专利名称：作为药物和基因传输体系的多官能枝状和超支化聚合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及多官能枝状体和超支化聚合物的合成，尤其但不仅仅是涉及其表面端基的改性，以便它们可用作有效的药物和基因传输体系。
背景技术：
枝状体和超支化聚合物(枝状聚合物)的结构特征和尤其在其内部纳米空腔的存在或者在其外表面上数种基团的存在，使得这些聚合物成为极其有用的药物和基因传输应用的候选物。生物活性的药物化合物可包封在纳米空腔内，同时可合适地改性表面基团，从而使得可制备多官能的枝状聚合物。
最近研究了枝状体作为药物载体的应用且已制备了功能枝状体。这些枝状体在其纳米空腔内包封生物活性的药物分子。这是由于在可分别包封或者亲水或者疏水化合物的纳米空腔内部疏水或者在一些其它情况下亲水的环境所致。如上所述，枝状聚合物的结构特征使得可能控释掺入的生物活性化合物。然而，难以制备下述多官能枝状聚合物，所述多官能枝状聚合物同时显示出所有所需的性能，以便有效地充当药物载体，和具体地说显示出生物相容性和生物降解性，为了在人体内长时间地循环，生物稳定，为了在细胞受体上被连接，带有靶配体，且具有包封的生物活性化合物的控释性能。上述性能之一的缺少使得药物载体无效。因此，若所使用的药物载体不显示出以上所述的多官能特征的话，则数种生物活性的药物化合物不可能商业化。
在通用的治疗术中，病毒载体广泛用作基因材料的载体。尽管病毒载体一般来说是有效的，但它们引起患者健康的问题。为此，最近引入了合成载体，例如用于基因材料的非病毒载体。例如脂质体和枝状体，因其在基因治疗术中的应用获得广泛关注，这是因为与病毒载体相比，它们的安全性所致。具体地说，用于基因材料的合成非病毒载体在染色体组内存在很小的基因重组危险。
用合成的非病毒载体转染的特征还在于低的细胞毒性、高的再现性和容易使用。
然而，目前已知的合成载体，由于与病毒载体相比，它们的有效性通常低，和它们不能用于靶基因的表达，因此存在缺点。具体地说，对于有效的基因表达来说，必须在细胞核的内部转移基因，和该工序必须克服一系列的胞内和胞外障碍。这些障碍包括细胞的靶向(targeting)、有效输送载体和通过细胞膜携带它们的基因材料，以及需要在胞饮作用之后从核内体中释放载体。
关于文献中描述的合成载体，解决了一些或所有这些问题，然而，却没有实现所需的最终目的。本发明的目的在于，通过在枝状体或超支化聚合物的表面上引入合适的官能团，同时解决或克服所有以上所述的问题。以上所述的问题要求开发将基因材料输送到细胞核上的新型且有效的载体。具体地说，这些载体应当同时具有靶向能力，在生物体系内显示出稳定性，具有与连接的基因材料一起通过细胞膜有效输送的能力，和后一络合物可在胞饮作用之后从核内体中释放。
这种稳定和有效的合成基因载体可以是枝状体或者超支化聚合物。与通常不稳定的脂质体相反，枝状体和超支化聚合物可作为稳定的纳米颗粒形式提供，枝状体的尺寸取决于其生成，同时可在其表面上方便地引入的官能团的多样性会决定性地影响其性能和因此其应用。
发明内容
本发明的目的是制备多官能的枝状聚合物，它可用作生物活性药物化合物和基因材料用的有效药物载体。优选的枝状聚合物包括对称的枝状聚合物和不对称的超支化聚合物。通过采用这些多官能的枝状体和超支化聚合物(枝状聚合物)，使得采用常规的不可能商业化的载体药物化合物可商业化。另外，基因可转移到用于基因治疗的细胞上。
超支化聚合物没有广泛用作药物载体。
它们的应用是非常令人感兴趣的，因为与枝状聚合物相比，它们的制备容易且成本低。
可合适地改性枝状和超支化聚合物的端基，以便变为多官能，且使得可能在其纳米空腔内包封药物化合物。
枝状和超支化聚合物的合适地选择的结构特征使得这些分子同时生物相容和可生物降解。
此外，可携载合适的靶向配体，以便连接到细胞受体上，和该分子可显示出生物稳定性，以便长时间地在生物流体内循环。可允许控释包封的药物化合物。
当这些聚合物在其表面上荷正电时，一旦与寡聚核苷或DNA相互作用，则它们可形成络合物。
本发明涉及多官能枝状聚合物的制备，除了其荷正电的表面以外，所述多官能枝状聚合物还导致与荷负电的DNA形成络合物，它们也可带有官能团，正如以下所述的那些，这有助于输送基因材料。
所提出的这些聚合物尤其用于生物医学应用的聚合物的结构特征如下所述a.在枝状或超支化聚合物的表面上存在官能团。这些官能团可分阶段引入。b.取决于其纳米环境，在可包封各种化合物的聚合物内部存在纳米空腔，这后一种特性使化合物可以特别作为药物载体使用。c.当用于基因传输时，要求在这些聚合物内存在阳离子电荷，这是因为它们将与荷负电的DNA相互作用，从而导致形成各种络合物。如此形成的络合物可通过胞饮作用引入到用于基因治疗的细胞核内。
根据本发明，提供具有对称化学结构的枝状聚合物和不对称的超支化聚合物，其特征在于对它们进行改性，以便显示出—能形成三个或更多个化学键的至少一个化学元素的原子，—键合到所述至少一个原子上的各种不同的端基官能团，所述端基官能团总体来说a)具有低毒性或根本没有毒性，b)使得可从细胞的互补受体中识别上述聚合物的分子，c)使得聚合物在有机体的生物环境内稳定，和d)有助于所述聚合物通过细胞膜输送。
优选地，阳离子化该聚合物以供与DNA形成络合物，当所述化合物将成为基因传输系统，例如基因材料的载体时。
方便地，可通过在枝状体的端基上引入铵、季铵或胍鎓基，从而阳离子化该聚合物。
