专利名称：对抗支气管败血性博德特氏杆菌的犬疫苗的制作方法
技术领域：
本发明是涉及包含支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原的疫苗；及将其使用来保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所造成的传染性气管、支气管炎(“犬舍咳”)。本发明也涉及一种联合疫苗，其包含气管败血性博德特氏杆菌p68抗原及一种或多种的其它犬科病原体抗原诸如犬瘟热(canine distemper)(CD)病毒、2型犬腺病毒(canine adenovirus)(CAV-2)、犬副流感(canine parainfluenza)(CPI)病毒、犬冠状病毒(canine coronavirus)(CCV)、犬细小病毒(canine parvovirus)(CPV)、布拉迪斯拉发钩端螺旋体(Leptospira bratislava)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)或波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)。本发明也提供使用联合疫苗来保护狗对抗由犬科病原体所引起的疾病的方法。
背景技术：
现在商业上可购得的犬支气管败血性博德特氏杆菌疫苗产品由灭活的、非佐剂化的支气管败血性博德特氏杆菌全细胞细菌所组成。此全细胞细菌会导致与细胞蛋白质相关的接种后反应。支气管败血性博德特氏杆菌的p68蛋白质与百日咳杆菌(B.pertussis)的外膜蛋白质(OMP)及副百日咳杆菌(B.parapertussis)的OMP抗原类似(Shahin等人，“百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)的69-kD外膜蛋白质的保护能力及免疫原性特征”，J.Exp.Med.，17163-73，1990)。此OMP对于老鼠已显示出保护角色(Shahin等人，前述；Novotny等人，“百日咳博德特氏杆菌的69-kD外膜蛋白质的生物学及保护性质一种新颖的无细胞百日咳疫苗配方”，J.Infect.Dis.164114-22，1991)、人类(He等人，“免疫球蛋白G抗体对在副百日咳博德式杆菌感染中的百日咳博德特氏杆菌的丝状血凝素(FilamentousHemagglutinin)及百日咳杆菌粘附素(pertactin)的保护角色”，Eur.J Clin Microbiol Infect Dis.10793-798，1996)及猪(Kobisch等人，“使用无特定病原体的小猪来鉴别做为支气管败血性博德特氏杆菌的主要保护抗原的68-KD的外膜蛋白质”，Infect.Immun.58(2)352-357，1990)。
在本发明之前尚未出现对于狗既安全又有效的支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原的疫苗。因此，需要发展合适于犬科使用的包含p68抗原的支气管败血性博德特氏杆菌疫苗。甚至更优良的是，希望此支气管败血性博德特氏杆菌p68疫苗能安全施用于幼犬并能提供一段长时间的保护。
CD为具有易变表征的、世界性分布的高死亡率病毒性疾病。大约50％被CD病毒感染的未接种、未免疫的狗会发展出临床征象，其中大约90％会死亡。
由1型犬腺病毒(CAV-1)所造成的传染性犬肝炎或ICH为世界性分布的、有时具致命性的狗的病毒性疾病，其特征为肝及全身性内皮病灶。CAV-2会造成呼吸道疾病，其在严重的情况下可包括肺炎及支气管炎。
CPI为平常的病毒上呼吸道疾病。无并发症时的CPI温和或临床症状不明显，但若同时感染其它呼吸道病原体时征象会变更严重。
CPV感染会产生肠道疾病，其特征为突然开始呕吐及腹泻，经常是出血性。通常伴随的临床征象为白血球减少症。任何年龄的易感狗群皆会受影响，但是死亡率最高在幼犬。在年龄4-12周的幼犬中，CPV偶尔会造成心肌炎，此会在短暂及不显著的病症后导致急性心衰竭。在感染后，许多狗对该疾病有一年或多年的抵抗力。血清反应呈阳性的母狗会类似地将CPV抗体传送至其幼犬，此会以自动免疫作用干涉所述幼犬至16周犬龄。
CCV也会在世界范围内于全部年龄的易感狗群中造成肠道疾病。该病毒具有高度接触传染性，其主要通过直接与感染性排泄物接触而传送，且可在接触后的1-4天内造成的临床的肠炎。该疾病的严重性会由于其它原因的同时感染而加剧。CCV感染的主要征象包括厌食、呕吐及腹泻。呕吐频率在一或两天内开始腹泻后通常减弱，但腹泻会持续整个感染病程，且粪便偶尔会包含血纹。在CCV感染后，在无并发的情况下，大部分的狗仍然无发热且不会观察到白血球减少症。
钩端螺旋体病会发生在全部年龄的狗中，在急性感染后发生通常有广泛的临床征象范围及慢性肾炎。无法临床区别由犬钩端螺旋体及黄疸出血型钩端螺旋体的感染。
在本发明之前，尚无能有效保护狗对抗支气管败血性博德特氏杆菌及一种或多种其它犬科病原体诸如CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV、CCV及细螺旋体种(诸如布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的联合疫苗。在发展联合疫苗上的问题包括功效干扰，即因为在该组合物中存在有其它抗原，于该联合组合物中的一种或多种抗原不能维持或实现功效。据信这是在施用于宿主(例如，狗)的组合物中的抗原受干扰的结果，诸如该抗原会因为存在于该组合物中的其它抗原于宿主中所引发的在免疫学、抗原、抗体或保护上的反应而受干扰。但是，对其它宿主(诸如狗)而言，联合疫苗是已知的。据信在狗上的功效干扰是由于犬科生物系统的某些特征，或由于所述抗原与犬科生物系统反应。
因此，需要发展适宜施用于狗的联合疫苗，以对抗支气管败血性博德特氏杆菌及一种或多种其它犬科病原体，而不会在犬科动物中显示出功效干扰。甚至更优良的是，此联合疫苗可安全施用于幼犬并能提供长时间的保护。
发明概述本发明提供用于保护狗对抗由犬科病原体所引起的疾病的疫苗及方法。
在一个具体实施例中，本发明提供适宜施用于狗且能保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病的p68疫苗。本发明的此疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原及兽医可接受的载体(诸如佐剂)。
在另一个具体实施例中，本发明提供保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病的方法，该方法对狗施用包含支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原与兽医可接受的载体(诸如佐剂)的疫苗。
在还有另一个具体实施例中，本发明提供适宜施用于狗的联合疫苗。本发明的联合疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原与至少一种来自其它犬科病原体的其它抗原(其能在狗中引发对抗由这样的其它病原体所引起的疾病的保护性免疫反应)的联合。这样的其它病原体可选自于犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬疱疹病毒、狂犬病病毒、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、Leptospirahardjobovis、单胞菌属(Porphyromonas spp.)、拟杆菌属(Bacteriodes spp.)、利什曼原虫属(Leishmania spp.)、包柔氏钩端螺旋体属(Borrelia spp.)、埃利希氏体属(Ehrlichia spp.)、霉浆菌属(Mycoplasma spp.)及犬小孢子菌(Microsporum canis)。
本发明优选的联合疫苗包括犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒及犬细小病毒(CPV)的减毒株；犬冠状病毒(CCV)株的灭活制剂；及支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原。
本发明另一个优选的联合疫苗包括犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感(CPI)病毒及犬细小病毒(CPV)的减毒株；犬冠状病毒(CCV)株的灭活制剂；支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质；及五种血清型螺旋体(布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的经灭活的细胞制剂。
本发明另一个优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的减毒株；CPV株系；及支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原。
本发明另一个优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的减毒株；CPV株系；支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原；及犬钩端螺旋体与黄疸出血型钩端螺旋体的经灭活的细胞制剂。
本发明另一个优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的减毒株；CPV株系；支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原及五种血清型螺旋体(布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的经灭活的细胞制剂。
另一个优选的联合疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原与经减毒的CPI病毒。
还有另一个优选的联合疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原、经减毒的CPI病毒及犬钩端螺旋体与黄疸出血型钩端螺旋体的经灭活的细胞制剂。
本发明也提供保护狗对抗由犬科病原体所引起的疾病的方法，该方法对狗施用本发明的联合疫苗。
图1在未接种与接种博德特氏杆菌p68(15微克/剂量)的狗中，对抗支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后的p68 ELISA终点滴度几何平均值的总结。
图2以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶对狗激发免疫反应后，血清淀粉状蛋白质A滴度的总结。
图3未接种的狗与接种博德特氏杆菌p68的狗在接种后，以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，p68 ELISA终点滴度几何平均值的总结。
图4以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶对狗激发免疫反应后，血清淀粉状蛋白质A滴度的总结。
图5蛋白质印迹法显示出p68单克隆抗体Bord 2-7对p68全细胞溶胞产物的反应性。
发明内容
在一个具体实施例中，本发明提供适宜施用于狗的单价疫苗，其能保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病。本发明的单价疫苗包括重组产生的支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原与兽医可接受的载体(诸如佐剂)。
在另一个具体实施例中，本发明提供保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病的方法，其可通过对狗施用包含重组产生的支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原与兽医可接受的载体(诸如佐剂)的单价疫苗。
在还有另一个具体实施例中，本发明提供适宜施用于狗的联合疫苗。本发明的联合疫苗包括重组产生的支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原与至少一种其它抗原(其能在狗中引发对抗由此其它抗原所引起的疾病的保护性免疫反应)的组合。
本发明的优选的联合疫苗包括犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒及犬细小病毒(CPV)的减毒株；犬冠状病毒(CCV)株的灭活制剂；及支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质。
本发明另一个优选的联合疫苗包括犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒及犬细小病毒(CPV)的减毒株；犬冠状病毒(CCV)株的灭活制剂；支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质；及五种血清型螺旋体(布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的制剂。
本发明还有另一个优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的减毒株；CPV株系；及支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质。
