专利名称：包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和吡美莫司的用于治疗炎症和免疫介导的疾病的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗例如炎症和免疫介导的疾病，包括自身免疫性疾病的药物组合物。
本发明的一方面提供了包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物与下式化合物的组合的药物组合物 其中R1为式(a)基团 其中R5为氯、溴、碘或叠氮基，R6为羟基或甲氧基，且R4为羟基且在10、11位之间有一个单键；或者R4不存在，且在10、11位之间有一个双键，或
R1为式(b)或(c)基团 和 其中R6为如上定义且R4为羟基且在10、11位之间有一个单键，R2为氧代且在23、24位之间有一个单键；任选保护的羟基且在23、24位之间有一个单或双键；或者R2不存在且在23、24位之间有一个双键；R3为甲基、乙基、丙基或烯丙基该药物组合物还包括至少一种药学上可接受的赋形剂。
包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物与式I化合物的组合的药物组合物在下文中称为“(根据)本发明组合物”。
本发明另一方面提供了本发明药物组合物，其中式I化合物为下式化合物 吡美莫司吡美莫司(INN推荐)(ASM981；ElidelTM)，即{[1E-(1R，3R，4S)]1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R}-12-[2-(4-氯代-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-17-乙基-1，14-二羟基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28，二氧杂-4-氮杂三环[22.3.1.0(4，9)]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮，公开于例如EP 427 680(实施例66a的33-表-33-氯代-FR 520)中。
本发明另一方面提供了其中雷帕霉素衍生物为下式化合物的本发明药物组合物， 其中R1为CH3或(C3-6)炔基，R2为H、-CH2-CH2-OH、3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，且X为＝O、(H，H)或(H，OH)，前提是当X为＝O且R1为CH3时，R2不为H，或者当R2为-CH2-CH2-OH时，为它的前药，例如它们生理学上可水解的醚。
典型的式II雷帕霉素衍生物包括例如32-氢化雷帕霉素，例如WO96/41807和US 5 256 790所述，此处引入以作参考，例如32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32-脱氧雷帕霉素、16-O-取代的雷帕霉素，例如公开于WO 94/02136、WO 95/16691和WO 96/41807的那些，此处引入其内容以作参考，例如16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、40-O-取代雷帕霉素，例如US 5 258 389、WO 94/09010、WO 92/05179、US 5 118 677、US 5 118 678、US 5 100 883、US 5 151 413、US 5 120 842、WO 93/11130、WO 94/02136、WO 94/02485和WO 95/14023中所述，此处全部引入以作参考，例如40-[3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称为CCI779)或40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也称ABT578)。优选的化合物为例如40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素(下文中的化合物A)，例如公开于WO94/09010的实施例8，或32-脱氧雷帕霉素，或16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氢-雷帕霉素，例如公开于WO96/41807。雷帕霉素衍生物也可以包括(表)雷帕类，例如公开于WO98/02441和WO01/14387，例如化合物AP23573、AP23464、AP23675或AP23841；或衍生物如雷帕霉素衍生物(biolimus)7或雷帕霉素衍生物9。雷帕霉素衍生物也可以包括雷帕霉素的前药，如TAFA93。
适当的雷帕霉素衍生物也例如US 3 929 992和US 5 258 389所述。更优选本发明组合物包含雷帕霉素，也称西罗莫司(雷帕霉素；RapamuneR)和/或雷帕霉素衍生物依维莫司(化合物A，RAD001；40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素；CerticanR)。
此处引入所有的专利文献以供参考。
