专利名称：来源于Livin的HLA－A24结合性癌抗原肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及HLA-A24结合性癌抗原肽。
背景技术：
已知免疫系统，尤其是T细胞，在清除活体癌(肿瘤)方面发挥重要作用。实际上，已在人肿瘤病灶中观察到对癌细胞表现出细胞毒活性的淋巴细胞浸润(Arch.Surg.，126p200，1990)，并在没有多大困难的情况下从黑色素瘤中分离到识别自体肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(例如，Immunol.Today，8p385，1987；J.Immunol.，138p989，1987；及Int.J.Cancer，52p52，1992)。此外，通过移植CTL对黑色素瘤的临床治疗结果也表明了T细胞在肿瘤清除方面的重要性(J.Natl.Cancer. Inst.，86p1159，1994)。
尽管在很长时间内并不清楚CTL攻击自体肿瘤细胞的靶分子，但近年来随着免疫学与分子生物学的发展，这类分子也逐渐清晰起来。具体而言，已知道CTL通过T细胞受体(TCRs)可识别一种被称作癌抗原肽的肽与主要组织相容性复合物I类抗原(MHC-I类抗原，也称作HLA抗原)的复合物，由此攻击自体肿瘤细胞。
癌抗原肽是通过细胞内合成的癌特异性抗原蛋白被细胞内蛋白酶体降解而生成的。这样生成的癌抗原肽结合至内质网中的MHC-I类抗原(HLA抗原)上形成复合物，该复合物转移到细胞表面而作为抗原形式存在。抗原特异的CTL识别以抗原形式存在的复合物，并且通过细胞毒活性或者产生淋巴因子而表现出抗癌作用。伴随这一系列作用的阐述明，有可能通过使用被称为癌疫苗的癌抗原蛋白或者癌抗原肽来增强癌症病人体内癌特异性的CTL，从而来治疗癌症。
就癌抗原蛋白而言，T.Boon等人于1991年第一次从人黑色素瘤中鉴定了一种名为MAGE的蛋白(Science，254p1643，1991)。随后，又鉴定了几种其它的主要来自黑色素瘤细胞的癌抗原蛋白。已经鉴定的黑色素瘤抗原的实例有黑色素组织特异性蛋白gp100、MART-1和酪氨酸酶等黑色素体蛋白、以及不仅在黑色素瘤而且在其它多种癌细胞以及正常睾丸细胞上表达的MEGE-相关蛋白、具有癌特异性氨基酸突变的β-联蛋白、还有CDK4。其它已鉴定的不是来自黑色素瘤的癌抗原蛋白包括HER2/neu和p53(变异体)等癌基因产物、CEA及PSA等肿瘤标志物、以及HPV和EBV等病毒蛋白。可以在已发表的综述文章中找到这些物质的详细描述(例如，Immunol.Today，183p267，1997；J.Exp.Med.，18p725，1996；及Curr.Opin.Immunol.，8p628，1996)。
Livin已经被鉴定为一个属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族的分子(J.Biol.Chem.276p3238，2001)。Livin由280个氨基酸组成，并具有一段称为杆状病毒IAP重复序列(BIR)的约70个氨基酸的独特重复序列。大约在相同时间被鉴定为一种被黑色素瘤大量表达的IAP的ML-IAP(黑色素瘤凋亡抑制蛋白)具有同Livin相同的氨基酸序列(Curr.Biol.10p1359，2000)。
已报道从HLA-A*0201阳性黑色素瘤病人转移灶中分离的T细胞，可识别ML-IAP衍生多肽并具有细胞毒性，因此认为livin作为一种癌抗原蛋白是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的靶作用物(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100p3398，2003)。不过，仍未阐明livin是否含有能够与若干HLA抗原中的HLA-A24抗原结合的肽组分。
发明内容
本发明的目标是提供来源于Livin的HLA-A24结合性癌抗原肽以及该肽作为癌疫苗的应用等。
本发明人已经对可能在癌症免疫疗法中用作癌疫苗的、来源于livin的抗原肽进行了仔细研究。因此，本发明人首次发现了livin含有可与属于若干HLA抗原亚类的HLA-A24抗原结合、并可被CTL所识别的癌抗原肽组分。这个发现使得新型癌疫苗疗法获得进展，由此可在HLA-A24阳性癌症病人中诱导livin特异性CTL。
具体而言，本发明人发现SEQ ID NO8所示的癌抗原肽同阳性对照相比，表现出非常高的HLA-A24抗原结合活性及更好的CTL诱导活性，适于临床应用。
基于这些发现完成了本发明。
因此，本发明包括以下部分。
(1)SEQ ID NO1所示的livin氨基酸序列中8-11个连续的氨基酸所组成的肽，其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
(2)上述(1)中的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列。
(3)上述(2)中的肽，其由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成。
(4)上述(2)中的肽，其包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列。
(5)上述(4)中的肽，其由SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列所组成。
(6)上述(4)中的肽，其包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
(7)上述(6)中的肽，其由SEQ ID NO8所示的氨基酸序列所组成。
(8)9-11个氨基酸的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列，而且可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
(9)上述(8)中的肽，其由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列组成。
(10)上述(8)中的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被下述氨基酸残基替代后所得到的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
(11)上述(10)中的肽，其由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被下述氨基酸残基替代后所得到的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
(12)上述(10)中的肽，其包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
