治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法

专利名称：治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法
技术领域：
本发明涉及利用中空纳米粒子治疗血友病的治疗产品(药物)以及利用其治疗血友病的方法。尤其是，本发明涉及含有装入用于转入细胞的粒子中的物质的治疗产品(药物)，所述物质可以特异性导入细胞中用于血友病治疗，本发明还涉及利用该产品治疗血友病的方法。
本申请要求2003年3月17提交的日本专利申请2003-071788的优先权，在此处引入作为参考。
背景技术：
在近年来医学领域，研制直接作用于感染位点显示高治疗效果又具有较少副作用的药物正在活跃地进行当中。尤其是，称作药物递送系统(DDS)的方法作为特异性转运有效组分诸如药物的有效组分到靶细胞或者组织使得组分作用于目标位点的方法正在吸引人们的广泛关注。
另一方面，在近几年来的分子细胞生物学领域，对基因转移到指定细胞的研究也正在成为不可或缺的技术。而且，随着人类基因组计划的进展，各种疾病的遗传背景已经变得不再神秘。因此，如果显示出对于这些细胞或者组织高特异性的基因转移方法目前已被建立，将该方法应用于基因治疗领域将成为可能。
在将基因引入细胞的方法中，已知存在将基因转入大分子然后通过内吞作用吸入细胞的方法(磷酸钙法或者ripofectomaine法)以及将电脉冲刺激施加于细胞膜使其通透从而使基因被吸入细胞的方法(电穿孔法或者基因枪方法)。这两种方法目前都被应用于分子生物学实验中。
这些方法虽然简单，但是易于直接物理性损伤细胞。而且，基因转移的位点必须通过外科方法暴露。为此，该方法不能轻易地施加于活体的细胞或者组织。此外，它难以实现接近100％的转移率。
还有已知作为将物质较安全引入的脂质体方法。该方法可应用于活体的细胞或者组织因为其不损伤细胞。然而，该方法存在的问题是它难以对单纯脂质的脂质体上的细胞或者组织赋予高特异性，而且体内基因转移率比期待值要显著低。
近来发展了一种将目的基因掺入病毒DNA产生感染性病毒以便影响基因导入的技术。本方法作为用于基因治疗多种遗传以及获得性疾病的划时代的方法吸引了广泛关注，因为该方法不用将转移位点暴露在外，可以应用于个体并且具有接近100％的转移效率。
例如，血友病为由于缺乏凝血因子以出血作为主要症状的遗传性疾病。人们注意到血友病A由缺乏凝血因子VIII(抗血友病因子)引起，而且血友病B由缺乏凝血因子IX(克里斯马斯氏因子)引起。血友病A以及血友病B分别由X染色体上因子VIII以及IX的基因失调引起。通常，通过静脉注射VIII(IX)因子药物的补充治疗被用于血友病患者。在这一点上，为了恒量表达接近生理水平量的凝血因子VIII(IX)，例如在日本专利公开2002-527493中提出了制备包括编码因子VIII的序列的腺伴随载体以及将如此制备的载体施用于血友病A患者的技术。
然而，采用病毒DNA的基因转移的严重问题在于病毒非特异性感染多种细胞，因此基因被引入除了靶细胞以外的其他细胞。还有一种可能就是病毒基因组本身被整合到染色体引起将来无法预料的副作用。而且，因为病毒缺乏细胞或者组织特异性，如果VIII因子将被表达于肝中，必须将载体施用于例如门静脉，或者根据组织学类型连接编码因子VIII的序列和特异性转录的控制序列。
本发明者也在日本公开特许公告2001-316298中提出了利用蛋白的中空纳米粒子特异性安全地将诸如基因，蛋白或者化合物的物质转运以及引入靶细胞或者组织的方法，所述蛋白显示出粒子形成能力并且向其中引入了生物识别分子。
根据公开在日本公开特许公告2001-316298中技术，借助于中空纳米粒子可以转运多种物质。现在有责任进一步开发利用该技术治疗特定疾病诸如血友病的药物。
发明公开鉴于上述本领域的发展状况，本发明的目的是提供治疗血友病的药物，其中凝血因子的基因可以通过简单的引入方法被有效地引入肝细胞，同时具有最小的副作用，以及利用该药物治疗血友病的方法。
本发明者已经进行了长久的研究，并且通过静脉内注射包含凝血因子VIII以及IX的基因的乙型肝炎病毒表面抗原粒子的实验到植入了人肝癌细胞的试验动物，发现基因可以特异性引入来源于人肝脏的组织部分表达凝血因子从而产生治疗血友病的有利结果。该发现完成了本发明。
根据本发明，提供了用于治疗血友病包括由显示出粒子形成能力的蛋白形成的中空纳米粒子以及用于治疗血友病埋入中空纳米粒子的基因的药物。
