专利名称：阻碍剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及阻碍RRE与Rev蛋白结合的阻碍剂。
背景技术：
病毒HIV-1是导致艾滋病的病因，抑制其感染、发病的药物的开发正在进行中。
HIV-1是逆转录病毒的一种，当感染正常细胞时，将病毒的mRMA送入细胞内，通过逆转录酶的作用，生成病毒的cDNA，结合在核内的染色体基因上。在转录用于细胞增殖的基因的同时，病毒的基因也被转录，变成RNA。
通常RNA接受剪接，作为成熟mRNA被放出核外，但此时的HIV-1的RNA必须不经剪接而放出至核外。该机理中重要的是HIV-1的mRNA的RRE(Rev Responsible Element)和Rev蛋白的相互作用。(RRE的碱基排列及Rev蛋白的结构分别如图1、图2所示，同时，通过RRE和Rev蛋白的结合，进行HIV-1复制时的状态概略地如图3所示)。
当阻碍RRE和Rev蛋白的结合(相互作用)时，HIV-1的mRNA因为接受剪接而变短，病毒不能增殖。因此，可以认为，阻碍RRE和Rev蛋白结合的物质具有抑制艾滋病发病的效果。
迄今为止，已报道有几种物质成为阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂。作为成为这种阻碍剂的物质，例如，可以列举出以结构式①表示的天然抗生素新霉素B(Neomycin B)。因新霉素B与RRE牢固结合，故RRE不能与Rev结合。
在能与RRE结合的物质中也有人工合成的，这种物质，例如在Luedtkeet al.Journal of American Chemical Society，122，980(2000)(以下称为“非专利文献1”)及Wilson et al.Biochemistry 40，1150(2001)(以下称为“非专利文献2”)中已作了公开。非专利文献1及2公开的物质的结构，分别如结构式②、③所示
然而，以前作为阻碍剂列举出的物质，几乎都是经过天然物筛选得到的氨基糖苷。另外，以前作为阻碍剂得到的物质，因为RRE的Rev蛋白结合点不具有设计成特异结合的结构，所以，非特异结合牢固，阻碍活性也不充分。
因此本发明的目的是提供一种具有充分的阻碍活性，同时牢固结合在RRE的Rev蛋白结合点上的阻碍剂。
发明内容
此前本发明人发现，具有与鸟嘌呤互补的氢结合部位的作为萘啶的二聚物(体)的萘啶二聚物，在双链DNA中的鸟嘌呤-鸟嘌呤失配(以下称为“GG失配”)碱基对上选择性结合，另外，萘啶二聚物中的一个萘啶，转变成具有与腺嘌呤互补的氢结合部位的氮杂喹啉酮所形成的萘啶-氮杂喹啉酮杂种，在鸟嘌呤-腺嘌呤失配(以下称为“GA失配”)碱基对上选择性结合。
在设计本发明时，本发明人着眼于RRE中的内环上具有GG失配碱基对及GA失配碱基对。从而发现通过在RRE的Rev蛋白结合点上的特异性结合，阻碍RRE和Rev蛋白结合的新型阻碍剂。
具体来说，本发明的阻碍剂是阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂，其特征在于含有以通式(A)表示的萘啶衍生物 (式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，X表示任意的二价基团，Y表示以通式(B)表示的取代基或以通式(C)表示的取代基)。
另外，本发明的萘啶衍生物是以上述通式(A)表示的萘啶衍生物。
上述萘啶衍生物，由于除一个萘啶部分外，还含有至少一个以通式(B)表示的萘啶部分或以通式(C)表示的氮杂喹啉酮部分，可在RRE中内环上存在的GG失配碱基对上进行特异性结合。由此可以提供一种通过与RRE结合从而阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂。
本发明的阻碍剂是阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂，其特征在于含有以通式(1)表示的萘啶二聚物 (式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R2表示碳数为1～20的亚烷基、且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代)。
本发明的阻碍剂，其特征在于含有以通式(2)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种
(式中，R3表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基、且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R4表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代)。
由于阻碍剂含有萘啶二聚物，该阻碍剂在RRE中的内环上存在的GG失配碱基对上进行特异性结合。另外，由于阻碍剂含有萘啶-氮杂喹啉酮杂种，该阻碍剂在RRE中的内环上存在的GA失配碱基对上进行特异性结合。由此，可以提供一种通过与RRE结合，从而阻碍RRE与Rev蛋白结合的阻碍剂。