(13)上述(12)中的肽，其由SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被下述氨基酸残基替代后所得到的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
(14)上述(12)中的肽，其包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列中其第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，如SEQ ID NO63所示的氨基酸序列，但SEQ ID NO8的氨基酸序列除外。
(15)上述(14)中的肽，其由SEQ ID NO8所示的氨基酸序列中其第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列组成，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，如SEQ ID NO63所示的氨基酸序列，但SEQ ID NO8的氨基酸序列除外。
(16)一种包含上述(1)至(15)中任一项所述的肽的表位肽。
(17)一种肽二聚体，其中(1)至(16)中任一项所述的含有的半胱氨酸残基的肽单体通过二硫键相结合。
(18)上述(17)中的肽二聚体，其中包含SEQ ID NO7-9中任一项所示的氨基酸序列的肽单体通过二硫键相结合。
(19)上述(18)中的肽二聚体，其中包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的肽单体通过二硫键相结合。
(20)一种编码(1)至(16)中任一项所述的肽的多聚核苷酸。
(21)一种含有上述(20)中所述的多聚核苷酸的表达载体。
(22)一种含有上述(21)中所述的表达载体的细胞。
(23)一个用于生产上述(1)至(19)中任一项所述的肽的方法，其包括在肽可表达的条件下培养上述(22)中所述的细胞。
(24)一种可与上述(1)至(19)中任一项所述的肽特异结合的抗体。
(25)一种抗原呈递细胞，其可呈递上述(1)至(19)中任一项所述的肽与HLA-A24抗原的复合物。
(26)上述(25)中的抗原呈递细胞，其可呈递包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的肽与HLA-A24抗原的复合物。
(27)上述(26)中的抗原呈递细胞，其可呈递包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的肽与HLA-A24抗原的复合物。
(28)一种CTL，它识别上述(1)至(19)中任一项所述的肽与HLA-A24抗原的复合物。
(29)上述(28)中的CTL，其识别包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的肽与HLA-A24抗原的复合物。
(30)上述(29)中的CTL，其识别包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的肽与HLA-A24抗原的复合物。
(31)一种药用组合物，其包含上述(1)至(19)中任一项所述的肽、上述(21)中所述的表达载体、上述(22)中所述的细胞、上述(25)至(27)中任一项所述的抗原呈递细胞、或者上述(28)至(30)中任一项所述的CTL、以及药学上可接受的载体。
(32)上述(31)中的药用组合物，其用作CTL诱导物。
(33)上述(31)中的药用组合物，其用作癌疫苗。
(34)一种癌症诊断试剂，其包含上述(24)中所述的抗体。
(35)一种包含上述(1)至(19)中任一项所述的肽以及HLA-A24抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
(36)上述(35)中的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体，其包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的肽以及HLA-A24抗原。
(37)上述(36)中的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体，包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的肽以及HLA-A24抗原。
(38)一种用于检测特异性作用于来源于livin的HLA-A24结合性癌抗原肽的CTL的试剂，该试剂含有作为其成分的上述(35)至(37)中任一项所述的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
(39)上述(38)中的试剂，其用于癌疫苗效果的评估中。
发明的简要描述
图1所示的是来源于livin的8个肽对HLA-A*2402的结合亲合力，来源于EV病毒的肽EBV用作阳性对照。在图中，纵轴为荧光强度的平均值(结合亲合力)(实施例1)。
图2所示的是51Cr释放实验的结果，在其中检测了来源于livin的肽(肽7)从人外周血单核细胞(PBMCs)诱导CTL的活性。使用了从一个HLA-A24阳性肺癌病人中分离的PBMCs。在图中，纵轴表示CTL的细胞毒活性。在图中所示的靶细胞中，LNY-1为livin阳性且HLA-A*2402阴性；LNY-1A24为livin阳性且HLA-A*2402阳性，K562为livin阴性且HLA-A*2402阴性(实施例2)。
图3所示的是按图2中描述进行相同实验获得的结果，只是其中PBMCs是从另外一个HLA-A24阳性肺癌病人中获得的。
实施本发明的最佳方案本发明提供了一种由SEQ ID NO1所示的livin氨基酸序列中8-11个连续的氨基酸所组成的肽，其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
本发明的肽包含上面所述的SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的一部分；不过，其N-末端和/或C-末端氨基酸残基可被修饰。此外，当肽含有半胱氨酸残基时，它可以是通过二硫键结合的二聚体的形式。
SEQ ID NO1所示的人livin氨基酸序列是J.Biol.Chem.2763238，2001及NCBI数据库中序列号AAG33622中所述的已知序列。