根据本发明，提供了用于治疗血友病的药物，包括由引入生物识别分子到蛋白粒子形成的中空纳米粒子以及用于治疗血友病，埋入中空纳米粒子的基因，所述蛋白粒子获得自真核细胞中表达的蛋白。
形成粒子的蛋白可以例如为乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。当表达在真核细胞中时，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在泡囊膜上并作为粒子释放。如此产生的中空纳米粒子能够识别肝细胞并特异性地转运粒子中的物质到肝细胞，以便通过埋入用于血友病治疗的基因，具体为凝血因子VIII或者IX于中空粒子中，这些基因可以特异性表达在肝细胞中。
用于本发明治疗的药物可以通过静脉注射的简单方法有效地治疗血友病并可以直接最小副作用危险地用于临床应用。
根据本发明用于治疗血友病的方法通过施用用于治疗本发明的血友病的药物治疗血友病。
本发明的其它目的以及优点根据其下列优选实施方案的说明特别是结合附图将变得更加显而易见。


图1图示了根据本发明实施方案的HBsAg基因的不同蛋白区域。
图2图示了根据本发明的实施方案采用重组体酵母表达以及纯化HBsAg粒子的操作。
图3显示了根据本发明的实施方案通过包含hFVIII基因的HBsAg粒子表达凝血因子VIII的表达效果。
图4显示了根据本发明的实施方案通过包含hFIX基因的HBsAg粒子表达凝血因子IX的效果。
本发明的最佳实施方案体现本发明的中空纳米粒子将生物识别分子引入具有粒子形成能力的蛋白使其可以特异性转运编码凝血因子VIII以及IX的基因到目的细胞或者组织，例如到肝细胞或者肝脏组织。具有粒子形成能力的蛋白可以例如是从多种病毒获得的亚病毒颗粒。蛋白例如可以是乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白。
由具有这种粒子形成能力的蛋白形成的蛋白粒子例如可以是通过在真核细胞中表达蛋白获得的蛋白粒子。简而言之，如果具有粒子形成能力的蛋白表达在真核细胞中，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在囊泡膜上以便作为粒子释放。真核细胞例如可以是酵母，重组体酵母，昆虫细胞以及动物细胞。
如随后实施例所述，本发明者发现并且报道，通过在重组体酵母中表达上述的HBV表面抗原L蛋白，可以形成大量基本上呈椭圆形的中空粒子，每一具有大约20nm的小头直径以及大约150nm的大头直径，并且每一具有埋于酵母来源双脂质层中的HBV表面抗原L蛋白(J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992)。因为这些粒子既不包含HBV基因组又不包含HBV蛋白并且由此不起病毒的作用，粒子对于人体是非常安全的。而且，这些粒子显示特异于肝细胞的受体，该受体位于其表面上对HBV的肝细胞显示极强的传染力，由此粒子显示出作为特异性转运物质到肝细胞的转运工具的高效力。
利用重组体酵母形成蛋白粒子的方法很方便，因为粒子可以高效地从细胞裂解物中的可溶性蛋白产生。
另一方面，采用昆虫细胞以及动物细胞的方法据报道是大量产生外源蛋白所希望的方法因为这些细胞是比酵母细胞更接近于高等动物细胞的真核细胞，并且因为昆虫细胞以及动物细胞能够再生酵母不能再生的高位结构，诸如糖链。昆虫细胞的常规系统采用巴库洛病毒，并且伴随表达病毒，因此在蛋白表达的时候细胞死亡或者溶解。因此，存在的问题就是连续地进行蛋白表达或者通过从死细胞分离的蛋白酶分解蛋白。而且，如果蛋白表达在分泌物上，培养基中所含的胎牛血清大量地混合使其难以纯化粒子。然而，不采用巴库洛病毒并且可以进行无血清培养的昆虫细胞系统近来已由Invitrogen公司开发，并且正在进入销售。因此，借助于这种昆虫细胞系统，有可能获得可以及其容易纯化并且可以再现高位结构的蛋白粒子。
借助本发明的中空纳米粒子，通过将上述各种方法获得的粒子表面的受体改变为任选的生物识别分子，可以将物质极高特异性地转运并且引入除了肝细胞外任选的细胞或者组织。
当然，显示出粒子形成能力的蛋白不局限于上述的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，并且可以是来源于动物细胞，植物细胞，病毒或者细菌或者任何多种合成蛋白的任一天然蛋白。如果例如是来源于病毒的抗原蛋白可能诱导活体中的抗体，这种被修饰减小其抗原性的蛋白可以用作生物识别分子。