本发明另一方面提供了除包含至少一种药学上可接受的赋形剂外还包含40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素和吡美莫司的组合的药物组合物，所述赋形剂为例如适当载体和/或稀释剂，例如包括填充剂、粘合剂、崩解剂、流动调节剂、润滑剂、糖和增甜剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、为调节渗透压的盐和/或缓冲剂。
本发明的组合化合物，即式I化合物，例如吡美莫司，可为游离形式、盐的形式、溶剂化物形式或盐和溶剂化物形式，如果存在盐和/或溶剂化物的话。
本发明另一方面提供了本发明组合物，其中式I化合物为盐的形式。
本发明组合物可以包含一种或多种雷帕霉素衍生物，优选雷帕霉素或一种雷帕霉素衍生物，和一种或多种式I化合物，更优选一种化合物，例如吡美莫司。
本发明组合物适合为乳剂、微乳剂、乳剂预浓缩剂或微乳剂预浓缩剂或固体分散剂，特别是雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物)和式I化合物(例如吡美莫司)的油包水微乳剂预浓缩剂或水包油微乳剂。
本发明组合物还可包括另外的药用活性化合物。这些另外的活性化合物包括例如抗炎性和免疫调节药物。
另一方面，本发明的药物组合物还可包括其他抗炎和/或免疫调节药物。
本发明组合物包括-固定组合，其中式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物，如化合物A)位于同一制剂中；-试剂盒(＝各部分组合的试剂盒)，其中式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物，如化合物A)分别是不同的制剂，但是以同一包装形式出售，其中可含义例如用于同时给药的说明；以及-游离的组合，在该组合中，式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物，如化合物A)独立包装，同时提供用于同时或依次给药的说明。
本发明另一方面提供了试剂盒，该试剂盒除包括用于同时或依次给药的说明外，还包括雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II雷帕霉素衍生物，例如化合物A)和式I化合物(例如吡美莫司)。
申请人令人惊奇地发现了这样一种药物组合物，该组合物可以为例如固体形式，如片剂，该药物组合物包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(包括式II化合物，例如化合物A)和式I化合物(例如吡美莫司)的固定组合作为活性药物，该药物组合物可以为例如口服药物组合物。
本发明另一方面提供了固定组合形式的药物组合物，例如口服药物组合物，例如固体口服组合物，例如固体分散形式，该药物组合物包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如化合物A)和式I化合物(例如吡美莫司)和载体(例如纤维素)，任选存在如上所述的赋形剂。
固体分散形式的组合物可以任何适当的形式给药，例如片剂、胶囊、颗粒剂或散剂形式。
本发明的药物组合物，包括口服药物组合物，可以例如根据类似的常规方法，或如此处所述方法制备。
为制备本发明的固定口服组合物或组合，例如片剂，可以采用包含式I化合物(例如吡美莫司)以及雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物)和载体(如纤维素，例如羟基丙基甲基纤维素)的固体分散形式。固体分散形式是已知的或者可以根据所属领域已知的方法获得。片剂可以通过适当方法获得，例如将活性药物和载体以及任选的另外的赋形剂混合，在加入另外的赋形剂以前或以后干法制粒，然后将得到的混合物压片。另外的赋形剂包括，如-润滑剂，如硬脂酸镁，-填充剂，例如糖，如乳糖，-助流剂，如二氧化硅，例如胶态二氧化硅，-崩解剂，如聚乙烯基吡咯烷酮，例如聚维酮，交联聚维酮(N-乙烯基-吡咯烷酮的均聚物或共聚物)。
式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物)的重量比，在本发明口服组合物中并不是至关重要的，例如其重量比由约1∶10至800∶1。如果采用化合物吡美莫司和化合物A作为活性药物，更优选采用过量吡美莫司，例如吡美莫司∶化合物A的适当重量比为例如约10∶1至800∶1。
本发明另一方面提供了口服给药的片剂，包含-化合物A和吡美莫司作为活性药物，例如固体分散形式，-纤维素，例如羟基丙基甲基纤维素作为载体，-任选的崩解剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮，-任选的助流剂，例如胶态二氧化硅，-任选的润滑剂，例如硬脂酸镁，-任选的填充剂，例如糖，如乳糖。
本发明另一方面提供了包含如下成分的本发明片剂(重量以百分比表示)
-吡美莫司2-8％，例如4％；-化合物A0.05-0.25％，例如0.13％；-羟基丙基甲基纤维素(例如3cps)10-30％，例如21.4％；-乳糖(例如200目)0.6-2.0％，例如1.2％；-丁羟甲苯0.005-0.025％，例如0.013％-喷雾干燥的乳糖25.0-70.0％，例如50.8％；-交联聚维酮10.0-40.0％，例如20.0％；-胶态二氧化硅(Aerosil 200)0.5-2.5％；例如1.5％-硬脂酸镁0.5-2.0％，例如1.0％。