本发明另一个优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的减毒株；CPV株系；支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质；及犬钩端螺旋体及黄疸出血型钩端螺旋体的制剂。
本发明另一个优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的减毒株；CPV株系；及五种血清型螺旋体(布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的制剂。
本发明也提供保护狗对抗由犬科病原体所引起的疾病的方法，该方法对狗施用本发明的联合疫苗。
为了公开的清楚性且不由其所限制，于此将本发明的详细说明划分成下列数小节来描述或阐明本发明的某些特征、具体实施例或应用。
定义及缩写在此使用的术语“保护狗对抗由犬科病原体所引起的疾病”指称减低或消除由病原体感染的风险、使病情好转或缓和该感染症状、或加速从感染状态恢复。例如，若降低病毒或细菌负荷、降低病毒或细菌脱落(shedding)、减小感染发生率或持续期间、降低急性阶段的血清蛋白质水平、降低直肠温度和/或增加食物吸收性和/或发育时，则实现了保护。
术语“p68抗原”指称具有分子量如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的68kDa的蛋白质，其被p68-特异的单克隆抗体Bord 2-7(ATCC#)识别，且具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或实质上与SEQ ID NO1相同的氨基酸序列。
术语“实质上相同”指称其序列一致性至少约90％，优选为至少约95％，或更优选为至少约98％。
在此使用的术语“单价疫苗”指为具有主要抗原组分的疫苗。例如，p68单价疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原，其作为该疫苗的主要抗原组分且能保护已施用该疫苗的动物对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病。
“联合疫苗”指称能在狗中引发保护性免疫反应的抗原的二价或多价联合。该联合疫苗对抗一种或多种病原体的保护效应通常借助在动物体内引发免疫反应(细胞介导的或体液免疫反应或二者的联合)而实现。
“免疫原性”指称组合物在狗中导致对抗特别病原体的免疫反应的能力。该免疫反应可为主要由细胞毒素的T细胞与产生细胞因子的T细胞所介导的细胞免疫反应，或主要由辅助性T细胞所介导的体液免疫反应，其依次可活化B细胞导致抗体生成。
术语“处理有效量”或“有效量”指为足以在施用了该疫苗的狗中引发保护性免疫反应的单价或联合疫苗量。该免疫反应可包括(不限于)诱导细胞和/或体液免疫。该疫苗的处理有效量可根据使用在该疫苗中的特别抗原、狗的年龄及状态和/或感染程度而变化，且可由兽医决定。
p68疫苗本发明第一次展示包含支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原的疫苗组合物有效保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病。本发明的疫苗组合物不会产生明显的接种后反应、可安全施用于幼犬且可在狗中引发持续一段长时间的保护性免疫。
据此，本发明的一个具体实施例涉及包含支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原(或“p68疫苗”)的疫苗组合物，其适宜施用于狗并能保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病，例如，传染性气管与支气管炎(“犬舍咳”)。
对本发明的目的而言，“p68抗原”指为具有分子量如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的68kDa的蛋白质，其被p68-特异的单克隆抗体Bord 2-7(ATCC#)识别，且具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或实质上与SEQ ID NO1相同的氨基酸序列。“实质上相同”指称该序列一致性至少约90％，优选为至少约95％或更优选为至少约98％。具有实质上SEQ ID NO1一致的氨基酸序列的p68抗原的实例有描述在WO 92/17587中的p68抗原，其以SEQ ID NO3加以说明。本发明的p68特定的单克隆抗体可例如识别出天然的p68蛋白质、重组型p68蛋白质及在细菌表面上的p68蛋白质。
根据本发明，适用于本发明的p68抗原包括天然的p68蛋白质(即，从支气管败血性博德特氏杆菌中纯化出的天然存在的p68蛋白质)和重组产生的p68蛋白质二者。
来自支气管败血性博德特氏杆菌的天然p68的纯化则例如描述在Montaraz等人，Infection and Immunity47744-751(1985)中；且也阐明在提供于下文的实施例中。p68的重组产生可使用任何一种由本领域技术人员所熟知的分子克隆及重组表达技术来实现。例如，可将能编码p68的核酸分子引进适当的宿主细胞，诸如细菌、酵母细胞(例如，毕赤氏酵母(Pichia)细胞)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。所述编码p68的核酸分子可以被置于针对能实现p68抗原在宿主细胞中表达的起动子的可操作的键合中。由该宿主细胞表达的p68可以使用例行的蛋白质纯化技术易于纯化。
在本发明优选的具体实施例中，可将如SEQ ID NO2所示编码SEQ ID NO1的氨基酸序列的p68抗原的核酸序列在表达载体中克隆，且置于针对温度敏感的起动子的可操作的键合中。将该表达载体引进大肠杆菌，且以加热诱导表达该p68抗原。溶解所述细胞，使用离心机分离积聚该p68抗原的内含体。使用SDS或其它本领域中熟知的增溶剂(诸如尿素、盐酸胍、胆酸钠、牛磺胆酸盐及脱氧胆酸钠)溶解该内含体中的重组型p68。根据本发明，经纯化的天然或重组型p68蛋白质联合兽医可接受的载体而形成p68疫苗组合物。
术语“兽医可接受的载体”包括任何及全部的溶剂、分散介质、涂布物、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌及抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂及其类似物。稀释剂可包括水、盐水右旋糖、乙醇、甘油及其类似物。等渗剂尤其可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。
根据本发明，合适于使用的佐剂包括(但是不限于)数种佐剂种类，诸如无机盐类，例如矾、氢氧化铝、磷酸铝及磷酸钙；表面活性剂及微粒子类，例如非离子嵌段聚合物表面活性剂(例如，胆固醇)、病毒脂蛋白体、皂素(例如Quil A、QS-21及GPI-0100)、蛋白体、免疫刺激复合物、蜗形载体(cochleates)、季胺(二甲基双十八烷基铵溴化物(DDA))、阿夫立定、维生素A、维生素E；细菌产物，诸如RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、草分枝杆菌的细胞壁骨架(Detox)、胞壁酰基二肽类(MDP)及三肽类(MTP)、单磷酰基脂质A、卡介苗(Bacillus Calmete-Guerin)、热不稳定的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脱氧核糖核酸；细胞因子及激素类，例如白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄甾酮、1，25-二羟基维生素D3；多聚阴离子类，例如，葡聚糖；聚丙烯酸类(例如，聚甲基丙烯酸甲酯、Carbopol 934P)；载剂，例如破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚基、肠毒性大肠杆菌的突变型热不稳定的肠毒素(rmLT)、热休克蛋白质；水包油乳液，例如AMPHIGEN(Hydronics，美国)；及油包水乳液，诸如例如弗式(Freund′s)完全及不完全佐剂。
可使用在本发明的疫苗中的优选佐剂包括Quil A及胆固醇。
p68抗原与兽医可接受的载体可以任何简便和实际的方式结合以形成疫苗组合物，例如混合物、溶液、悬浮液、乳化、胶囊化、吸收等，且可制做成制剂，诸如合适于注射、植入、吸入、摄入或其类似方法的片剂、胶囊、粉末、糖浆、悬浮液。优选将该疫苗配制成可利用注射而以约0.1至5毫升的剂量，或优选为约0.5至2.5毫升，或更优选以约1毫升的剂量施用于狗。若适当地，应该利用熟知的步骤将本发明制成的医药组合物消毒。
在疫苗中的p68量应该具有免疫有效性，且范围通常为每剂量0.5-1000微克。优选的p68量范围为每剂量1-260微克。更优选p68量范围为每剂量10-100微克。甚至更优选p68量为每剂量约15至25微克。
适用于疫苗中的佐剂量根据所使用的佐剂本质而定。例如，当使用Quil A及胆固醇作为佐剂时，Quil A通常的量为每剂量约1-1000微克，优选为每剂量30-100微克，更优选为每剂量约50-75微克；及胆固醇通常的量为每剂量约1-1000微克，优选为每剂量约30-100微克，更优选为每剂量约50-75微克。
在另一个具体实施例中，本发明提供能保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病的方法，其可通过对狗施用如上所述的p68疫苗组合物。根据本发明，该p68疫苗组合物可提供狗具有长时间(至少约4个月)的免疫性，优选为至少约6个月或甚至更优选为约一年。
根据本发明，可利用任何熟知的途径对狗施用该p68疫苗，包括口服、鼻内、粘膜、局部、经皮及肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮肤内、皮下或肌肉内)。也可使用无针传递装置来实现施用疫苗。可使用组合途径来实现施用疫苗，例如首先使用肠胃外(parental)途径施加，随后使用粘膜途径施加疫苗。
优选的施用途径包括皮下及肌肉内施用疫苗。
本发明的p68疫苗组合物可施用于至少6周大的狗，优选为至少7周大及更优选为至少8或9周大。可以一次剂量或以多于一次的剂量对狗接种p68疫苗。优选以约2-4周的间隔对狗施用二次剂量的p68疫苗，优选两次施用之间为约3周。若狗在年龄4个月前接种，则推荐在到达年龄4个月后再以单一剂量接种，因为在小于4个月大的幼犬中母体抗体会干扰足够的免疫反应的发展。狗也可每年以单一剂量再接种。若可能接触支气管败血性博德特氏杆菌(诸如生育、供食及显示出状况)，可在这些事件发生1年(或优选6个月)内提供额外的强化免疫一次(an additional booster)。
p68联合疫苗在另一个具体实施例中，本发明提供用来保护对抗支气管败血性博德特氏杆菌与一种或多种其它犬科病原体的联合疫苗及方法，该方法施用此联合疫苗。本发明的联合疫苗组合物不会显示出功效干扰，且可安全施用于幼犬。
本发明的联合疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原(其可如上述制得)，与至少一种来自其它犬科病原理的抗原(其能在狗中引发对抗由此其它病原体所引起的疾病的保护性免疫反应)的组合。
此其它病原体包括(但是不限于)犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感(CPI)病毒、犬极小DN病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬疱疹病毒及狂犬病病毒。来自这些病原体而可使用在本发明的疫苗组合物的抗原可以是经改性的活病毒制剂或灭活的病毒制剂形式。减毒这些病毒的毒性株系的方法及制造灭活的病毒制剂的方法在本领域是已知的，且描述在例如美国专利4,567,042及4,567,043中。
其它病原体还包括布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、Leptospira hardjobovis、单胞菌属、拟杆菌属、利什曼原虫属、包柔氏钩端螺旋体属、埃利希氏体属、霉浆菌属及犬小孢子菌。来自这些病原体而使用在本发明的疫苗组合物中的抗原可为灭活的完整或部分细胞制剂的形式，其使用在本领域已知的方法来制备。例如，制备灭活的完整或部分螺旋体细胞制剂的方法在本领域是已知的，且描述在例如Yan，K-T，“Aspects of Immunity to Leptospiraborpetersenii serovar hardjo”，PhD Thesis，Appendix I，1996.Faculty of Agriculture and Food Science，The Queen′s Universityof Belfast；Mackintosh等人，“The use of a hardjo-pomona vaccineto prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challengewith Leptospia interrogans serovar hardjo”，New Zealand Vet.J.28174-177，1980；Bolin等人，“Effect of vaccination with apentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogansserovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle”，Am.J.Vet.Res.50161-165，1989。
