专利名称：：基因表达的调控的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因表达的调控，具体来说，涉及细胞凋亡介质(apoptoticmediator)的调控中小分子干扰RNA(siRNA)的应用。
背景技术：
：对照哺乳动物细胞凋亡的途径是复杂的，根据物种、细胞类型，调控细胞生存的促细胞凋亡和抗细胞凋亡的变更是不同的，这种变更在正常细胞和癌细胞之间也存在(综述见于Johnstone等人，2002；Reed2002；CoryandAdams，2002)。有利于细胞存活的不平衡促使了肿瘤的发展和对抗癌药物的抗性。例如，由于核苷酸114-121位的G8片段不稳定，促细胞凋亡的Bax基因经常在DNA错配修复缺失的肿瘤中发生突变(Ionov等人，1993；Rampino等人，1997；Zhang等人，2000)。当两个Bax等位基因均发生突变时，产生的Bax缺失则带来了对例如舒林酸和indomethicin的非甾体抗炎药物(NSAIDs)的抗性(He等人，1999；Yamamoto等人，1999；Zhang等人，2000)。由于结肠癌的诱因通常与缺失性错配修复有关(Lynch，1999)，Bax的突变可以解释对作为化学预防剂给药的舒林酸的获得性抗性。实际上，舒林酸促使了Bax-缺失细胞在培养液中的克隆扩充(Zhang等人，2000)，同样有利于具有遗传性错配修复缺失的患者的结肠上皮中Bax-缺失细胞的克隆扩充。然而，Bax-缺失细胞仍然对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感，5-FU激活p53依赖性细胞凋亡(Bunz等人，1999；Zhang等人，2000)，其是结肠癌的主流疗法。人们需要确定影响癌细胞存活的细胞途径和细胞凋亡介质。这种细胞途径和细胞凋亡介质代表了有希望的抗癌治疗的靶点。当前RNAi原理的模型基于以下观察，导入的dsRNA和核酸内切酶RNAeIII结合，并被其酶解成21和22个核苷酸的产物。这些小分子干扰RNA(siRNA)保持与核酸内切酶稳定地结合。产生的dsRNA-蛋白复合物看起来代表了同源mRNA选择性降解的活性效应子(Hamilton&Baulcombe，1999；Zamore等人，2000；Elbashir等人，2001a)。实际上，已经确定21核苷酸的RNA的双螺旋足以抑制内源基因在哺乳动物细胞中的表达(Elbashir等人，2001b)。在导入同源的siRNA双螺旋之后，人类上皮细胞中内源性核纤层蛋白A/C表达的选择性沉默证明了这一点。因此，将siRNA导入哺乳动物细胞足以选择性地以同源mRNA作为靶点，使其基因的表达沉默。重要的是，观察长度大于30个核苷酸的dsRNA，siRNA并未诱导非特异性干扰素反应(Minks等人，1979)。RNA干扰由双链RNA(dsRNA)触发，并通过以特定的mRNA转录体为靶点降解，促使基因沉默沉默过程因而是转录后的，宿主细胞的基因组的完整性得到了保持。在哺乳动物细胞中RNA干扰是由短的干扰性RNA(siRNA)双螺旋引发的(Elbashir等人，2001)。siRNA双螺旋以同源mRNA为靶点降解，具有优秀的选择性和很高的持续效力。而且，单剂量的siRNA在几天之内完成了基因沉默(Elbashir等人，2001；JiangandMilner，2002)，并且避免了对长时间选择过程的需求，例如建立基因敲除细胞所必需的过程。因此，通过在特定的促细胞凋亡基因缺失的细胞中使抗细胞凋亡基因沉默，RNA干扰使得细胞凋亡途径的功能剖析成为可能。
发明内容本发明提供了一种调控细胞凋亡的方法，所述方法包括向细胞中导入一种含有与所述细胞内的mRNA同源的核苷酸序列的RNA构建物，其特征在于所述的mRNA包括与细胞凋亡的调控有关的基因要素的基因信息。优选地，所述RNA构建物的核苷酸序列和所述mRNA的同源性为至少50％的序列相同，优选至少75％，更优选至少85％，或至少95％相同。所述RNA构建物的核苷酸序列与所述mRNA的同源性最优选为92到95％，97到99％或100％。该RNA构建物的核苷酸序列与相应的mRNA序列中不相同的核苷酸优选不多于4个。该RNA构建物的核苷酸序列与相应的mRNA序列中不相同的核苷酸优选不多于3、2或1个。所述的基因要素优选与细胞凋亡的抑制有关。在本发明的一个优选实施方式中，所述基因要素为Bcl-2。该基因要素优选包含选自下列的核酸分子或其部分(i)图6表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可与(i)中的任意核酸序列杂交，并具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遗传码简并的结果的核酸分子。