该片剂可以，包含例如约10-60mg吡美莫司(例如30mg)，以及0.1-2mg化合物A(例如1mg)。
本发明另一方面提供了雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(包括式II化合物)和式I化合物(例如吡美莫司)的组合作为药物的用途。
本发明另一方面提供了雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(如式II化合物)和式I化合物(例如吡美莫司)的组合用于制备治疗炎性肠疾病和与之相关的疾病药物的用途。
人类的IBD，与许多其它慢性炎症或自身免疫性疾病一样，可以被看作是敏感性基因、环境和免疫系统的相互作用的综合性结果。这些因素间的相互影响程度将决定疾病的临床表现；局限性回肠炎(CD)或溃疡性结肠炎(UC)和各种根据严重性和部位确定的临床亚群。关于IBD的发病机理的主流观点是认为对正常肠道细菌性抗原的免疫应答失调(参见例如Kirsner JB，炎性肠疾病.第5版；W.B.Saunders，第208-39页，第299-304页；第305-14页和第315-25页)。在CD和UC中，固有层T淋巴细胞数量增多(参见例如Selby等，(1984)，Gut；25(1)32-40)。大量来自实验模型如SCID-IBD模型的证据显示，抑制性亚类T细胞阻止对肠内遇到的正常菌群的反应(参见例如Groux H.等，(1999)，Immunol.Today；20(10)442-5)。在IBD中，这种平衡受到干扰且引起炎症级联发展成慢性应答。表达高水平的CD45RB(CD4+CD45RBHi)的同基因CD4+T细胞向SCID小鼠(SCID-IBD)中的转移引发了重度结肠炎和消耗性疾病，其通常会导致小鼠在病理性CD4+CD45RBHiT细胞转染(transferred)后的4-8周内死亡(参见例如Powrie F等(1993)，Int.Immunol.；5(11)1461-71)。结肠炎严重程度模型具有许多人类IBD的特征并确实在90年代被广泛采用以进一步加强对人类疾病的理解，被认为比任何其他模型更能反映IBD。这些也包括经外源性药物给药或经基因操作诱导的结肠炎(参见例如BlumbergRS等，(1999)Curr.Opin.Immunol.；11(6)648-56；Strober W等，(1998)，Ann.Intern.Med.；128(10)848-56；Strober W等，(1998)，Scand.J.Immunol.；48(5)453-8)。采用SCID-IBD模型，TNFα、IFNγ和IL-12抗体显示短暂部分有效的作用(参见例如Powrie F等(1994)，Immunity.；1(7)553-62；Simpson SJ，等(1998)，J.Exp.Med.；187(8)1225-34；Mackay F等(1998)，Gastroenterology；115(6)1464-75)。最近，有报告称CD134配基抗体对OX40L(参见例如Malmstrom V等(2001)，J.Immunol.；166(11)6972-81)、CD154(参见例如Liu Z.等，(2000)，J.Immunol.；164(11)6005-14；De Jong YP等(2000)，Gastroenterology；119(3)715-23)和对β7整合素或MAdCAM-1(参见例如Picarella D等，(1997)，J.Immunol.；158(5)2099-106)有效。这些数据共同表明，通过抑制主要炎症介质包括TNFα，和/或参与中和Th1型分化和效应子功能的细胞因子，或干扰淋巴结中存在的抗原呈递步骤或干扰这些细胞的白细胞归巢方法，可以消除疾病。
本发明另一方面提供了雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(如式II化合物，例如化合物A)以及式I化合物(例如吡美莫司)的组合的用途，用于制备治疗疾病的药物，所述疾病选自特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
例如，观察得到的结果表明，本发明的组合或组合物可以作为治疗疾病的药物，其中式I化合物(包括吡美莫司)和/或雷帕霉素或雷帕霉素衍生物具有药用活性，例如包括可以治疗包括炎症和免疫介导的疾病，包括自身免疫性疾病，例如过敏性病症，如特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症、痤疮、哮喘；银屑病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠疾病(IBD)、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、Sjgren综合征、内源性后葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、血管炎；或阻止同种异体移植的排斥反应，例如包括肾脏或肝移植；或移植物抗宿主疾病，更优选IBD和与IBD相关的疾病。
本发明另一方面提供了治疗疾病的方法，该方法包含给予需要此类治疗的患者治疗有效量的本发明组合物或本发明的药用试剂盒，所述疾病选自下列特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