根据本发明，该联合疫苗通常包括兽医可接受的载体。如上所述，兽医可接受的载体包括任何及全部的溶剂、分散介质、涂布物、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌及抗微菌剂、等渗剂、吸收延缓剂及其类似物。稀释剂可包括水、盐水右旋糖、乙醇、甘油及其类似物。等渗剂尤其可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。
根据本发明，合适于使用的佐剂包括(但是不限于)数种佐剂种类，诸如无机盐类，例如矾、氢氧化铝、磷酸铝及磷酸钙；表面活性剂及微粒子类，例如非离子嵌段聚合物表面活性剂(例如，胆固醇)、病毒脂蛋白体、皂素(例如Quil A、QS-21及GPI-0100)、蛋白体、免疫刺激复合物、蜗形载体(cochleates)、季胺(二甲基双十八烷基铵溴化物(DDA))、阿夫立定、维生素A、维生素E；细菌产物，诸如RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、草分枝杆菌的细胞壁骨架(Detox)、胞壁酰基二肽类(MDP)及三肽类(MTP)、单磷酰基脂质A、卡介苗、热不稳定的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脱氧核糖核酸；细胞因子及激素类，例如白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄甾酮、1，25-二羟基维生素D3；多聚阴离子类，例如，葡聚糖；聚丙烯酸类(例如，聚甲基丙烯酸甲酯、Carbopol 934P)；载剂，例如破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚基、肠毒性大肠杆菌的突变型热不稳定的肠毒素(rmLT)、热休克蛋白质；水包油乳液，例如AMPHIGEN(Hydronics，美国)；及油包水乳液，诸如例如弗式完全及不完全佐剂。
用于根据本发明的联合疫苗的优选佐剂包括Quil A及胆固醇。
可以任何简便和实际的方式(例如，通过混合物、溶液、悬浮液、乳化、胶囊化、吸收等方式)来结合p68抗原、一种或多种来自其它病原体的抗原与该兽医可接受的载体，以形成联合疫苗组合物；且可制成制剂，诸如合适于注射、植入、吸入、摄入或其类似方法的片剂、胶囊、粉末、糖浆、悬浮液。优选将该疫苗配制成可利用注射以约0.1至5毫升的剂量，或优选为约0.5至2.5毫升，或更优选以约1毫升的剂量施用于狗。
根据本发明，该p68联合疫苗可施用于至少6周大的狗，优选为至少7周大及更优选为至少8或9周大。该施用疫苗可利用任何熟知的途径来完成，包括口服、鼻内、粘膜、局部、经皮及肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮肤内、皮下或肌肉内)。该施用疫苗也可使用无针传递装置来实现。该施用疫苗也可使用组合途径来实现，例如首先使用肠胃外(parental)途径施加，随后使用粘膜途径施加疫苗。优选的施用途径包括皮下及肌肉内施用。
优选的p68联合疫苗及接种方法本发明优选的联合疫苗包括经减毒的CD病毒株、经减毒的CAV-2株、经减毒的CPI病毒株、经减毒的CPV株、CCV株的灭活制剂及支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原。
特别优选的联合疫苗包括所述经减毒的CD病毒株，其标示为“Snyder Hill”株(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述经减毒的CAV-2株，其标示为“Manhattan”株(NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述经减毒的CPI病毒株，其标号为“NL-CPI-5”(National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)；所述经减毒的CPV株，其标号为“NL-35-D”(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述CCV株的灭活制剂，其标号为“NL-18”(National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)；及所述重组型支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原，其序列为SEQ ID NO1。此联合疫苗(于本文中也指为“p68/5CV联合疫苗”)可优选地通过用液体制剂再水合所述减毒株及病毒制剂的经冷冻干燥的制剂来制备，而该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的p68抗原组成，并经Quil A及胆固醇佐剂化。
另一个特别优选的联合疫苗包括该p68/5CV联合疫苗的抗原组分和五种螺旋体的灭活全细胞制剂布拉迪斯拉发钩端螺旋体(例如，布拉迪斯拉发钩端螺旋体株，其获自National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)、犬钩端螺旋体(例如，C-5株，NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)、感冒伤寒型钩端螺旋体(例如，MAL 1540株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)、黄疸出血型钩端螺旋体(例如，NADL 11403株，NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)及波摩那钩端螺旋体(例如，T262株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)。此联合疫苗(于本文也指为“p68/5CV-螺旋体联合疫苗”)可优选地通过用液体制剂再水合所述减毒株及病毒制剂的经冷冻干燥的制剂(或利用其它方法诸如喷雾干燥或干燥作用制得的制剂)来制备，而该液体制剂由溶解在无菌的盐水溶液中的p68抗原及钩端螺旋体抗原，并经Quil A及胆固醇佐剂化。
根据本发明，可将该p68/5CV及p68/5CV-螺旋体联合疫苗施用于年龄4周或较大(优选为6周或较大)的健康的狗，优选为3次剂量，每次给药间隔约3周。每年可再对狗接种单一剂量。若可能接触支气管败血性博德特氏杆菌及犬科病毒(诸如生育、供食及显示出状况)，可在这些事件发生1年(或优选6个月)内提供额外的强化免疫一次。
本发明还有另一优选的联合疫苗包括经减毒的CD病毒株、经减毒的CAV-2株、经减毒的CPI病毒株、经减毒的CPV株及重组型支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原。
特别优选的联合疫苗包括所述经减毒的CD病毒株，其标示为“Synder Hill”株(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述经减毒的CAV-2株，其标示为“Manhattan”株(NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述经减毒的CPI病毒株，其标号为“NL-CPI-5”(National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)；所述经减毒的CPV株，其标示为“NL-35-D”(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；及所述重组型支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原，其具有SEQ ID NO1的序列。此联合疫苗(于本文也指为“p68/DA2PP联合疫苗”)可优选地通过用液体制剂再水合所述减毒株及病毒制剂的经冷冻干燥的制剂(或利用其它方法诸如喷雾干燥或干燥作用制得的制剂)来制备，而该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的p68抗原组成，并经Quil A及胆固醇佐剂化。
另一个特别优选的联合疫苗包括该p68/DA2PP联合疫苗的抗原组分和二种螺旋体的灭活的全细胞制剂犬钩端螺旋体(例如，C-51株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)及黄疸出血型钩端螺旋体(例如，NADL 11403株，National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)。可代替地，优选的联合疫苗可包括该p68/DA2PP联合疫苗的抗原组合和五种螺旋体的灭活的全细胞制剂布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体。这些联合疫苗(于本文也指为“p68/DA2PP-螺旋体联合疫苗”)可优选地通过用液体制剂再水合所述减毒株及病毒制剂的经冷冻干燥的制剂(或利用其它方法诸如喷雾干燥或干燥作用制得的制剂)来制备，而该液体制剂由溶解在无菌的盐水溶液中的p68抗原及钩端螺旋体抗原，并经Quil A及胆固醇佐剂化。
根据本发明，可将p68/DA2PP及p68/DA2PP-螺旋体联合疫苗施用于6周或较大(或优选年龄为8周或较大)的健康的狗，优选为2次剂量，每次给药间隔约3周。若提供至年龄至少12周的狗时，单一剂量即足够。每年可再对狗接种单一剂量。若可能接触支气管败血性博德特氏杆菌及犬科病毒(诸如生育、供食及显示出状况)，可在这些事件发生1年(或优选6个月)内提供额外的强化免疫一次。另一种优选的联合疫苗包括p68抗原(优选为具有SEQ ID NO1的重组型p68抗原)与CPI减毒株的联合。
还有另一个优选的联合疫苗包括p68抗原(优选为具有SEQ ID NO1的重组型p68抗原)、CPI减毒株及二种至少二种的螺旋体诸如犬钩端螺旋体(例如，C-51株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)及黄疸出血型钩端螺旋体(例如，NADL 11403株，NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)。
在本发明的联合疫苗中的p68抗原及来自一种或多种其它病原体的抗原量应该具有免疫有效性。通常而言，在该联合疫苗中的p68抗原量应该至少为每剂量约0.5微克。该减毒的CD病毒量应该至少为每剂量TCID50约102至约109TCID50，每剂量TCID50(组织培养传染剂量50％细胞病变效应)，优选的范围为每剂量约104至约106TCID50。该减毒的CAV-2量应该为每剂量至少约102TCID50至约109TCID50，优选的范围为每剂量104.0至约106.0TCID50。该减毒的CPI病毒量应该为每剂量至少约102TCID50至约109TCID50，及优选的范围为每剂量106至约108TCID50。该减毒的CPV量应该为每剂量至少约102TCID50至约109TCID50，优选的量范围为每剂量107至约109TCID50。CCV在灭活的病毒制剂中的量应该为每剂量至少约100个相对单位，优选的范围为每剂量1000-4500个相对单位。每种螺旋体在该疫苗中的范围应该为每疫苗剂量约100-3500NU(浊度测定单位)，优选的范围为每剂量200-2000NU。
可将该疫苗配制成可利用注射以约0.1至5毫升的剂量，或优选为约0.5至2.5毫升，或更优选以约1毫升的剂量施用于狗。
本发明利用下列非为限制的实施例来进一步阐明。
实施例1犬博德特氏杆菌p68重组抗原剂量滴定法研究疫苗该实验疫苗抗原为大肠杆菌菌株LW68所产生的支气管败血性博德特氏杆菌的重组型p68外膜蛋白质(SEQ ID NO1)。该疫苗包含不同程度的经SDS(十二烷基硫酸钠)溶解的p68，用在1毫升剂量中含有50微克的QAC(Quil A/50微克的胆固醇)佐剂化。
激发免疫反应物质使用支气管败血性博德特氏杆菌(dog isolate #85B，passage#3，lot #051597)的气溶胶作为该激发免疫反应物质。此平均板计数为1.59×108CFU/毫升。
动物将六十只雄性及雌性幼犬随意分配成六个处理组(每组10只幼犬)。在第一次接种前41天，对所述幼犬抽血且气管擦拭；在第一次接种前28天再次进行一次，并将任何血清反应或培养物呈阳性的动物从该研究中移除。
根据随机完全区集设计，将动物随意分配处理并分配至房间中。在无疫苗分配组的认知下完成该接种后观察。
设计
1SC＝皮下步骤IVP给药在第0天时，以安慰剂或实验疫苗接种动物。在第21天时，进行第二次接种。第一次接种施用在右颈皮下处，第二次接种施用在左颈皮下处。
激发免疫反应实施在第二次接种后28天，以支气管败血性博德特氏杆菌的气溶胶对全部的动物激发免疫反应。在激发免疫反应后的2至14天(第51至63天)，每日两次(一次早上，一次下午)监视动物的咳嗽状态30分钟。
观察及样品收集在每次接种后，触诊全部的注射位置并进行三维测量七天(第0至7天及第21至28天)，且在每次接种后的第14天(第14及35天)进行相同步骤。
在接种当天及在每次接种后的三天(第0至3天及第21至24天)记录直肠温度。
在接种当天(第0及21天)和在第42、50及63天收集血液，利用ELISA来分析特异抗体对抗从支气管败血性博德特氏杆菌纯化的p68蛋白质。也在第42、49、50、52、54、56及58天时收集血液，来进行血清淀粉状蛋白质A(SAA)分析。
对全部动物进行气管擦拭法分离支气管败血性博德特氏杆菌离；在接种前(在此供应下，于-41天及-28天)及在第49天时收集血液用于支气管败血性博德特氏杆菌凝集滴度。