另外，本发明的阻碍剂，其特征在于含有以通式(3)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种
(式中，R5～R7分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代)。
如通式(3)所示，三萘啶-氮杂喹啉酮杂种含有2个萘啶及氮杂喹啉酮。因此，如果是这种含有三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的阻碍剂，对存在于RRE中内环上的GG失配碱基对及GA失配碱基对的特异性结合可同时进行。由此，可以提供一种更加有效阻碍RRE与Rev蛋白结合的阻碍剂。
含有本发明的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的阻碍剂，例如萘啶二聚物和氮杂喹啉酮杂种可通过连接体结合而得到。本发明的阻碍剂，可通过适当调节该连接体的结构，得到含有以通式(4)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种衍生物的结构 (式中，R8～R10分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R11、R12分别表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代)。这种含有三萘啶-氮杂喹啉酮杂种衍生物的阻碍剂，也可以有效阻碍RRE与Rev蛋白的结合。
本发明的含有三萘啶-氮杂喹啉酮杂种衍生物的阻碍剂，例如，可通过萘啶二聚物或萘啶-氮杂喹啉酮杂种，与以通式(D)表示的二醛反应，经过以醛作为中间体的合成工序而得到OHC-RA-CHO(D)(式中，RA表示碳数为1～13的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代)。这里用RA表示的亚烷基，特别是指碳数为1～3的亚烷基。此时的醛，具体的说，其特征在于含有以通式(5)表示的萘啶二聚物的醛或者是含有以通式(6)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种的醛 (式中，R13、R14分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R15、R16分别表示碳数为1～18的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代，R17表示碳数为1～14的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代)； (式中，R18表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R19、R20分别表示碳数为1～18的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代，R21表示碳数为1～14的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代)。这里以R17及R21表示的亚烷基，特别是指碳数为1～4的亚烷基。
另外，在本发明中，提供一种由含有选自上述萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、三萘啶-氮杂喹啉酮杂种或其衍生物的化合物组中的至少一种化合物的组合物所构成的基底。
如采用该基底，构成例如芯片、实验皿、平皿等器具，则这些器具可具有培养液中或血水中含有的RRE的检出功能。
另外，本发明的生物传感器，是把本发明的萘啶衍生物固定在芯片、实验皿、平皿等载体上而形成。
通过上述生物传感器，可以检出培养液中或血水中含有的RRE，可以检出因HIV-1病毒引起的感染等。
本发明的其他目的、特征及优点，可通过以下所述而充分了解。本发明的优点，参考附图通过以下说明而变得更清楚。
图1是表示RRE的碱基排列图。
图2是表示Rev蛋白的结构图。
图3是表示通过RRE和Rev蛋白的结合，进行HIV-1复制时的状态的概略图。
图4是表示萘啶二聚物及萘啶-氮杂喹啉酮杂种通过连接体结合时的状态的概略图。
图5是表示作为阻碍剂的萘啶二聚物在RRE内环上存在的GG失配碱基对上结合时的状态的概略图。
图6是表示作为阻碍剂的萘啶-氮杂喹啉酮杂种在RRE内环上存在的GA失配碱基对上结合时的状态的概略图。
图7是表示实施例2中萘啶二聚物与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图8是表示实施例2中萘啶-氮杂喹啉酮杂种与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图9是表示实施例2中含第1喹啉的化合物与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图10是表示实施例2中含第2喹啉的化合物与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图11是表示实施例2中萘啶单独与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图12是表示实施例2中氮杂喹啉酮单独与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图13是表示实施例2中喹啉酮单独与RRE混合时的UV吸收光谱图。
