组织再生的制作方法

专利名称：组织再生的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物组织的再生和修复。具体地说，本发明涉及但并非仅仅涉及使用生物相容的组合物促进神经元组织的生长、再生和/或修复。
使用自体移植材料修复神经有几个缺点，包括供体部位病态、功能恢复不充分和异常再生。人们已致力于寻找用于搭接神经间隙的自体移植物的替代物。已研究了许多管型(entubulation)材料，但与自体移植物相比，结果通常让人失望。最近，外周神经研究致力于制出有望克服这些问题的合成神经导管。许多实验室都使用可通过水解并溶解分解产物而从工程化组织中去除的、合成的可生物降解的聚合物，与许旺细胞一起，制造用于修复分支外周神经的优良修补物(Hadlock等(1998)Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1241081；Hadlock等(2000)Tissue Eng，6119；Bryan等(2000)Tissue Eng，6129)。神经和血管等组织的功能依赖于细胞的受控定向。对于许多组织细胞类型，需要一定的空间结构来确保发生细胞间相互作用。合成材料可设计为模拟天然发育过程中遇到的细胞微环境。例如，可生物降解的聚合物表面可以设计为呈递含有氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽。该序列结合细胞表面的整联蛋白受体，诱导细胞粘着、扩散和胞内信号传递，由此模仿细胞与胞外基质的交互作用。
有许多技术可使生物分子以微米级的精确度固定于表面。这些技术包括平版印刷法(lithographic method)和微接触印刷技术(micro-contact printing technique)，前者使用带布图的掩膜限制光束、离子或电子与表面相互作用的位置。然而这些技术限制了可布图的配体和表面的类型。
如WO99/36107所示，可以在可生物降解的嵌段共聚物表面产生微米级的生物素化配体布图，从而实现以纳米精确度控制生物分子的附着。这可通过使用原子力显微镜对布图表面的蛋白分子进行分子级分辨来加以证实。该系统已在培养的牛主动脉内皮细胞和PC12神经细胞中进行了测试，并显示出对细胞发育的空间控制作用。在聚合物表面，PC12细胞神经突的延伸可以受由包含IKVAV序列的肽组成的布图式样指导(Patel等(1998)FASEB J，121447；Cannizaro等(1998)Biotechnol Bioeng，58529)。
以上系统使用的聚合物通常为生物素化的聚乙二醇(PEG)和聚乳酸(PLA)的嵌段共聚物，该聚合物利用生物素-亲和素的高亲和力偶联作为制造后的表面处理手段。这些聚酯对酸催化的水解敏感，因而可生物降解。可以控制生物降解的速度，因而这些聚合物可用于治疗剂的受控释放。为此目的，还研究了与此相关的一类聚合物即聚原酸酯的pH敏感性(Leadley等(1998)Biomaterials，191353-60)。
然而，先前使用的所有方法均有一个缺点。为了维持自身及神经突生长，神经元需要多种生长因子的存在。细胞培养条件下进行的实验通常有胎牛血清或添加的生长因子存在。然而在体内正常情况下，循环中的生长因子的水平太低，无法对神经再生起作用。
神经生长因子(NGF)为神经营养蛋白(neurotrophin)家族成员之一。其他家族成员包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT3)和神经营养蛋白-4(NT4，有时称为NT4/5或NT5)。所有神经营养蛋白均与同一受体即p75NGFR结合。通过它们与酪氨酸受体激酶(Trk)的相互作用确定特异性，该相互作用的Kd值约为10-10～10-11M。
TrkA的性质记载于WO99/53055。TrkA结构示意图附于

图1。免疫球蛋白(Ig)样结合域2(TrkAIg2)的核苷酸序列和推得的氨基酸序列附于图2。
NGF与TrkA结合，BDNF及NT4与TrkB结合，NT-3与TrkC及另一种剪接形式的TrkA结合，所述剪接形式的TrkA在其Ig样结合域2中具有六氨基酸的插入序列VSFSPV(图2中以下划线标出)。