被引入显示出粒子形成能力蛋白中的生物识别分子优选地例如为生长因子，细胞功能调节分子，诸如细胞因子，细胞表面抗原，组织特异性抗原，识别细胞或者组织的分子，诸如受体，来源于病毒以及微生物的分子，抗体，糖链或者脂质。这些可以根据靶细胞或者组织进行合适地选择以及应用。
根据本发明，编码凝血因子VIII以及IX，希望被引入任选的细胞或者组织假若是肝细胞或者组织的基因被封入上述中空纳米粒子中产生用于治疗血友病的物质转运工具。
为了将基因引入上述的中空纳米粒子，可以利用用于化学实验或者分子生物学实验中的任何多种常规技术。这些方法的实例包括电穿孔法，超声波法，单向扩散法或者采用电荷脂质的方法。
利用这些中空纳米粒子或者物质转运工具，将特定物质体内或者体外转入细胞或者组织成为可能。此外，借助于中空纳米粒子或者物质转运工具可以将物质引入特定细胞或者组织作为治疗各种疾病的方法或者其中的一个步骤。
本发明的药物的效力实际上已经通过下面将要解释的实施例所述的动物试验得以证实。在这些实施例中，包含编码凝血因子VIII以及IX的本发明药物的效力通过如下方法得以证实首先将药物施用于移植有来源于人肝癌的细胞的裸鼠，然后测定血清中凝血因子VIII以及IX的表达水平。虽然药物通过静脉内施用，药物也可以口服，肌内注射，腹膜内或者皮下施用。
本发明现在将如同参考附图一样参考特定的实施例进行更详细的解释。本发明不局限于下列实施例，并且可以包含各种变化，取代或等效物，只要不背离在权利要求中限定的本发明的目的以及范围。
实施例在该实施例中，下述的HBsAg表示乙型肝炎病毒表面抗原。具体地，HBsAg是HBV.的外壳蛋白。参考图1的示意图，在HBsAg中有3个蛋白，也就是S-蛋白，M-蛋白以及L-蛋白。其中，S-蛋白是为这3个蛋白所共有的重要的外壳蛋白。M-蛋白是由55个氨基酸组成的前-S2肽，并且其连接于S-蛋白的N-末端侧。L-蛋白是由108个或者119个氨基酸组成的前-S1肽，并且其连接于M-蛋白的N-末端侧。这种L-蛋白的碱基序列以及氨基酸序列分别由序列1以及2表示。
在已知的方法中，HBsAg的L-蛋白的前-S1结构域具有直接接合肝细胞的位点并且当HBV结合于肝细胞时起重要的作用(Cell.Vol.46，429-436，1986J.of Virol.，Vol.73，2052-2057，1999)。
当蛋白HBsAg表达在真核细胞中时，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在泡囊膜上。HBsAg的L-蛋白分子在絮凝期间絮凝在一起并且吸收在泡囊膜中。HBsAg的L-蛋白的这种絮凝的分子作为粒子以出芽方式释放在细胞腔侧。
在下述的实施例中，使用HBsAg的L-蛋白。图2图示了用于下列实施例中描述的HBsAg粒子纯化的表达以及操作。
实施例1由重组体酵母表达HBsA粒子根据本发明者报道的文献J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992，将具有L-蛋白表达质粒pGLDLIIP39-RcT的重组体酵母(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-菌株)培养在合成培养基High-Pi以及855N-P400中表达L-蛋白粒子(图2a以及2b)。从稳定生长期(大约72小时后)的重组体酵母，利用Pierce Chemicals有限公司生产的酵母蛋白质提取试剂制备全细胞提取物。全细胞提取物中的蛋白由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)彼此分离，并且通过银染色鉴定样品中的HBsAg。以这种方式，HBsAg被证实是具有大约52kDa分子量的蛋白。
实施例2从重组体酵母纯化HBsAg粒子(1)将培养在合成培养基855N-P400上的重组体酵母(湿重26g)悬浮在100ml的缓冲溶液A(7.5M尿素，0.1M磷酸钠(pH 7.2)，15mMEDTA，2mM PMSF以及0.1％吐温80)中，并且利用珠子搅拌器(BEAD-BEATER)用玻璃珠对酵母进行匀浆化。匀浆化后，通过离心回收上清液(图2c以及2d)。
(2)然后将上清液与0.75-倍体积的33％(wlw)PEG6OOO混合并且用冰冷却产生的混合物30分钟。然后，在7000rpm离心30分钟后回收沉淀。然后将沉淀重新悬浮在不含吐温80的缓冲液A溶液中。
(3)重新悬浮后将溶液在显示10到40％密度梯度范围的CsCl中进行分层。然后将溶液在28000rpm超离心16小时。离心的样品分离成12级分并且通过Western印迹法鉴定含HBsAg的级分，其中第一抗体是抗HBsAg单克隆抗体。进一步，利用不含吐温80的缓冲液A溶液透析含HBsAg的级分。