本发明的肽是由SEQ ID NO1所示的人livin氨基酸序列中8-11个连续的氨基酸所组成的肽。“8-11个氨基酸”的界定是基于“能够同HLA-A24抗原结合的肽一般由8至11个氨基酸所组成(Immunogenetics，41178-228，1995，J.Immunol.，1554307-4312，1995，J.Immunol.，1523913-3924，1994，J.Immunol.，1523904-3912，1994)”这个事实的基础上的。优选的肽是那些由SEQ IDNO1所示的人livin氨基酸序列中9-11个连续的氨基酸所组成的肽，SEQ ID NO1所示的人livin氨基酸序列中9-10个连续的氨基酸是更优选的。
可以通过合成由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中8-11个连续的氨基酸所组成的部分肽(候选肽)、并测定该肽能否与HLA-A24抗原结合且能否被CTL识别来鉴定本发明的肽。
肽的合成可以依照肽化学领域中常用方法来进行。可以在包括Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；The Proteins，Vol.2，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide Synthesis，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Gosei no Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985；及Iyakuhin no Kaihatsu(Zoku)，Vol.14，Peptide Synthesis，Hirokawa-syoten，1991等文献。
在本文用法中，“与HLA-A24抗原结合并被CTL识别”指的是一种肽具有癌抗原肽的活性，它同“与HLA-A24抗原结合并诱导CTL(具有CTL诱导活性)”或者“与HLA-A24抗原结合并激活CTL(具有CTL激活活性)”具有相同含义。因此，“与HLA-A24抗原结合并被CTL识别”可以表达为“具有癌抗原肽活性”或者“具有CTL诱导活性”。
可以通过例如，J.Immunol.，169，1611，2002中描述的方法来检验是否“一种候选肽与HLA-A24抗原结合并被CTL识别”。
具体而言，首先从人类HLA-A24抗原阳性患者中分离并培养外周血单核细胞(PBMCs)。培养后，回收并培养非粘附细胞。使用固定在磁珠或其它类似物上的抗-CD8抗体从培养物中分离含有CTL的T细胞群落(CD8阳性T细胞)。个别情况下，为了制备抗原呈递细胞，培养粘附细胞，并在加入(冲击致敏)候选肽后，进一步培养细胞。
混合培养该候选肽所冲击致敏的抗原呈递细胞以及含有CTL的T细胞群落。通过重复该肽所冲击致敏的抗原呈递细胞的刺激使得该肽特异性的CTL获得扩增后，利用例如，51Cr释放实验(Int.J.Cancer，58p317，1994)或其它类似方法测量上述CTL的细胞毒活性。在测定中可以使用的靶细胞的实例包括livin阳性且HLA-A24阳性的51Cr标记细胞。具体的实施例包括通过将编码HLA-A*2402HLA-A24的一个亚类的基因(Cancer Res.，554248-4252(1995)，Genbank序列号M64740)导入来源于黑色素瘤或者肺癌并且是livin阳性且HLA-A24阴性的细胞系中而获得的51Cr标记细胞。
若靶细胞在上述检测中被CTL损伤，则认为候选肽具有本发明中“与HLA-A24抗原结合并被CTL识别”的活性。
此外，可通过使用WO02/47474及Int.J.Cancer，100，565-570，2002中描述的HLA-A24模型小鼠来确认候选肽是否具有本发明中的活性，即“与HLA-A24抗原结合并被CTL识别”的活性。
已知HLA分子存在许多亚类，而且能够与其结合的抗原肽的氨基酸序列遵守一定的规则(结合基序)。关于HLA-A24的结合基序，已知在8至11个氨基酸的肽中，第二位的氨基酸为酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或者色氨酸(Trp)，C-末端的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)或者甲硫氨酸(Met)(Immunogenetics，41p178-228，1995，J.Immunol.，155p4307-4312，1995，J.Immunol.，152p3913-3924，1994，J.Immunol.，152p3904-3912，1994)。此外，与上述基序中相关氨基酸残基同源的氨基酸残基也是可用的。
近来，已经可以使用NIH的BIMAS软件通过互联网(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)来搜索预计能够与HLA抗原结合的肽序列。
本发明首次发现livin(SEQ ID NO1)含有能够与HLA-A24抗原结合并被CTL识别的抗原肽组分。通过使用上述BIMAS软件所筛选的由livin氨基酸序列所确定的、推测可与HLA-A24结合的9或10个氨基酸的氨基酸序列的实例，包括SEQ ID NO2-59中列出的livin的部分氨基酸序列。
因此，作为本发明中肽的一个具体实例，本发明提供了包含SEQID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的肽，其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
关于等肽的长度没有特别的限制，只要上述肽是包含SEQ IDNO2-59中任一项所示的氨基酸序列的livin的部分肽段、具有与HLA-A24抗原结合并被CTL识别的活性即可。不过，由于已知具有HLA-A24抗原结合活性的肽一般由8至11个氨基酸组成(Immunogenetics，41p178-228，1995，J.Immunol.，155p4307-4312，1995，J.Immunol.，152p3913-3924，1994，J.Immunol.，152p3904-3912，1994)，因此本发明的肽如同前述序列标记号中所示的那样，优选地由9-11个、更优选地为9-10个氨基酸组成。
作为本发明的肽的更为优选的实施例，本发明提供了一种由9-10个、更优选地为9-10个氨基酸所组成的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列，可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
作为更为优选的实施例，本发明提供了一种由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的肽，其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
在前述序列标记中所示的本发明的肽中，那些包含SEQ ID NO6-9中所列出氨基酸序列的是优选的，包含SEQ ID NO8中所列出氨基酸序列的是特别优选的。本发明人已经发现SEQ ID NO8所示的癌抗原肽同阳性对照相比，表现出非常高的HLA-A24抗原结合活性及更好的CTL诱导活性。