大多数外周神经和脊神经都需要一种或多种神经营养蛋白的存在才能存活。最近的研究指出，神经营养因子在轴突切除后帮助发育中的和成熟的神经系统的存活中起到重要的作用。轴突切除后，神经元在再生前首先需要存活下来。神经营养蛋白救助未成熟(Diener和Bregman(1994)Neuroreport，51913)和成熟(Shibayama等(1998)，JComp Neurol，390102)的轴突切除的中枢神经系统(CNS)神经元，防止退行性细胞死亡。外周神经系统(PNS)神经元的轴突切除常导致有助于再生的再生相关基因的上调。在靠近细胞体进行轴突切除后CNS中的这些基因只是瞬时增加，而在损伤靠近末梢时不是这样。在这种情况下需要对再生相关基因进行更长时间的诱导才能够实现再生。神经营养蛋白能够增强再生相关基因(如c-Jun，、GAP-43、Taltubulin)的表达。在培养的成熟背根神经节细胞(dorsal rootganglion cell，DRG)中，轴突生长的形式(分枝或伸长)取决于不同的基因表达模式(Smith和Skene(1997)J Neurosci，17646)。例如，BDNF增强GAP-43的表达，支持分枝过程。
一些研究人员移植经过遗传修饰的细胞，这些细胞可在损伤部位分泌NGF等生长因子(Grill等(1997)Exp Neurol，148444)，而另一些人把目光投向与卵清蛋白一起封装的NGF从可生物降解的聚合微球体上释放的情况，所述聚合微球体的例子有从PLGA 50/50、PLGA85/15、PCL和混合的PCL/PLGA 50/50制备的聚合微球体(Cao和Schoichet(1999)Biomaterials，20329)。发现NGF可释放并保持生物活性至少3个月之久。
其他研究人员已试图将胚胎细胞植入脊髓的损伤部位。脊髓损伤和移植后，体内轴突凸出的重建由神经营养因子的可得性调节。成人中，外源NGF促进经历轴突切除的背根轴突长入脊髓(Oudega和Hagg(1996)Exp Neurol，140218；Oudega等(1994)Exp Neurol，129194)。将成人脊髓切除一半并植入胚胎脊髓后，外源给予BDNF、NT3和NT4增加了神经索长入胚胎移植物的数量。睫状节神经营养因子(CNTF)达不到此效果。BDNF和NT3也支持脑干纤维再生长进入放置于成年大鼠的胸水平损伤中的许旺细胞移植物(Xu等(1995)Exp Neurol，134261)。经修饰可分泌NGF和NT3的细胞，植入脊髓之后可影响向脊髓凸出的神经元的轴突生长(Tuszynski等(1996)Exp Neurol，137157；Grill等(1997)J Neurosci，175560)，并与改善运动功能相关(Grill等(1997)J Neurosci，175560)。
NT3和BDNF还在脊髓挫伤损伤后诱导再生轴突的少突胶质细胞增殖和髓鞘形成(McTigue等(1998)J Neurosci，185354)。
最近的研究证实，除了急性损伤之外，神经营养蛋白还可以在慢性损伤中促进再生长(Ye和Houle(1997)Exp Neurol，14370；Houle等(1997)Restorative Neurol Neurosci，10205；Houle和Ye(1997)Neuroreport，8751)。
上述现有技术表明神经营养生长因子在神经元存活、修复和再生中的重要性，以及在体外可生物降解的聚合物支架上培植神经元组织的可能性，同时也留下一个问题在主要的生长因子的浓度较低的条件下，怎样才能有效培养神经元细胞，而且也没有解决怎样控制神经元生长的速度和方向。
本发明的目的是提供能够支持神经元和其他组织和细胞的生长、再生和/或修复，并能够避免现有技术中遇到的问题的产品及其应用。
因此，本发明在第一方面提供一种生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物可促进神经元的受控生长、再生或修复，所述组合物包括由可生物降解和生物相容材料制成的支架，以及位于或邻近支架表面的酪氨酸受体激酶(Trk)、或其神经营养蛋白结合性片段或其同源物。
本文使用的术语″可生物降解的″是指在暴露于pH6.0到8.0、温度25到37℃的生理介质或生理型介质条件下，能够被分解、断裂和/或溶解。发生这种分解、断裂和/或溶解经历的时间取决于组合物的预期应用。通常时间为少于或大约五年，更常见的是在一个星期到一年之间。本文使用的术语″生物相容的″是指用于体内时，此术语所指的材料及其生物降解产物不具有不可接受的毒性、免疫原性、过敏原性或促炎症作用。本文使用的术语″支架″是指在其上、其中或通过它可支持细胞的生长、再生或修复的任何结构。
本发明的组合物优选包括结合于Trk或Trk片段或同源物的一种或多种神经营养蛋白。神经营养蛋白可选自神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养蛋白-3和神经营养蛋白-4。