有利地，化学元素的原子能形成三或更多个化学键，它可以是氮或者其它合适的特征基团，例如碳或硅。
优选地，改性的枝状聚合物可以是二氨基丁烷聚(亚丙基亚氨基)枝状体(DAB)，或者类似结构的其它枝状分子，例如PAMAM枝状体。
方便地，改性的超支化非对称聚合物可衍生于缩聚酸酐，例如琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐或四氢邻苯二甲酸酐与二烷基胺，例如二异丙胺。
有利地，改性的超支化的非对称聚合物可衍生于阴离子聚合环氧衍生物与1，1，1-三(羟烷基)丙烷。
方便地，改性的超支化的非对称聚合物可衍生于阴离子聚合缩水甘油与1，1，1-三(羟甲基)丙烷(PG-5)。
方便地，改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称聚合物可在其表面官能团上具有例如聚亚烷基二醇和优选聚(乙二醇)，其中所述表面官能团包括各种分子量的聚合物链。
有利地，改性枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物可包括下述官能团，所述官能团包括与细胞的受体位点互补的至少一个基团，例如胍鎓基，碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸、RGD受体、碱基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸盐。
有利地，改性枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物可包括有助于通过细胞膜输送枝状聚合物或改性的超支化聚合物与任何包封的活性药物成分或基因材料的至少一种基团，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚环氧丙烷部分。
方便地，改性枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物可包括含至少一种靶向配体的官能团，例如胍鎓基，碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸、RGD受体、碱基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸盐。
优选地，改性枝状聚合物和改性的超支化的非对称聚合物可用作生物活性的药物化合物的药物载体或者用于携载基因材料。
方便地，由改性的枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物携载的生物活性的药物化合物可以是倍他米松或倍他米松衍生物。
本发明还提供合成多官能枝状体和超支化聚合物的方法，以便它们可用作用于生物活性药物化合物的药物载体，该方法的特征在于，分阶段改性这些聚合物的表面，其中包括a.用羟基、羧基或季铵基，或其它无毒基团取代表面上的氨基或其它有毒基团，b.在枝状载体或超支化聚合物，例如聚(乙二醇)的表面上引入各种分子量的聚合物链(PEG化)，以便保护聚合物免遭有机体的MPS(单核吞噬细胞系统)的，c.引入与受体或组织互补的可识别基团，即胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸或RGD受体、碱基(腺嘌呤—胸腺嘧啶、胍—胞嘧啶)或巴比妥酸盐，以便提高载体的靶向能力。d.引入有助于通过细胞膜输送载体和包封的活性药物成分的基团，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚环氧丙烷部分。
优选地，该方法包括进行枝状体或超支化聚合物的外部氨基或羟基与合适的保护聚合物的起始反应，所述保护聚合物在一端带有反应性基团，如异氰酸酯、环氧化物或N-羟基琥珀酰亚胺；随后进行所得聚合物的最大部分的氨基与异氰酸乙酯的反应，用以取代有毒的氨基；随后使前面所得聚合物反应，用以将氨基转化成可识别基团如胍鎓基；随后引入有助于通过细胞膜输送载体的一个或多个基团，如聚精氨酸或环氧丙烷链。
方便地，阳离子化所述聚合物用以与DNA形成络合物，当所述化合物将成为基因输送系统，例如它们将成为基因材料的载体时。
有利地，该方法的特征在于，当表面的有毒基团是氨基时，可引入具有小于8个碳原子，优选2或3个碳原子的小的脂族链以供取代。
本发明提供药物配方，所述配方包括包封在改性的多官能枝状或改性的多官能超支化的非对称聚合物内的生物活性的药物化合物或基因材料。
本发明还提供生产药物配方用以输送生物活性的药物化合物或基因材料的方法，该方法包括通过分阶段改性该聚合物的表面，合成对称的枝状体或者非对称的超支化的聚合物，其中包括a.用羟基、羧基或季铵基或其它无毒基团取代表面的氨基或其它有毒基团，b.在枝状载体或超支化聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG化)的表面上引入各种分子量的聚合物链，以便如此保护聚合物，免遭有机体的MPS(单核吞噬细胞系统)。c.引入与受体或组织互补的可识别基团，即胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸或RGD受体、碱基(腺嘌呤—胸腺嘧啶、胍—胞嘧啶)或巴比妥酸盐，以便提高载体的靶向能力。d.引入有助于通过细胞膜输送载体和包封的生物活性药物化合物的基团，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚环氧丙烷部分；和用所述改性聚合物包封生物活性的药物化合物或基因材料。