肽的长度优选地为9-11个、更优选地为9-10个氨基酸。由SEQ IDNO6-9中所列出氨基酸序列所组成的肽是优选的，由SEQ ID NO8中氨基酸序列所组成的肽是特别优选的。
本发明的肽在保持其活性的适当范围内可以进行一些改造。在本文用法中，氨基酸残基的“改造”指氨基酸残基的替代、删除和/或增加(包括在肽的N-或C-末端添加氨基酸的情形)。氨基酸残基的替代是优选的。当改造是氨基酸残基的替代时，在任意位点上任意数目的氨基酸残基均可替换，只要保留其作为癌抗原肽的活性即可。不过，由于与HLA-A24抗原结合的肽其长度一般为约8-11个氨基酸，因此优选地，改造只涉及1至几个氨基酸。
当通过替代来改变氨基酸残基时，具有HLA-A24抗原结合基序结构的肽，其第二位和/或C-末端氨基酸残基的替代是优选的。
本发明中与替代相关的肽的具体实例，例如9-11个氨基酸(优选地为9-10个氨基酸)的肽，其包含下述氨基酸序列，该氨基酸序列为在SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
其中，由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代、并且可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别的氨基酸序列所组成的肽是优选的。
在上述替代中，能够保持HLA-A24抗原结合基序结构的氨基酸残基的替代是优选的。因此，本发明中与替代相关的肽的优选实施例包括9-11个氨基酸的肽(优选地为9-10个氨基酸)，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
与替代相关的肽的更为优选的实例包括由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
与替代相关的肽的进一步优选的实例包括9-11个氨基酸的肽(优选地为9-10个氨基酸)，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
与替代相关的肽的更为优选的实例，例如由SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
与替代相关的肽的特别优选的实例包括9-11个氨基酸的肽(优选地为9-10个氨基酸)，其包含下述氨基酸序列，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO8中列出的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别，例如SEQ ID NO63所示的序列，但SEQ ID NO8的氨基酸序列除外。
与替代相关的肽的更加特别优选的实例包括由SEQ ID NO8中列出的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，并且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别，例如同SEQ ID NO63所示的序列，但SEQ ID NO8的氨基酸序列除外。
出于增加上述本发明中由livin部分序列所组成的天然类型癌抗原肽的HLA-A24抗原结合活性或增强其活性的目的，可对第二位和/或C-末端氨基酸残基进行改造(优选地为替代)。肽第二位和/或C-末端被替代了的氨基酸残基之外的部分可保持天然类型序列(即，保持具有与livin相同的序列)，或者在维持活性的情况下进行进一步改造。具体而言，所述改造涉及用另一种氨基酸残基(例如，丝氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸)取代半胱氨酸残基。更具体的实例还包括通过使用另一种氨基酸(例如，丝氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸)取代肽第六位的半胱氨酸所获得的肽，这种肽可以是具有SEQ ID NO7中列出的氨基酸序列的肽，或者是通过替代SEQ ID NO7中列出的氨基酸序列的第二位和/或C-末端获得的替代类型的肽。这类肽的另一个实施例包括通过使用另一种氨基酸(例如，丝氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸)取代肽第六位的半胱氨酸所获得的肽，这种肽可以是具有SEQID NO8中列出的氨基酸序列的肽，或者是通过替代SEQ ID NO8中列出的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基获得的替代类型的肽(例如，由SEQ ID NO63所示的肽)。这类肽还有另一个实施例，包括通过使用另一种氨基酸(例如，丝氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸)取代肽第七位的半胱氨酸所获得的肽，这种肽可以是具有SEQID NO9中列出的氨基酸序列的肽，或者是通过替代SEQ ID NO9中列出的氨基酸序列的第二位和/或C-末端的氨基酸残基获得的替代类型的肽。
本发明还提供包含本发明的肽(天然的或改造的肽)与辅助肽或者另一种癌抗原肽的肽(所谓的表位肽)。
近来，已表明由多个CTL表位(抗原肽)连接所组成的肽(“表位肽”)具有有效诱导CTL的活性。例如，已报道一种肽(大约30-mer)，其中源于癌抗原蛋白PSA的，分别为HLA-A2-、-A3、-A11或B53限制性的CTL表位相连接，在体内可针对不同的CTL表位特异性地诱导CTL(Journal of Immunology 1998，1613186-3194)。
此外，已表明肽(“表位肽”)，其中CTL表位与辅助表位相连接，可有效诱导CTL。在本文中，“辅助表位”指能够激活CD4阳性T细胞的肽(Immunity.，1751，1994)，它的实例包括B型肝炎病毒来源的HBVc128-140、破伤风毒素来源的YY947-967等。由上述辅助表位激活的CD4+T细胞表现出包括诱导并维护CTL、分化、以及巨噬细胞等效应子的激活等在内的多种活性，因此认为它在免疫学抗肿瘤应答中有重要作用。上述的辅助表位与CTL表位相连接的肽的具体实例，报道了一种编码由HBV来源的HLA-A2限制性抗原肽(6肽)、HLA-A11限制性抗原肽(3肽)及一种辅助表位所组成的肽的DNA(微基因)在体内可直接针对不同的表位有效诱导CTL(Journalof Immunology 1999，1623915-3925)。实践中一种CTL表位(同黑色素瘤抗原gp100的280-288位相对应的癌抗原肽)与辅助表位(来源于破伤风毒素的T辅助表位)相连接的肽已经被用于临床试验(Clinical Cancer Res.，2001，73012-024)。