组合物中的Trk可以是TrkA、B或C；其另外的剪接形式；广谱Trk(即能够与所有神经营养蛋白结合的Trk)；Trk的功能性同源物或几种Trk类型的组合。还包括Trk同源物的片段和Trk片段的同源物。在优选的实施方案中，Trk的神经营养蛋白结合性片段包括TrkA的免疫球蛋白(Ig)样亚结构域，优选Ig样亚结构域2(TrkAIg2或TrkAIg2.6，即图2所示的氨基酸22到150，其中130到135六个氨基酸只存在于TrkAIg2.6剪接变体)。另外，Trk的神经营养蛋白结合性片段可包含TrkA的两个Ig样亚结构域(TrkAIg1，2)。这些TrkA片段优选还包括富含脯氨酸区。当使用TrkA的Ig样亚结构域2时，不管是单独使用还是与Ig样亚结构域1同时使用，它优选包括氨基酸插入序列VSFSPV(TrkAIg2.6，插入序列在图2中示为氨基酸130到135)。神经营养蛋白结合性Trk片段可以包含图2所示的全部序列(TrkAIg2.6-6His)或由其组成。
当组合物包括一种或多种神经营养蛋白时，如果使用TrkA或其神经营养蛋白结合性片段，神经营养蛋白优选选自NGF和NT3。如果使用TrkB或其神经营养蛋白结合性片段，神经营养蛋白优选选自BDNF和NT4。如果使用TrkC或其神经营养蛋白结合性片段，优选NT3。
本发明的一些实施方案中，组合物还包括位于或邻近支架表面的一种或多种胞外基质组分。这些胞外基质组分可包含含有序列RGD、YIGSR和/或IKVAV的肽，以促进整联蛋白或其他细胞表面受体介导的神经元延伸和生长因子反应。
在主要为亲水性生物材料如PLA-PEG-生物素上培养的细胞，需要另外存在胞外基质分子才能使细胞粘附于表面。
所述胞外基质分子包括胶原、蛋白聚糖、弹性蛋白、透明质酸和糖蛋白如纤连蛋白(FN)、玻连蛋白(VN)和层粘连蛋白(LN)。这些分子上发现的短肽结构域负责与细胞表面粘附受体即整联蛋白相互作用。这些受体的结合不但促进细胞粘附，而且触发细胞间事件如迁移、扩散和表型表达。尽管整个胞外分子均可与生长因子修饰的表面组合使用，但完整的粘附分子通常与很多细胞类型作用，特异性程度也不同。因此优选使用分离的短肽序列，以制备与靶细胞类型特异性相互作用的材料，产生预先确定的反应。
整联蛋白结合性肽序列的例子包括普遍存在的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，和异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、亮氨酸-精氨酸-谷氨酸(LRE)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)片段，其中RGD序列与大多数细胞类型相互作用，后三种片段从层粘连蛋白中分离，已经证实可促进神经元发育。这些肽序列可组合应用，通过使用侧翼肽序列提高序列的可接近性，可以提高这些肽序列的活性。
在设计粘附肽修饰的表面时，必须确定最佳的表面浓度。粘附配体的最小密度为细胞粘附和迁移所必需，而高密度肽由于粘附力太强会抑制细胞的迁移(Huttenlocher，Sandborg，Horwitz(1995)Adhesionin cell migration.Curr.Opin.Cell Biol.，7697-706)。因此需要中等程度的附着力来诱导最大的迁移速率(Schense，Hubbell(2000)Three-dimensional migration of neurites is mediated by adhesion sitedensity and affinity.J.Biol.Chem.，2756813-6818；Palecek，Loftus，Ginsberg，Lauffenburger，Horwitz(1997)Integrin-ligand bindingproperties govern cell migration speed through cell-substratumadhesiveness.Nature，385537-540)。
支架的材料优选可生物降解的和生物相容的聚合物。可生物降解的和生物相容的聚合物可选自聚羟基酸，如聚羟基丁酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚ε-己酸、聚ε-己内酯、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈和聚磷酸盐/酯；多糖，如透明质酸；蛋白，如胶原；聚氨基酸；聚伪氨基酸(pseudo amino acid)；以及由任何此类聚合物的单体制备的共聚物。优选乳酸或羟基乙酸的聚合物，或这些单体的共聚物。特别优选任何上述聚合物与聚烷撑二醇如聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物。最优选PEG与聚乳酸、聚羟基乙酸或乳酸/羟基乙酸共聚物的嵌段共聚物。这些聚合物的性质和优点可参见WO99/36107。