本发明另一方面提供了治疗炎性肠疾病和与之相关的疾病的方法，该方法包含给予需要此类治疗的患者治疗有效量的本发明组合物或本发明的药用试剂盒。
本发明组合物可以通过适当途径给药，例如类似于式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II化合物)的给药方式。
本发明组合物可以适当制备，例如类似于常规方法，如将式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物一起或分别与至少一种药学上可接受的赋形剂混合制备。除外的申请人还发现，化合物包括FK506与雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的组合可以用于治疗炎症和免疫介导性疾病。
本发明另一方面提供了雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II雷帕霉素衍生物，例如化合物A)和下式化合物的组合在制备治疗下列疾病的药物中的用途
其中R1为羟基或保护的羟基，R2为氢、羟基或保护的羟基，R3为甲基、乙基、丙基或烯丙基，n为整数1或2，且线和虚线为单键，所述疾病选自特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
本发明另一方面提供了雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II雷帕霉素衍生物，例如化合物A)和式III化合物的组合用于制备治疗炎性肠疾病的药物的用途。
本发明另一方面提供了雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如式II雷帕霉素衍生物，例如化合物A)和式III化合物的组合的用途，其中式III化合物为下式化合物
申请人:还发现，式II化合物可用于治疗各种皮肤相关疾病，如特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
相应地，本发明另一方面提供了一种治疗患者特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮所需的方法，该方法包含给予所述患者治疗有效量的下式化合物
其中R1为CH3或(C3-6)炔基，R2为H、-CH2-CH2-OH、3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，且X为＝O、(H，H)或(H，OH)，前提是当X为＝O且R1为CH3时，R2不为H，或者当R2为-CH2-CH2-OH时，为它们的前药，例如其生理学上可水解的醚。
就该方面而言，本发明特别优选的式II的雷帕霉素衍生物是40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素(下文中的化合物A)、40-[3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基-丙酸酯]-雷帕霉素(又称CCI779)、40-表-(四唑基)-雷帕霉素(又称ABT578)、32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氢雷帕霉素或TAFA-93。更优选化合物A。
本发明进一步提供了1.如上所述的式II雷帕霉素衍生物(例如化合物A)，用于治疗如上定义皮肤相关疾病的方法中。
2.如上所述的式II雷帕霉素衍生物(例如化合物A)，用于制备用于治疗如上定义皮肤相关疾病方法的药物组合物。
3.用于治疗如上定义皮肤相关疾病方法的药物组合物，该药物组合物包含如上所述的式II雷帕霉素衍生物(例如化合物A)和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。
如上所述的式II雷帕霉素衍生物和本发明组合物在治疗如上文详述的疾病和紊乱中的用途，可以在标准动物或临床试验中证明，例如如下文所述。
实施本发明方法所需的日剂量，可根据例如所采用的本发明化合物的化学性质和药物代谢动力学数据、个体特征、给药方法及所治紊乱的性质和严重性进行变化。但是，通常而言，对于大型哺乳动物(例如人类)，采用与通常给予的式I化合物(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的日剂量相似或更低的剂量即可得到令人满意的效果。
优选日剂量范围为约0.1-25mg的式II的雷帕霉素或雷帕霉素衍生物，例如化合物A，可以为单一剂量或分份剂量。口服时，给患者的合适的日剂量是例如0.1-25mg的式II的雷帕霉素或雷帕霉素衍生物，例如化合物A。
本发明组合物可以通过适当途径给药，例如类似于式I化合物，(例如吡美莫司)和雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(如式II化合物)的途径给药。例如，式II的雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如化合物A)，可以经任何常规途径给药，特别是肠内给药，例如口服，如以片剂、胶囊、饮用溶液形式、鼻内、肺(经吸入)或肠胃外，例如以注射溶液或悬浮液形式。口服给药的适当的单位剂量形式包含约0.05-12.5mg、通常为0.25-10mg的式II的雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(例如化合物A)，还包括一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。