优选地，阳离子化所述聚合物用以与DNA形成络合物，当所述化合物将成为基因材料的载体时。
方便地，包括包封的生物活性的药物化合物或携载基因材料的改性枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物用于治疗应用。
有利地，包括包封的生物活性的药物化合物或携载治疗用基因材料的改性枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物用于制造药物剂型。
方便地，包括包封的生物活性的药物化合物或携载基因材料的改性枝状聚合物或改性的超支化的非对称聚合物用于制造治疗与该化合物或基因材料相同疾病或病况的药物。
图1示出了一个本发明的目的具有对称枝状结构的通式I的分子，其中符号(.)可以是能形成3或更多个化学键的化学元素的原子，例如氮或者合适的特征基团，直线(-)对应于脂族链和外部官能团X、Y、Z总体来说是a)使得可从细胞的互补受体中识别上述聚合物分子，b)使得同一聚合物在生物环境内稳定和c)有助于这些聚合物通过细胞膜输送的基团。
图2和3示出了两种不同的非对称的超支化聚合物的分子结构(它是本发明的目的)，其中符号(g)可以是能形成3或更多个化学键的化学元素的原子，例如氮或者合适的特征基团，直线(-)对应于脂族链和外部官能团X、Y、Z总体来说是a)使得可从细胞的互补受体中识别上述聚合物分子，b)在生物环境内提供这些聚合物稳定性和c)它们有助于这些聚合物通过细胞膜输送的基团。
图4示出了根据本发明的一个实施方案在枝状体(或超支化聚合物)的表面上逐步引入官能团，亦即在第一步中，使枝状体中的外部氨基或羟基与带有反应性基团，如环氧或N-羟基琥珀酰亚胺的合适的聚合物反应。
在第二步中，残留在枝状体表面上的较大部分的氨基例如与异氰酸乙酯反应，以取代有毒的氨基。
在第三步中，引入识别基团，例如胍鎓基。
在第四步中，引入有助于载体与包封的药物化合物通过细胞膜转移的基团，如胍鎓基、寡聚精氨酸或聚精氨酸。
图5图示了在枝状载体和DNA或寡聚核苷之间络合物的形成及其通过细胞膜的输送。
图6示出了包封的戊酸倍他米松的释放作为氯化钠水溶液浓度的函数的图表。
图7示出了根据本发明的一个实施方案，在超支化聚合物的表面上官能团的引入，亦即在一步反应中，引入在端羟基上连接的两种官能团，例如保护的PEG链和叶酸酯靶向配体。
具体实施例方式
在一个实施方案中，本发明涉及合成多官能的对称枝状体。由图1中所示的通式(I)列出了这些多官能的对称枝状体。这种聚合物可以是例如二氨基丁烷聚(亚丙基亚氨基)枝状体。
本发明还涉及多官能的非对称的超支化聚合物的合成。由图2中所示的通式(II)列出了这些多官能的非对称的超支化聚合物和图3示出了式(III)的超支化聚合物。
这种非对称的聚合物例如是由缩聚琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐或四氢邻苯二甲酸酐与二异丙胺而得到的聚合物或者由阴离子聚合缩水甘油与1，1，1-三(羟甲基)丙烷而得到的聚合物。
在式I、II和III中，符号(y)是可形成三个或更多个化学键的化学元素的原子，例如氮或其它合适的特征基团，例如叔氨基，直线(-)相当于脂族链和外部官能团X、Y、Z总体来说可以a)使得可从细胞的互补受体中识别上述聚合物的分子，b)使得上述聚合物在生物环境内稳定，和c)有助于这些聚合物通过细胞膜输送。
使得本发明所述的聚合物尤其可用于生物医学应用的那些特征性结构特征是下述a)在枝状体或超支化聚合物的表面上存在功能性特征基团，这些功能性特征基团来自于在聚合物表面上的逐步引入，例如如图4所示，和b)取决于其纳米环境，在聚合物内部存在可包封各种化合物的纳米空腔。
在第一阶段引入正电荷的情况下改性枝状体或超支化聚合物表面(分子设计枝状或超支化聚合物的表面)，使得该聚合物适于粘接负电荷的基因材料(DNA、质粒、寡聚核苷)。如此形成的枝状或超支化聚合物载体—基因材料的络合物最终通过胞饮作用引入到用于基因治疗的细胞核内。
为了制备这种多官能的枝状和超支化聚合物(它们是本发明的目的)，使用可商购的枝状体，例如购于DSM公司且以名称DAB-32和DAB-64销售。在合适的反应器内和在合适的实验条件下，通过逐步引入官能团来改性其结构。图4示出了用于合成例如多官能的枝状药物传输系统的反应流程。
在本发明的另一实施方案中，可在合适的反应器内相同地使用PAMAM而不是DAB。
在本发明中，生物活性的化合物可主要引入到枝状体或超支化聚合物的纳米空腔内部，同时在其外表面上引入旨在形成纳米尺寸载体的合适官能团，所述载体总体来说具有下述特征它们具有低的毒性或者无毒，它们在生物环境内稳定且它们拥有朝向特异细胞的靶向和输送能力。
当使用枝状体或超支化聚合物作为基因材料的合适载体(用于基因传输)时，例如通过在枝状体或超支化聚合物的端基处引入铵基、季铵或胍鎓离子，从而引入正电荷，用以粘接荷负电的基因材料(DNA、质粒、寡聚核苷)，正如以下所述。