Trk或其片段可通过与生物相容的、可生物降解的材料和Trk相容的任何方式使其位于或邻近支架的表面，当由嵌段共聚物构成支架时，更优选位于聚烷撑二醇链的末端。所述方式可包括共价连接、吸附或物理包埋。然而优选通过一种或多种特异性分子相互作用使Trk或片段附着于或邻近表面。所谓″特异性分子相互作用″是指两种或多种结合性组分之间的相互作用，与这些结合性组分中的一种同它可能遇到(如在细胞培养中或体内)的其他分子的相互作用相比，其亲和力至少高100倍，优选至少高500倍、至少高1000倍或至少高2000倍。可使Trk附着于或邻近支架表面的一种或多种特异性分子相互作用，优选发生在结合于或邻近支架表面的一种或多种锚分子与结合于Trk或片段的一种或多种标记分子之间。
锚分子和标记分子可以相同也可以不同。在某些实施方案中，锚为抗体或其片段，标记为相应的抗原或半抗原，反之亦然。优选地，标记为生物素，锚为亲和素或链亲和素，反之亦然。最优选地，还使用能够同时与标记和锚结合的接头分子。在这种情况下，标记和锚可以相同。在优选的实施方案中，标记和锚均为生物素，接头分子为亲和素或链亲和素(亲和素和链亲和素与生物素结合时呈四价)。
应该知道，只需采用一种特异性分子相互作用使Trk或片段附着于或邻近支架表面，以使组合物受益于与特异性分子相互作用带来的好处。因此，任何其他分子相互作用(例如，当标记与接头通过特异性分子相互作用结合时，锚和接头分子之间的相互作用)不必具有特异性。
适合于将锚分子共价连接于或邻近支架表面的方法，以及适合于将标记分子共价连接于Trk或片段的方法，均为本领域所公知，可参考WO99/36107和其中的引文。
本发明组合物优选具有管状支架，神经元的再生优选沿着管状结构的内腔进行。使Trk或片段的溶液流过经预处理而能结合Trk或片段的支架，可以使Trk或片段定位于内腔壁。因此，在采用特异性分子相互作用的情况下，支架可经过预处理使得内腔壁被锚分子标记，溶液中的Trk被标记分子标记。如果使用接头分子，则接头分子应在标记的Trk之前加到支架上。
位于或邻近支架表面的任何附加组分都可以以与Trk或片段相同的方式附着。当组合物包括一种或多种神经营养蛋白时，神经营养蛋白既可以以与Trk或片段结合的形式引入支架，也可以在先将Trk或片段定位后作为一个单独的步骤引入支架。在将组合物中的Trk、标记、接头、锚、神经营养蛋白或任何其他组分以溶液形式引入支架的情形下，通常引入过量的组分以利于确保装载足量的结合部位。然后可将过量的部分冲洗掉，当然其中一些组分可能会非特异性结合于支架或其他组分。WO99/36107中记载的制备表面的方法与可用于本发明的方法相类似。具体地说，可使用类似于WO99/36107中使用的方法进行位于或邻近支架表面的Trk的布图。
组合物还可以包括处于生长期、再生期或修复期的神经细胞，或神经祖细胞或多能干细胞。
本发明组合物具有能够稳定供给神经营养蛋白以供神经元吸收的优点。神经营养蛋白非共价结合于支架，因此可释放供神经元利用。这就以前所未有的方法为神经元提供了神经营养支持。此外，特别是在所使用的Trk或片段的位置具有一定空间排列或布图的实施方案中，可以实现神经元的导向性延伸。不管在体外还是在体内，本发明的组合物均既可用作神经营养蛋白的吸收剂以随后将其供给神经元(在这种情况下，可使用最初只结合极少量或根本不结合神经营养蛋白的组合物)，也可以用作供给神经元的神经营养蛋白的来源(在这种情况下，组合物可包括较高比例的神经营养蛋白结合的Trk分子或片段)。
循环的神经营养蛋白水平太低，不能够支持存活。神经营养蛋白一般从受神经支配的组织释放，在结合Trk受体之后被神经元吸收。然后此复合物被运送至细胞体，并可能在那里发挥其细胞存活功能。为了体内再生神经，必须提供神经营养蛋白的局部供给。本发明通过Trk分子或片段以非共价结合于支架的形式供给神经营养蛋白。
本发明的相关的第二方面提供用于治疗的第一方面的组合物。
在第三方面，提供Trk或其神经营养蛋白结合性片段或其同源物在制备促进神经生长、再生或修复的药物中的应用，所述药物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的支架，和位于或邻近支架表面的Trk或片段或同源物。
在第四方面，本发明还提供一种促进神经生长、再生或修复的方法，所述方法包括将本发明第一方面的组合物与一种神经营养蛋白源接触，以在支架表面上或邻近支架表面形成Trk-神经营养蛋白复合物，将组合物与干细胞、神经祖细胞、神经元细胞或组织接触，使干细胞、神经祖细胞、神经元细胞或组织在支架表面上或邻近支架表面生长、再生或修复。