因此，作为一个具体的实例，本发明还涉及具有CTL诱导活性的、含有本发明的肽(天然的或改造的肽)的若干表位相连接所形成的表位肽。
当被连接到本发明中的癌抗原肽上的表位是一种CTL表位(癌抗原肽)时，可使用的CTL表位的实例包括HLA-A0201、-A0204、-A0205、-A0206或者-A0207限制性的livin来源的CTL表位。多个等CTL表位可以相连接，基于抗原肽与多种HLA分子进行结合的分析，单个CTL表位的长度可以位约8-14个氨基酸(Immunogenetics，41178，1995)。
当被连接到本发明中的癌抗原肽上的表位是一种辅助表位时，可使用的辅助表位的实例包括前述B型肝炎病毒来源的HBVc128-140、破伤风毒素来源的YY947-967等。辅助表位长度可以为13-30个氨基酸，优选地为13-17个氨基酸。
具体而言，本发明中表位肽的实例包括由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的一个或多个肽与辅助表位相连接的表位肽，其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
更具体的实例包括由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽与破伤风毒素来源的辅助肽(例如，Phe Asn Asn Phe Thr Val SerPhe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu；SEQ IDNO61)相连接的表位肽，或由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽与肽Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly IleThr Glu Leu；SEQ ID NO62.Clinical Cancer Res.，2001，73012-3024，相连接形成的表位肽。
可通过前述常用的肽合成方法来制备其中多个表位相连接的肽(表位肽)。也可以通过常用的DNA合成方法以及基于编码多个表位连接所组成的肽的多聚核苷酸的序列信息的基因工程来制备。即可通，过将编码该肽的多聚核苷酸插入已知的表达载体、使用获得的重组表达载体转化宿主细胞、培养转化子以及从培养物中回收目的肽的方法来制备其中多个表位相连接的表位肽。这些过程可以根据例如，文献中描述的方法(Molecular Cloning，T.Maniatis等，CSHLaboratory(1983)，DNA Cloning，DM.Glover，IRL PRESS(1985))或者下文描述的方法来进行。
这样所获得的多个表位相连接的表位肽可通过上述的51Cr释放实验或者通过利用WO02/4747或Int J.Cancer 100，565-570，2002中描述的用于人类的模型动物来检验其CTL诱导活性。
同样，上述本发明的肽(天然的、改造的或表位肽)其N-末端的氨基基团或C-末端的羧基基团可被修饰。其N-末端和/或C-末端氨基酸残基被修饰的肽也在属于本发明的肽的范围。
用于对N-末端氨基酸的氨基基团进行修饰的那些基团的实例包括从中C1-6烷基、苯基、环烷基及酰基中选择的1至3个基团。酰基包括C1-6烷酰基、苯基取代的C1-6烷酰基、C5-7环烷基取代的羰基、C1-6烷基磺酰基、苯基磺酰基、C2-6烷氧羰基、苯基取代的烷氧羰基、C5-7环烷氧基取代的羰基、苯甲氧基羰基以及其它类似物。
C-末端氨基酸羧基被修饰的肽的实例包括酯和酰胺。酯包括C1-6烷基酯、苯基取代的C0-6烷基酯、C5-7环烷基酯及其它类似物。酰胺特别包括酰胺、被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺、被一个或两个苯基取代的C0-6烷基所取代的酰胺、形成了包括酰胺基团中氮原子在内的5至7元氮杂环烷的酰胺以及其它类似物。
此外，当上述本发明的肽(天然的、改造的或表位肽)含有半胱氨酸残基时，肽单体可通过二硫键形成二聚体。上述二聚体可以通过合成肽单体后将获得的肽单体置于氧化条件下来获得。
具体的实施例包括由SEQ ID NO7中所示的氨基酸序列所组成的肽、或者通过其第二位和/或C-末端氨基酸替代获得的替代型肽的二聚体。另一个实施例包括由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽、或者通过其第二位和/或C-末端氨基酸替代获得的替代型肽(例如，SEQ ID NO63中所示的肽)的二聚体。再一个实施例由SEQ ID NO9中所示的氨基酸序列所组成的肽、或者通过其第二位和/或C-末端氨基酸替代获得的替代型肽的二聚体。
本发明还提供了一种编码上述本发明中肽(天然的、改造的或表位肽)的多聚核苷酸。编码本发明中肽的多聚核苷酸可以是DNA或RNA的形式。基于本发明中肽的氨基酸序列或者编码该肽的DNA的多聚核苷酸序列的信息，可以很容易地制备本发明中的多聚核苷酸。具体而言，可使用常用的DNA合成或者PCR扩增的方法来进行合成。
具体的实例包括编码可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别的一个或多个由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的肽与辅助表位连接形成表位肽的多聚核苷酸。
优选实例包括编码由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽与破伤风毒素来源的辅助肽(例如，Phe Asn Asn Phe Thr Val SerPhe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu；SEQ IDNO61)连接的表位肽的多聚核苷酸。还包括编码由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽与肽Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn SerLys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu(SEQ ID NO62，Clinical CancerRes.，2001，73012-3024)相连接的表位肽的多聚核苷酸。
通过将上述制备的多聚核苷酸整合到表达载体中可构建用于表达本发明中肽的重组表达载体。
根据所用的宿主、目的及其它可选择适当的表达载体，包括质粒、噬菌体载体、病毒载体以及其它类似载体。