随后，在枝状体或超支化聚合物的表面上引入各种官能团，和最终目的是在细胞核内输送基因材料。具体地说，选择无毒的枝状体或超支化聚合物，或者改性起始化合物，以便使之无毒和生物相容。
随后，引入下述官能团，所述官能团i)使得DNA—载体的络合物在生物环境内稳定，ii)提供靶向特异细胞或组织的性能，iii)有助于它们通过膜输送，和iv)具有在胞饮作用之后从核内体中释放的能力。
如此形成的枝状体或超支化聚合物与基因材料的络合物最后可通过胞饮作用引入到细胞中。基因材料通过胞间过程最后进入用于基因治疗的核内。
根据以下所述的方法实现全部这些性能，其中根据所述方法，合适地改性枝状体或超支化聚合物的外部端基(按照公知的合成有机化学方法，在合适的一系列反应中，分子设计枝状体或超支化聚合物)，为的是实现a)用无毒，例如羟基、羧基或季铵基取代有毒的端基，例如氨基，b)在枝状体或超支化聚合物的表面上引入各种分子量的聚合物链，例如聚(乙二醇)(PEG化)。如此保护聚合物，免遭有机物的MPS(单核吞噬细胞系统)。c.引入与细胞的受体互补的可识别基团，例如胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸或RGD受体、核碱部分(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸盐基，以便提高载体的靶向能力。d.引入有助于通过细胞膜输送载体和包封的活性药物成分或基因的基团，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚环氧丙烷部分。可引入荷正电的部分，如铵、季铵、胍鎓用以与基因材料(DNA、质粒、寡聚核苷)形成络合物。
可通过使用可商购的枝状体或者超支化聚合物，实现这种多官能枝状体的合成。图4示出了例举的实施例，该实施例表明了合成多官能枝状体的步骤。
最初使枝状体或超支化聚合物的外部氨基或羟基与带有反应性基团，例如异氰酸酯、环氧化物或N-羟基琥珀酰亚胺部分的选择分子量的聚(乙二醇)聚合物反应。在这第一步之后，使所得枝状体中残留氨基的大部分例如与异氰酸乙酯反应，以降低外表面上有毒伯氨基的存在。在第三步中，最后残留的伯氨基可转移到靶向基团，例如胍鎓基上。在另一阶段中，可引入有助于通过细胞膜输送药物载体以及包封的活性成分的基团，例如寡聚精氨酸或聚精氨酸部分。在本发明的情况下，作为靶向配体引入的胍鎓基可有助于通过细胞膜输送包封活性药物成分的传输系统。要求阳离子化枝状体或超支化聚合物以供荷负电的基因材料连接到枝状聚合物上用以与将转移到细胞上的基因材料形成各种稳定的络合物。
以上所述的反应可在室温下在含水介质中进行。可通过使副产物流经半渗透膜，通过渗析进行产物的纯化。
可在本发明中使用的典型的枝状体或超支化聚合物例如是对称的二氨基丁烷聚(亚丙基亚氨基)枝状体或不对称的超支化聚合物，例如由缩聚琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐或四氢邻苯二甲酸酐与二异丙胺得到的聚合物或者由阴离子聚合缩水甘油与1，1，1-三(羟甲基)丙烷而得到的聚合物。
可用作枝状体的保护涂层的聚合物例如是具有各种分子量的聚乙二醇，所述聚乙二醇带有与枝状体或超支化聚合物反应的活性基团，例如异氰酸酯、环氧化物或N-羟基琥珀酰亚胺部分，例如使用平均分子量为5000的甲氧基聚(乙二醇)的异氰酸酯衍生物。
可通过与异氰酸烷酯或烷基环氧化物反应，实现有毒基团，例如氨基的取代或反应。后者使伯氨基转化成仲氨基醇。在本发明中，优选异氰酸乙酯，因为它方便地与伯氨基反应。
此外，为了引入靶向配体(在以上所述的实施例中是胍鎓基)，可使用1H-吡唑并-1-羧脒基(carboxamidine)盐酸盐，将所讨论的枝状体的外伯氨基转化成这一基团。胍鎓基以及寡聚和聚精氨酸部分有助于通过细胞膜输送载体。对于基因传输应用来说，图5图示了络合物的制备及其输送。
使用在水中完全不溶的亲脂的生物活性化合物，例如戊酸倍他米松，进行枝状体用作药物载体的实施例。发现，这些化合物在多官能团枝状体内部增溶达14.5％。
它们受到聚(乙二醇)链(PEG)的保护，和它们具有胍鎓基作为靶向配体，所述胍鎓基使得该聚合物能靶向细胞或组织受体。还确立了甚至在酸性环境下，戊酸倍他米松保持包封在这些多官能枝状体内。然而，在添加NaCl水溶液的情况下，生物活性的皮质类甾醇化合物从枝状体的纳米空腔中释放(图6)。
由于枝状聚合物与类似的多官能超支化聚合物的共同的结构特征，因此强烈希望后一聚合物显示出与来自于多官能枝状体的那些相类似或几乎相同的作为药物载体的行为和性能。图7示出了基于可商购的聚合物，例如PG-s5，合成多官能的超支化聚合物的反应流程。
在该说明书中，以下实施例提及的用量以摩尔计，除非另有说明。
实施例材料与方法在外表面上分别具有32和64个氨基的第4和5代二氨基丁烷聚(亚丙基亚胺)枝状体(在以下的流程中-DAB-32和DAB-64用No.1表示，DSM Fine Chemicals)用作起始材料。
甲氧基聚(乙二醇)异氰酸酯(在以下的流程-MW5000中用No.2表示，ShearwaterPolymers，INC)、异氰酸乙酯(Aldrich)和1H-吡唑-1-羧脒基盐酸盐(Fluka)(在以下的流程中用No.3表示)用于枝状聚合物的多官能化。
由意大利的EFFECHEM S.R.L.提供戊酸倍他米松(在以下的流程中用No.4表示)(它是一种亲脂药物)，和它用于包封和释放研究。