第四方面的方法可在体内或体外进行。在本方法的一个体内实施方案中，神经营养蛋白源可包含将组合物放入其中的神经支配部位。然而在体内和体外的实施方案中，神经营养蛋白源都更优选包括神经营养蛋白溶液，所述溶液流过具有已定位的Trk或片段的支架或其表面。本方法优选用于体内切断神经的再生。
本发明还提供根据本发明第四方面的方法获得或可获得的干细胞、神经祖细胞、神经元细胞或组织。
在相关的第五方面，本发明提供移植干细胞、神经祖细胞、神经细胞或组织的方法，该方法包括从适当的供体培养物或受试者采得供体干细胞、神经祖细胞或神经细胞样品；将供体细胞与本发明第一方面的组合物接触使之生长、再生或修复，所述组合物在支架表面上或邻近支架表面含有Trk-神经营养蛋白复合物；将此供体细胞和组合物放入需要此供体细胞的受体受试者体内。
供体和受体受试者可以相同(即自体移植)或不同(即异体移植)个体。
上述的本发明的组合物、方法和应用至少部分避免了本领域现有技术的几个缺点。就使用自体移植材料修复外周神经来说，这些缺点包括供体部位病态、功能恢复不充分和异常再生。与许旺细胞共用合成的可生物降解的聚合物也受到限制，因为需要额外的多轮细胞培养且必须将细胞植入治疗部位。应尽可能避免神经移植，因为神经移植会增加患者患变异型克雅病的风险。有关呈递RGD型肽的可生物降解的聚合物表面的现有技术提供了引导细胞扩散和再生的方法，但没有指明怎样提供关键的生长因子，特别是在体内环境中。处于生长期、修复期和/或再生期的神经元所需的生长因子，需要被供给到神经元细胞表面才能被吸收。使用本发明，可以在支架表面上或邻近支架表面形成Trk或片段的布图，从而能够附着一种或几种不同的神经营养蛋白以供呈呈递给生长中的神经元。
在本发明的第六方面，提供一种用于受控释放Trk或其片段或同源物的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的储存器，和紧密结合于储存器和/或位于或邻近储存器表面的Trk、或其神经营养蛋白结合性片段或同源物。
所述储存器可具有上述支架的任何优选特征。Trk可以上述方式与储存器结合。所述组合物可以既包含表面结合的Trk或片段，又包含嵌入储存器材料内部的Trk或片段。这样的混合系统可以为控制Trk的释放速度提供更强的灵活性。所述组合物可适于体外和/或体内应用。
本发明还提供用于治疗的第六方面的组合物。
在相关的第七方面，本发明提供Trk或其神经营养蛋白结合性片段或同源物在制备用于治疗与神经营养蛋白水平升高有关疾病的受控释放药物中的应用，所述药物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的储存器，和紧密结合于储存器和/或位于或邻近储存器表面的Trk或片段或同源物。
本发明还提供一种治疗受试者与神经营养蛋白水平升高有关的疾病的方法，所述方法包括给受试者施用本发明第六方面的组合物。
所治疗的疾病可以是阿尔察默病或疼痛症。所述疼痛症可为下列疾病的症状特发性感觉性尿急(idiopathic sensory urgency，ISU)、间质性膀胱炎、关节炎、带状疱疹、外周炎症、慢性炎症、肿瘤疾病或疱疹后神经痛。
在第八方面，本发明提供一种用于促进生物组织或细胞受控生长、再生或修复的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容材料制成的支架，以及位于或邻近支架表面的生长因子的受体、或其生长因子结合性片段或同源物。
生长因子可为神经营养蛋白。
进一步，在第九方面，本发明提供一种用于促进生物组织或细胞的受控生长、再生或修复的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容材料制成的支架，以及位于或邻近支架表面的生长因子或其功能性片段或同源物。所述生长因子(可为神经营养蛋白)可与支架共价或非共价结合。本发明还提供用于治疗的第九方面的组合物。
现参照附图将本发明仅以实施例方式进行更加具体的叙述。附图中图1为TrkA结构示意图；图2提供TrkAIg2的核苷酸序列和推得的氨基酸序列，包括N末端六组氨酸标记和六氨基酸插入序列VSFSPV(以下划线标出)；图3表示研究Trk和NGF修饰的表面对体外神经突生长的影响的实验结果；图4示意性说明一种组织再生支架的制造方法，所述支架包括布图配体槽或衬有配体的管子；图5为一种本发明组合物的简化的、部分横截面的结构示意图；图6说明怎样将本发明的组合物用于促进神经元生长和延伸。