图14是分别表示实施例3中，仅RRE、在RRE中添加萘啶二聚物、在RRE中添加萘啶-氮杂喹啉酮杂种时的CD光谱图。
图15是分别表示实施例3中，仅RRE-neg、在RRE-neg中添加萘啶二聚物、在RRE-neg中添加萘啶-氮杂喹啉酮杂种时的CD光谱图。
图16是表示实施例3中RRE-neg的碱基排列图。
图17是表示调查实施例4中RRE、RRE-neg、TAR、单链RNA分别对SPR传感器芯片上固定的萘啶二聚物的结合时的状态的概略图。
图18是表示实施例4中RRE、RRE-neg、TAR、单链RNA分别对SPR传感器芯片上固定的萘啶二聚物的结合的强度图。
图19是表示实施例4中TAR的碱基排列图。
图20是表示实施例4中单链RNA的碱基排列图。
图21是表示实施例5中各种浓度RRE存在下的萘啶二聚物的UV吸收光谱图。
图22是表示实施例5中由图21的332nm处的吸收强度计算出的RRE上结合的萘啶二聚物对添加的全部萘啶二聚物的比例图。
图23是表示实施例6中的采用荧光素荧光标识的Rev-F1与RRE形成复合体状态的概略图。
图24是表示实施例6中的Rev-F1的结构图。
图25是表示实施例6中，对各种浓度的RRE存在下，Rev-F1的各向异性变化图。
图26是表示实施例7中采用萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、新霉素B作阻碍剂时，对各自阻碍剂浓度的各向异性图。
图27是表示实施例8中，仅RRE、在RRE中添加萘啶二聚物、在RRE中添加三萘啶-氮杂喹啉酮杂种、以及在RRE中添加三萘啶-氮杂喹啉酮杂种时各自的RRE的CD光谱变化图。
图28是表示实施例8中采用萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、新霉素B及三-氮杂喹啉酮杂种作阻碍剂时，各自的各向异性测定结果图。
具体实施例方式
对本发明的一实施方式说明如下。本发明的阻碍剂是含有以上述通式(1)表示的萘啶二聚物结构的阻碍剂。
本实施方式的萘啶二聚物并没有特别的限定。因此，该萘啶二聚物可通过以前公知的各种方法合成。例如，采用1，8-萘啶衍生物，将其通过连接体结合，可得到以通式(1)表示的萘啶二聚物。
上述1，8-萘啶衍生物，例如可通过将2-氨基-1，8-萘啶或2-氨基-7-甲基-1，8-萘啶与N-保护-4-氨基丁酸的反应性衍生物，例如酰氯化物反应，使2位氨基酰化后，脱氨基保护基而得到。
本实施方式的阻碍剂，也可以是以通式(1)表示的萘啶二聚物中的一个萘啶变成氮杂喹啉酮，而形成含有以上述通式(2)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种的结构。
本实施方式的萘啶-氮杂喹啉酮杂种，并没有特别的限定。因此，该萘啶-氮杂喹啉酮杂种也可采用以前公知的各种方法加以合成。
本实施方式的阻碍剂，也可含有以通式(3)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的结构。
上述三萘啶-氮杂喹啉酮杂种，例如，如图4所示，萘啶二聚物及萘啶-氮杂喹啉酮杂种可通过连接体结合而得到。对此时的连接体并没有特别的限定，可根据需要适当设定。另外，本实施方案的阻碍剂，通过适当调整该连接体的结构，也可形成含有以上述通式(4)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种衍生物的结构。
三萘啶-氮杂喹啉酮杂种，例如，可通过萘啶二聚物和戊二醛等二醛反应，以含有以上述通式(5)表示的萘啶二聚物的醛作为中间体进行合成，再通过使该含有萘啶二聚物的醛与萘啶-氮杂喹啉酮杂种反应而得到此三萘啶-氮杂喹啉酮杂种。
或者，通过萘啶-氮杂喹啉酮杂种与戊二醛等二醛反应，以含有以上述通式(6)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种的醛作为中间体进行合成，再使该含有萘啶-氮杂喹啉酮杂种的醛与萘啶二聚物反应，也可以得到三萘啶-氮杂喹啉酮杂种。
这样，本实施方式的阻碍剂含有萘啶二聚物及/或萘啶-氮杂喹啉酮杂种。因此，该阻碍剂在RRE中的内环上存在的GG失配碱基对及/或RRE中的内环上存在的GA失配碱基对上进行特异性结合。
图5表示作为本实施方式的阻碍剂的萘啶二聚物，在RRE中的内环上存在的GG失配碱基对上结合时的情况。图6表示作为本实施方式的阻碍剂的萘啶-氮杂喹啉酮杂种，在RRE中的内环上存在的GA失配碱基对上结合时的情况。
在本实施方式中，当阻碍剂含有萘啶二聚物的结构时，对RRE 100纳摩尔浓度(nM)和Rev蛋白100纳摩尔浓度(nM)的结合，优选该阻碍剂采用的浓度在1.2微摩尔浓度(μM)～12微摩尔浓度(μM)的范围内。