在本发明的另一个优选实施方式中，所述基因要素为Bcl-xL。该基因要素优选包含选自下列的核酸分子或其部分(i)图7表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可与(i)中的任意核酸序列杂交，并具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遗传码简并的结果的核酸分子。在本发明的另一个优选实施方式中，所述基因要素是细胞凋亡中调控有关的基因的病毒同源物。本文中所用的术语病毒同源物是指结构或功能同源物，其中的病毒基因可能与例如Bcl-2或Bcl-xL的抗细胞凋亡基因有某种程度上的结构同源性。该同源性优选为至少50％的序列相同，更优选至少75％的序列相同，更优选至少85％相同，更优选至少95％的序列相同。另一方面，所述同源物可以是抗细胞凋亡基因的功能同源物，其特征在于所述的同源物在调控中具有作用，优选在细胞凋亡的抑制中具有作用。已发现Bcl-2的沉默诱导了大量p53依赖性的细胞凋亡，并且这种细胞凋亡在正常细胞生长条件下发生(不借助于将p53活化为转录因子所必需的基因毒性药物)。本发明涉及Bcl-2调控下p53促细胞凋亡的新功能，因此创建了调控人类结肠上皮细胞中细胞凋亡的组成性Bcl-2/p53体系。进一步使用Bax+/-和Bax-/-细胞的同基因克隆体(isogenicclone)和胱冬蛋白酶2siRNA的实验，清楚地显示了Bax和胱冬蛋白酶2均为Bcl-2/p53细胞凋亡途径中必不可少的介质。(Bax+/-是HCT116衍生的具有Bax基因的细胞系，Bax//-是HCT116衍生的敲除了Bax基因的细胞系)。本发明还提供了一种siRNA构建物，其具有与细胞凋亡的调控有关的基因要素转录出的mRNA同源的核苷酸序列。该siRNA构建物在长度上优选为15到25个核苷酸。该siRNA构建物在长度上更优选为19到23个核苷酸。该siRNA构建物优选包含(i)与图6中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(ii)以上(i)的核酸序列的遗传码简并结果的核苷酸序列。在本发明的一个优选实施方式中，所述的siRNA构建物在严格杂交条件下与图6中的核酸序列杂交。(Sambrook等人，(1989)分子克隆实验方法(MolecularCloning；ALaboratoryApproach))。该siRNA构建物优选包含与Bcl-2mRNA354-372位核苷酸同源的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方式中，该siRNA构建物包含(iii)与图7中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(iv)以上(i)的核酸序列遗传码简并的结果的核苷酸序列。在本发明的一个优选实施方式中，所述的siRNA构建物在严格杂交条件下与图7中的核酸序列杂交。该siRNA构建物优选包含与Bcl-xL347-366位同源的核苷酸序列。在本发明的另一个优选实施方式中还提供了治疗与不恰当的细胞调亡有关的疾病或生理状况的方法，其包括给予受试者一种RNA构建物，其特征在于所述的RNA构建物具有与所述受试者的细胞内存在的mRNA同源的核苷酸序列，其特征在于所述的mRNA包括与细胞调亡的调控有关的基因要素的基因信息。本文所用的术语“不恰当的细胞调亡”是指细胞调亡的水平以不希望的方式失衡的情形，例如，有利于细胞存活，这便促进了肿瘤的发展和对抗癌药物的抗性。本发明的另一个优选实施方式还提供了这种RNA构建物在细胞内细胞调亡的调控中的使用，其特征在于所述的RNA构建物具有与细胞内的mRNA同源的核苷酸序列，其特征在于所述的mRNA包括与细胞调亡的调控有关的基因要素的基因信息。因而本发明提供了一种用作药物的RNA构建物。本发明还提供了将RNA构建物用于治疗与不恰当的细胞调亡相关的疾病或生理状况的药物的制造。本发明还提供了将RNA构建物用于诱导细胞调亡的药物的制造。在本发明的一个实施方式中，与不恰当的细胞调亡有关的疾病或生理状况是结肠癌。在本发明的另一个实施方式中，与不恰当的细胞调亡有关的疾病或生理状况是病毒诱导的癌症。在本发明的另一个实施方式中，与不恰当的细胞调亡有关的疾病或生理状况是结肠癌、白血病、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、肝癌、肾细胞癌、成神经细胞瘤、腺癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、子宫平滑肌瘤。