实施例1-TrkAIg2和TrkAIg2.6的结构
TrkA及其分离的结构域在WO99/53055中进一步叙述，其公开内容通过引用的方式纳入本说明书。附图1示意性说明其结构(另见Robertson等(2001)BBRC，282131)。实心圆点表示糖基化位点。本实施例中定义的TrkAIg2包括Ig样亚结构域2和富含脯氨酸区。图2所示序列(TrkAIg2.6-6His)表示带有六组氨酸标记的TrkAIg2的核苷酸序列和推得的氨基酸序列。来自人TrkA的序列加粗显示，六氨基酸插入变体以下划线标出。此序列包括人TrkA序列(氨基酸22到150)和来自pET15b载体的侧翼序列(氨基酸1到21)，后者还编码N末端六组氨酸标记。载体序列(图2中密码子452到468)还提供终止密码子。人TrkA推断的胞外区的长度被认为是375或381个氨基酸，这取决于是否存在六氨基酸插入序列VSFSPV。
最近的研究指出，只由两个免疫球蛋白样结构域和富含脯氨酸区组成的蛋白，与完整的胞外区具有相似的与NGF的结合亲和力(Holden等(1997)Nature Biotechnology，15668)。本说明书将该区定义为TrkAIg1，2。另外还发现，即使更小的TrkA结构域(称为TrkAIg2，图2中氨基酸22到150所示)也与完整的胞外区或TrkAIg1，2区具有相似的与NGF的结合亲和力，因此该结构域主要负责这些较大实体的结合性质。包含六氨基酸插入序列VSFSPV的TrkAIg2(图2中氨基酸130到135所示)，在本说明书中称为TrkAIg2.6。
实施例2-使用Trk固定NGF以促进神经元生长本研究证实了使用Trk片段将NGF固定于生物材料表面，因而为刺激外周神经再生提供局部环境的可行性。实验使用PLA-PEG-生物素作为基体材料，该材料先前已被证实能够容易地使表面进行配体布图，以在空间上控制组织再生(WO99/36107)。本实施例中使用的Trk片段为TrkIgA2.6的六组氨酸标记形式(TrkIgA2.6-6His)。
于RPMI-1640培养基中以2～5×105个细胞/ml的密度培养PC12细胞，该培养基中补充10％马血清、5％胎牛血清、抗生素/抗真菌素和L-谷氨酰胺，每只T75培养瓶含有10到20ml培养基。
由于PC12细胞需要表面附着才能够使神经突延伸，而这些细胞不粘附于塑料组织培养器皿，这就意味着表面必须先预涂胶原或层粘连蛋白等胞外基质底物。T-75培养瓶和24孔板通过下列步骤包被胶原将0.01％IV型胶原的无菌蒸馏水溶液置于表面两小时(分别为10ml和0.5ml)，然后过夜风干。
在TrkIgA2.6的神经突延伸实验之前，先将培养于胶原包被的培养瓶上的PC-12细胞用NGF(50ng/ml)处理5天，每24小时加入新鲜培养基和NGF。
TrkIgA2.6-6His(溶于20mM磷酸钠缓冲液pH8.0，100mM氯化钠和10％甘油)使用WO99/53055和未决申请PCT/GB02/04214的方法制备，Sigma试剂盒使用标准方法用于生物素化。制备大约250μg/ml的原液。
PLA-PEG-生物素包被的Iwaki未处理24孔板通过下列步骤制备将0.25ml 2mg/ml的聚合物溶于2，2，2-三氟乙醇(TFE)，滴入多孔板中并于60℃烘箱中干燥1小时。多孔板用PBS冲洗并于冰箱中过夜保存。每批生物素化的TrkIgA2.6制备三块实验板。
通过以下步骤将亲和素附着于PLA-PEG-生物素包被的板上使用0.5ml 500μg/ml亲和素的蒸馏水溶液37℃下处理45分钟，然后再次用PBS冲洗多孔板。
然后将1ml如上制备的生物素化TrkA加入多孔板中，浓度为0到250μg/ml(溶于蒸馏水)，于37℃下处理1小时。然后用PBS冲洗多孔板。然后加入0.5ml溶于PBS的0～50ng/ml(＝0～1μl/ml)NGF，37℃下处理45分钟，然后最后一次用PBS冲洗。然后用0.25ml溶于蒸馏水的0.0025％的IV型胶原包被所有孔，1小时后冲洗。对照孔含有存在有PLA-PEG-生物素或0.01％胶原的NGF培养基，但没有TrkIgA2.6。
以每孔2.0×104细胞/ml接种细胞(第18代)。24小时后更换新鲜培养基(含0、0.1或1μl NGF)。
在37℃/5％CO2的培养箱中使细胞附着和延伸神经突48小时后，吸出培养基以去掉所有松散粘附的细胞，再次更换培养基。使用NikonEclipse TS100显微镜和DN100数码照相机以20倍放大、0.45倍C接头照相。用Leica Qwin图像分析软件测量突起长度和细胞数目。
图3显示在使用一定浓度范围的Trk，以及随后使用NGF修饰的表面上培养的PC12神经细胞系的神经突延伸情况。数据显示，随着表面固定的NGF的量的增加，神经突延伸长度也增加，而最佳Trk浓度似乎落在所使用的浓度范围内。