缩水甘油基三甲基氯化铵(在以下的流程中用No.5表示)和叶酸(在以下的流程中用No.6表示)购于Flika。
超支化的聚醚多元醇(在以下的流程中-MW5000，PG5用No.7表示)购于Hyperpolymers GmbH且在亲脂化之后使用。
以下流程中示出了以上所述的枝状聚合物和碱性有机起始材料。
流程A枝状体的多官能化实施例1步骤1.二氨基聚(亚丙基亚氨基)枝状体0.001mol(它是第5代商购产品)(或任何其它代的产品)和0.004mol分子量为5000的甲氧基聚(乙二醇)异氰酸酯溶解在水中。在所得溶液中添加小量三乙胺水溶液，获得pH＝13的溶液。在室温下搅拌该溶液数小时。随后通过经半渗透膜渗析，纯化该溶液24小时，为的是从反应混合物中除去所有小分子量的杂质。采用NMR光谱确定来自步骤1的在枝状体内引入的聚(乙二醇)部分。
1H NMR δ＝6.20和5.90(s，NHCONH)，3.55(s，OCH2CH2O)，3.25(s，OCH3)，3.15(m，CH2NHCONHCH2)，2.70(m，CH2NH2)，2.45(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH2，NCH2CH2CH2NH)，1.55(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，1.42(NH2).
13C NMR δ＝159.7(NHCONH)，71.5(OCH2CH2O)，58.5(OCH3)，53.5(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，51.2(NCH2CH2CH2NH2)，50.5(NCH2CH2CH2NHCO)，43.5(NHCONHCH2CH2)，42.4(NCH2CH2CH2NHCO)，39.5(CH2NH2)，30.4(CH2CH2NH2)，27.9(NCH2CH2CH2NHCO)，24.8(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N).
步骤2.向溶解在水内的0.001moll中添加同样溶解在水内的0.052mol异氰酸酯乙酯。通过添加40％三甲胺水溶液，调节溶液的pH到13。使该混合物在室温下反应数小时，用截留值为12400的膜渗析，除去低分子量的化合物，和最后冻干，从而提供化合物II。通过H和NMR确立第二步的官能化。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝6.05(broad s，NHCONH)，3.50(s，OCH2CH2O)，3.25(s，OCH3)，3.05(m，CH2NHCONHCH2)，2.70(m，CH2NH2)，2.35(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH2，NCH2CH2CH2NH)，1.45(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，1.35(NH2)，0.98(t，CH3).
13C NMR(62.9MHz，D2O)δ＝159.7(NHCONH)，71.5(OCH2CH2O)，58.5(OCH3)，53.5(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，51.2(NCH2CH2CH2NH2)，50.5(NCH2CH2CH2NHCO)，43.5(NHCONHCH2CH2O)，42.4(NCH2CH2CH2NHCO)，39.5(CH2NH2)，37.8(NHCONHCH2CH3)，30.4(CH2CH2NH2)，27.9(NCH2CH2CH2NHCO)，24.8(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，14.8(CH3).
步骤3.向溶解在干燥DMF内的0.001mol步骤1中制备的枝状体中添加同样溶解在干燥DMF内的0.01mol1H-吡唑-1-羧脒基盐酸盐和0.01mol二异丙基乙胺。使反应混合物在室温下反应过夜，和用二乙醚沉淀所得产物并离心。将固体化合物溶解在水中，并用截留值为12400的膜渗析。除去溶剂，和充分干燥剩余材料，从而提供化合物III。通过1H和13C NMR确立胍鎓基的引入。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝7.65(broad s，NH of guanidinium group)，6.95(broad s，NH2+)，6.05(broad s，NHCONH)，3.50(s，OCH2CH2O)，3.25(s，OCH3)，3.05(m，CH2NHCONHCH2，NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，2.35(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，1.45(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，0.98(t，CH3).