现在通过实施例的方式，并参考以下图表仅对本发明进行说明；图1说明了所用siRNA的序列，以及HCT116细胞中Bcl-2的表达。Bcl-2siRNA的a和b序列，分别与Bcl-2mRNA核苷酸77-95位和354-372位等同；Bcl-xL的c序列和核苷酸的347-366位等同(产生RNA的方法，见WO03/008573)。使用VectorNTI衍生了具有配对不准确的碱基对(二聚体)或形成茎-环结构(环)倾向的预测的二级结构。反义RNA对照组使用了Bcl-2反义核苷酸354-372位，和Bcl-xL反义核苷酸347-366位。在本研究中还使用了对照siRNA(JiangandMilner，2002)和核纤层蛋白A/CsiRNA(Elbashir等人，2001)。d-h，使用不同的抗-Bcl-2抗体的HCT116p53+/+和p53-/-细胞溶解物中Bcl-2蛋白的免疫印迹(箭头指向)d，＝N19，SantaCruz；e，＝C-2，SantaCruz；f，＝Ab-1，Oncogene；该抗体给出与多种细胞蛋白的非特异性交叉反应性(未显示)；g，＝Ab-2，Oncogene；和h，＝BDPharmingen。该C-2抗体(SantaCruz)用于随后所有的实验。i，用所示的对照siRNA转染后，HCT116p53+/+细胞中不同时刻的p53和p21的免疫印迹。图2表明Bcl-2中siRNA的沉默诱导了p53依赖性细胞凋亡。培养p53+/+和p53-/-HCT116细胞的同基因克隆体，并用siRNA如前文所述(方法)转染。转染效率＝70-80％。a，Bcl-2的免疫印迹(封闭箭头)，和核纤层蛋白A/C(开放箭头)。用对照siRNA、Bcl-2siRNA和核纤层蛋白A/CsiRNA的转染后时间如图所示。b，p53+/+和p53-/-HCT116细胞在用对照siRNA、Bcl-2siRNA或用核纤层蛋白A/CsiRNA转染后24小时和48小时的相差图像。c，通过DNA梯度确认的凋亡细胞。M＝标准参照物；条带1＝对照siRNA；条带2＝Bcl-2(a)siRNA；条带3＝Bcl-2(b)siRNA。转染后48小时收集细胞进行分析。d，通过FACS分析(方法)检测的膜联蛋白-V-阳性的凋亡细胞。如图所示转染后24小时和48小时收集细胞。□＝对照siRNA；□＝Bcl-2(a)siRNA；□＝Bcl-2(b)siRNA；□＝Bcl-2(b)反义RNA。在所有随后的实验中，采用Bcl-2(b)siRNA来使Bcl-2的表达沉默，通过单独的用FACS分析的DNA梯度和膜联蛋白-V标记技术来确认细胞凋亡。e，转染时间(0小时)以及释放进入用HCT116p53+/+细胞中的Bcl-2siRNA转染之后48小时收集的非粘着性细胞胞质溶胶中的细胞色素c的分布。P＝片状沉淀物部分；C＝胞质部分。图3HCT116细胞的同基因克隆体中非p53依赖性细胞凋亡。a-c，使用图1c所示的siRNA序列使抗细胞凋亡基因Bcl-xL的siRNA沉默。a，用对照siRNA或Bcl-xLsiRNA转染后不同时刻的Bcl-xL蛋白的免疫印迹。b，用对照siRNA或Bcl-xLsiRNA转染后48小时和72小时的相差图像。c，膜联蛋白-V标记和FACS分析检测的早期凋亡细胞。如上所述48小时和72小时后收集细胞进行分析。□＝对照siRNA；□＝Bcl-xLsiRNA；□＝Bcl-xL反义RNA。d，舒林酸(方法)处理诱导的细胞凋亡。舒林酸处理后24小时和48小时的细胞相差图像，舒林酸活化了Bax依赖性、非p53依赖性细胞凋亡(Zhang等人，2000)。通过DNA梯度和膜联蛋白-V标记的细胞的FACS分析确认了细胞凋亡(未显示)。图4Bcl-2或Bcl-xL沉默之后的细胞凋亡取决于Bax和胱冬蛋白酶2。a，如上所述用对照siRNA、Bcl-2siRNA或Bcl-xLsiRNA转染后72小时Bax+/-和Bax-/-HCT116细胞的同基因克隆体的相差图像。b，膜联蛋白-V标记和FACS分析检测的HCT116细胞的同基因克隆体中的凋亡细胞。如上所述用对照siRNA、Bcl-2siRNA或用Bcl-xLsiRNA转染后72小时收集细胞；＝Bax+/-细胞和＝Bax-/-细胞。c，如上所述用胱冬蛋白酶2siRNA结合Bcl-2siRNA或Bcl-xLsiRNA转染之后72小时HCT116p53+/+细胞中(图2和图3中使用的相同的克隆体)的凋亡细胞。图5细胞凋亡与Bcl-2表达沉默之后个体人类结肠癌细胞系中的p53状态相关联。细胞用Bcl-2siRNA转染，48小时后测定凋亡细胞(如图2的和方法所描述的)。□＝表达内源野生型p53的细胞系；□＝p53缺失细胞系。图6a和6b说明了Bcl-2α和Bcl-2βmRNA和蛋白质的序列。