本文中术语“治疗”或“处理”指预防或阻止治疗和治愈或疾病缓解治疗，包括可能感染疾病或怀疑已感染疾病的患者的治疗和生病或经诊断为罹患疾病或医学紊乱的患者的治疗。
图1-图3显示了经用2×105CD4+CD45RBHiT细胞重建后，采用和未采用吡美莫司(ASM)、化合物A和ASM+化合物A的组合处理的SCID-IBD小鼠体重。PBS-小鼠为非转染小鼠(non-transferred mice)。转染后的第1天开始治疗且每日进行。数据表示为体重均值％(与0日对比的体重)±s.e.m.，每组小鼠n＝8(少数为n＝5、6或7)，**p＜0.01，*p＜0.05与溶媒处理组体重下降相比。
图1显示了采用剂量1(化合物A0.1mg/kg/d，ASM60mg/kg/d)的结果、图2显示了采用剂量2(化合物A0.1mg/kg/d，ASM30mg/kg/d)的结果，图3显示采用剂量3(化合物A0.05mg/kg/d，ASM10mg/kg/d)的结果。
图4显示经各种治疗后SCIB-IBD小鼠结肠炎严重程度，严重程度评分如温度以摄氏度表示(℃)且未校正本文采用下列缩写ASM吡美莫司AUC曲线下面积ANOVA 方差分析BW 体重CD 局限性回肠炎CyA环胞菌素AFACS 荧光激活细胞分类器H&E苏木精 & 伊红HTAB 十六烷基三甲基溴化铵IBD炎性肠疾病IFN干扰素IL-白细胞介素i.p. 腹膜内的MPO髓过氧化物酶MLN肠系膜淋巴结
MTOR雷帕霉素哺乳动物靶PBS 磷酸盐缓冲盐水PBS-(小鼠) 接受PBS i.p.而非致病T细胞的SCID小鼠p.o.口服RAD 化合物A，依维莫司SCID重度联合免疫缺陷病s.e.m. 均值的标准误SD 标准偏差TMB 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺TNF 肿瘤坏死因子UC 溃疡性结肠炎实施例1试验方法SCID-IBD小鼠模型将雌性BALB/cJ和C.B.17 scid/scid小鼠(Fox Chase SCID，Bomholtgaard，Denmark)置于通风的无特定病原体的笼子架上(微-通风型84-II，Allentown Caging Equipment Co.，Allentown，新泽西，USA)。采用小鼠进行的试验过程是经许可的，许可证号为MA1048/00(Magistratabteilung 58号，Amt der Wiener Landesregierung)。
简单地说，通过活着/死亡分级经双色FACS-分类由BALB/c小鼠脾中分离CD4+CD45RBHiT淋巴细胞并向6-9周大的雌性SCID小鼠体内注射(2×105细胞/小鼠，i.p.)。阴性对照小鼠i.p.注入PBS，将每个笼子中的一只这样的小鼠作为岗哨动物以监测在这些免疫缺失的群体中可能出现的感染(PBS-小鼠)。
首先将SCID小鼠用CD4+CD45RBHiT细胞重建，然后用试验化合物或作为对照的溶媒进行处理。可以采用化合物A(RAD)和吡美莫司(ASM)作为试验化合物。采用不同剂量进行3个独立的研究。在每个研究中，两种化合物分别单独和组合使用。所有3个研究均按照相同的基本方案进行，采用4组小鼠，以管饲每日口服给药，1组给予溶媒(安慰剂)，1组仅给予化合物A，1组仅给予ASM，1组给予化合物A和吡美莫司的组合，在细胞转染后的第1-第29日给药。
给药剂量研究1剂量1化合物A0.1mg/kg/d，ASM60mg/kg/d研究2剂量2化合物A0.1mg/kg/d，ASM30mg/kg/d，以及研究3剂量3化合物A0.05mg/kg/d，ASM10mg/kg/d。
每一小鼠的体重均全程监控并在研究结束时将小鼠称重。
在研究结束后麻醉小鼠并通过心穿刺抽血，分离血清并于-80℃冷冻。
将血溶于10mM EDTA中用于FACS分析。
自每一小鼠中提取脾和MLN，称重并进行单细胞悬浮液FACS分析。
取得开腹腔影像，然后将直肠上面1cm长的结肠在福尔马林中固定以进行组织学研究。
将样本埋入石蜡，切片(3μm厚)并用H&E染色。
将自每只小鼠血液中制备的细胞悬浮液、脾和肠系膜淋巴结(MLNs)进行四色FACS分析。
抗体得自Pharmingen。将对CD3和CD4的双阳性细胞计数为淋巴细胞。对Ly-6G阳性(骨髓分化抗原)和对CD3或CD4阴性的细胞为嗜中性粒细胞(它们的细胞特征(前方和侧面的分散性)使它们区别于其它细胞)。
每一样本的细胞数量可以通过每个细胞悬浮液中的总细胞数量和每个样本中的鉴定的阳性细胞的％计算(采用CellQuest Pro软件在FACSCalibur上进行样本分析)。
因此可以计算出各小鼠组的均值。为进一步处理这些数据，测定的值可以通过减去在非转染小鼠中测定的基础值并计算相对于安慰剂处理组的细胞数量的减少或增加的％来调整。