当宿主为大肠杆菌时，载体的实例包括pUC118、pUC119、pBR322、pCR3及其它类似的质粒载体；以及λZAPII、λgt11及其它类似的噬菌体载体。当宿主为酵母时，载体的实例包括pYES2，pYEUra3等，当宿主细胞为昆虫细胞时，例如pAcSGHisNT-A等。当宿主为动物细胞时，载体的实例包括pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMV及其它类似的质粒载体；以及逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及其它类似的病毒载体。
表达载体可随意包含能够诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、用于选择的标记基因、终止子及其它类似元件。
此外，表达载体可包含用于将肽同硫氧还蛋白、His标签、GST(谷胱甘肽S-转移酶)或其它类似物一起作为融合蛋白表达的附加序列，以利于分离纯化。在等例子中可使用的载体包括pGEX4T等、含有可在宿主细胞中正确发挥功能的启动子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST融合蛋白载体；pcDNA3.1/Myc-His等含有标签序列(Myc、His等)的载体；以及pET32等能够表达硫氧还蛋白及His标签的融合蛋白的载体。
可以通过使用上述所获得的表达载体转化宿主细胞来制备本发明含有载体的转化细胞。
本文中所用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞与动物细胞。大肠杆菌的实例包括HB101、C600、JM109、DH5α及AD494(DE3)等大肠杆菌K-12株。酵母的实例包括酿酒酵母。动物细胞的实例包括L929、BALB/c3T3、C127、CHO、COS、Vero及Hela细胞。昆虫细胞的实例包括sf9。
可以使用适合上述每种宿主细胞的常规方法将表达载体导入宿主细胞中。具体而言，导入可使用磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、及利用脂类进行转基因(Lipofectamine、脂质体转染；Gibco-BRL)的方法完成。导入后，细胞在含有选择标记的常规培养基中进行培养，由此选择含有表达载体的转化子。
可以通过在适当的条件下(肽可以被表达的条件)培养转化细胞来生产本发明的肽。所获得的肽可根据标准生化纯化过程来进一步分离纯化。纯化过程包括盐析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。当本发明中的多肽如上所述同硫氧还蛋白、组氨酸标签、GST或其它类似物一起作为融合肽被表达时，可利用融合蛋白或标签的性质通过合适的纯化过程对肽进行分离纯化。
本发明提供了一种本发明中肽特异性结合的抗体。本发明中的抗体不限定其形式，可以是针对作为抗原的本发明中肽的多克隆或单克隆抗体。
如上所述，关于本发明中的抗体并没有什么限制，只要它与本发明的肽特异性结合即可。抗体的实例包括那些可特异性结合至由SEQID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的、可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别的肽上的抗体。可特异性结合至由SEQ IDNO6-9中任一项所示的氨基酸序列所组成的肽上的抗体是优选的，可特异性结合至由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽上的抗体是特别优选的。
在本领域中抗体的制备方法是众所周知的，本发明中的抗体可根据任何一种常规方法(Current protocols in Molecular BiologyeditAusubel等(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13，Antibodies；A laboratory Manual Lane，H，D.等，ed.，ColdSpring Harber Laboratory Press，New York 1989)来制备。
具体而言，本发明中的抗体可通过使用本发明的肽作为抗原来免疫兔子等非人类动物、按常规方法从被免疫动物的血清中回收抗体的方式来获得。在单克隆抗体的例子中，可通过使用本发明的肽免疫小鼠等非人类动物、将所获得的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合、以及从所获得的杂交瘤细胞中回收抗体的方式来获得(Current protocolsin Molecular Biologyedit Ausubel等(1987)Publish.John Wiley andSons.Section 11.4-11.11)。
当根据宿主使用不同的佐剂增强其免疫应答时，也可以生产出针对本发明中肽的抗体。佐剂的实例包括弗氏佐剂、氢氧化铝等矿物凝胶、溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳状剂、钥孔嘁血蓝蛋白及二硝基苯酚(dinitorophenol)等表面活性剂、BCG(卡介苗)或棒杆菌等人类佐剂等。
如上所述，可以识别本发明中肽的抗体及可以中和其活性的抗体可通过常规方法中免疫动物的方式来顺利制备。抗体可用于亲和层析、免疫诊断方法及其它类似方法中。可从免疫印迹、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫反应(ELISA)、荧光或发光试验以及其它类似方法中选择适当的免疫诊断方法。免疫诊断方法在对肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、黑色素瘤(尤其是恶性黑色素瘤)、透明细胞肉瘤等癌表达livin基因的癌症诊断中是有效的。
本发明提供了一种抗原呈递细胞，它可呈递本发明的肽与HLA-A24抗原的复合物。
如下文实施例中所示，已观察到可通过本发明的肽刺激作用可诱导CTL活性，这表明存在可呈递本发明的肽与HLA-A24抗原的复合物的抗原呈递细胞，并且诱导了可特异性识别上述抗原呈递细胞的CTL。等可呈递HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物的抗原呈递细胞，可有效应用于下文所述的细胞疗法(DC疗法)中。
本发明中的抗原呈递细胞包括任意能够呈递HLA-A24抗原与本发明中肽的复合物的细胞，尤其是那些将HLA-A24抗原与由SEQ IDNO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的、可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别的肽的复合物呈递到树突状细胞表面上的抗原呈递细胞。其中可将HLA-A24抗原与由SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列所组成的肽的复合物呈递到树突状细胞表面上的抗原呈递细胞是优选的，那些将由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽与HLA-A24抗原的复合物呈递到树突状细胞表面上的抗原呈递细胞是更优选的。