另外，当该阻碍剂含有萘啶-氮杂喹啉酮杂种的结构时，对RRE 100纳摩尔浓度(nM)和Rev蛋白100纳摩尔浓度(nM)的结合，优选该阻碍剂采用的浓度在2微摩尔浓度(μM)～20微摩尔浓度(μM)的范围内。
当该阻碍剂含有三萘啶-氮杂喹啉酮杂种或三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的衍生物的结构时，对RRE 100纳摩尔浓度(nM)和Rev蛋白100纳摩尔浓度(nM)的结合，优选该阻碍剂采用的浓度在200纳摩尔浓度(nM)～2微摩尔浓度(μM)的范围内。
本实施方式的阻碍剂，由于与RRE进行特异性结合，故可以抑制基因组RNA的细胞质输送。因此，本实施方式的阻碍剂，可以用作阻碍病毒复制的抗HIV-1药物。
选自本实施方式的含萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、三萘啶-氮杂喹啉酮杂种及其衍生物的化合物组中的至少一种化合物所构成的组合物，例如，也可以构成基底(载体)。采用这些基底，构成如芯片、实验皿、平皿等器具时，这些器具可以具有培养液中或血水中含有的RRE的检出功能。
下面通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些。
实施例1三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的合成方法如下。
(i)向萘啶二聚物(73mg)的甲醇溶液中添加醋酸数滴，调至pH5。向该溶液中添加戊二醛(360mg)，然后添加氰硼氢化钠(3.6mg)，于室温下反应10分钟。
将反应混合物用水-氯仿进行萃取，干燥有机层后进行浓缩。采用制备TLC精制粗生成物，得到含有萘啶二聚物的醛(27.0mg)。
将所得到的含有萘啶二聚物的醛进行NMR测定，得到的结果如下所示1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝10.29(br，2H)，9.65(br，1H)，8.32(d，2H，J＝8.8Hz)，7.93(d，2H，J＝9.2Hz)，7.83(d，2H，J＝8.0Hz)，7.14(d，2H，J＝8.4Hz)，2.98(m，4H)，2.80(br，4H)，2.69(s，6H)，2.65(m，4H)，1.64(m，4H)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ＝202.6，171.8，162.7，154.3，153.6，138.5，136.2，121.17，118.2，114.6，53.7，49.6，43.5，34.8，25.7，25.4，19.9.
(ii)向含有萘啶二聚物的醛(22.3mg)的甲醇溶液中添加醋酸数滴，调至pH5。向该溶液中添加萘啶-氮杂喹啉酮杂种(29.6mg)，然后添加氰硼氢化钠(3.6mg)，于室温下反应15分钟。
将反应混合物用水-氯仿进行萃取，干燥有机层后进行浓缩。采用硅胶柱色谱法精制粗生成物，得到三萘啶-氮杂喹啉酮(10.0mg)。
上述合成反应如式A所示。
萘啶二聚物 三萘啶-氮杂喹啉酮………(式A)将所得到的三萘啶-氮杂喹啉酮进行NMR测定，得到的结果如下所示
1H NMR(CD3OD，400MHz)δ＝8.11(br，1H)，8.10(d，2H，J＝8.8Hz)，8.01(d，2H，J＝8.4Hz)，7.99(d，1H，J＝8.0Hz)，7.87(d，2H，J＝8.4Hz)，7.85(d，2H，J＝8.4Hz)，7.63(d，1H，J＝8.0Jz，7.57(d，1H，J＝9.6Hz)，7.24(d，1H，J＝8.4Hz)，7.18(d，2H，J＝8.4Hz)，6.97(d，1H，J＝7.6Hz)，6.38(d，1H，J＝9.6Hz)，4.39(s，2H)，2.98(br，8H)，2.72(10H)，2.62(s，3H)，2.61(s，6H)，2.60(2H)，1.70(m，4H)，1.47(m，2H)；13C NMR(CD3OD，100MHz)δ＝173.7，172.6，164.5，163.0，162.7，160.0，153.9，153.83，153.78，153.7，148.5，139.7，138.9，138.6，137.4，137.2，136.7，121.6，121.3，121.2，118.5，118.4，116.1，114.4，114.3，113.3，54.05，53.8，50.3，49.6，49.4，48.7，44.6，33.9，25.9，24.9，23.9，23.8实施例2以萘啶二聚物存在下、不存在下的RRE的UV吸收光谱为指标筛选药物。其结果如图7～图10所示。
图7表示萘啶二聚物与RRE混合时的UV吸收光谱。图7中实线表示的是仅为RRE吸收的光谱、虚线表示的是从萘啶二聚物与RRE混合物的吸收中减去萘啶二聚物单独吸收的光谱。
图8表示萘啶-氮杂喹啉酮杂种与RRE混合时的UV吸收光谱。图8中实线表示的是仅为RRE吸收的光谱、虚线表示的是从萘啶-氮杂喹啉酮杂种与RRE混合物的吸收中减去萘啶-氮杂喹啉酮杂种单独吸收的光谱。