所有以平均值给出的数据均为s.e.m值。体重数据可以经重复测量分析或通过首先测定平均AUC，然后经多因素ANOVA检验进行分析，采用Tukey post hoc校正。组织学分数以平均的严重程度分数表示，并与给出精确p-值和Bonferroni post hoc修正因素(StatXact-5软件)的Wilcoxon-Mann-Whitney检验比较。所有其它数据首先进行正态分布分析，然后进行多因素比较的ANOVA检验。p＜0.05表示具有显著统计学意义。
SCID小鼠对CD4+CD45RBHiT细胞转染的反应显示，其第一个步骤为T细胞扩张，随后为炎症，其衡量标准为体重的迅速减少，严重的结肠炎以及全身症状如增加的血清结合珠蛋白水平以及中性。随时间成倍增加的T细胞数量也导致淋巴器官的体积增大，而相比而言淋巴器官在未转染的SCID小鼠中是很小的。在T细胞转染后第28天，在一组小鼠中炎症状况相对一致，并且这是可以采用的精确测定所试化合物的治疗效果的最短时间。作为单一预防化合物的化合物A和ASM的有效量范围，简单地说，相对有效的给药剂量范围为30-100mg/kg/d的ASM和0.1-1mg/kg/d的化合物A。在本试验中采用每一化合物的最大剂量以下的剂量，并且在同一研究中测定单一和联合治疗的效果。
结果用化合物A和ASM联合治疗SCID-IBD小鼠在体重减轻中的协同作用由CD4+CD45RBHiT细胞引起的SCID小鼠转染疾病最初的可见症状为严重的体重减轻，通常在转染后21天非常显著。这些小鼠(在这些研究中为安慰剂组，如图所示)通常在细胞转染后4-8周持续体重减轻直至死亡。非转染小鼠则在研究期间(图中称为“PBS(-小鼠)”)状况仍旧稳定或体重增加。在此处所述的3个单独研究中，在非转染和溶媒处理的小鼠之间的体重的平均％差异经测定为16.3±1.8％。
如果转染SCID小鼠单独用化合物A或ASM处理，一个显著的但较低的抑制体重减轻的作用只在采用剂量60mg/kg/d的ASM处理的小鼠中出现。在使用两种的化合物单独进行处理时，它们均具有很小的抑制体重减轻的效果，但是当联合给予化合物A和ASM时，则具有显著的保护效果，即使在最低的ASM(10mg/kg/d)和化合物A(0.05mg/kg/d)的剂量下也是如此，参见图3。由于化合物A和ASM单独给药时在该给药剂量下不具有或只有很小的抑制体重减轻的作用，所以联合给药的保护作用不是相加的，而是协同的。
申请人还获得了另外的数据(文中没有显示)验证了本发明组合的协同作用。
简言之，申请人发现，在SCID-IBD模型中，当分别采用最大剂量以下的剂量60、30和10mg/kg/d的ASM和0.1、0.1和0.05mg/kg/d的化合物A时，ASM和化合物A的组合具有协同作用。虽然60mg/kg/d的ASM本身也能起到显著的作用，但所有其它单独治疗组均只产生轻微的疾病抑制性。
具体而言，申请人得到了下列结果-所有三种联合，特别是最低剂量10mg/kg/d的ASM和0.05mg/kg/d的化合物A组，也没有体重减轻(给出数据，参见图1-3)-低剂量10和0.05mg/kg/d的联合在结肠炎中显示具有协同作。但是每一种化合物本身几乎没有作用，而且在联合治疗组中的严重程度分数是最低的(详细数据未给出)。
-ASM于60和30mg/kg/d的剂量下有效地减少了血清结合珠蛋白水平，但是化合物A于0.1或0.05mg/kg/d的剂量下却具有极其微弱的活性。另外，在低剂量研究组中协同的作用很明显，每一单一化合物减少的％为32.7％(ASM 10mg/kg/d)或27.4％(化合物A，0.05mg/kg/d)，而联合治疗组则具有显著的抑制作用，减少了81.0％(详细数据未给出)。
-在任何一个治疗组中的低剂量研究中，尽管相对于溶媒处理的小鼠，联合治疗组中的数量有所减少(在血液、脾和MLN中分别为46.5、19.0和48.0％)，但淋巴细胞的数量没有明显减少。在ASM和化合物A给药的高剂量(分别为30mg/kg/d和0.1mg/kg/d；研究2)下，淋巴细胞的数量有显著减少(在血液、脾和MLN中分别为73.0、80.3和90.7％)，而在单一治疗组中(分别只给予ASM或化合物A的一种)淋巴细胞的数量则根本没有减少。
类似地，单独高剂量的ASM(60mg/kg/d；研究1)，可以特别地减少在MLN(73.5％)中的淋巴细胞数量，而与化合物A(0.1mg/kg/d)的联合则可以显著减少血液(65.4％)和脾(64.8％)中的淋巴细胞的数量，并且也可以提高MLN中的减少量(93.2％)。化合物A的单一剂量0.1mg/kg/d即使能够影响淋巴细胞的数量的话也是极小的。
ASM981与化合物A联合协同作用以治疗SCID-IBD小鼠结肠炎SCID-IBD小鼠结肠炎具有与在患有局限性回肠炎结肠的受损组织中观察到的许多特征相同。为确定SCID-IBD小鼠的肠粘膜损伤，可以根据定义的形态学参数对结肠切片进行组织学检查。与该IBD模型相关的严重结肠炎的特征为几乎所有的黏膜下层发生大量细胞浸润。所述浸润液中混合有淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和某些嗜曙红细胞。另一特征为隐窝结构的消失、肠的延长和上皮增生。严重的结肠炎也可能存在隐窝脓肿。根据下述方案给出每一分数0-3分分别指白细胞浸润，轻微为1分，中度为2分，包括黏膜下层的严重浸润为3分。杯状细胞的减少则以0-2分给出阿辛蓝着色的完全缺乏为2，正常的着色数量为0，而中度减少为1。包括隐窝延长、上皮增生、存在隐窝脓肿、糜烂和上皮坏死的粘膜增生和退化的变化的计分为0-3。最大的可能分数为8，(PBS)-小鼠的分数为0。