13C NMR(62.9MHz，D2O)δ＝159.7(NHCONH)，157.2(NHC(NH2)2+)，71.5(OCH2CH2O)，58.5(OCH3)，53.5(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，50.5(NCH2CH2CH2NHCO，NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，43.5(NHCONHCH2CH2O)，42.4(NCH2CH2CH2NHCO)，42.2(NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，37.8(NHCONHCH2CH3)，28.2(NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，27.9(NCH2CH2CH2NHCO)，24.8(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，14.8(CH3).
实施例2步骤1.二氨基丁烷聚(亚丙基亚胺)枝状体的季化。
如下所述进行聚(亚丙基亚胺)枝状体的部分季化向在10ml水内的0.113mmolDAB-32(0.398g)溶液中添加1.938mmol缩水甘油基三甲基氯化铵(260pl)。使该混合物反应过夜，然后用截留值为1200的膜相对于H2O渗析，以除去未反应的环氧化物，并冻干。通过在D2O中记录的1H和13C NMR光谱确立季铵的引入。在1H光谱中，在2.60、3.16、3.34和4.26ppm处，和在13C NMR光谱中，在55.1、56.9、67.4和71.8ppm处的预期的4个新信号的出现证明发生了季化。另外，在13C NMR光谱中，在28.0和49.5ppm处出现两个新的信号，这对应于相对于新形成的仲氨基的α和β亚甲基碳。根据对于在1.58ppm处的信号(对应于连接到枝状体的叔、仲和伯氨基上的所有β-亚甲基质子)，在3.16ppm处的信号(对应于季甲基质子)的积分比，估计取代度。发现取代度为33％。
叶酸活性酯的合成这是一种不可商购的有机中间体，和它被要求用于下一步通过下述工序制备多官能枝状体在氮气氛围下，使溶解在7.5ml无水DMSO内的叶酸0.594mmol与在1ml无水溶剂内的0.595mmol TEA(82.5pl)和0.595mmol DCC(0.123g)反应1小时。向该混合物中添加在1ml干燥DMSO内的0.594mmolN-羟基琥珀酰亚胺，使之在惰性条件下反应过夜。
通过过滤回收DCU，并在干燥中沉淀并通过过滤收集。真空干燥活性酯约2小时，然后用于与前面获得的季化DAB-32反应。
步骤2.引入叶酸到季化DAB-32上将前面制备的叶酸活性酯用作起始材料，用于根据下述工序将叶酸靶向配体引入到枝状体内将在7ml无水DMSO内的0.0137mmol季化DAB-32加入到溶解在1ml相同的干燥溶剂内的0.0413mmol叶酸-NHS活性酯中。在5天的时间段之后，在干燥Et2O中沉淀该产物，首先相对于pH7.4的磷酸盐缓冲液渗析，之后用截留值为1200的膜相对于H2O渗析并冻干。
在D2O中记录1H和13C NMR光谱这二者。通过在8.6ppm处的特征信号(对应于在喋呤环的位置7处的次甲基)，以及在6.7和7.7ppm处的两个双峰(对应于苄环部分的芳族质子)，从而证明叶酸的存在。根据在8.6ppm处的信号(对应于在喋呤环的位置7处的质子)与在4.54ppm处的信号(对应于带有缩水甘油基试剂的羟基中的次甲基，其来自于环氧环的开环)的积分比，估计每一共轭物中叶酸分子的平均数。估计在枝状体衍生物内的叶酸酯残基的平均数为3。此外，还使用消光系数值ζ280＝74620M-1cm-1，通过UV光谱在PBS(7.4)内测定在这些枝状体内的叶酸酯的含量。通过13C NMR光谱进一步证明这些结果。季化最终产物(引入阳离子电荷)，并通过靶向叶酸酯配体，从而官能化，同时其氨基(伯、仲和叔)也可在生物环境内质子化，从而显示出缓冲能力。
B.超支化聚合物的官能化 聚甘油PG-5的PEG化向溶解在pH13.0三甲胺水溶液内的在10ml水中的0.04094mmolPG-5溶液中，添加溶解在10ml水内的1639mmol甲氧基聚(乙二醇)异氰酸酯。使该混合物在惰性氛围下反应约4小时，用截留值为12400的膜渗析，除去未反应的聚合物和PEG-异氰酸酯，最后冻干并真空干燥，得到PEG化的PG5。
在D2O中记录1H和13C NMR光谱。在3.32ppm处出现的信号(对应于该试剂中的端甲基)，以及在3.25ppm处的信号(对应于相对于酰胺键(CONHCH2-)的CH2质子)证明引入了PEG部分。还通过13C NMR光谱确立PEG化的超支化聚合物多元醇的形成。根据在3.24ppm处的信号(对应于相对于酰胺键(CONHCH2-)的CH2质子)与在0.82ppm处的信号(对应于核心部分的甲基)的积分比，估计取代度。每一聚合物中m-PEG的平均数为2。