细胞疗法(DC疗法)中所用的抗原呈递细胞可以通过从癌症病人中分离具有抗原呈递能力的细胞、在体外使用本发明的肽冲击致敏该细胞、或者向细胞中导入本发明中的多聚核苷酸或含有该多聚核苷酸的表达载体、使细胞呈递来源于本发明中肽的癌抗原肽与HLA-A24抗原的复合物等方式来制备。“具有抗原呈递能力的细胞”并不限定于特定细胞，可以是能够在细胞表面表达可呈递本发明中肽的HLA-A24抗原的任何细胞；已知具有非常高的抗原呈递能力的树突状细胞是优选的。
此外，冲击致敏抗原呈递细胞的物质可以是本发明的肽，或者是编码本发明中肽的多聚核苷酸或含有该多聚核苷酸的表达载体。
本发明中的抗原呈递细胞可以通过例如，从癌症病人中分离具有抗原呈递能力的细胞、在体外用本发明的肽(譬如，由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的癌抗原肽)冲击致敏该细胞、从而产生HLA-A24抗原与本发明中肽的复合物的方式来制备(CancerImmunol.Immunother.，4682，1998，J.Immunol.，158p1796，1997，Cancer Res.，59p1184，1999)。当使用树突状细胞时，本发明中的抗原呈递细胞可以通过例如，利用Ficoll法从癌症病人的外周血中分离淋巴细胞、除去非粘附细胞、在存在GM-CSF与IL-4的条件下培养粘附细胞以诱导树突状细胞、并通过与本发明的肽共同培养来冲击致敏树突状细胞的方式来制备。
在本发明中的抗原呈递细胞是通过将编码本发明的肽的多聚核苷酸(譬如，编码由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的表位肽的多聚核苷酸)或含有该多聚核苷酸的表达载体导入上述具有抗原呈递能力的细胞之中来进行制备的例子中，若多聚核苷酸为DNA，可根据Cancer Res.，56p5672，1996或J.Immunol.，161p5607，1998或者其它类似文献中描述的方法来进行制备。根据J.Exp.Med.，184p465，1996或其它类似文献中的方法，也可使用RNA按照与使用DNA相似的方法来制备抗原呈递细胞。
本发明还提供了可识别本发明的肽与HLA-A24抗原的复合物的CTL。
如下文实施例中所示，已观察到本发明的肽的刺激作用可导致出现CTL诱导活性。这表明存在可呈递本发明的肽与HLA-A24抗原的复合物的抗原呈递细胞，并且诱导了可特异性识别上述抗原呈递细胞的CTL。可特异性识别HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物的CTL，可有效应用于下文所述的过继性免疫疗法中。
本发明中的CTL包括可特异性识别HLA-A24抗原与本发明中肽的复合物的任何CTL。具体的实例包括可特异性识别HLA-A24抗原与SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的、可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别的肽的复合物的CTL。可特异性识别HLA-A24抗原与SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列所组成的肽的复合物的CTL是优选的，可特异性识别HLA-A24抗原与SEQ ID NO8所示的氨基酸序列所组成的肽的复合物的CTL是更优选的。
在过继性免疫疗法中所用的CTL可通过从病人中分离外周血淋巴细胞、在体外使用本发明的肽(例如，由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的癌抗原肽)或编码本发明中肽的多聚核苷酸(例如，编码由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的表位肽的多聚核苷酸)或含有该核苷酸的表达载体刺激细胞的方式来制备(Journalof Experimental Medicine 1999，1901669)。
上述本发明的肽、表达载体、细胞抗原呈递细胞及CTL，如下文所详述，均可通过依照不同物质配制成适当形态，来用作CTL诱导物的活性成分——即，癌疫苗。
(1)以本发明的肽作为活性成分的癌疫苗本发明的肽具有CTL诱导活性，所诱导的CTL通过细胞毒活性或产生淋巴因子表现出抗癌活性。因此本发明的肽可以用作治疗或预防癌症的癌疫苗的活性成分。所以，本发明提供了以本发明的肽作为活性成分的癌疫苗(作为癌疫苗的药学组分)。当对HLA-A24阳性及livin阳性病人给药本发明中的癌疫苗时，肽(例如，由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的癌抗原肽)被呈递到呈递细胞的HLA-A24抗原上。然后，特异性识别呈递的HLA-A24抗原复合物的CTL可以增殖并破坏癌细胞，由此可治疗或预防癌症。本发明中的癌疫苗可用于预防或治疗同livn基因表达增高相伴发的癌症——例如，肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、黑色素瘤(尤其是恶性黑色素瘤)、透明细胞肉瘤等癌症。
在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，其包括对HLA-A24阳性及livin阳性病人给药有效剂量的本发明中的癌疫苗。
以本发明的肽作为活性成分的癌疫苗可以包含单个CTL表位(例如，由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的癌抗原肽)或者与其它肽相连接的表位肽作为活性成分(CTL表位、辅助表位等)。近来，已表明其中多个CTL表位(抗原肽)相连接的表位肽可有效诱导CTL。例如，已报道一种约30-mer的、来源于癌抗原蛋白PSA中HLA-A2-、-A3、-A11或B53限制性CTL表位相连接的表位肽，其可特异性针对每种CTL表位诱导CTL(Journal of Immunology1998，1613186-3194)。还报道了一种CTL表位与辅助表位相连接形成的表位肽，其可有效诱导CTL。当以这些形式给药表位肽时，所述的肽被整合至抗原呈递细胞；由细胞内降解所生成的每种抗原肽与HLA抗原结合形成复合物；复合物以高密度呈递至抗原呈递细胞表面；特异性识别这些复合物的CTL在体内有效增殖并破坏癌细胞。以这种方式，可以实现癌症治疗及预防。