申请人发现，当单独给予60mg/kg/d剂量的ASM981时，具有显著的疗效。当化合物A的剂量低于0.5mg/kg/d，不具有明显的效果，而且该模型中也已得到证明。然而，当两种化合物一起给药时，则会将炎性减轻(图5)至轻微水平(分数在4分以下)，这种疗效是每种药物分别单独给药的相加作用所不可能达到的。
总之，在SCID-IBD模型中，当吡美莫司和化合物A分别单独给药时具有最小的效果，而当吡美莫司和化合物A联合给药治疗时，则可以达到非常显著的治疗作用。申请人所看到的对体重和结肠炎的非常显著的作用与淋巴细胞的数量无关。协同作用不仅表现为对淋巴细胞数量的影响，并且也可能影响淋巴细胞活性或功能以及与疾病有关的其它细胞。这些数据更加证实了吡美莫司和化合物A的联合在SCID-IBD小鼠模型中起到了协同作用。
实施例2包含化合物A和吡美莫司的片剂的制备每片重750mg的片剂按如下方式制备将含有30mg吡美莫司的固体分散剂和1.00mg化合物A与作为载体的160mg羟基丙基甲基纤维素(3cps)的固体分散剂与8.90mg乳糖(200目)、0.10mg丁羟甲苯、381.25mg喷雾干燥的乳糖、150.00mg交联聚维酮、11.25mg胶态二氧化硅(Aerosil 200)和7.50mg硬脂酸镁混合，得到的混合物经干法制粒，然后将得到的颗粒混合物压制成总重750mg(+/-10％)的片剂。
得到用于口服的片剂。
实施例3式II化合物在治疗此处说明的疾病和紊乱中的用途A)体内在过敏性或过敏原诱导的接触性皮炎模型中局部给药后的活性A1)噁唑酮过敏症(小鼠)将10μl 2％噁唑酮溶液敷于小鼠腹部皮肤致敏。8日后用10μl 2％噁唑酮溶液经敷于耳廓外周内表面进行第二次接触。经二次接触2小时20分钟后，产生反应，将受试溶液敷于第二次接触处。通过与溶解受试物质的溶剂处理的对照相比，测定受试物质对炎症的抑制作用。在第二次接触后24小时，将动物杀死并称重分离耳廓。采用该两耳廓间的重量差异评价；统计比较试验组和溶剂对照组中的个体差异(经简单方差分析，然后如果分布为正态的话，用Dunnet检验进行正态分布检验，否则经Kruskal-Wallis U-检验和Wilcoxon-Mann-Witney U-检验)。
A2)二硝基氟苯(DNFB)过敏症(猪)利用DNFB或二硝基氯苯(DNCB)诱导接触性过敏症是典型的实验途径，其也用于人类(P.S.Friedmann和C.Moss，Models in dermatology，1987，Maibach，Lowe，Ed.，Vol.2，p.275-281，Karger-Basel)。鉴于猪和人类皮肤间存在相似性，在猪中建立相应的物质局部试验模型。于第1和第3日，将100μl每份的10％DNFB制备物分别敷于右和左股内面。于第14日，于背部右和左侧用直径5cm圆形标记(每只动物8个标记)标记每只猪并将150μl每份的5％DNFB制备物敷在上面。物质以盖仑组合物或溶液形式进行试验。在每种情况下，均采用载体作为安慰剂对照。将试验产物仔细敷4次(分别于激发反应后20分钟，6小时、24小时和32小时)。每次敷用之前，评价试验区域的红、肿和一致性状况。然后用反射计定量测定试验区域的着色情况。自亮度(L*)和饱和度(C*)数据，依据下式计算红斑指数100-L*×C*。依据下式由平均红斑指数计算活性 Δ＝与初始值的差异B)体内刺激物诱导的皮炎模型(小鼠)中局部给药后的活性B1)12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)诱导的皮炎于试验动物中用TPA刺激是测定试验物质局部敷用后抗炎活性一个方法(Maibach，Lowe，Ed.Models in Dermatology，Vol.3，1987，p.86-92，Karger-Basel)。于右耳廓内和外侧，给予NMRI小鼠10μl TPA溶液(2×10μl/小鼠＝2×0.5μl TPA/小鼠)。不处理左耳廓。刺激后30分钟，如上所述，经将2×μl的试验溶液敷至刺激的耳表面进行治疗。经与仅用刺激物溶液和采用用于溶解试验物质的溶剂处理的右耳廓的组比较进行试验组评价。敷用刺激物后6小时，将动物杀死，将耳廓分离并称重。采用该两耳廓间的重量差异评价，将试验组个体间差异与对照组个体差异进行统计学比较(如A1中)。
B2)经巴豆油诱导的皮炎采用巴豆油作为TPA，以引发刺激物诱导的皮炎，以此检验物质的抗炎症活性(Maibach，Lowe，Ed.，Model in Dermatology，Vol.3，1987，p.86-92，Karger-Basel)。于右耳廓内侧，给予NMRI-小鼠15μl 0.23％巴豆油(二甲基乙酰胺、丙酮和乙醇2/4/4的混合物中)。刺激同时进行治疗，将试验物质溶于敷于耳部试验处的刺激物溶液中。经与只接受刺激物溶液的耳廓的炎症比较，进行试验组评价。敷用刺激物后6小时，将动物杀死，将耳廓分离并称重。采用该两耳廓间的重量差异，对试验组个体差异与对照组个体差异进行统计学比较来评价(如A1中)。
C)体内特应性皮炎(人类)在随机、双盲研究中，用包含0.05-2％重量的式II化合物(基于组合物的总重量)的组合物对7-12名(总共)中度至严重性特应性皮炎患者每日治疗2次，持续3周，显示症状的皮肤面积为200-1000cm2。对治疗第一日和最后一日间的红斑、水肿和瘙痒情况进行汇总评分。记录研究药物的局部耐受性和常规安全参数，包括血液学和临床化学。