图7描绘了Bcl-xLmRNA的序列。Bcl-2表达的选择性沉默使用了HCT116p53+/+和p53-/-细胞的配对同基因克隆体(Bunz等人，1999；Zhang等人，2000)。为了使Bcl-2的表达沉默我们选择了两段Bcl-2mRNA靶点序列(图1a&b)。二者在人类和鼠科Bcl-2之间均为100％保守。通过对Bcl-2蛋白进行免疫印迹来监视Bcl-2表达的沉默。应当注意到在先前的对照良好的研究中，在HCT116细胞溶解物的免疫印迹中没有清楚地检测到Bcl-2(Zhang等人，2000)。使用相同的抗体(N19，SantaCruz；图1d)时确认了这一观察。然而，其它抗体在HCT116细胞中清除地检测到Bcl-2，重要的是，显示了p53+/+和p53-/-细胞中的Bcl-2蛋白水平是相等的。与转染过程相关的必然应激(inevitablestress)在p53+/+细胞中并不足以将p53活化为转录因子，这一点从缺乏p53靶蛋白p21的上位调控可以明显看出(图1i)。用Bcl-2siRNA转染24小时之内Bcl-2蛋白处于几乎检测不到的水平(图2a)。有趣的是，仅仅两个Bcl-2siRNA之一沉默了Bcl-2的表达(Bcl-2(b)；图2)表明由于某种原因必须通过RNA干扰保护与非有效siRNA同源的mRNA序列(核苷酸77-95；图1a)使之不受识别和/或降解。这样的保护可以由于局部mRNA二级结构或蛋白-mRNA相互作用产生(参见JiangandMilner，2002)。对照转染包括一段随机的siRNA序列(对照siRNA，JiangandMilner，2002)和核纤层蛋白A/CsiRNA，先前已显示其抑制了核纤层蛋白A/C蛋白的表达而不诱导细胞凋亡(Elbashir等人，2001)。Bcl-2的沉默诱导p53依赖性细胞凋亡用Bcl-2siRNA转染的p53+/+细胞内48小时内观察到大规模细胞凋亡(Bcl-2(b)；图2b-d)。Bcl-2反义RNA(反义序列354-372)转染的细胞的细胞凋亡可忽略不计(图2d)，这相当于使用对照siRNA转染时观察到的情况。这一点确认了p53+/+细胞中Bcl-2siRNA诱导的细胞凋亡应归因于RNA干扰。核纤层蛋白A/C的siRNA沉默在p53+/+或p53-/-细胞中均不能导致细胞凋亡(图2b)。这一点说明了RNA干扰的过程本身并不足以活化HCT116p53+/+细胞的细胞凋亡。出乎意料的是，p53-/-细胞在Bcl-2表达沉默之后不再经历细胞凋亡(图2b-d)。因此我们推断Bcl-2表达的选择性沉默诱导了HCT116结肠癌细胞的大规模细胞凋亡，并且这一作用依赖于p53。最近已经表明Bcl-2能够调控不依赖于线粒体细胞色素c的释放和Apaf1/胱冬蛋白酶9的活化而被激活的细胞凋亡途径(Marsden等人，2002)。这便提高了p53可能启动这种不依赖于细胞色素c的途径的可能性，因此解释了观察到的Bcl-2的沉默之后p53+/+和p53-/-细胞之间在细胞凋亡上的差别(图2)。然而，对细胞色素c分布的分析清楚地表明细胞色素c释放进入了经历了用Bcl-2siRNA处理之后的细胞凋亡的p53+/+细胞的胞质溶胶中(图2e)。长期暴露于免疫印迹时，线粒体细胞色素c在用Bcl-2siRNA处理后的贴壁p53+/+细胞中的释放也很明显，但是在用Bcl-2siRNA处理的p53-/-细胞的平行培养物中却检测不到胞质细胞色素c(未显示)。这些结果显示，Bcl-2的沉默诱导了通过与从线粒体释放细胞色素c相关的途径的p53依赖性细胞凋亡。Bcl-xL的沉默诱导非p53依赖性细胞凋亡非p53依赖性细胞凋亡途径的完整性接下来由Bcl-xL基因的沉默确认，并再次使用了RNA干扰。Bcl-xL是一种抗细胞凋亡基因(Boise等人，1993)，结肠上皮细胞中Bcl-xLBax的比例的降低便足以诱导细胞凋亡(Zhang等人，2000)。因此我们预测在p53+/+和p53-/-两种细胞中Bcl-xL的选择性沉默都将会到诱导凋亡细胞的死亡。事实证明了这样一种情况。首先我们确定所选的Bcl-xLsiRNA序列(见图1c)可有效地降低Bcl-xL蛋白的表达(图3a)，接下来论证了其诱导细胞凋亡的能力(图3b-c)。用Bcl-xLsiRNA转染后24小时和48小时之间Bcl-xL蛋白的水平下降，接下来在p53+/+和p53-/-两种细胞中均观察到细胞凋亡。这表明对于结肠上皮细胞中Bcl-xL-调控的细胞凋亡途径来说，p53并非必需的。通过用已知可激活Bax依赖性细胞凋亡的舒林酸处理细胞，非p53依赖性细胞凋亡的途径得到了进一步的证实(Zhang等人，2001)。舒林酸在p53+/+和p53-/-两种细胞中均诱导了细胞凋亡(图3d；又见Zhang等人，2000)。