博德特氏杆菌p68的狗及老鼠抗体滴定DAB ELISA以0.01M的硼酸盐缓冲液将经纯化的天然p68稀释成600纳克/毫升，并以100微升/孔加入至各孔。在4℃下培养所述平板过夜。然后以过量PBS-Tween 20清洗所述平板一次。将在PBS中1％脱脂干燥的牛奶以200微升/孔加入至所述平板。然后在37℃下培养所述平板1小时。然后以过量PBS-Tween 20清洗所述平板一次。
将狗或老鼠血清以1∶50稀释加入至所述ELISA平板的顶端列，然后将二倍连续稀释的血清依序加入所述平板。在37℃下培养所述平板1小时。随后，以过量PBS-Tween 20清洗这些平板3次。
将经过氧化物酶标定的山羊抗狗IgG(H+L)(以1∶2000稀释)，以100微升/孔加入至培养有上述狗血清的平板。然后在37℃下培养所述平板1小时。将经过氧化物酶标定的山羊抗老鼠IgG(H+L)(以1∶4000稀释)，以100微升/孔加入至培养有上述老鼠血清的平板。然后在37℃下培养所述平板1小时。然后以过量PBS-Tween 20清洗所述平板3次。
以100微升/孔加入ABTS底物。大约20分钟后，于405-490纳米用分子装置(Molecular Devices)或相当的平板计读器读取所述平板。数据分析使用Fisher′s精准检定(Fisher′s Exact Test)来测试咳嗽狗数的处理差异。使用5％的显著性水准。
在分析前，使用一般线性混合模型(general linear mixed model)将ELISA滴度进行对数转换。使用95％的置信度水准来评估处理差异。每日进行两次激发免疫反应观察，每次30分钟。
结果气管擦拭培养物及凝集滴度评估气管擦拭培养物及凝集滴度，以监视在研究时所登记的动物的支气管败血性博德特氏杆菌状况。一些狗在不同的时间点处显示出增加的滴度，但是在激发免疫反应前并无滴度增加大于128。
注射位置观察第一次接种后的注射位置反应显示于表1。在接种T05(64微克)的动物中可观察到最大的注射位置反应(接种后2天)，测量该最大平均注射位置反应，仅有14.69cm3。接种T03(4微克)、T04(16微克)及T06(256微克)的动物在接种后多至7天表露出变化的注射位置反应。接种T02(1微克)的动物仅在接种后第1天表露出反应。接种后第七天，在处理组当中，于注射位置反应上并无统计上的显著差异。第14天时，全部的注射位置反应已经消失。
第二次接种后的注射位置反应显示于表2。在第二次接种后，在T06(256微克)中观察到最大的平均注射位置反应，测量该最大的平均注射位置反应，其为50.03cm3(接种后1天)。在T05(64微克)及T04(16微克)的动物中，于第二次接种后表露出多至7天的注射位置反应。在T03(4微克)及T02(1微克)动物中，于接种后多至7天表露出最小注射位置反应。在接种T02(1微克)及T03(4微克)后，与安慰剂的组相比并无表露出统计上的注射位置反应差异。第二次接种后14天并无观察到注射位置反应。
第一次接种后的注射位置反应频率显示于表3。在第一次接种后的任何时间处，用T06(256微克)接种的显示出反应的注射位置的最高整体LSM频率76％。下一个最常发生的为用T05(64微克)进行的第一次接种，其有72％的注射位置显示出反应，用T04(16微克)的第一次接种后为69％，及用T03(4微克)的第一次接种后为63％。在T02(1微克)的第一次接种后发生频率最低，为38％。
第二次接种后的注射位置反应频率显示于表4。每种疫苗的整体LSM频率与第一次接种后所看见的一致。
接种后的注射位置反应的发生率及持续期间总结于表5。在第一及第二次接种后，可测量的注射位置反应的发生率(或在任何时间显示出反应的狗数)，对T03、T04、T05及T06(分别为4微克、16微克、64微克及256微克)而言皆为100％。接收T02(1微克)的动物表露出最小的接种后注射位置反应发生率(57.1％)。
对接种T04、T05及T06(分别为16微克、64微克及256微克)的动物而言，该反应(以反应的天数的最小平方平均值表示，显示于表5)在第一及第二次接种后的持续期间较长(第一次接种后的2.7至5.1天及第二次接种后的6.0至6.7天)。接种T02及T03(分别为1微克及4微克)的动物在第一及第二次接种后表露出最少的注射位置反应天数(第一次接种后的0.3及1.3天和第二次接种后的1.9及4.5天)。
直肠温度平均直肠温度测量则总结于表6。T02(1微克)在第1及24天、T03(4微克)在第1、21及24天、T04(16微克)在第2及24天、T05(64微克)在第23天及T06(256微克)在第0、1及24天的LSM直肠温度明显与安慰剂不同。在第23天时，所有与安慰剂的对比在统计学上不明显(P＞0.05)。
p68 ELISA血清学p68 ELISA数据总结于表7。p68 ELISA特异抗体的接种前几何平均值病毒滴度在全部组中皆为低值(范围为24.9至28.9)，且该安慰剂的滴度遍及研究期间保持低值。在第一次接种后21天，在接种处理中的p68 ELISA几何平均值滴度已经增加(范围为55.2至4，411.7)，但是T02(1微克)滴度在统计上与安慰剂(T01)并无差异。在第二次接种后42天，在全部的接种组中的几何平均值滴度会进一步增加(范围为674.6至48，382.0)，此说明针对接种有良好的血清学反应。血清淀粉状蛋白质A(SAA)血清学SAA滴度总结于表8。在激发免疫反应前，几何平均值SAA滴度在全部的处理组中为低值(范围为0.1至0.5)。激发免疫反应后，T01GMT滴度范围从1.5至146.0，其中p68处理组的范围从0.3至23.1。在第50、52、54及56天时，全部的处理组在统计学上皆与安慰剂不同。在p68疫苗当中并无表露出统计学差异，除了在第52天的T02(1微克)外，因其表露出与全部其它p68处理组统计上不同的几何平均值。
激发免疫反应激发免疫反应数据显示于表9。在激发免疫反应后通过监视咳嗽来测量反应，使用二种方法来分析观察有咳嗽的天数的最小平方平均值及连续二天咳嗽(疾病发生率)。
平均咳嗽天数分析说明在p68处理组之间并无统计学上的显著差异；但是以安慰剂接种的狗平均咳嗽8.6天，然而施用p68疫苗的狗其咳嗽明显较少，平均范围在2.2至4.7天间。
当使用疾病发生率来评估狗时，全部的T01(安慰剂)皆观察到连续二天咳嗽(100％的疾病发生率)。接种T04(16微克)及T05(64微克)的狗分别表现出55.6％及66.7％的疾病发生率。接种T02(1微克)的狗仅有28.6％、接种T03(4微克)的有50％及接种T06(256微克)的有33.3％观察到连续咳嗽二天。
讨论在此研究中，目标为在狗中建立抗原剂量、免疫反应与保护之间的关系。所检验的p68抗原剂量为1微克、4微克、16微克、64微克及256微克。
注射位置反应测量的分析说明可忽略在p68处理组中的反应，除了在第二次接种后第一天的T06(256微克)外。所观察到的反应趋向于小，通常尺寸在观察期间会减少。这些反应尺寸临床上不明显且在未修剪毛的狗上最可能被忽略。
接种后的直肠温度在全部组中皆不显著，且全部组的狗皆在正常限度内。
在T03至T06组中，针对接种的血清学反应优良。在这些处理组中，当与第21天至第63天的安慰剂比较时，全部皆表露出明显较高的p68 ELISA滴度。与第42天至第63天的T01(安慰剂)比较，T02(1微克)表露出明显的p68 ELISA滴度。在T05(64微克)及T06(256微克)中观察到最高的滴度。
在激发免疫反应后，检验全部经p68接种的狗的SAA反应显示当与对照组的狗比较，激发免疫反应后仅显示出很小幅的SAA升高。在激发免疫反应后，p68疫苗剂量水平之间并无表露出差异，除了在第52天时的T02(1微克)外，其在统计学上表露出与全部其它p68处理组有不同的几何平均值。
使用咳嗽天数的最小平方平均值(LSM)或连续二天咳嗽(疾病发生率)来分析激发免疫反应后的咳嗽观察。使用咳嗽天的LSM时，虽然在不同的p68疫苗剂量水平之间无表露出差异，但在安慰剂与全部接种p68的组之间则表露出显著的差异。使用疾病发生率时，接种T02(1微克)、T03(4微克)及T06(256微克)的狗的咳嗽明显少于安慰剂组。
结论此研究在狗中建立起抗原剂量、免疫反应与保护之间的关系。所检验的p68抗原剂量为1微克、4微克、16微克、64微克及256微克。
全部的疫苗可由最小的注射位置反应、正常的直肠温度及针对接种无负面反应而表露出安全性。注射位置反应的尺寸及这些反应的持续期间在较低抗原处理组中较少。如由ELISA滴度测量，其针对接种的血清学反应优良，用较高的抗原剂量组显示出较高的血清学反应。当使用咳嗽天数的LSM作为比较方法时，与安慰剂比较，全部的处理组在咳嗽上表露出有明显的减低。在处理组之间没有注意到差异。当使用连续二天咳嗽(或疾病发生率)来比较时，接种T02(1微克)、T03(4微克)及T06(256微克)的狗的咳嗽明显少于安慰剂组。
表1.在以p68抗原或安慰剂第一次接种后，于狗中的注射住置反应的体积
表2.在以p68抗原或安慰剂第二次接种后，注射位置反应的体积
1具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)
表3.在以p68抗原或安慰剂第一次接种后，注射位置反应的频率
表4.在以p68抗原或安慰剂第二次接种后，注射位置反应的频率
2每次处理二栏3具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)
表5.在以p68抗原或安慰剂第一次接种后，注射位置反应的持续期间
4具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)
表6.在以p68抗原或安慰剂第二次接种后，狗的平均直肠温度
表7.在以p68抗原或安慰剂接种后，在狗中的血清学p68 DAB ELISA滴度6
1在第0及21研究日时施用疫苗。具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)6在第0及21研究日时施用疫苗，且在第49研究日时施加激发免疫反应。
2具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)
表8.在激发免疫反应经p68抗原或安慰剂接种的狗后，在狗中的血清淀粉状蛋白质A(SAA)滴度
1具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)表9.在激发免疫反应经p68抗原或安慰剂接种的狗后，在狗中的咳嗽发生率及持续期间
8以连续二天咳嗽为准。
2具有不同上标的值在统计学上不同(P≤0.05)
实施例2犬博德特氏杆菌p68免疫原性研究动物购买45只混合育种的雄性及雌性狗。在幼犬到达研究场所那天，对全部的幼犬施加MLV细小病毒疫苗。在研究期间，除了实验产物外，并无对所述幼犬施用其它疫苗。在第0天(第一次接种当天)时犬龄大约为9周(±1周)。
在激发免疫反应前，需要将狗保持在隔离设备中，以防止接触博德特氏杆菌及其它犬科病原体。在以博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，继续隔离步骤以防止接触其它犬科病原体。
疫苗在处理组T01及T02中使用无菌的盐水作为安慰剂疫苗。在处理组T03及T04中使用犬重组p68支气管败血性博德特氏杆菌疫苗。将p68抗原的结构基因克隆在大肠杆菌中，由温度敏感的起动子调节该基因的表达。溶解细胞，且利用离心机分离所述内含体。通过SDS处理来增溶在该内含体内的重组p68。将该重组p68(每毫升15微克)与在无菌的盐水(作为稀释剂)中每毫升50微克的Quil A及50微克的胆固醇结合。每1毫升的剂量包含0.28％的乙醇及0.01％的硫柳汞。
激发免疫反应接种物使用现在由生物学控制实验室-微生物学(Biologics ControlLaboratories-Microbiology)所使用的方法，来制备支气管败血性博德特氏杆菌的伯尔猫(Bihr Cat)株作为该激发免疫反应接种物。以Bordet-Genou琼脂板接种汇合生长的支气管败血性博德特氏杆菌-伯尔猫株，并在37.5+/-2.5℃下培养48小时。选择毒性阶段I(virulentphase I)菌落且在Bordet-Genou琼脂上划线，并在37.5+/-2.5℃下培养24小时。在培养后，使用博德特氏杆菌盐水清洗来自该琼脂的菌落，且将该抗原稀释成在600纳米下的光学密度为0.80。在激发免疫反应前及后进行的细胞计数，以确证该比浊计读数.免疫抗原剂量标的浓度大约1×109CFU。免疫激发标的的浓度为2.37×109CFU(100％的阶段I)及激发免疫反应后的浓度计数为1.35×109CFU(100％的阶段I)。研究设计总结表
随机选择/盲测试对从接种至激发免疫反应日的期间而言，针对处理根据一般区集设计(generalized block design)来分配动物。针对房间随意分配处理。在激发免疫反应日时，利用区集将动物随意分配至激发免疫反应房间。
确认个体资格，随意分配处理组，进行微生物学及血清学测试并评估注射位置，测量直肠温度及观察咳嗽。
数据分析接种后反应变量由注射位置数据、直肠温度及p68 ELISA滴度组成。以下列方法总结注射位置数据1)因处理而具有可测量的反应的动物数目与研究日；2)因处理而具有可测量的反应的时间点的动物数目；3)在任何时间点因处理而具有可测量的反应的动物数目。
使用一般线性混合模型，分别对第一及第二接种分析注射位置体积(cm3)、直肠温度及经自然对数转换的p68 ELISA滴度数据。
通过观察时间点最小平方平均值为建构处理的事前线性对比，以测试处理组在每个观察时间点处的差异及比较在每次处理内的时间点。对全部的比较而言，使用5％的显著性水准。
激发免疫反应后变量由每日的咳嗽观察、p68 ELISA滴度及血清淀粉状蛋白质A滴度所组成。使用一般线性混合模型来分析在激发免疫反应后期间的咳嗽天数。
建构该处理最小平方平均值的事前对比，以测试处理组差异。对全部的比较而言，使用5％的显著性水准。
使用Fisher′s精准检定，分别对第一及第二接种比较处理组的连续二天咳嗽的发生率。对全部的比较而言，使用5％的显著性水准。