权利要求
1.药物组合物，该药物组合物包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和下式化合物的组合 其中R1为式(a)的基团 其中R5为氯、溴、碘或叠氮基，R6为羟基或甲氧基，且R4为羟基且在10、11位之间有一个单键；或者R4不存在且在10、11位之间有一个双键，或者R1为式(b)或式(c)的基团 和 其中R6为如上定义，且R4为羟基且在10、11位之间有一个单键，R2为氧代且在23、24位之间有一个单键；任选保护的羟基且在23、24位之间有一个单键或双键；或者R2不存在且在23、24位之间有一个双键；R3为甲基、乙基、丙基或烯丙基，该药物组合物还包括至少一种药学上可接受的赋形剂。
2.权利要求1的药物组合物，其中式I化合物为下式的化合物 吡美莫司。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中雷帕霉素衍生物为下式的化合物 其中R1为甲基或(C3-6)炔基，R2为H、-CH2-CH2-OH、3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，X为＝O、(H，H)或(H，OH)，前提是当X为＝O且Rf为CH3时，R2不为H，或者当R2为-CH2-CH2-OH时，为它的前药。
4.权利要求1-3中任一项的药物组合物，该药物组合物包含40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素和吡美莫司的组合。
5.权利要求1-4中任一项的固体分散形式的药物组合物，该药物组合物包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物、式I化合物和载体。
6.药物试剂盒，该试剂盒除包括用于同时或依次给药的说明之外，还包括雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和式I化合物。
7.雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和式I化合物组合作为药物的用途。
8.雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和式I化合物组合在制备用于治疗炎性肠疾病和与此相关的疾病的药物中的用途。
9.雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和式I化合物组合在制备用于治疗选自下列的疾病的药物中的用途特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
10.治疗炎症疾病或免疫调节疾病，包括自身免疫性疾病的方法，所述治疗方法包括给予需要这种治疗的宿主有效量的权利要求1-5中任一项的药物组合物或权利要求6的药用试剂盒。
11.权利要求10的方法，其中所述疾病选自特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
12.权利要求10的方法，其中所述疾病为炎性肠疾病和与此相关的疾病。
13.雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和下式化合物的组合在制备用于治疗选自下列的疾病的药物中的用途， 其中R1为羟基或保护的羟基，R2为氢，羟基或保护的羟基，R3为甲基、乙基、丙基或烯丙基，n为整数1或2，且线和虚线为单键，所述疾病选自特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
14.雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和式III化合物组合在制备用于治疗炎症肠疾病和与之相关的疾病的药物中的用途。
15.权利要求13或14的用途，其中式III化合物为下式的化合物
16.下式化合物在制备用于治疗下列疾病的药物中的用途 其中R1为甲基或(C3-6)炔基，R2为H、-CH2-CH2-OH、3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，X为＝O、(H，H)或(H，OH)，前提是当X为＝O且R1为CH3时，R2不为H，或者当R2为-CH2-CH2-OH时，为其前药，所述疾病为特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、接触性过敏反应、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多症和痤疮。
17.权利要求16的用途，其中式II化合物为40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素。
全文摘要
本发明涉及包含雷帕霉素或雷帕霉素衍生物与式I化合物的组合的药物组合物，该组合物可用于治疗例如炎症和免疫介导的疾病，包括自身免疫性疾病。
文档编号A61P37/00GK1756548SQ200480005834
公开日2006年4月5日 申请日期2004年3月16日 优先权日2003年3月17日
发明者H·莫勒 申请人:诺瓦提斯公司