(4)在(3)中透析获得的溶液(12ml)在糖上分层，显示出从5到50％的密度梯度范围。然后将生成的物质在28000rpm超离心16小时。离心后，像(3)一样鉴定含HBsAg的级分。含HBsAg的级分用不含尿素也不含吐温80但是含0.85％NaCl的缓冲液A溶液进行透析(图2e中(2)到(4))。
(5)重复以上(4)的类似操作。利用Advantec公司生产的超滤器Q2000浓缩透析的样品，并保藏在4℃直至使用(图2f)。CsCl平衡离心后Western印迹(3)的结果表明HBsAg是分子量为52kDa显示出S-抗原性的蛋白。最终，约24mg的纯化HBsAg粒子可以从湿重26g来源于培养基2.5L的细胞裂解物获得。
利用银染色SDS-PAGE分析来自纯化操作的序列的级分。另外，为了证实酵母来源的蛋白酶已通过净化过程除去，将通过(5)获得的HBsAg粒子培养在37℃12小时，并进行SDS-PAGE 12小时，继之以SDS-PAGE，通过银染色进行鉴定。结果，证实来源于酵母的蛋白酶在序列纯化步骤中被完全除去。
实施例3将hFVIIJ以及hFIX基因封入HBsA粒子(制备包括hFVIII以及hFIX基因埋入其中的HBsAg粒子)将通过上述方法制备的HBsAg粒子中封入编码人凝血因子VIII(IX)的基因(hFVIII以及hFIX)作为治疗血友病的基因从而产生埋入基因(hFVIII以及hFIX)的HBsAg粒子作为本发明的药物。
在本实施例中，由Torino大学的Dr.L.Naldini捐赠的pRRLsin.cPPT.CMV.FVIII.Wpre以及pRRLsin.cPPT.Alb.FIX.Wpre(Human Gene Therapy，Vol.13，243-260，2002)被用作用于将hFVIJI以及hFIX基因封入HBsAg粒子的表达载体。
具有hFVIII(hFIX)基因埋入其中的HBsAg粒子通过电穿孔法方将上述表达载体引入HBsAg粒子进行制备。具体地，将20μg的上述表达载体添加给溶于500μl的PBS(pH 7.2)的HBsAg粒子中的100μg的L-蛋白粒子。利用4mm的样品池在Gene Pulser II电穿孔系统(由Bio-Rad有限公司生产)上，于50V以及750μF进行电穿孔。
实施例4由埋入hFVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子在移植有人肝癌的裸鼠中表达凝血因子VIII (IX)的效果利用试验用动物检验由上述实施例制备的封入hFVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子表达凝血因子VIII(IX)的效果。
在本实施例中，将来源于人肝癌Nue的1×107个细胞施用于从Nippon Clair有限公司购买的试验动物裸鼠(Balb/cnu/nu，雌性，5周龄)的两侧背部皮下区域。饲养小鼠大约5到6周直到实体癌生长到约1cm直径的大小产生患有癌症的小鼠。
埋入其中约20μg hFVIII(hFIX)基因表达载体的HBsAg粒子通过尾部静脉施用于上述患癌小鼠，并且通过酶免疫分析(ELISA)测定血液中凝血因子VIII(IX)的量随时间的变化。利用分别特异性于VIII以及IX因子的Asserachom VIIICAg试剂盒以及Asserachom IXAg试剂盒(由Diagnostica Stago Inc生产)，进行ELISA。
使用施用来源于人结肠癌WiDr的1×107个细胞获得的患癌小鼠作为阴性对照，并且利用如上所述的方法测定血浆中凝血因子VIII(IX)的量。
测定的血浆中凝血因子VIII相对于上述试剂盒的阳性对照血浆中凝血因子VIII的转移部分的％量显示在图3中。血浆中凝血因子IX的浓度转移显示在图4中。从图3以及图4可以看出，阴性对照随时间没有变化，而施用了来源于人肝癌的肿瘤细胞的小鼠(Nue)约十天后观察到凝血因子VIII以及IX的表达，并且表达水平达到人类病人从严重病态恢复到中度病态的值(Cur.Gene Therapy，Vol.1，301到305，2001)。然后该水平保持至少持续一个月并且随后约40天后降低。这种表达的下降可能归因于由于肿瘤细胞(Nue)引起癌症的坏死。
因此，已经证实含hFVIII(hFIX)基因作为体现本发明药物的HBsAg粒子能够将基因高特异性并且高效地引入人类肝细胞，并且实际上显示出抗血友病的疗效。此外，根据本试验，由含FVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子治疗血友病的方案可以建立在试验动物的水平上。