图9表示将以结构式(7)所示的萘啶二聚物中一个萘啶转变成不能与鸟嘌呤进行氢键结合的喹啉而形成的含第1喹啉的化合物，以及与RRE混合时的UV吸收光谱。图9中实线表示的是仅为RRE吸收的光谱、虚线表示的是减去含第1喹啉的化合物单独吸收的光谱。
图10表示将以结构式(8)所示的萘啶二聚物中一个萘啶转变成不能与鸟嘌呤进行氢键结合的喹啉而形成的含第2喹啉的化合物，以及与RRE混合时的UV吸收光谱。图10中实线表示的是仅为RRE吸收的光谱、虚线表示的是减去含第2喹啉的化合物的单独吸收的光谱。
在本实施例中，对RRE无吸收的300nm～400nm处进行比较。
由图7～图10可以确认，在使用识别GG失配的萘啶二聚物，及识别GA失配的萘啶-氮杂喹啉酮杂种时，UV吸收光谱的变化较大。然而，在将一个萘啶环转变成不能与鸟嘌呤进行氢键结合的喹啉的含第1及第2喹啉的化合物中无显著变化。
另外，以结构式(9)表示的单独萘啶
结构式(10)表示的单独氮杂喹啉酮 以及，结构式(11)表示的单独喹啉酮 各自以及分别与RRE混合时，在300nm～400nm处几乎未发现变化。单独萘啶、单独氮杂喹啉酮、单独喹啉酮，及分别与RRE混合时的UV吸收光谱，分别如图11～图13所示。
由以上结果可知，为了在RRE上结合，含有2个萘啶的萘啶二聚物，或萘啶二聚物中的一个萘啶转变成氮杂喹啉酮而形成的萘啶-氮杂喹啉酮杂种是必需的，其各自单独的构成分子不与RRE结合。
实施例3调查由于与药物结合所致的RRE的CD光谱的变化。其结果如图14所示。
图14中实线表示仅RRE时的光谱、虚线表示RRE中添加萘啶二聚物时的光谱、点虚线表示RRE中添加萘啶-氮杂喹啉酮杂种时的光谱。
如图14所示，当RRE中添加萘啶二聚物时，整个光谱的变化较大。RRE中添加萘啶-氮杂喹啉酮杂种时，在300nm以下也可见到光谱变化。
另外，调查由于与药物结合所致的RRE-neg的CD光谱的变化。其结果如图15所示。RRE-neg是失去由RRE的GG失配和GA失配构成的内环，具有如图16所示的碱基排列的物质。
由图14及图15所示的结果可知，萘啶二聚物及萘啶-氮杂喹啉酮杂种在RRE内环上进行特异性结合。
实施例4如图17所示，调查RRE、RRE-neg、与RRE同样作为用V-RNA靶已知的TAR、以及单链RNA(ssRNA)对SPR的传感器芯片上固定的萘啶二聚物的结合强度。其结果如图18所示。图18中实线表示使用RRE时的情况、虚线表示使用RRE-neg时的情况、点虚线表示使用TAR时的情况、二点虚线表示使用ssRNA时的情况。(TAR及ssRNA的碱基排列分别如图19及图20所示)。
如图18所示，使用RRE时，可得到较大的SPR信号，可知萘啶二聚物与RRE牢固结合。但是，采用其他的RNA时，几乎无响应。特别是TARRNA，尽管与RRE同样具有内环，却完全没有结合。
由该结果可知，萘啶二聚物识别RRE的内环碱基对排列。
实施例5为了调查萘啶二聚物对RRE的结合形态，进行UV滴定。其结果如图21及图22所示。图21表示各种浓度的RRE存在下的萘啶二聚物的UV吸收光谱。图22表示由图21的332nm处的吸收强度计算出的RRE上结合的萘啶二聚物对加入的全部萘啶二聚物的比例。
已经确认，随着RRE浓度的增加，萘啶二聚物的UV吸收减少，通过等吸收点，复合体的UV吸收增加。
由此可知，萘啶二聚物在RRE的双链上嵌入，由萘啶二聚物和萘啶二聚物形成复合体。
实施例6采用荧光偏光法探讨实际上通过萘啶二聚物及萘啶-氮杂喹啉酮杂种是否阻碍Rev-RRE复合体的形成。
偏光度即各向异性是随着分子量的增大而变大。如图23所示，采用荧光素荧光标识的Rev肽(以下成为Rev-Fl)，与RRE形成复合体时，随着分子量的增大，各向异性变大。Rev-Fl的结构如图24所示。
在各种浓度的RRE存在下，测定Rev-Fl的各向异性，得到如图25所示的结合曲线，从而确认复合体的形成。
另外，通过解析所得到的结合曲线，可知Rev和RRE的解离常数为16nM。
实施例7采用萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、新霉素B作为阻碍剂，分别进行各向异性测定。其结果如图26所示。图26中各向异性由大开始依次为，添加新霉素B、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、萘啶二聚物时的解离曲线，横轴为阻碍剂的浓度。
由图26可以确认，与新霉素B相比，萘啶二聚物及萘啶-氮杂喹啉酮杂种在低浓度时，各向异性减少。由此可知，萘啶二聚物及萘啶-氮杂喹啉酮杂种对Rev-RRE复合体形成的阻碍能力高于新霉素B。
另外，阻碍复合体形成的IC50值，新霉素为4微摩尔、萘啶二聚物为1.2微摩尔、萘啶-氮杂喹啉酮杂种为2微摩尔。
实施例8采用荧光偏光法，采用三萘啶-氮杂喹啉酮杂种作为阻碍剂时，求出阻碍复合体形成的IC50值为0.2微摩尔。另外，图27中表示仅为RRE(图中用实线表示)、RRE中添加萘啶二聚物(图中用虚线表示)、RRE中添加三萘啶-氮杂喹啉酮杂种(图中用点虚线表示)、及RRE中添加三萘啶-氮杂喹啉酮杂种时各自的RRE的CD光谱的变化。