在所有这些结果的基础上，我们推断所观察到的用Bcl-2siRNA处理的p53-/-细胞中细胞凋亡的缺乏(图2)不能归因于Bax的缺失或其它由Bcl-xL抑制的细胞凋亡途径。这一点与这两种细胞克隆体的同基因本质一致，并表明p53是Bcl-2沉默诱导的细胞凋亡的选择性要求。Bax和胱冬蛋白酶2对于Bcl-2或Bcl-xL沉默之后的细胞凋亡所必需的迄今我们的结果显示了Bcl-2组成性地抑制了在培养液中生长的结肠癌细胞的细胞凋亡，并显示了在Bcl-2表达沉默之后，细胞凋亡过程需要p53。这一点是新颖的，并带来了在Bcl-2调控下p53的促细胞凋亡功能。而且，p53的这一促细胞凋亡功能并不需要用例如5-FU的细胞毒性试剂对细胞进行处理。(注意RNA干扰过程自身并不足以激活p53诱导的细胞凋亡，这一点通过用核纤层蛋白A/CsiRNA处理的p53+/+细胞中细胞凋亡的缺乏得到说明，见上文)。另外，我们显示了Bcl-xL的沉默以非p53依赖性的方式诱导了细胞凋亡(图3)。这一点与早期的工作一致，确定了Bax是结肠癌细胞细胞凋亡响应中的主要参与者(Ionov等人2000；Zhang等人，2001；LeBlanc等人，2002)，并且Bcl-xL是其抗细胞凋亡的对应物(当外源性表达时，Zhang等人，2001)。这些观察结合起来使得我们有理由认为Bcl-2/p53和Bcl-xL/Bax可能代表了对照人类结肠上皮细胞中细胞凋亡的功能配对物。在这一假说中设想了至少两个假定的细胞凋亡途径(i)Bcl-2/p53可能定义了一种基本不依赖Bcl-xL/Bax的细胞凋亡途径；或(i)Bcl-2/p53和Bcl-xL/Bax在细胞凋亡过程中可能对照着相互关联的转变。为了区别这两种可选择的情况，我们在Bax+/+和Bax-/-HCT116细胞的同基因克隆体中分别地沉默了Bcl-2和Bcl-xL的表达(注意Bax+/-细胞的细胞凋亡响应与Bax+/+细胞相当；Zhang等人，2000)。Bcl-2和Bcl-xL的siRNA沉默在Bax+/-细胞中诱导了大规模细胞凋亡，但是在Bax-/-细胞中未能导致显著的细胞凋亡(图4c和d)。这一点清楚地说明了Bax对于Bcl-2调控的和Bcl-xL调控的两种途径的细胞凋亡均是必需的。上述结果表明，结肠癌细胞中Bcl-2和Bcl-xL细胞的死亡途径在对Bax的需求上具有共同性，但是在对p53的需求上有所不同。有可能是被Bcl-2选择性抑制的促细胞凋亡的途径的开始需要p53，因此降低了Bcl-沉默之后的细胞凋亡阈值。为了进一步剖析Bcl-2、Bcl-xL、p53和Bax之间的功能关联，我们接下来提出了是否还涉及胱冬蛋白酶2的问题。当胱冬蛋白酶2siRNA分别与Bcl-2siRNA或Bcl-xLsiRNA共转染时，Bcl-2或Bcl-xL的沉默诱导的细胞凋亡被阻断(图4c；胱冬蛋白酶2siRNA序列，见Lassus等人，2002)。单独的胱冬蛋白酶2的沉默(图4c)，或者用反义胱冬蛋白酶2RNA转染(未显示)，对细胞生存没有明显的影响。所有这些结果表明，Bax和胱冬蛋白酶2二者对于p53+/+结肠癌细胞中Bcl-2或Bcl-xL沉默之后的细胞凋亡均是必需的。这一点与最近的证据一致，其证明胱冬蛋白酶2促使了Bax向线粒体中的转运，以及接下来由细胞色素c的释放标记的线粒体膜的渗透性。Bcl-2siRNA对单个结肠癌细胞系中变化的p53状态的影响上述实验涉及HCT116细胞的同基因克隆体，因此受基因变异的严格制约。为了建立我们的观察的一般原则，我们沉默了其它人类结肠癌细胞系中的Bcl-2，其DNA错配修复也缺失，并定义了p53的状态下(见方法)。在每种情况下，野生型p53的存在与用Bcl-2siRNA转染后48小时可检测的细胞凋亡的诱导有关，而p53缺失与细胞凋亡的本底水平有关(图5)。这些结果确认了我们对p53+/+和p53-/-细胞的同基因克隆体的观察，与Bcl-2组成性地抑制结肠癌细胞中p53依赖性细胞凋亡的观点一致。材料和方法细胞系和转染HCT116克隆体在具有10％FCS的DMEM中培养。所有的细胞克隆体与100单位ml-1青霉素和100μgml-1链霉素在5％CO2的空气中37℃培养。其它人类结肠癌细胞系，也有DNA错配修复缺陷(见Branch等人，1995)，为Lovo和PKO(p53野生型)；DLD1、LS174T、SW48和HT29(所有的p53突变体)。为了进行转染，对细胞进行胰蛋白酶消化，并传代培养到无抗体的6孔培养板(10cm2)中，每孔1.5×105个细胞。根据提供的说明书合成并用HPLC纯化(德国MWG)选择的21核苷酸的RNA，并将其退火为siRNA双螺旋。