合成NH2-PEG-叶酸酯通过在含1摩尔当量二环己基碳二亚胺和吡啶的干燥二甲亚砜内，使聚氧亚乙基双胺(Nektar，MW3400)与等摩尔量的叶酸反应，合成NH2-PEG-叶酸酯。在室温下在暗处搅拌反应混合物过夜。在反应最后，添加双倍体积的水，和通过离心过滤不溶副产物，二环己基脲。然后相对于5mM的NaHCO3缓冲液(pH9.0)，然后相对于去离子水，渗析上清液，除去混合物中未反应的叶酸(截留值1200)。然后通过用过量5mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)预洗涤的纤维素磷酸盐阳离子交换树脂分批吸收，除去痕量未反应的聚氧亚乙基双胺。再次相对于水渗析产物NH2-PEG-叶酸酯，冻干，并在D2O中记录1H和13C NMR光谱。通过在产物内，在1H光谱中，在8.64ppm处的特征信号(对应于在喋呤环的位置7处的次甲基)以及在6.74和7.60ppm处的两个双峰(对应于苄基部分的芳族质子)，证明叶酸的存在。根据在8.64ppm处的信号与在3.15ppm处的信号(对应于与其余氨基相邻的α-亚甲基)的积分比，估计每一共轭物中叶酸分子的平均数。根据13CNMR光谱，通过其在30.4ppm处的α-亚甲基信号被在32.6ppm处的新信号取代，说明仅仅叶酸中的y-羧基反应。
合成PG5-PEG-叶酸酯通过在略微升高的温度下，使聚甘油PG-5与过量的琥珀酸酐在DMF中反应过夜，以便实现5-10％的聚甘油羟基反应，从而合成PG5-PEG-叶酸酯。相对于水渗析反应产物，和通过1H和13C NMR实验证明其结构。在1H光谱中，在2.5和2.6ppm处出现两个新的信号，这两个信号分别对应于新形成的酯键中的α-和3-亚甲基。另外，如上所述，在干燥DMF中，和在二环己基碳二亚胺和吡啶存在下，通过使NH2-PEG-叶酸酯与改性的聚甘油PG5反应，实现酰胺键的形成。相对于水渗析反应产物(截留值为5000)，和再次通过1H和13C NMR实验证明叶酸酯的引入。通过在1H光谱中，在8.64ppm处的特征信号证明在超支化聚合物上存在PEG-叶酸酯。根据在8.64ppm处的信号与在0.82ppm处的信号(对应于在聚合物的核心基团上的甲基)的积分比，估计每一共轭物中叶酸分子的平均数。此外，还使用消光系数值ζ280＝74620M-1cm-1，在PBS(pH7.4)内，通过定量UV光谱测定共轭物中分子内的叶酸酯含量。
倍他米松衍生物的包封和释放采用下述方法进行在实施例1中制备的多官能枝状体内倍他米松衍生物的包封在氯仿/甲醇的混合物内溶解枝状体和戊酸倍他米松衍生物。在蒸馏溶剂之后，获得薄膜，所述薄膜可在水中分散。具有包封化合物的枝状体在水相中，而非包封的物质仍然不溶于水，并通过离心除去。表1给出了在多官能枝状体内包封的戊酸倍他米松的百分数。为了比较，包括来自包封例如苝，一种公知的探针的数据。
表1.苝(PY)和戊酸倍他米松(BV)在母体和多官能枝状体内的溶解度比较
采用逐滴添加氯化钠水溶液，实现例如戊酸倍他米松的释放(图6)。观察到一旦添加0.8M的氯化钠，生物活性的化合物几乎完全从多官能的枝状体中释放。
携带基因材料的多官能枝状体的制备将正电荷的多官能枝状体加入到质粒DNA(3-7mg)中，以便在各种介质如天然血清、300mM氯化钠水溶液、RPMI-1640中，枝状体对DNA的电荷比为3.5∶1至8.5∶1。
术语“包括”、“含”及其各种变体，当在说明书和权利要求书中使用时，是指包括特定的特征、步骤、组分或整数。该术语不应当解释为排除存在其它特征、步骤、组分或整数。
在前述说明书或者下述权利要求或者附图中披露的特征(用其具体形式或者用实现所披露的功能的手段，或者达到所披露的结果的方法或工艺的方式表达)，可独立地或者以这些特征的任何结合方式，用于实现各种形式的本发明。
权利要求
1.一种具有对称的化学结构的枝状聚合物或者非对称的超支化聚合物，其特征在于改性该聚合物，以便包括能形成3或更多个化学键的至少一个化学元素的原子；键合到所述至少一个原子上的各种不同的端基官能团，所述端基官能团全部a)具有低的毒性或根本没有毒性，b)使得可从细胞的互补受体中识别上述聚合物的分子，c)使得聚合物在生物环境内稳定，和d)有助于所述聚合物通过细胞膜输送。
2.根据权利要求1的枝状聚合物或者超支化的非对称聚合物，其中阳离子化该聚合物用以与DNA形成络合物，当所述化合物将成为基因材料的载体时。
3.根据权利要求2的枝状聚合物或者超支化的非对称聚合物，其中通过在该枝状体的端基上引入铵、季铵或胍鎓基，从而阳离子化该聚合物。
4.根据权利要求1的枝状聚合物或者超支化的非对称聚合物，其中能形成3或更多个化学键的化学元素的原子是氮、碳或硅。
5.根据权利要求1的改性的枝状聚合物，它是二氨基丁烷聚(亚丙基亚氨基)枝状体(DAB)或者PAMAM枝状体。
6.根据权利要求1的改性的超支化的非对称聚合物，其中超支化聚合物衍生于缩聚酸酐，例如琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐或四氢邻苯二甲酸酐，与二烷胺，例如二异丙胺。
7.根据权利要求1的改性的超支化的非对称聚合物，其中超支化聚合物衍生于阴离子聚合环氧衍生物与1，1，1-三(羟烷基)丙烷。
8.权利要求1的改性的超支化的非对称聚合物，其中超支化聚合物衍生于阴离子聚合缩水甘油与1，1，1-三(羟甲基)丙烷(PG-5)。
9.根据权利要求1-8任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称聚合物，其中官能团包括在枝状聚合物或者超支化聚合物，例如聚(亚烷基二醇)和优选聚(乙二醇)的表面上的各种分子量的聚合物链。