图28表示采用萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、新霉素B及三萘啶-氮杂喹啉酮杂种作为阻碍剂时，分别进行各向异性测定的结果。(图28中表示各向异性值由大开始依次为，RRE中添加新霉素B、RRE中添加萘啶-氮杂喹啉酮杂种、RRE中添加萘啶二聚物、RRE中添加三萘啶-氮杂喹啉酮杂种时的解离曲线，横轴表示阻碍剂的浓度)。由这些结果可知，含三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的阻碍剂，具有新霉素B约20倍的活性。
本发明的阻碍剂，如上所述，是阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂，含有以通式(1)表示的萘啶二聚物的结构。
本发明的阻碍剂，如上所述，含有以通式(2)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种的结构。
本发明的阻碍剂，如上所述，含有以通式(3)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的结构。
本发明的阻碍剂，如上所述，含有以通式(4)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种衍生物的结构。
由此可取得通过在RRE中内环上存在的GG失配碱基对及/或GA上的特异性结合，提供一种阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂的效果。
另外，用于实施发明的最佳方式中所做的具体实施方式
或实施例，始终是用于说明本发明的技术内容，不应狭义理解为只限定于这种具体例，在本发明的精神及所要求保护内容的范围内可作各种变更并加以实施。
产业上利用的可能性本发明的阻碍剂，可用作抑制艾滋病发病的抗艾滋病药物等。另外，本发明的萘啶衍生物，可用作构成上述阻碍剂的成分。本发明的含有萘啶二聚物的醛及含有萘啶-氮杂喹啉酮杂种的醛，可用作三萘啶-氮杂喹啉酮杂种及其衍生物的制造中间体。本发明的基底及生物传感器，可用在具有培养液中或血水中所含RRE的检出功能的芯片、实验皿、平皿等中。
权利要求
1.一种阻碍剂，是阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂，其中含有以通式(A)表示的萘啶衍生物 式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，X表示任意的二价基团，Y表示以通式(B)表示的取代基或以通式(C)表示的取代基。
2.根据权利要求1所述的阻碍剂，其中上述萘啶衍生物是以通式(1)表示的萘啶二聚物 式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R2表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代。
3.根据权利要求1所述的阻碍剂，其中上述萘啶衍生物是以通式(2)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种 式中，R3表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R4表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代。
4.根据权利要求1所述的阻碍剂，其中上述萘啶衍生物是以通式(3)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种 式中，R5～R7分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代。
5.根据权利要求1所述的阻碍剂，其中上述萘啶衍生物是以通式(4)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的衍生物 式中，R8～R10分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R11、R12分别表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代。
6.一种萘啶衍生物，是阻碍RRE和Rev蛋白结合的阻碍剂，其是以通式(A)表示的萘啶衍生物 式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，X表示任意的二价基团，Y表示以通式(B)表示的取代基或以通式(C)表示的取代基。
7.根据权利要求6所述的萘啶衍生物，其是以通式(5)表示的含萘啶二聚物的醛的萘啶衍生物 式中，R13、R14分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R15、R16分别表示碳数为1～18的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代，R17表示碳数为1～14的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代。