虽然pRRRLsinPPTCMVFVIIIpre(pRRLsinPPTAlbFIXpre)在上述实施例中用作表达hFVIII(hflX)基因的载体，本发明并不限于此，诸如描述于出版物Cur.Gene Therapy，Vol.1，301-305，2001中的多种载体也可以使用。例如凝血因子VIII的轻以及重链可以整合在不同的载体中。此外，缺乏B-结构域的凝血因子VIII也可以整合在载体中用于实现类似的结果。
工业实用性根据本发明用于治疗血友病的上述药物可以通过静脉注射的简单方法可以有效地治疗血友病并可以直接最小副作用危险地用于临床应用。
序列表<110>株式会社贝亚克莱(BEACLE Inc.)法兰德斯校际生物技术研究所(VIB(VLAAMS INTERUNIVERSITAIRINSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE)VZW)D.COLLEN RESEARCH FOUNDATION VZW ONDERWIJS EN NAVORSINGCAMPUS GASTHUISERG K.U.LEUVEN<120>治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法(DRUG FOR TREATINGHEMOPHILIA AND METHOD OF TREATING HEMOPHILIA USING THESAME)<130>03P08BK01<160>2<210>1<211>1218<212>DNA<213>Hepatitis B virus<220>
<221>CDS<222>(1)..(1218)<400>1atg aga tct ttg ttg atc ttg gtt ttg tgt ttc ttg cca ttg gct gct48Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala1 5 10 15ttg ggt aag gtt cga caa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aat96
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1.用于治疗血友病的治疗产品，包括由显示出粒子形成能力的蛋白形成的中空纳米粒子；以及包埋入所述中空纳米粒子的用于治疗血友病的基因。
2.用于治疗血友病的治疗产品，包括由引入生物识别分子到在真核细胞中表达蛋白获得的蛋白粒子中形成的中空纳米粒子；以及包埋入所述中空纳米粒子的用于治疗血友病的基因。
3.根据权利要求2的治疗血友病的治疗产品，其中所述真核细胞是酵母或者重组体酵母。
4.根据权利要求2的治疗血友病的治疗产品，其中所述真核细胞是昆虫细胞。
5.根据权利要求2的治疗血友病的治疗产品，其中所述真核细胞是动物细胞。
6.根据权利要求1到5任一项的用于治疗血友病的治疗产品，其中所述显示出粒子形成能力的蛋白是乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。
7.根据权利要求1到6任一项的用于治疗血友病的治疗产品，其中所述用于治疗血友病的基因是凝血因子VIII或者IX。
8.根据权利要求1到7任一项的用于治疗血友病的治疗产品，其由治疗产品通过静脉注射被施用于人体。
9.治疗血友病的方法，包括施用权利要求1到8任一项的治疗产品。
全文摘要
用于治疗血友病的治疗产品或者药物可以通过包括如下的简单方法生产将用于治疗血友病的凝血因子VIII(IX)的基因埋入由表达具有粒子形成能力的蛋白获得的空纳米粒子中，所述蛋白为真核细胞中的诸如乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。如此产生的药物能够将凝血因子的基因有效地最小副作用危险地引入肝细胞。
文档编号A61K47/42GK1787840SQ200480007428
公开日2006年6月14日 申请日期2004年3月17日 优先权日2003年3月17日
发明者上田政和, 黑田俊一, 谷泽克行, 妹尾昌治, 近藤昭彦, 蒂埃里·范登德里施, 蔡丽琴 申请人:株式会社贝亚克莱, 法兰德斯校际生物技术研究所, 天主教鲁汶大学加斯蒂斯伯格教学和研究校区 D.科伦研究基金