传代培养24小时之后，根据制造商提供的说明书将细胞用装入脂质体中的siRNA(Oligofectamine，LifeTechnologies)转染。该方案包括在不含血清的培养基中孵育一小段时间，但是对照组表明这并不足以激活p53反应(见结果部分)。siRNA的浓度为每孔1.5×105个细胞中0.58μg。培养用培养基的最终体积为每孔1.5mL。如结论部分所示，其后不同的时间收集细胞进行分析。HCT116细胞的每一实验重复四次或更多次。转染效率通过用包含FITC-葡聚糖的脂质体转染来确定(JiangandMilner，2002)。反义RNA对照组包括在每一使用Bcl-2(b)、Bcl-xL和胱冬蛋白酶2各自的反义序列的实验中(见图1a和正文)。免疫印迹和线粒体细胞色素c的释放为了进行免疫印迹，对细胞进行胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，并移出一等份进行细胞计数。剩余的细胞用50μL裂解缓冲液(150mMNaCl；0.5％NP40；50mMTrispH8.0)在冰上裂解30分钟。样品用4倍强度的Laemlli缓冲液1∶1稀释。蛋白质用15％的SDS-PAGE溶解，并电印迹到硝化纤维素膜上进行抗体检测。将分子量标记和纯化的重组人类p53包括为标准参照物(未显示)。使用如下抗体对于Bcl-2＝N19和C-2(SantCruz)；Ab-1和Ab-2(Oncogene；注意Ab-1给出与多种细胞蛋白的非特异性背底；未显示)；和BD(Pharmingen)(图1b)。C-2抗体给出了最干净的结果，并在随后的实验中全部使用它。核纤层蛋白A/C＝抗体636；(SantaCruz)；Bcl-xL＝Bcl-X抗体(Pharmingen；该抗体给出相对较高的非特异性背底)。P53＝DO-1抗体(Oncogene)和胱冬蛋白酶2＝胱冬蛋白酶-2L抗体(F-7；SantaCruz)。结合抗体的显像由化学发光增强(Roche)。细胞分离(fractionation)和细胞色素c的检测如Marsden等人(2002，补充材料)所述进行。细胞生长、细胞周期分析和细胞调亡通过细胞计数测定细胞生长曲线。舒林酸诱导的细胞调亡(见图3)采用了舒林酸sulphide120μM(Calbiochem)。收集细胞，用PBS洗涤，并在-20℃下在90％的乙醇中固定过夜，以进行细胞周期分析。将固定的细胞压片，用PBS洗涤，再次分散在含0.1μg/ml的碘化丙锭和200U/ml的核糖核酸酶A的PBS中，并用FACS分析。在制造商提供的方案之后使用膜联蛋白-V-Fluos(Boehringer)来识别调亡细胞。另外根据制造商提供的说明书使用自杀-径迹(suicide-track)DNA梯度分离试剂盒(Oncogene)，由DNA梯度证实了细胞调亡。讨论我们在本研究中使用了同基因细胞克隆体和siRNA，以得到细胞中定义的促细胞调亡与抗细胞调亡基因表达的组合，否则它们在遗传上是对等的。我们的观察显示了一种新的细胞调亡途径，其中Bcl-2组成性地抑制了p53依赖性细胞调亡。通过用例如5’FU的制剂处理细胞以激活p53，也可以诱导细胞的调亡(Zhang等人，2000及未显示的结果)。这一点与确定的证据一致，即激活的p53在Bcl-2的上游起作用，响应基因毒性的压力(见Strasser等人，1994；和Johnstone等人的综述，2002；CoryandAdams2002)。为了使我们当前的观察与本研究的背景协调，我们提出Bcl-2组成性地抑制新的p53的促细胞调亡功能，暴露于基因毒性的压力下则通过诱导p53的反式激活潜力越过了Bcl-2的抑制。一旦激活为转录因子，p53便具有改变Bcl-2与Bcl-xL(下位调控)和Bax(上位调控)的表达比，有利于细胞调亡的能力(见Johnstone等人，2002)。从临床的观点来说，这一点对于抗癌治疗非常有用，但是带来了p-53激活剂导致的非特异性细胞毒性和基因毒性的内在风险。本发明显示，p53具有促细胞凋亡的性质，其虽然被Bcl-2抑制，但显现出组成性活性。Bcl-2确定为抗结肠癌的治疗中有希望的潜在靶点(又见Reed等人，2002)，并证明了Bcl-2对siRNA沉默的可行性。其它表皮肿瘤的存活可能同样受Bcl-2沉默的影响。随着RNA干扰的发展，特定基因的选择性沉默如今具有现实的可能性，靶向输送体系方面持续不断的创造性发展(例如见Hood等人，2002)将会促使RNA干扰应用于预防和治疗癌症。本发明还对具有遗传性DNA错配修复缺陷和相关结肠癌诱因的患者提供了重要建议。具体来说，由于已经确定缺失错配修复使得Bax基因容易发生突变并有利于Bax缺失细胞的克隆扩增，不应在这样的患者上采用舒林酸作为化学预防剂。