本研究说明了通过使用受体片段呈递NGF，将该生长因子附着于表面，能够诱导在修饰的PLA-PEG-生物素表面上培养的细胞长出神经突。胞外基质分子也优选呈递于表面以促进细胞表面附着。
本数据中，在各不同NGF浓度下均可见Trk浓度依赖性影响，并似乎存在最佳Trk浓度，对于TrkAIg2.6可能在2.5到250μg/ml之间，这取决于实验条件，可能在25μg/ml左右。更高浓度下神经突生长减缓，这可能是由于毒性作用，或者固定的受体片段和细胞本身对NGF的竞争加剧。
实施例3-神经再生支架图4示意性说明如何制作适于本发明组合物的支架。支架可以制作成包含布图配体槽(A)或者包含具有布图配体衬里的管子(B)。
图5示意性说明如何组装本发明的组合物。简言之，图4中的聚合物支架或基体(聚酯，如聚乳酸、乳酸/羟基乙酸共聚物或这些聚酯与PEG的嵌段共聚物)用生物素分子布图(如WO99/36107中所述)。随后将亲和素引入支架以产生亲和素布图表面。然后使生物素标记的TrkAIg2.6通过支架。生物素标记与亲和素分子上未占用的结合位点相结合，因而生成Trk布图表面。最后引入神经营养蛋白，它们与TrkAIg2.6结合，因而产生神经营养蛋白布图的可生物降解聚合物支架。
在图5所示的实施例中(图6更为清晰地显示)，支架具有包括许多条管子或管道的结构，图中只显示一条。神经细胞能够沿着管子/管道的内腔生长，生长时从制备的表面上获取神经营养蛋白。从图5中可以看出，神经细胞吸收神经营养蛋白是通过细胞表面表达的Trk分子实现的。
本发明的组合物可具体用于急性脊髓损伤、急性外周损伤和慢性损伤之后的神经再生。
实施例4-Trk的受控释放制剂按照实施例3中有关神经元修复支架的叙述，制备TrkAIg2.6的可植入乳酸/羟基乙酸共聚物聚合储存器，但不包括最后一步的添加神经营养蛋白。将储存器植入神经性疼痛的体内模型中。观察到Trk的延时释放及所导致的疼痛消失。
权利要求
1.一种用于促进神经元受控生长、再生或修复的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括一个由可生物降解的和生物相容的材料制成的支架，以及位于或邻近该支架表面的一种酪氨酸受体激酶(Trk)或其神经营养蛋白结合性片段或同源物。
2.根据权利要求1的组合物，其中Trk为TrkA、B或C；其另一种剪接形式；广谱Trk；Trk的功能性同源物或不同Trk类型的组合。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中Trk片段包括Ig样亚结构域。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述片段包括TrkA的Ig样亚结构域2。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述Ig样亚结构域2包括氨基酸插入序列VSFSPV。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述片段包括图2所示序列或其功能性同源物。
7.根据前面任一项权利要求的组合物，该组合物包括结合于Trk或片段或同源物的一种或多种神经营养蛋白。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述神经营养蛋白选自NGF、BDNF、NT3或NT4。
9.根据前面任一项权利要求的组合物，该组合物包括位于或邻近支架表面的一种或多种胞外基质组分。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述胞外基质组分包括胶原。
11.根据权利要求9或10的组合物，其中所述胞外基质组分包括含序列RGD、YIGSR和/或IKVAV的肽。
12.根据前面任一项权利要求的组合物，其中支架的材料为可生物降解的和生物相容的聚合物。
13.根据权利要求12的组合物，其中所述聚合物选自聚羟基酸、多糖、聚氨基酸、聚伪氨基酸，以及由任何上述聚合物的单体制备的共聚物。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述聚合物为与聚烷撑二醇的嵌段共聚物。
15.根据权利要求14的组合物，其中所述聚合物为聚乙二醇与聚乳酸、聚羟基乙酸或乳酸/羟基乙酸共聚物的嵌段共聚物。