对激发免疫反应后的血清淀粉状蛋白质A(SAA)滴度数据而言，在使用一般线性混合模型分析前，对滴度值进行自然对数转换。
通过观察时间点最小平方平均值来建构处理的事前线性对比，以测试处理组在每个观察时间点的差异及比较在每次处理内的时间点。对全部的比较而言，使用5％的显著性水准。
研究步骤详细的动物步骤将四十五(45)只血清反应及培养物呈阴性幼犬随意分配成4个处理组。分别将八只及七只狗分配成肌肉内(IM)或皮下(SC)对照组，总共有15只对照狗。将十五只狗分配给p68 SC处理组及15只狗分配给p68 IM处理组。处理组则详述在上述的研究设计一节中。
第0天标示为第一次接种那天。在第0天时，施用疫苗且21天后重复。第一次接种使用右颈，第二次接种使用左颈。第一及第二次接种分别在右及左半膜肌肌肉中进行肌肉内注射给药。在每次接种后，对全部的注射位置进行七天的三维测量，在接种后14天进行跟踪测量。在接种当天(在接种前)和在每次接种后三天监视直肠温度。
在第35天时，对全部的动物进行气管擦拭用于支气管败血性博德特氏杆菌培养物，且收集用于凝集滴度的血液。全部的动物针对博德特氏杆菌呈气管擦拭阴性且呈血清学阴性，并针对激发免疫反应而言被认为合格。
在第45天时，在第二次接种后24天，对全部的狗施加支气管败血性博德特氏杆菌的气溶胶激发免疫反应。使用一次性鼻锥(被舒适地安装在经镇静的狗的口套上)来激发经镇静的狗的免疫反应。将该鼻锥接附于喷雾器，而该喷雾器接附于设定在5.5至6.0磅/平方英寸(psi)的真空压力泵上。将1毫升的激发免疫反应物质置于该喷雾器中，且对每只狗施加该经雾化的激发免疫反应物质4分钟。观察人员并不知道处理组的分配状况。
在激发免疫反应后，监视动物的咳嗽状况14天(第46-59天)。每天观察2(二)次，每次时间点大约相同大约30分钟，一次在早上及一次在下午进行，并记录结果。
血液收集在第一次接种前及在激发免疫反应前收集用于凝集滴度的血液。在接种前，在第0及21天及在第35、45及59天时，收集用于ELISA评估抗-p68的血液。在激发免疫反应那天(第45天)及在第46、48、50、52及54天时，收集血清淀粉状蛋白质A(SAA)测试用的血液。
在样品上进行的测试利用培养来评估气管擦拭上支气管败血性博德特氏杆菌的存在。将每个气管擦拭划线到肯博德特氏杆菌选择性的琼脂板上。包括正和负对照。在37.5±2.5℃下培养这些平板48±4小时。将在每片平板上所产生的菌落与正对照组比较，且进一步测试显示出与正对照组相同的任何菌落，以确定支气管败血性博德特氏杆菌存在。证实性测试包括使用TSI、柠檬酸盐及尿素琼脂及硝酸盐红介质(Nitrate Redmedia)。
使用下列下列方法来评估血清的凝集滴度、p68 ELISA分析或SAA分析凝集滴度-使用博德特氏杆菌盐水将血清连续稀释在微滴板中。每片板中包含正及负对照。使用支气管败血性博德特氏杆菌株87(在Bordet Genou琼脂上生长、采集、灭活及稀释成在630纳米下呈20％T)作为凝集抗原，且将其加入至每个孔。摇晃这些平板，并在35±2℃下温育2小时。在室温下第二次温育22小时后，读取这些平板。终点滴度可使用最后的孔显示出50％的凝集来决定。
p68 ELISA滴度-在涂布有对博德特氏杆菌p68抗原特异的多克隆抗血清的96孔微滴板上捕获该重组p68抗原。将连续二倍级数稀释的狗血清加入至该平板且温育。每片滴板上包含以1∶1000稀释的正及负对照。使用经过氧化物酶标定的亲和纯化的山羊抗狗IgG指示剂共轭物来侦测对p68抗原特异的抗体。然后加入发色底物ABTS并当正对照孔具有1.2+0.2的O.D.时读取该板。以最后稀释液的倒数计算所提供的样品的滴度，其光学密度大于该负对照血清稀释液的平均加上五个标准偏差。
SAA滴度-使用购置于Accuplex Co.University of NebraskaMedical Center，Omaha，NE 68198的试剂盒来评估狗血清淀粉状蛋白质A滴度。简单地说，在涂布有单克隆抗狗的SAA抗体的微滴板上捕获狗的SAA。将该狗血清的经稀释的样品加入至该板，随后加入经生物素标定的抗狗抗体共轭物。在温育后，加入经过氧化物酶结合的抗生蛋白链菌素发色底物。在30分钟后读取该平板。
结果直肠温度直肠温度的测量总结于表10及11。
表10在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后a)，在狗中的直肠温度(℃)的最小平方平均值
a在第0天时，施用第一次接种。
表11在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后a)，在狗中的直肠温度(℃)的最小平方平均值
a在第21天时，施用第二次接种。
在第一次接种后，在任何一天上，于任何组之间均没有注意到显著的差异。在第21天时，在接种盐水的狗及接种p68的全部狗之间均注意到有显著的差异(对T01T02 v T03T04而言，p＝0.0053)。在第24天时，在p68 SC与IM接种间表露出显著的差异(p＝0.0124)。
注射位置反应注射位置反应总结于表12及13。由于工艺误差，在第二次接种后的14天观察中(第35天)没有进行注射位置观察。
在T03(p68 SC)中观察到可测量的位置反应，且在尺寸上最小。在第3天的T04(p68 IM)的一只狗中注意到有小的注射位置反应，但是此测量的最小冲击不反映在该组的整体平均中。
表12.在接种盐水或p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌后(第一次接种后a)，在狗中的注射位置反应的最小平方平均值(cm3)
a在第0天时，施加第一次接种b标准误差，T01＝0.80、T02＝0.84、T03＝0.70及T04＝0.70c一只狗具有小的位置反应(0.5平方公分)，但是由于摄入，此最小的冲击值并不反映在整体平均中。
表13.在接种盐水或p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌后(第二次接种后a)，狗的注射位置反应的最小平方平均值(cm3)
a在第21天时，施加第二次接种b标准误差，T01＝1.12、T02＝1.19、T03＝0.92及T06＝0.92在注射位置测量上的显著差异总结于表14。在T02(盐水SC)对T03(p68 15微克SC)之间的注射位置测量的显著差异可在第一次接种后的六天注意到。第7天及再次在第14天(二周的再评估观察)时，在任何处理组之间并无注意到显著的差异。
在第二次接种后的七天，在T02(盐水SC)对T03(p68 15微克SC)之间的注射位置测量上注意到显著的差异。
表14.在注射位置反应测量的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值。
仅显示出显着的(P＜0.05)对比。
p68 ELISA滴度p68 ELISA数据总结于表15及图1。由于在经接种的狗中对p68有相当大的滴定反应，故在研究时的不同时间点处使用不同的滴定最小值。第0及21天的滴定从50开始。对第35、45及59天而言，以200开始滴定。任何报导为“少于”的值皆在分析前除以2。在研究进程中，在对照组(T01及T02)的p68 ELISA值中所观察到的增值归因于这些最小滴定值。凝集滴度仍然＜4。
当与接种安慰剂的运行比较时，全部接种p68的动物从接种的第一天至激发免疫反应那天(第0至第45天)在滴度上皆表露出至少增加四倍。
表15.在接种盐水或p68(15微克/剂量)后及在支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，狗的p68(15微克/剂量)ELISA终点滴度a的几何平均值及标准误差。
a第0及21天的滴定以50开始。第35、45及59天的滴定以200开始。任何报导为“少于”的值皆在分析前除以2。
b在第0天时进行第一次接种；在第21天时进行第二次接种；及在第45天时施加时施加激发免疫反应。
接种后及激发免疫反应后的ELISA滴度的最小平方平均值的显著差异则编列于表16中。在完成接种后，在接种p68 SC与p68 IM的动物之间并无注意到显著的差异。
表16在接种后及激发免疫反应后的p68 ELISA终点滴度的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值。
仅显示出显著的(p＜0.05)对比。
血清淀粉状蛋白质A滴度在激发免疫反应后的第0、1、3、5、7及9天的SAA值测量。血清淀粉状蛋白质A值显示于表17及表示在图2。
表17在接种盐水及p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的狗中，于以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，血清淀粉状蛋白质A滴度的几何平均值及标准误差
a在第45天时，施加激发免疫反应在SAA滴度中的显著差异总结于表18。盐水对照组的SAA滴度表露出比经接种的狗在激发免疫反应后第1、3及5天的还高。当与经接种的SC狗在激发免疫反应后第7及9天比较时，盐水SC对照组继续显示出明显较高的SAA滴度。
表18.在激发免疫反应后的血清淀粉状蛋白质A滴度的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值。
仅显示出显著的(p＜0.05)对比。
咳嗽观察在第二次接种后的24天(第45天)，对全部的处理组进行气溶胶激发免疫反应。使用二种方法来检验咳嗽观察以连续二天咳嗽为准的疾病状况(显示于表19)及咳嗽天数的百分比(显示于表20及21)。当使用连续二天咳嗽的准则来评估狗时，80％接种p68的狗(SC及IM)会至少连续二天咳嗽，然而接种盐水SC及盐水IM的狗有咳嗽的分别为100％及87.5％。当使用观察到咳嗽的天数的百分比来评估狗时，p68 SC及IM接种的狗有咳嗽的分别为观察天数的38.72％及41.05％盐水SC及盐水IM接种的狗有咳嗽的分别为69.04％及62.66％。
表19.在接种盐水及p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的狗中，在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，以连续二天咳嗽为准的疾病状况的总结
当该疾病状况以连续二天咳嗽为准时，在接种盐水及接种p68的狗之间无显示出显著的差异。
表20.在接种盐水及p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的狗中，在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，咳嗽天数的平均百分比
在T02(盐水SC)与T03(p6815微克SC)间表露出显著的差异(p＝0.0112)。在T01(盐水IM)与T04(p6815微克IM)间表露出无显著的差异。
表21.在接种盐水及p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的狗中，在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，经由处理的咳嗽天数的平均百分比
在盐水对照组与接种p68的狗之间表露出显著差异(p＝0.0022)。讨论设计该研究以阐明p68博德特氏杆菌15微克/剂量疫苗在狗中的安全性及功效。
使用注射位置及直肠温度观察来检验安全性。注射位置反应测量的分析说明在IM接种的组中可忽略反应，而在SC接种的组中有最小的反应。所观察的反应趋向于小，尺寸通常会在观察期间减少。这些反应的尺寸将最可能在未剪毛的狗中被忽略。虽然在第21天时在盐水与经接种的狗之间及在第24天时在IM与SC接种之间观察到显著的差异，但在全部的组中，全部狗的直肠温度临床不显著且皆在正常限度内。
使用p68 ELISA终点滴度的测量及咳嗽的观察来检验功效。不管施用途径，在第35天时于经p68接种的组中显示出好的p68抗体反应。在激发免疫反应后的接种者中观察到好的回忆应答。与SC途径比较，虽然传统上更多血管及较少脂肪的IM途径可获得较高的抗体反应，但在p68 SC与IM接种间的差异遍及整个研究进程并不显著。
在激发免疫反应后，在经接种及未接种p68博德特氏杆菌的狗中的SAA反应检验指出，在接种的动物组中，特别是在激发免疫反应后第1、3及5天时的SAA值很小幅提高。
结论在此研究中，使用犬激发免疫反应模型在接种后24天，来检验15微克/剂量的p68犬博德特氏杆菌疫苗的功效。疫苗的安全性可由正常的直肠温度、最小的注射位置反应表明，且可在结合的IM及SC组中说明功效。SAA值的比较表露出在气溶胶激发免疫反应后第1、3及5天，于接种盐水与p68的狗之间有显著的差异。
实施例3犬博德特氏杆菌p68疫苗持续六个月的免疫性研究动物购买九十只混合育种的雄性及雌性狗，多数的幼犬在第一次接种当天为9周(±1周)。
在狗到达研究场所后施加MLV细小病毒疫苗。气管擦拭及凝集滴度测定为对支气管败血性博德特氏杆菌呈阴性的动物适用于研究。在研究期间，并无施用实验产品以外的疫苗。
将狗保持在必需的隔离设备中，以防止在激发免疫反应前接触支气管败血性博德特氏杆菌及犬科病原体。在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，继续该隔离步骤以防止接触其它犬科病原体。
疫苗在处理组T01及T02中使用无菌的盐水作为安慰剂疫苗。在处理组T03及T04中使用犬重组p68支气管败血性博德特氏杆菌疫苗。将p68抗原的结构基因克隆在大肠杆菌中，且由温度敏感的起动子来调节基因表达。溶解细胞，并由离心机分离这些内含体。通过SDS处理来增溶在该内含体中的重组p68。将15微克的p68和60微克的p68分别与在无菌的Lepto盐水中(作为稀释剂)每毫升50微克的Quil A及50微克的胆固醇结合。在4℃下混合这些联合的组分24小时，且通过三次微流器(microfluidizer)。每1毫升的剂量包含2.7微升的乙醇及0.0001％的硫柳汞。p68在实验疫苗中的浓度可由p68 ELISA测量。全部的分析物复制五(5)份。全部的疫苗在组合后的6个月内使用。
