鼠以基础饲料预养三天后，采用自由摄食的方式饲喂高脂高糖饲料四周，饲养期间自由饮水，并确保清洁的饲养环境。四周后，各实验组小鼠禁食6小时，以150mg/kg体重的剂量腹腔注射STZ(溶于0.1M柠檬酸缓冲液，pH 4.4)，小鼠开始单笼饲养，在第3、4、7、9天测定饮水量，每周检测体重，同时对各实验组小鼠进行尾静脉采血，按试剂盒说明书的方法测定血清胰岛素；用微量血糖测定仪测定空腹血糖。对各实验组小鼠进行口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。口服葡萄糖耐量试验的方法为小鼠禁食22小时，测量空腹血糖值，以2g/kg体重的剂量灌胃20％的葡萄糖溶液(去离子水配制)，分别测定15分钟、30分钟、60分钟和120分钟时的血糖值。以各个时间点的血糖值做糖耐量曲线，以模型组和正常对照组组各点进行t检验，进行统计分析；胰岛素耐量试验的方法为小鼠禁食5小时，测量空腹血糖值，腹腔注射胰岛素0.75U/kg体重，分别测定5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟时的血糖值。以血糖值对时间点做胰岛素耐量曲线，计算曲线下面积，以模型组和正常组各点进行t检验，进行统计分析。
3、试验结果3.1、模型组小鼠的平均体重为22.1±1.83g，正常对照组小鼠的平均体重为20.5±1.22g。
3.2、如表1和图1所示，模型组小鼠在腹腔注射STZ后，其饮水量呈递增趋势，而正常对照组小鼠的饮水量则保持稳定。
表1高脂高糖饲料喂养的C57BL/6J小鼠注射STZ后饮水量变化趋势
3.3、模型组小鼠的平均空腹血糖值可达17.6±3.27mmol/L，平均胰岛素值为36.0±17.8μIU/ml。而正常对照组小鼠的平均空腹血糖值为6.2±0.42mmol/L，平均胰岛素值为19.0±6.2μIU/ml。
3.4、如表2和图2所示，口服葡萄糖耐量试验中，模型组与正常对照组相比，其空腹血糖及15分钟、120分钟血糖值差异极显著(P＜0.001)；60分钟血糖值差异显著(P＜0.01)；30分钟血糖值存在差异(P＜0.05)。
表2口服糖尿病试验(oral glucose tolerance test，OGTT)结果
注表中数据为平均数±SE*表示P＜0.05，与正常组相比有差异；**表示P＜0.01，与正常组相比有显著差异；***表示P＜0.001，与正常组相比有极显著差异。
3.5、如表3如表3和图3所示，胰岛素耐量试验结果表明，模型组相对于正常对照组组，曲线下面积存在差异(P＜0.05)。
表3胰岛素耐量试验(insulin tolerance test.ITT)
注表中数据为平均数±SE*P＜0.05，与正常对照组相比有差异；
权利要求
1.一种II型糖尿病动物模型的制备方法，其特征在于先用高脂高糖饲料诱导动物产生胰岛素抵抗，然后腹腔注射中剂量的链脲佐菌素破坏胰腺β细胞分泌胰岛素的功能，得到II型糖尿病动物模型，其中高脂高糖饲料中脂肪和含量为13％～28％(以重量计)，碳水化合物含量为5％～7％(以重量计)。
2.根据权利要求1所述的II型糖尿病动物模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)通过自由摄食的方式，用高脂高糖饲料持续喂养3-4周龄的雄性动物4-6周，诱导动物产生胰岛素抵抗；(2)喂养结束后禁食6-8小时后，以150mg/kg体重的剂量向动物腹腔一次性注射链脲佐菌素，得到动物模型。
3.根据权利要求1或2所述的II型糖尿病动物模型的制备方法，其特征在于所述的高脂高糖饲料的组成为(以重量计)葡萄糖1-5％胆固醇0.1-0.5％玉米油10-25％基础饲料 余量其中基础饲料为符合国家标准的商品饲料。
4.根据权利要求1或2所述的II型糖尿病动物模型的制备方法，其特征在于所述的动物是小鼠或大鼠或豚鼠。
全文摘要
本发明涉及一种II型糖尿病动物模型的制备方法。具体指利用高脂高糖饲料喂养诱导动物产生胰岛素抵抗，用链脲佐菌素(STZ)破坏动物胰腺β细胞。利用本发明方法制备的动物模型具有与人类II型糖尿病发病相似的过程，出现高空腹血糖、高胰岛素血症、糖耐量低减、胰岛素抵抗等II型糖尿病的典型症状，可用于分析II型糖尿病发病机理及进行治疗II型糖尿病药物筛选。
文档编号A61K49/00GK1785433SQ200410089318
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者龚邦强, 相幼青, 连霁虹 申请人:上海凯曼生物科技有限公司