10.根据权利要求1-8任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称聚合物，其中官能团包括与细胞的受体位点互补的至少一个基团，例如胍鎓基、碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸、RGD受体、碱基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸盐。
11.根据权利要求1-8任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称聚合物，其中官能团包括有助于通过细胞膜输送枝状聚合物或改性的超支化聚合物与任何包封的活性药物成分或基因材料的至少一种基团，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚环氧丙烷部分。
12.根据权利要求1-8任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称聚合物，其中官能团包括至少一种靶向配体，例如胍鎓基，碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸、RGD受体、碱基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸盐。
13.根据权利要求1-12任何一项的枝状聚合物或者超支化的非对称聚合物，它包括包封的生物活性的药物化合物或者携载基因材料。
14.根据权利要求1-12任何一项的枝状聚合物或者超支化的非对称聚合物，其中生物活性的药物化合物是倍他米松或倍他米松衍生物。
15.根据权利要求1-14任何一项的多官能的枝状体或超支化聚合物的合成方法，其特征在于分阶段改性这些聚合物的表面，其中包括a.用羟基、羧基或季铵基，或其它无毒基团取代表面上的氨基或其它有毒基团，b.在枝状载体或超支化聚合物，例如聚(乙二醇)的表面上引入各种分子量的聚合物链(PEG化)，以便保护聚合物免遭有机体的MPS(单核吞噬细胞系统)，c.引入与受体或组织互补的可识别基团，即胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、叶酸或RGD受体、核碱部分(腺嘌呤-胸腺嘧啶、胍-胞嘧啶)或巴比妥酸盐，以便提高载体的靶向能力，和d.引入有助于通过细胞膜输送载体和包封的活性药物化合物的基团，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚环氧丙烷部分。
16.根据权利要求15的合成方法，其中进行枝状体或超支化聚合物的外部氨基或羟基与合适的保护聚合物的起始反应，所述保护聚合物在一端带有反应性基团，如异氰酸酯、环氧化物或N-羟基琥珀酰亚胺；随后进行所得聚合物的最大部分的氨基与异氰酸乙酯的反应，用以取代有毒的氨基；随后使前面所得聚合物反应，用以将氨基转变成可识别基团如胍鎓基；随后引入有助于通过细胞膜输送载体的一个或多个基团，如聚精氨酸或环氧丙烷链。
17.根据权利要求15或16的合成方法，其特征在于，阳离子化所述聚合物用以与DNA形成络合物。
18.根据权利要求15-17任何一项的合成方法，其特征在于，当表面的有毒基团是氨基时，引入具有小于8个碳原子，优选2或3个碳原子的[小]脂族链以供取代。
19.一种药物配方，其特征在于它包括包封在权利要求1-14任何一项的改性的多官能枝状或改性的多官能超支化的非对称聚合物内的生物活性的药物化合物或基因材料。
20.一种生产药物配方用以输送生物活性的药物化合物或基因材料的方法，该方法包括合成权利要求15-18任何一项的聚合物，和用其包封生物活性的药物化合物或基因材料。
21.根据权利要求1-14任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称的聚合物，它包括包封的生物活性药物化合物或者携载用于治疗的基因材料。
22.根据权利要求1-14任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称的聚合物用于制造药物剂型的用途，它包括包封的生物活性药物化合物或者携载用于治疗的基因材料。
23.根据权利要求1-14任何一项的改性的枝状聚合物或者改性的超支化的非对称的聚合物在制造治疗与包封的生物活性药物化合物或基因材料相同疾病或病况的药物中的用途，它包括该化合物或者携载基因材料。
全文摘要
本发明涉及用作生物活性的药物化合物的药物传输系统和基因传输系统(基因材料的载体)的多官能的枝状和超支化聚合物的合成，其中后者通过与基因材料缩合。具体地说，本发明涉及基于在其表面上引入官能团X、Y、Z的合适的枝状或超支化聚合物的多官能的化合物的合成。另外，为了基因传输到细胞上，这些多官能系统将变为阳离子系统用于与荷负电的基因材料形成络合物。该官能团使得该传输系统可被互补的细胞受体识别。此外，它们使得该系统在生物环境内稳定且有助于其通过细胞膜输送。
文档编号A61K47/48GK1747988SQ200480004047
公开日2006年3月15日 申请日期2004年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者康斯坦提纳斯·帕里奥斯, 第密特洛斯·查瓦斯, 奥利奥兹里·赛德雷托 申请人:“德默克里托斯”国家科学研究中心, 康斯坦提纳斯·帕里奥斯, 第密特洛斯·查瓦斯, 奥利奥兹里·赛德雷托