本研究中我们证明，Bax是新发现的Bcl-2/p53途径调控的细胞凋亡中必不可少的介质(见上文)。由此得出结论，对于具有错配修复缺失的患者，任何Bax-缺失细胞的选择性压力可能加剧肿瘤的发生，应当避免。p53的组成性促细胞凋亡功能可能与正常结肠上皮中的顶端细胞凋亡相关联。假如是这样的话，结肠上皮肿瘤中细胞凋亡不再发生可能反映了对固有的p53诱导的细胞凋亡的不适当抑制。在这一点上强有力的候选物是组成性阻断p53诱导的细胞凋亡并促使结肠癌细胞存活的Bcl-2。这种模型与结肠癌的恶性发展中p53突变的晚期发作相一致。它还加强了Bcl-2作为一种新型抗癌制剂的发展的首要靶点。例如Bcl-2的细胞抗细胞凋亡基因的病毒同源物代表了治疗病毒诱导的癌症中有希望的靶点。人类Bcl-2表达的沉默确定RNAi机理可用于Bcl-2mRNA序列。已发现仅两个不同抗-Bcl-2siRNA之一是有效的，这强调了任何基于RNA干扰的抗病毒治疗的发展中，对靶向序列的选择和确认的重要性。可用于RNAi的包含病毒特异性核苷酸序列的Bcl-2的病毒同源体(v-Bcl-2)将代表着基于RNAi的抗病毒/抗癌治疗的有希望的靶点。参考文献Boise，L.H.等人1993.作为凋亡细胞死亡的主要调控子的Bcl-2相关基因。Cell74，597-608.Branch，P.，Hampson，R.andKarran，P.1995.人类结肠癌细胞系中的DNA错配结合缺失、DNA损伤耐受性和增变表现型。CancerResearch55，2304-2309.Bunz，F.等人1999.人类癌细胞中p53的破坏改变化疗制剂的反应。J.Clin.Invest104，263-269.Cory，S.andAdams，J.M.2002.Bcl2家族细胞生存或死亡开关的调控子。NatureReviewsCancer2，647-656.Elbashir，S.M.等人2001.21核苷酸RNA双螺旋在培养的哺乳动物细胞中介导RNA干扰。Nature441，494-498.He，T.C.，Chan，T.A.，Vogelstein，B.&Kinzler，K.W.1999.PPARδ是非甾体抗炎药物的APC-调控靶点。Cell99，335-345.Hood，J.D.等人2000.通过靶定基因向新生血管传递的肿瘤退化。Science296，2404-2407.Ionov，Y.，Peinado，M.A.，Malkhosyan，S.，Shibita，D.&Perucho，M.1993.遍体细胞中简单重复序列突变揭示了一种结肠致癌的新机制。Nature363，558-561.Ionov，Y.，Yamamoto，H.，Krajewski，S.，Reed，J.C.&Perucho，M.2000.促细胞凋亡基因Bax的突变失活在肿瘤无性进化中具有选择性优势。Pro.Natl.Acad.Sci.USA97，10872-10877.Jiang，M.，&Milner，J.2002.一种RNA干扰引物siRNA处理的人类HPV-阳性宫颈癌细胞中病毒基因表达的选择性沉默。Oncogene216041-6048.Lassus，P.，Optiz-Araya，X.&Lazebnik，Y2002.线粒体渗透前压力诱导的细胞凋亡对胱冬蛋白酶2的需求。Science2971352-1354.Johnstone，R.W.，Ruefli，A.A.&Lowe，S.W.2002.细胞凋亡癌遗传学与化学治疗之间的联结。Cell108153-164.LeBlanc，H.等人2002.肿瘤细胞通过促细胞凋亡Bcl-2同源体Bax的突变灭活对死亡受体诱导的细胞凋亡的抗性。NatureMedicine8，274-281.Lynch，H.T.1999.遗传性非息肉病结肠癌(HNPCRC)。Cytogenet.CellGenet.86，130-135.Marsden，V.S.等人2002.不依赖于细胞色素c/Apaf-1/胱冬蛋白酶9凋亡体的Bcl-2调控的胱冬蛋白酶活化引发的细胞凋亡。Nature419634-637.Rampino，N.等人1997.微卫星增变表现型结肠癌中BAX基因的体细胞移码突变。Science275，967-969.Reed，J.C.2002.基于细胞凋亡的治疗。Nat.Rev.DrugDiscov.1111-121.Strasser，A.，Harris，A.W.，Jacks，T.&Cory，S.1994.DNA损伤能够通过不依赖p53的可被BCL-2抑制的机制诱导增殖性淋巴细胞中的细胞凋亡.。Cell79329-339.Yamamoto，Y.，Yin，M.J.，Lin，K.M.&Gaynor，R.B.1999.舒林酸抑制NF-kappaB途径的激活。J.Biol.Chem.274，27307-27314.Zhang，L.