激发免疫反应接种物以Bordet-Genou琼脂板来平板接种支气管败血性博德特氏杆菌-伯尔猫株，且在37.5+/-2.5℃下培养48小时。选择毒性阶段I菌落且划线在Bordet-Genou琼脂上，并在37.5+/-2.5℃下培养24小时。在培养后，使用博德特氏杆菌盐水来清洗来自琼脂的菌落，且将细胞稀释成在600纳米下的光学密度为0.80。激发免疫反应前及后进行细胞计数，来确证比浊计读数。激发免疫反应标的浓度大约1×109CFU。对组I而言，激发免疫反应前的浓度计数为1.94×109及激发免疫反应后的浓度计数为1.43×109。对组II而言，该激发免疫反应前的浓度计数为2.55×109及该激发免疫反应后的浓度计数为2.13×109。
研究设计总结表
以二阶段或组(在组I中由48只狗组成及在组II中为42只狗)进行研究。每个组在第0天时进行接种#1。20天后进行接种#2。在组1中的事件与在组II中的事件偏差大约15天。在最后的接种后181天，以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发狗的免疫反应。
随机选择/盲目测试根据完全随机化设计，将动物随意分配处理及分配至房间。
在每个研究组内，对从接种#1至激发免疫反应那天的期间，使用随机计划将动物随意分配处理及分配至房间(每个房间3至5只狗)。
在激发免疫反应那天，使用一般区集设计，将在研究组内经预先处理的动物随机分配至激发免疫反应房间。
确认个体资格，随意分配处理组，进行微生物学及血清学测试，且评估咳嗽及注射位置。
数据分析接种后反应变量由注射位置数据、直肠温度及p68 ELISA滴度所组成。注射位置数据总结如下1)因处理而具有可测量的反应的动物数及研究日；2)因处理而具有可测量的反应的动物时间点数；3)因处理而在任何时间点具有可测量的反应的动物数；4)每只动物的可测量的反应的持续期间。
使用一般线性混合模型，分别对第一及第二接种进行注射位置体积(cm3)、直肠温度及经自然对数转换的p68 ELISA滴度数据的分析。
通过观察时间点最小平方平均值为建构该处理的事前线性对比，以测试处理组在每个观察时间点的差异，及比较在每次处理内的时间点。有兴趣的特定比较为T01对T03、T01对T05、T03对T05、T02对T04、T02对T06及T04对T06。若时间点处理研究组(timepoint-by-treatment-by-study group)的交互作用项目(interactionterm)在P＜0.05处显著时，在每次时间点的处理组当中与在处理组内的时间点当中的对比皆在每个研究组内，否则这些对比以时间点对处理的交互作用效应最小平方平均值为准。对全部的比较而言，使用5％的显著性水准。
激发免疫反应后变量由p68 ELISA滴度、血清淀粉状蛋白质A滴度及每日的咳嗽观察所组成。如前述来分析激发免疫反应后的p68ELISA滴度。对激发免疫反应后血清淀粉状蛋白质A(SAA)滴度量数据而言，在使用一般线性混合模型分析前，对该滴度值进行自然对数转换。
改善咳嗽分析以反映出USDA需求。对每只狗而言，计算在观察咳嗽期间的观察时期的百分比。在分析前，使用反正弦平方根转换来转换该百分比。使用一般线性混合模型来分析咳嗽。
将来自此分析的最小平方平均值转换回百分比，且在咳嗽上的减低百分比可如下计算
减低百分比＝100×(对照组平均-处理组平均)/(对照组平均)建构处理最小平方平均值的事前线性对比，以测试处理组差异。有兴趣的特定比较为T01对T03、T01对T05、T03对T05、T02对T04、T02对T06及T04对T06。若研究处理组(treatment-by-study group)的交互作用项目在P＜0.05处显著时，在处理组当中的对比在每个研究组内，否则在处理组当中的对比以该处理主要有效最小平方平均值为准。对全部的比较而言，使用5％的显著性水准。
研究步骤详细的动物步骤在达到研究前提前及在第一次接种前，对幼犬进行气管擦拭支气管败血性博德特氏杆菌培养物，且收集用于凝集滴度的血液。全部的动物针对博德特氏杆菌呈气管擦拭阴性及血清学阴性，被认为合适于研究。将48只幼犬随意分配至六个处理组之一，此为组I。重复该步骤，使用42只狗做为组II。让动物适应研究场所至少5天。
组及处理详述在第7.4.A节。由于设备限制及由于提高在激发免疫反应后咳嗽观察的准确性，接种及分别的激发免疫反应时期交错15天，以产生二组狗。对组I及II二者而言，第0天指为接种#1天。20天后进行接种#2。经由皮下途径进行处理T01、T03及T05。经由肌肉内途径进行处理T02、T04及T06。在颈的背面及侧面方位进行皮下注射。对接种#1而言，使用右颈；及对接种#2而言，使用左颈。对接种#1及接种#2而言，分别在右及左半膜肌肌肉处施加肌肉内注射。在每次接种后对全部的注射位置进行三维测量七天，在接种后14天进行跟踪测量。在接种当天(在接种前)和在每次接种后三天监视直肠温度。在每次接种(在第-1天及第19天)前及在第50天时收集用于p68ELISA滴度测量的血液。
每个月，对全部经镇静的狗进行气管擦拭用于支气管败血性博德特氏杆菌培养物，以确认呈支气管败血性博德特氏杆菌阴性状态。还收集用于凝集及ELISA滴度的血液。在激发免疫反应前对每个组重复该步骤7天。将气管擦拭培养物显示阳性或凝集滴度提高的动物从研究中排除。
在接种#2后181天，对狗施加激发免疫反应。使用一次性鼻锥对经镇静的狗进行激发免疫反应，该鼻锥被舒适地安装在经镇静的狗的口套上。将该鼻锥接附于喷雾器，而该喷雾器接附于设定在5.5至6.0磅/平方英寸的真空压力泵上。将1毫升的激发免疫反应物质置于该喷雾器中，且对每只狗施加该经雾化的激发免疫反应物质4分钟。
在激发免疫反应前，改变了激发免疫反应后的咳嗽观察，以符合USDA的推荐。在激发免疫反应后，观察在激发免疫反应后第三至第十天间的每群狗，总共8天。每日观察动物咳嗽状况两次，每次观察时间大约45分钟。观察期之间的间隔大约为12小时。观察人员并不知道经记录的咳嗽观察的处理组的分配状况。
血液收集在第一次接种前、每个月及在对每个组激发免疫反应前收集用于凝集滴度的血液。
在接种#1及#2前的当天、在第50天及在大约30天之后，对每组收集用于评估抗p68 ELISA的血液。还收集激发免疫反应当天及激发免疫反应后观察的最后那天的血液。
在激发免疫反应当天(激发免疫反应前)及在激发免疫反应后1、3、5、7及9天对每组收集用于测试血清淀粉状蛋白质A(SAA)的血液。
在样品上进行的测试通过培养来评估气管擦拭是否存在有支气管败血性博德特氏杆菌。将每个气管擦拭划线到对博德特氏杆菌具选择性的琼脂板上。包括正及负对照。在37.5±2.5℃下培养这些平板48±4小时。将在每个平板上所产生的菌落与正对照比较，且进一步测试任何显示出与正的对照相同的菌落，以确认支气管败血性博德特氏杆菌存在。证实测试包括使用TSI、柠檬酸盐及尿素琼脂及硝酸盐红介质。
使用下列方法来评估用于凝集滴定、p68 ELISA分析或SAA分析的血清凝集滴度-使用博德特氏杆菌盐水将血清连续稀释在微滴板中。每片板中包含正及负对照。使用支气管败血性博德特氏杆菌株87(在Bordet Genou琼脂上生长、采集、灭活及稀释成在630纳米下呈20％T)作为凝集抗原，且将其加入至每个孔。摇晃这些平板，并在35±2℃下温育2小时。在室温下第二次温育22小时后，读取这些平板。终点滴度可使用最后的孔显示出50％的凝集来决定。
p68 ELISA滴度-在涂布有对博德特氏杆菌p68抗原特异的多克隆抗血清的96孔微滴板上捕获该重组p68抗原。将连续二倍级数稀释的狗血清加入至该平板且温育。每片滴板上包含以1∶1000稀释的正及负对照。使用经过氧化物酶标定的亲和纯化的山羊抗狗IgG指示剂共轭物来侦测对p68抗原特异的抗体。然后加入发色底物ABTS并当正对照孔具有1.2+0.2的O.D.时读取该板。以最后稀释液的倒数计算所提供的样品的滴度，其光学密度大于该负对照血清稀释液的平均加上五个标准偏差。
SAA滴度-在涂布有单克隆抗犬SAA抗体的96孔微滴板上捕获犬科血清淀粉状蛋白质A。将犬血清的经稀释的样品加入至该板并温育。加入参考标准，以获得从0.31纳克/毫升至20纳克/毫升的标准曲线。加入经生物素标定的抗犬抗体共轭物。在温育该经生物素标定的抗犬抗体后，加入结合过氧化物酶的抗蛋白链菌素。加入发色底物TMB且在30分钟读取该板。通过将样品与标准曲线比较来测量血清淀粉状蛋白质A的浓度，且通过适当的稀释因子放大。
结果除非其它方面有提到，否则结果为来自组I及II的结合数据。
气管擦拭培养及凝集滴度在研究进程中，有11只狗显示出气管擦拭培养物阳性和/或凝集滴度提高。将这些狗与任何与呈阳性的狗关在一起的狗从该研究中移除，此导致减少20只狗。从每群中移除的狗数分别为T01-4只狗，T02-2只狗，T03-3只狗，T04-1只狗，T05-5只狗，T06-5只狗。
注射位置观察注射位置反应总结于表22-25。由于工艺误差，在第21天时不对组I的狗81595收集注射位置信息。改变该实施方案以致因此在第22天时不收集在组II中的狗的注射位置反应数据，来自第22天的数据总结仅包含来自在组I中的每个处理组的八只狗的信息。没有观察任何接受IM处理的狗的注射位置反应。对于SC接种的二处理组(T03及T05)注射位置测量是最小的。
表22.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后a)狗的注射位置反应的最小平方平均值(cm3)
a接种#1，在第0天时施用b全部平均的标准误差＝0.64
表23.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后a)，狗的注射位置反应的最小平方平均值(cm3)
a接种#2，在第20天时施用b在此天的标准误差＝0.55c在此天的标准误差＝0.70d在第21天时T06的标准误差＝0.57表24.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后a)，具有可测量的注射位置反应的狗的百分比
a接种#1，在第0天时施用表25.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后a)，具有可测量的注射位置反应的狗的百分比
a接种#2，在第0天时施用b对第22天而言，n＝8c在第21天时的T06 n＝14
在注射位置测量中的显著差异则总结于表26中。在第一次接种后的七天，在T01(盐水SC)对T03(60微克SC)间注意到有注射位置测量的显著差异。在第一次接种后，仅有前四天在T01(盐水SC)与T05(15微克SC)间注意到显著的差异。在第3至7天时，在T03(60微克SC)与T05(15微克SC)间发现显著的差异。在第14天(二周的再评估观察)时，在任何组之间并无注意到差异。
在第二次接种后的七天，在T01(盐水SC)对T03(60微克SC)及T05(15微克SC)间的注射位置测量注意到显著的差异(P＝0.0138)。在第23至27天时，在T03(60微克SC)与T05(15微克SC)间发现显著的差异。第34天(二周的再评估观察时，在任何组之间无注意到差异)。
表26.在注射位置反应测量的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值。
仅显示显著的(P＜0.05)对比直肠温度直肠温度测量则总结于表27及28。改变方案，以便在第22天时不收集组II的狗的直肠温度数据，因此，第22天的数据总结仅包括在组I中每个处理组的狗的信息。
表27.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后a)，狗的直肠温度的最小平方平均值(℃)
a接种#1，在第20天时施用b标准误差＝0.09表28.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后a)，狗的直肠温度的最小平方平均值(℃)
a接种#2，在第20天时施用b标准误差＝0.08c标准误差＝0.11在第一次接种后第1天，在T02(盐水IM)与T04(60微克IM)间注意到直肠温度有显著的差异。在第二次接种后，在任何一天，在任何组之间于直肠温度上无发现显著的差异。
p68 ELISA滴度激发免疫反应前p68 ELISA数据总结于表29。由于在第19天时，在T06中组I的狗有反应，在p68 ELISA滴度的数据分析中可观察到由于组的影响。此影响小且不影响其它分析的时间点。因此，结合自组I及II的数据用于报告目的。
在经接种的狗中，由于对p68有相当大的滴度反应，在此研究中，在不同的时间点使用不同的滴定最小值。第-1及19天的滴定以50开始。对第50至195天而言，滴定以200开始。在第201及211天时收集的样品的滴定以1000开始。任何报导为“少于”的值，在分析前皆除以2。在研究进程中，在对照组(T01及T02)的p68 ELISA值中所观察到的增值归因于这些最小滴定值。除了如先前提到的外，凝集滴度仍然＜4。
在第50天时，全部接种安慰剂的狗皆具有p68滴度＜200。在第二次接种后(第0天对第50天)，当与接种安慰剂的动物比较时，全部接种p68的动物的滴度显示出增加至少四倍。
表29.在接种p68博德特氏杆菌后，在第0天及第20天时，狗的p68ELISA终点滴度的几何平均值及标准误差。
a第-1及19天的滴定以50开始。任何报道为“少于”的值在分析前皆除以2b第50天的滴定以200开始。任何报导为“少于”的值在分析前皆除以2接种后ELISA滴度的最小平方平均值的显著差异列于表30。在接种前(第-1天)、在SC对照与SC接种间或在IM对照与IM接种间，在p68 ELISA滴度上并无观察到显著的差异。