8.根据权利要求7所述的萘啶衍生物，其是通过萘啶二聚物与以通式(D)表示的二醛反应而得到的萘啶衍生物OHC-RA-CHO………(D)式中，RA表示碳数为1～13的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代。
9.根据权利要求6所述的萘啶衍生物，其是以通式(6)表示的含有萘啶-氮杂喹啉酮杂种的醛 式中，R18表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R19、R20分别表示碳数为1～18的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代，R21表示碳数为1～14的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代。
10.根据权利要求9中所述的萘啶衍生物，其是通过萘啶-氮杂喹啉酮杂种与以通式(D)表示的二醛反应而得到的萘啶衍生物OHC-RA-CHO………(D)式中，RA表示碳数为1～13的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代。
11.根据权利要求6中所述的萘啶衍生物，其是含有以通式(1)表示的萘啶二聚物的萘啶衍生物 式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基该且烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R2表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代。
12.根据权利要求6所述的萘啶衍生物，其是含有以通式(2)表示的萘啶-氮杂喹啉酮杂种的萘啶衍生物 式中，R3表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R4表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代。
13.根据权利要求6所述的萘啶衍生物，其是以通式(3)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的萘啶衍生物 式中，R5～R7分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代。
14.根据权利要求6所述的萘啶衍生物，其是以通式(4)表示的三萘啶-氮杂喹啉酮杂种的衍生物的萘啶衍生物 式中，R8～R10分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基该且烷基氨基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，R11、R12分别表示碳数为1～20的亚烷基且该亚烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子、硫原子、氮原子或羰基取代。
15.一种基底，其是由含有选自萘啶二聚物、萘啶-氮杂喹啉酮杂种、三萘啶-氮杂喹啉酮杂种或其衍生物的化合物组中的至少一种化合物的组合物所构成。
16.一种用于检测RRE的生物传感器，其是将以通式(A)表示的萘啶衍生物固定在载体上而形成的生物传感器 式中，R、R1分别表示氢原子、碳数为1～15的烷基且该烷基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、碳数为1～15的烷氧基且该烷氧基中的1个或1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代、或者碳数为1～15的单或二烷基氨基且该烷基氨基中的1个或者1个以上的碳原子可被氧原子或氮原子取代，X表示任意的二价基团，Y表示以通式(B)表示的取代基或以通式(C)表示的取代基。
全文摘要
一种阻碍剂，其中含有萘啶二聚物、萘啶－氮杂喹啉酮杂种、三萘啶－氮杂喹啉酮杂种、或三萘啶－氮杂喹啉酮杂种的衍生物。对RRE 100纳摩尔浓度和Rev蛋白100纳摩尔浓度的结合，如使用含萘啶二聚物的阻碍剂，则采用1.2微摩尔浓度～12微摩尔浓度，如使用含萘啶－氮杂喹啉酮杂种的阻碍剂，则采用2微摩尔浓度～20微摩尔浓度，如使用含三萘啶－氮杂喹啉酮杂种或三萘啶－氮杂喹啉酮杂种衍生物的阻碍剂，则采用200纳摩尔浓度～2微摩尔浓度。由此，可有效阻碍RRE与Rev蛋白的结合。
文档编号A61P43/00GK1753900SQ20048000533
公开日2006年3月29日 申请日期2004年2月26日 优先权日2003年2月28日
发明者中谷和彦, 堀江壮太, 斋藤烈, 萩原伸也, 后藤佑树, 小堀哲生 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构