，Yu，J.，Park，B.H.，Knizler，K.W.&Vogelstein，B.2000.BAX在对抗癌试剂的细胞凋亡响应中的作用。Science290989-992.权利要求1.一种调控细胞凋亡的方法，其特征在于所述的方法包括向细胞中导入含有与所述细胞内的mRNA同源的核苷酸序列的RNA构建物，所述的mRNA包括与细胞凋亡的调控有关的基因要素的基因信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的基因要素与细胞凋亡的抑制有关。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的基因要素为Bcl-2。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的基因要素包括以下核酸分子或其部分(i)图6表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可与(i)中的任意核酸序列杂交，并具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遗传码简并的结果的核酸分子。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的基因要素为Bcl-xL。6.根据权利要求5所述的方法，其中的基因要素包括以下核酸分子或其部分(i)图7表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可与(i)中的任意核酸序列杂交，并具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遗传码简并的结果的核酸分子。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的基因要素为与细胞凋亡的调控有关的基因的病毒同源物。8.一种siRNA构建物，其具有与细胞凋亡的调控有关的基因要素转录的mRNA同源的核苷酸序列。9.根据权利要求8所述的siRNA构建物，其特征在于所述的结构在长度上为15到25个核苷酸。10.根据权利要求9所述的siRNA构建物，其特征在于所述的结构在长度上为19到23个核苷酸。11.根据权利要求8-10中的任何一项所述的siRNA构建物，其包含(i)与图6中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(ii)以上(i)的核酸序列遗传码简并的结果的核苷酸序列。12.根据权利要求8-11中的任何一项所述的siRNA构建物，其包含与Bcl-2mRNA核苷酸354-372位同源的核苷酸序列。13.根据权利要求8-10中的任何一项所述的siRNA，其包含(i)与图7中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(ii)以上(i)的核酸序列遗传码简并的结果的核苷酸序列。14.根据权利要求8-10或13中的任何一项所述的siRNA构建物，包含与Bcl-xL核苷酸347-366位同源的核苷酸序列。15.一种治疗与不恰当的细胞调亡有关的疾病或生理状况的方法，其包括给予受试者RNA构建物，其特征在于所述的RNA构建物具有与所述受试者的细胞内存在的mRNA同源的核苷酸序列，其特征在于所述的mRNA包括与细胞调亡的调控有关的基因要素的基因信息。16.权利要求8-14中的任何一项所述的RNA构建物在细胞调亡的调控中的应用，其特征在于所述的RNA构建物具有与细胞内的mRNA同源的核苷酸序列，其特征在于所述的mRNA包括与细胞调亡的调控有关的基因要素的基因信息。17.RNA构建物作为药物的应用。18.RNA构建物在制备诱导细胞调亡的药物中的应用。19.RNA构建物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。20.RNA构建物在制备治疗病毒诱导的癌症的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种调控细胞凋亡的方法。该方法包括向细胞中导入一种包含与所述细胞内的mRNA同源的核苷酸序列的RNA构建物的步骤。细胞内的该mRNA包括与细胞凋亡的调控有关的基因要素的基因信息。本发明还涉及一种具有与细胞凋亡的调控有关的基因要素转录的mRNA同源的核苷酸序列的siRNA构建物。文档编号A61P35/00GK1761681SQ200480007384公开日2006年4月19日申请日期2004年3月17日优先权日2003年3月18日发明者J·米尔纳申请人:J·米尔纳