表30.在接种后p68 ELISA终点滴度的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值。
仅显示显著的(P＜0.05)对比在研究进程中所测量的p68 ELISA滴度总结于表31并显示于图3。
在此研究进程中，尝试每种方法以协调在组I及II间的活动。对关键的数据收集时间点(即环绕着接种及激发免疫反应的事件)而言，此可实现。在此研究的过渡期间的三个例子中，组之间的血液及气管擦拭的收集会变化1或2天。为了总结及报导此过渡期间的p68 ELISA数据，结合了这些天的数据。因此，第79天包括来自第79天(组I)与第81天(组II)的结合数据，第111天与第110天(组II)及第111天(组I)相应，而第169天则与第169天(组II)及第170天(组I)相应。根据所述方案，不对超过第50天的p68 ELISA数据进行数据分析。
表31.在接种及以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，在未接种及接种p68博德特氏杆菌的狗中的p68 ELISA终点滴定的几何平均值的总结
a第50至195天的滴定以200开始。在第201及211天时所收集的样品的滴定以1000开始。任何报导为“少于”的值在分析前皆除以2。
b接种#1及#2，分别在第0及20天施用。在第201天施加激发免疫反应。
c在此研究进程中，尝试每种方法以协调在组I及II间的活动。在三个例子中，组的血液收集会变化1或2天。为了数据总结，结合了来自这些天的数据。不对在超过第50天所收集的p68 ELISA滴度值进行分析。第79天与第79及81天相应，第110天与第110及111天相应，第169天与第169及170天符合。
咳嗽观察在第二次接种后，对二组进行181天的气溶胶激发免疫反应。为了符合USDA推荐，将咳嗽标准改变成大约45分钟的观察，在激发免疫反应后第三至八天大约间隔十二小时。咳嗽观察总结于表32及33。
表32.在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，在未接种及接种p68博德特氏杆菌的狗中的咳嗽时间点的平均百分比
表33.在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，在未接种及接种p68博德特氏杆菌的狗中的处理的咳嗽时间点的平均百分比
当与盐水对照组比较时，对15微克/剂量组的咳嗽减低百分比为51.55％，对60微克/剂量组为11.09％。统计学显著差异总结于表34。
表34.在咳嗽时间点的百分比的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值
(仅显示显著的(P＜0.05)对比。)血清淀粉状蛋白质A在激发免疫反应后第0、1、3、5、7及9天时测量SAA值。血清淀粉状蛋白质A值显示于表35及表示在图4。
表35在以支气管败血性博德特氏杆菌气溶胶激发免疫反应后，在未接种及接种p68博德特氏杆菌的狗中，血清淀粉状蛋白质A滴度的几何平均值及标准误差
a在第201天时施加激发免疫反应SAA滴度的显著差异总结于表36。
表36.在血清淀粉状蛋白质A滴定激发免疫反应后的最小平方平均值当中，事前对比的显著性值。
仅显示显著的(P＜0.05)对比。
讨论设计该研究以显示出重组p68博德特氏杆菌疫苗在狗中的安全性及六个月的功效。15微克/剂量及60微克/剂量疫苗二者皆显示出安全性。在研究上，15微克/剂量可良好地支持免疫性功效及6个月的持续性。
使用注射位置及直肠温度观察来检验安全性。注射位置反应测量的分析显示出在IM接种的组中并无反应，且在接种15微克/剂量与60微克/剂量SC的二组中有最小的反应。在接种15微克/剂量SC的狗中，所观察到的反应趋向于较小。此已看见的反应短暂，通常在14天或较少会消除。这些反应的尺寸在注射位置未剪毛的狗中最可能被忽略。接种后的直肠温度不显著，且对全部组的全部狗而言皆在正常限度内。
使用咳嗽观察及p68 ELISA终点滴度的测量来检验从接种后181天的免疫性功效及持续期间。在盐水对照组中的咳嗽百分比(78.26％)指出施加至该研究动物的免疫抗原计量为可接受的。当与对照组比较时，15微克/剂量组的咳嗽时间点的百分比(37.92％)说明在咳嗽上减低51.55％，而满足由USDA所规定的功效要求。当与对照组比较时，在60微克/剂量组中显示出并无保护性(69.58％)，而狗在咳嗽上显示极小的减弱。
虽然统计学上无比较，但可从表29及31中看见，当与IM接种比较时，SC接种趋向具有较高的抗体反应。为了讨论的目的，进一步评论则考虑到不同的剂量组结合IM及SC施用途径的结果。
不管施用途径，在二经接种的组中的第50天时皆显示出优良的p68抗体反应，且由该接种反应可持续整个研究进程。在激发免疫反应后，该接种者可观察到好的回忆应答。
比较15微克/剂量与60微克/剂量在研究进程中的p68 ELISA滴度可显示出，60微克/剂量组具有稍微较高的滴度反应(图3)。此反应虽然优良，但不与在气溶胶激发免疫反应后的保护有相互关联。p68ELISA滴度反应在从该研究移除了具有气管擦拭呈阳性或升高的凝集滴度的狗的狗中是变化的。从该研究移除了具有气管擦拭培养物呈阳性和/或升高的凝集滴度的六个对照的三个，维持p68 ELISA滴度＜200。此显示出p68 ELISA滴度与从该研究移除的狗的气管擦拭或凝集滴度状况并无相关联性。
在接种及未接种p68博德特氏杆菌的狗中，在激发免疫反应后，SAA反应的检验指出SAA值在15微克/剂量组中仅稍微升高，特别是在激发免疫反应后第5及7天。
结论在此研究中，在接种后6个月，使用犬激发免疫反应模型来检验15微克/剂量与60微克/剂量的p68犬博德特氏杆菌疫苗的功效。由正常直肠温度及最小的注射位置反应可说明二疫苗皆安全。虽然接种15微克/剂量与60微克/剂量二者的狗对接种皆显示出好的血清学反应(如可由p68 ELISA滴度来测量)，在接种60微克/剂量的狗中，该反应与临床保护无相互关联性。当接种60微克/剂量的狗与未接种的对照比较时在咳嗽上没有显示出显著差异。当与对照组比较时，15微克/剂量疫苗的好功效则可由减低大于50％的咳嗽来说明。假定SDS在60微克/剂量疫苗中的增加程度可在保护上造成明显的差异。SAA值的比较可说明在接种与对照组间的差异。
实施例4VANGUARDPlus 5/CV-L的安全性及功效VANGUARDPlus 5/CV-L为一种经冷冻干燥的制剂，其由CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV的减毒株和犬钩端螺旋体及黄疸出血型钩端螺旋体的灭活的完整培养物，加上灭活的CCV与佐剂的液体制剂所组成。全部的病毒皆在经建立的细胞系上增殖。CPV部分可通过在该犬细胞系上低传代而减毒，而该细胞系可于表38所指出的程度下提供该CPV能使母体抗体干扰无效的免疫性质。所述液体组分可使用来再水合该经冷冻干燥的组分，该组分已以惰性气体封装而取代真空包装。
实验室评估已说明经VANGUARDPlus 5/CV-L免疫的狗可对抗CD、ICH、CAV-2及CPI呼吸道疾病、由CCV及CPV所造成的肠炎、及由犬钩端螺旋体及黄疸出血型钩端螺旋体所造成的螺旋体病，且在这些疫苗部分当中不存在有免疫学干扰。大范围的安全性测试显示出其安全，且在正常使用条件下于年龄如6周的狗中基本上无反应。
此也说明CAV-2疫苗可交叉保护对抗由CAV-1所造成的ICH。研究说明CAV-2不仅保护对抗ICH，而且同样对抗CAV-2呼吸道疾病。在所进行的测试中，2型犬腺病毒激发免疫反应病毒不会从接种CAV-2的狗重新获得。
在VANGUARDPlus 5/CV-L中的CPV部分已接受广泛的安全性及功效测试。其在实验室测试中及在范围条件下的临床测试中显示出安全及基本上无反应。产物安全性可进一步由backpassage研究说明，其包括口服给药多次剂量的疫苗株至易感狗群，其仍然全部正常。
研究说明3次含有增加的CPV病毒滴度的疫苗剂量可克服与母体抗体相关的血清中和(SN)滴度。如低至1∶4的血清中和滴度已由其他人显示出会干扰使用传统的经改性的活疫苗的自身免疫作用。以50只6周大的幼犬来进行临床测试[25只经接种(SN滴度范围-256)及25只为未接种的对照组(SN滴度范围4-1024)](表37)。接种组接受3次剂量，从6周的年龄开始间隔3周进行一次接种。在第1次接种后，13/25只幼犬在CPV SN滴度(血清转化)上显示出增加4倍或较大(表38)。这13只幼犬的十二只在第一次接种时的母体SN滴度≤1∶16，剩余的幼犬的SN滴度为1∶64。另外9只具有起始SN滴度在1∶16至1∶256间的幼犬会在第二次接种后血清转化。其母体抗体SN滴度在第二次接种时已下降至≤1∶64。类似地，最后3次具有1∶128的起始SN滴度的接种，在其母体抗体CPV滴度降至≤1∶64后，在第三次接种后血清转化。因此，在此研究中，当从年龄6周开始提供3次疫苗剂量后，全部25只接种狗(甚至具有最高母体抗体程度的那些)会变成自动免疫(GM＝1∶1176；SN滴度的范围128-4096)。在第三次以异种CPV激发免疫反应病毒接种3周后，对全部50只的狗激发免疫反应。25只未接种的对照狗有14只死亡或显示出严重足以授权安乐死的病症，然而全部25只接种狗基本上仍然健康。因此，在VANGUARDPlus 5/CV-L中高滴度、低传代的疫苗病毒具高免疫性且能于母体抗体存在下刺激自动免疫性。
VANGUARDPlus 5/CV-L的CCV部分的功效已在大量的接种激发免疫反应研究中说明。十六只7至8周大的幼犬以VANGUARDPlus5/CV-L接种(接种狗)及17只以VANGUARDPlus 5/L接种(对照组)。全部的幼犬以3周的间隔接受三次1毫升的剂量。在第三次接种后三周，以毒性株CCV(CV-6)对幼犬进行激发免疫反应。监视在感染后的临床观察、温度、体重及血液参数21天。当与对照组比较时，CCV接种狗表现出减低的腹泻发生率及毒性CCV脱落的量。在激发免疫反应后21天，对小肠部分切片的毒性CCV进行萤光性抗体染色，在CCV接种狗与对照组之间可侦测的CCV抗原表现出显著地减低(P)(表39)。
表37接种及对照组的起始血清中和(SN)滴度
表38.接种后血清中和(SN)滴度的几何平均值(范围)a
a在年龄6、9及12周接种的狗。
b激发免疫反应前的SN滴度表39.在激发免疫反应后21天，小肠部分切片的萤光性抗体染色
结论在此研究中，包含CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV与犬钩端螺旋体及黄疸出血型钩端螺旋体及CCV的灭活的完整培养物的经佐剂化的联合疫苗显示出，当使用在幼犬时具有作为疫苗安全性和有效性。该联合疫苗也显示出可克服与母体抗体相关的血清中和(SN)滴度。
实施例5犬博德特氏杆菌天然的p68免疫原性研究动物此研究包括二窝SPF小猎犬及二窝随机来源的狗。将狗随意分配成经接种或无接种的组。此研究包括总共10只经接种及11只无接种的狗。
实验疫苗的制备从48小时Bordet-Gengou血液琼脂敷开板中采集支气管败血性博德特氏杆菌(110H株)，以5至10毫升的热萃取缓冲液洗涤该板表面。再者，利用离心机抛弃上层液部分以采集在二培养物(CharlotteParker所定义的介质)中生长的细胞。将所采集的细胞悬浮在25mMTris-HCl，pH8.8中，且在60℃下培养1小时。利用离心机，以20,000×克在4℃下将细胞碎物与热萃取物分离30分钟。将叠氮化钠(0.01％)加入至该热萃取液的上层液部分，然后利用多微孔性过滤进一步净化。
可使用标准步骤，通过将单克隆抗体(经标示的Bord 2-7)与经CNBr活化的琼脂糖凝胶4B结合而制备单克隆抗体亲和树脂。将大约30.35毫克的单克隆抗体结合至1克的亲和树脂。以大约1升萃取物对20毫升树脂的比率来结合该经净化的热萃取上层液部分(上部)与Bord 2-7亲和树脂。
通过在环境温度下温育该混合物，伴随着温和摇晃，过夜，接着沉淀树脂并抽出上层液部分促使天然p68与树脂的结合。然后将该树脂填入直径2.6公分的管柱，并相继以PBS(pH7.5)及10mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)使用5毫升/分钟的流速来清洗该管柱。当在280纳米处的吸收到达基线程度时，使用100mM的三乙基胺来洗脱键结物质，且收集在280纳米处的吸收呈单一大波峰的馏分，利用ELISA来测试p68的存在。混合包含p68的馏分且对PBS透析以移除三乙基胺。
以包含大约100微克的经纯化的p68与1％的氢氧化铝凝胶来制备系列配制的实验疫苗。在1毫升的最后疫苗剂量的体积中，使用福尔马林(0.01％)作为防腐剂。
激发免疫反应接种物实质上如描述在上述实施例一般制备激发免疫反应物质。
研究步骤将二十一(21)只血清反应及培养物呈阴性的幼犬随意分配成二个处理组。十一只狗分配至无接种组(对照组)及十只狗为接种组。第0天标示为第一次接种当天。在第0天时，皮下给药一毫升的疫苗及21天后重复。在第一及第二次接种前收集血清学的p68 ELISA用的血液。
在第35天时(在第二次接种后14天)，如上所述对全部的狗施加支气管败血性博德特氏杆菌的气溶胶激发免疫反应。如描述于先前实施例，在激发免疫反应后，监视动物的咳嗽14天。
结果临床观察及对p68的血清学反应的总结显示于表40。
表40临床观察及血清学反应的总结
讨论在此研究中，10只对照狗有10只至少连续咳嗽二天。若狗连续咳嗽二天则其视为临床生病。借此标准，100％无接种的对照狗生病。在接种组中，在激发免疫反应后第4天有一只狗咳嗽，且在激发免疫反应后4及6天有一只狗咳嗽。二只狗在第14天咳嗽。经接种的狗并无连续二天咳嗽。因此，在接种天然的p68的狗组中，在激发免疫反应后100％判断为保持正常。
结论此测试说明天然p68疫苗对抗支气管败血性博德特氏杆菌疾病的保护能力。
序列表<110>Dominowski，Paul J.