16.根据前面任一项权利要求的组合物，其中所述Trk或片段或同源物位于或邻近支架表面是通过一种或多种特异性分子相互作用实现的。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述一种或多种特异性分子相互作用发生在结合于或邻近支架表面的一种或多种锚分子与结合于Trk或片段或同源物的一种或多种标记分子之间。
18.根据权利要求17的组合物，其中所述标记分子为生物素，锚分子为亲和素或链亲和素，反之亦然。
19.根据权利要求17的组合物，其中使用一种能够同时与标记和锚结合的接头分子。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述标记和锚均为生物素，接头为亲和素或链亲和素。
21.根据前面任一项权利要求的组合物，其中所述支架为管状。
22.根据前面任一项权利要求的组合物，其中所述Trk存在的浓度为大约2.5到250μg/ml。
23.一种用于促进生物组织或细胞受控生长、再生或修复的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的支架，以及位于或邻近该支架表面的生长因子受体、或其生长因子结合性片段或同源物。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述生长因子为神经营养蛋白。
25.根据前面任一项权利要求的组合物，其中所述Trk或其他生长因子受体在支架表面或邻近支架表面布图，用以为神经元或其他生物组织或细胞的生长、再生或修复提供导向控制。
26.根据前面任一项权利要求的组合物，该组合物用于治疗。
27.Trk或其神经营养蛋白结合性片段或同源物在制备促进神经生长、再生或修复的药物中的应用，所述药物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的支架，以及位于或邻近该支架表面的Trk或片段或同源物。
28.一种促进神经生长、再生或修复的方法，该方法包括将一种根据权利要求1到22任一项的组合物与一种神经营养蛋白源接触，以在支架表面或邻近支架表面形成Trk-神经营养蛋白复合物，将该组合物与干细胞、神经祖细胞、神经元细胞或组织接触，使干细胞、神经祖细胞、神经元细胞或组织在支架表面上或邻近支架表面生长、再生或修复。
29.一种移植干细胞、神经祖细胞、神经细胞或组织的方法，该方法包括从适当的供体培养物或受试者采得供体干细胞、神经祖细胞或神经细胞样品；将供体细胞与根据权利要求1到22任一项的组合物接触使之生长、再生或修复，所述组合物在支架表面上或邻近支架表面含有Trk-神经营养蛋白复合物；将此供体细胞和组合物放入需要此供体细胞的受体受试者体内。
30.一种用于Trk或其片段或同源物受控释放的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的储存器，和紧密结合于该储存器和/或位于或邻近储存器表面的Trk、或其神经营养蛋白结合性片段或同源物。
31.根据权利要求30的组合物，该组合物用于治疗。
32.Trk、或其神经营养蛋白结合性片段或同源物在制备治疗与神经营养蛋白水平升高有关疾病的受控释放药物中的应用，所述药物包括由可生物降解的和生物相容的材料制成的储存器，和紧密结合于储存器和/或位于或邻近储存器表面的Trk或片段或同源物。
33.根据权利要求32的应用，其中所治疗的疾病为阿尔察默病或疼痛症。
34.根据权利要求33的应用，其中所述疼痛症与下列疾病相关特发性感觉性尿急、间质性膀胱炎、关节炎、带状疱疹、外周炎症、慢性炎症、肿瘤疾病或疱疹后神经痛。
35.根据权利要求28的方法获得的或可以获得的干细胞、神经祖细胞、神经元细胞或组织。
36.一种用于促进生物组织或细胞的受控生长、再生或修复的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容材料制成的支架，以及位于或邻近支架表面的生长因子或其功能性片段或同源物。
37.根据权利要求36的组合物，该组合物用于治疗。
全文摘要
一种用于促进生物组织或细胞的受控生长、再生或修复的生物相容的、可生物降解的组合物，所述组合物包括由可生物降解的和生物相容材料制成的支架，以及位于或邻近支架表面的生长因子受体或其生长因子结合性片段或同源物。所述组织或细胞优选为神经元组织或细胞，在这种情况下受体优选为酪氨酸受体激酶(Trk)或其神经营养蛋白结合性片段或同源物。此组合物可包括结合于Trk或其片段或同源物的一种或多种神经营养蛋白。
文档编号A61K9/52GK1750849SQ200480004202
公开日2006年3月22日 申请日期2004年2月12日 优先权日2003年2月13日
发明者S·J·艾伦, D·道伯恩, A·阿特金森 申请人:纳诺摩生物医学有限公司