Frantz，Joseph C.
Krebs，Richard L.
Shields，Shelly L.
Sorensen，Robert G.
<120>对抗支气管败血性博德特氏杆菌的犬疫苗<130>16112(PC25496A)<140>60/443,418<141>2003-01-29<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>602<212>PRT<213>支气管败血性博德特氏杆菌<400>1Asp Pro Asn Thr Val Ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gln His Gly1 5 10 15Ile His Ile Lys Gln Ser Asp Gly Ala Gly Val Arg Thr Ala Thr Gly20 25 30Thr Thr Ile Lys Val Ser Gly Arg Gln Ala Gln Gly Val Leu Leu Glu35 40 45Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gln Asn Gly Ser Val Thr Ser Ser50 55 60Gly Gln Leu Phe Asp Glu Gly Val Arg Arg Phe Leu Gly Thr Val Thr65 70 75 80Val Lys Ala Gly Lys Leu Val Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Val85 90 95Ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr Val Ala Gly Glu100 105 110Gln Ala Gln Ala Ser Ile Ala Asp Ser Thr Leu Gln Gly Ala Gly Gly115 120 125Val Arg Val Glu Arg Gly Ala Asn Val Thr Val Gln Arg Ser Thr Ile130 135 140Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu145 150 155 160
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Ile His Ile Lys Gln Ser Asp Gly Ala Gly Val Arg Thr Ala Thr Gly20 25 30Thr Thr Ile Lys Val Ser Gly Arg Gln Ala Gln Gly Val Leu Leu Glu35 40 45Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gln Asn Gly Ser Val Thr Ser Ser50 55 60Gly Gln Leu Phe Asp Glu Gly Val Arg Arg Phe Leu Gly Thr Val Thr65 70 75 80Val Lys Ala Gly Lys Leu Val Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Val85 90 95Ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr Val Ala Gly Glu100 105 110Gln Ala Gln Ala Ser Ile Ala Asp Ser Thr Leu Gln Gly Ala Gly Gly115 120 125Val Arg Val Glu Arg Gly Ala Asn Val Thr Val Gln Arg Ser Thr Ile130 135 140Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu145 150 155 160Asp Leu Pro Pro Ser Arg Val Val Leu Gly Asp Thr Ser Val Thr Ala165 170 175Val Pro Ala Ser Gly Ala Pro Ala Ala Val Ser Val Phe Gly Ala Asn180 185 190Glu Leu Thr Val Asp Gly Gly His Ile Thr Gly Gly Arg Ala Ala Gly195 200 205Val Ala Ala Met Asp Gly Ala Ile Val His Leu Gln Arg Ala Thr Ile210 215 220Arg Arg Gly Asp Ala Pro Ala Gly Gly Ala Val Pro Gly Gly Ala Val225 230 235 240Pro Gly Gly Phe Gly Pro Leu Leu Asp Gly Trp Tyr Gly Val Asp Val245 250 255Ser Asp Ser Thr Val Asp Leu Ala Gln Ser Ile Val Glu Ala Pro Gln260 265 270
Leu Gly Ala Ala Ile Arg Ala Gly Arg Gly Ala Arg Val Thr Val Ser275 280 285Gly Gly Ser Leu Ser Ala Pro His Gly Asn Val Ile Glu Thr Gly Gly290 295 300Gly Ala Arg Arg Phe Pro Pro Pro Ala Ser Pro Leu Ser Ile Thr Leu305 310 315 320Gln Ala Gly Ala Arg Ala Gln Gly Arg Ala Leu Leu Tyr Arg Val Leu325 330 335Pro Glu Pro Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Gly Ala Gln Gly Gln Gly340 345 350Asp Ile Val Ala Thr Glu Leu Pro Pro Ile Pro Gly Ala Ser Ser Gly355 360 365Pro Leu Asp Val Ala Leu Ala Ser Gln Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr370 375 380Arg Ala Val Asp Ser Leu Ser Ile Asp Asn Ala Thr Trp Val Met Thr385 390 395 400Asp Asn Ser Asn Val Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ser Val405 410 415Asp Phe Gln Gln Pro Ala Glu Ala Gly Arg Phe Lys Cys Leu Met Val420 425 430Asp Thr Leu Ala Gly Ser Gly Leu Phe Arg Met Asn Val Ala Phe Ala435 440 445Asp Leu Gly Leu Ser Asp Lys Leu Val Val Met Arg Asp Ala Ser Gly450 455 460Gln His Arg Leu Leu Val Arg Asn Ser Gly Ser Glu Pro Ala Ser Gly465 470 475 480Asn Thr Met Leu Leu Val Gln Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Thr Phe485 490 495Thr Leu Ala Asn Lys Asp Gly Lys Val Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Tyr500 505 510Arg Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Gln Trp Ser Leu Val Gly Ala Lys515 520 525
Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly530 535 540Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Arg Gln545 550 555 560Pro Glu Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ala Gly Arg Glu Leu Ser Ala565 570 575Ala Ala Asn Ala Ala Val Asn Thr Gly Gly Val Gly Leu Ala Ser Thr580 585 590Leu Trp Tyr Ala Glu Ser Asn59权利要求
1.疫苗组合物，其包含一定量的支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原及佐剂，以有效保护狗对抗支气管败血性博德特氏杆菌。
2.如权利要求1的疫苗组合物，其中该支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且该抗原是重组制备的。
3.如权利要求1的疫苗组合物，其中该佐剂包含Quil A及胆固醇。
4.保护狗对抗支气管败血性博德特氏杆菌的方法，其包括将如权利要求1至3中任一项的疫苗组合物施用于狗。
5.用于使狗对于犬科病原体免疫的联合疫苗，其包含犬瘟热(CD)病毒的减毒株、2型犬腺病毒(CAV-2)的减毒株、犬副流感病毒(CPI)的减毒株及犬细小病毒(CPV)的减毒株的制剂，犬冠状病毒(CCV)株的灭活的完整或部分细胞制剂、支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质及佐剂。
6.如权利要求5的联合疫苗，其中该支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且该抗原是重组制备的。
7.如权利要求5的联合疫苗，其中该佐剂包含Quil A及胆固醇。
8.用于使狗对于犬科病原体免疫的联合疫苗，其包含犬瘟热(CD)病毒的减毒株，2型犬腺病毒(CAV-2)的减毒株、犬副流感病毒(CPI)的减毒株及犬细小病毒(CPV)的减毒株的制剂、犬冠状病毒(CCV)株的灭活的完整或部分细胞制剂、支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质、至少一种选自于由感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体所组成的组的螺旋体的螺旋体细胞制剂，以及佐剂。
9.如权利要求8的联合疫苗，其中该螺旋体细胞制剂包含布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体细胞制剂。
10.如权利要求8的联合疫苗，其中该支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且该抗原是重组制备的。
11.如权利要求8的联合疫苗，其中该佐剂包含Quil A及胆固醇。
12.用于使狗对于犬科病原体免疫的联合疫苗，其包含犬瘟热(CD)病毒的减毒株、2型犬腺病毒(CAV-2)的减毒株、犬副流感病毒(CPI)的减毒株及犬细小病毒(CPV)的减毒株的制剂；支气管败血性博德特氏杆菌p68蛋白质、螺旋体疫苗，该螺旋体疫苗包含至少一种选自于由布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体所组成的组的螺旋体的细胞制剂；以及佐剂。
13.如权利要求12的联合疫苗，其中该螺旋体疫苗包含布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体的细胞制剂。
14.如权利要求12的联合疫苗，其中该支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且该抗原是重组制备的。
15.如权利要求12的联合疫苗，其中该佐剂包含Quil A及胆固醇。
全文摘要
本发明涉及一种用来保护狗对抗由支气管败血性博德特氏杆菌所引起的疾病的疫苗及方法。本发明也涉及一种用来保护狗对抗由犬科病原体所引起的疾病或病症的联合疫苗及方法，该疾病或病症例如有由支气管败血性博德特氏杆菌所造成的传染性气管与支气管炎、由犬瘟热(CD)病毒所造成的犬瘟热、由1型犬腺病毒(CAV－1)所造成的传染性犬肝炎(ICH)、由2型犬腺病毒(CAV－2)所造成的呼吸道疾病、由犬副流感病毒所造成的犬副流感、由犬冠状病毒(CCV)及犬细小病毒(CPV)所造成的肠炎及由布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体或波摩那钩端螺旋体所造成的螺旋体病。本发明的疫苗包括支气管败血性博德特氏杆菌p68抗原。
文档编号A61K39/39GK1835767SQ200480003087
公开日2006年9月20日 申请日期2004年1月15日 优先权日2003年1月29日
发明者P·J·多米诺夫斯基, J·C·弗朗茨, R·L·克莱布斯, S·L·希尔兹, R·G·索兰森 申请人:辉瑞产品公司