以本发明的肽作为活性成分的癌疫苗可以与药学上接受的载体例如，适当的佐剂一起或者以颗粒的形式来给药，这样可有效建立细胞免疫。作为佐剂，文献(Clin.Microbiol.Rev.，7277-289，1994)中所述的那些以及其它类似的均可应用。具体实施例包括微生物来源的组分、细胞因子、植物来源的组分、海洋生物来源的组分、氢氧化铝等矿物凝胶、溶血卵磷脂及Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳状剂(乳状制剂)等表面活性剂以及其它类似物。脂质体制剂、有效成分结合在直径几μm珠子上的颗粒制剂，和有效成分附着在油脂上的制剂以及其它类似制剂也是可以考虑的。
给药可以通过例如，皮内、皮下、肌内或静脉内的方式来实现。尽管在配方中本发明中肽的剂量可根据例如，所治疗的疾病、病人的年龄与体重来进行适当调节，但通常的用量在0.0001mg-1000mg，优选地为0.001mg-1000mg，更优选地为0.1mg-10mg，每几天至每几个月给药一次这些剂量是优选的。
(2)以含有编码本发明中肽的多聚核苷酸的表达载体为活性成分的癌疫苗不仅是上述本发明的肽，含有编码本发明中肽的多聚核苷酸的表达载体也可以作为癌症治疗或预防中DNA疫苗的活性成分。因此，本发明提供了以含有编码本发明中肽的多聚核苷酸的表达载体为活性成分的癌疫苗(作为癌疫苗的药学组分)。在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，其包括对HLA-A24阳性及livin阳性病人给药有效剂量本发明中的DNA疫苗。
近来，已表明一种编码多个CTL表位(抗原肽)相连接或者CTL表位与辅助表位相连接形成的表位肽的多聚核苷酸在体内可有效诱导CTL。例如，已报道一种编码HBV来源的HLA-A2限制性抗原肽(6肽)、HLA-A11限制性抗原肽(3肽)及一种辅助表位相连接的表位肽的DNA(微基因)在体内可直接针对不同的表位有效诱导CTL(Journal of Immunology 1999，1623915-3925)。
因此，可以通过将编码本发明中表位肽的多聚核苷酸整合到适当的表达载体上的方式来获得癌疫苗的活性成分。
当把含有本发明中多聚核苷酸的表达载体作为癌疫苗(DNA疫苗)的活性成分来给药时，可利用下面的方法。
作为将本发明中多聚核苷酸转入细胞中的方法，包括使用病毒载体等方法在内的任何手段均是可应用的(Nikkei-Science，April，1994，20-45；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及它们所引用的参考文献)。
使用病毒载体方法的实例包括那些将本发明中DNA整合到逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或辛德毕斯病毒(Sindbis virus)等DNA或RNA病毒上、然后将其转入细胞的实例。其中，使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或牛痘病毒等方法是特别优选的。
其它方法的实例包括将表达质粒直接进行肌内注射(DNA疫苗接种)的方法、脂质体法、脂质体转染法、显微注射法、磷酸钙法及电穿孔法。DNA疫苗接种和脂质体法是特别有效的。
关于在实践中使用本发明中多聚核苷酸作为药剂的方法，例如将多聚核苷酸直接导入体内的体内方法，以及将DNA在体外导入从人体取出的特定细胞中、再将细胞再次导入体内的先体外后体内方法(Nikkei-Science，April，1994，20-45；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikkenn-Igaku-Zokan，12(15)，1994；以及它们所引用的参考文献)。体内方法是更优选的。
在体内方法的例子中，可根据要治疗的疾病及症状通过适当的途径来有效给药。例如，可通过静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌内途径或其它类似途径来给药。当通过体内方法进行给药时，可利用溶液等多种形式给药有效组分，并可在必要时配制成例如，以含有本发明中多聚核苷酸的表达载体作为活性成分的注射剂，需要时可以加入常用载体。至于含有包含本发明中多聚核苷酸的表达载体的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)脂质体)，可以配制成悬浮液、冷冻药物、离心浓缩的冷冻药物或其它类似形式。
尽管配方中包含多聚核苷酸的表达载体的含量可根据例如，所治疗的疾病、病人的年龄与体重来进行适当调节，但通常用量为0.0001mg-100mg、优选地为0.001mg-10mg的包含本发明中多聚核苷酸的表达载体每几天至每几个月给药一次。
当对癌症病人给药包含本发明中肽的上述表达载体时，与所述多聚核苷酸相对应的多肽在抗原呈递细胞中大量表达。此后，细胞内降解生成的癌抗原肽与HLA抗原形成复合物；然后复合物以高密度呈递至抗原呈递细胞表面；特异性识别所述复合物的CTL在体内有效增殖并破坏癌细胞。以这种方式，可以实现癌症治疗或预防。以含有本发明中多聚核苷酸的表达载体为活性成分的癌疫苗可用于预防或治疗同livn基因表达增高相伴发的癌症——例如，肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、黑色素瘤(尤其是恶性黑色素瘤)、透明细胞肉瘤等癌症。
(3)以本发明中抗原呈递细胞作为活性成分的癌疫苗本发明提供了以本发明中抗原呈递细胞作为活性成分的癌疫苗。
近来，已报道一种细胞疗法(DC疗法)，其包括从癌症病人外周血中分离淋巴细胞、从淋巴细胞诱导出树突状细胞、使用肽或其它类似物在体外冲击致敏树突状细胞、并将所获得的抗原呈递细胞通过皮下注射或其它类似方法再次导入病人体内(Cancer Immunol.Immunother.，4682，1998，J.Immunol.，158p1796，1997，CancerRes.，59p1184，1999，Cancer Res.，56p5672，1996，J.Immunol.，161p5607，1998，J.Exp.Med.，184p465，1996)。因此上述本发明中的抗原呈递细胞可用作细胞疗法中所用的癌疫苗的活性成分。
以本发明中抗原呈递细胞作为活性成分的癌疫苗优选地含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基等，以稳定维持抗原呈递细胞。可通过例如，静脉、皮下或皮内等方式给药。剂量与上述所引用的参考文献中描述的相似。
当上述癌疫苗再次导入病人体内时，在HLA-A24阳性及livin阳性病人体内可有效诱导特异性CTL，因此可实现癌症的治疗与预防。以本发明中抗原呈递细胞作为活性成分的癌疫苗可用于预防或治疗同livn基因表达增高相伴发的癌症——例如，肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、黑色素瘤(尤其是恶性黑色素瘤)、透明细胞肉瘤等癌症。
(4)以本发明中CTL作为活性组分的癌疫苗本发明提供了一种以本发明中CTL作为活性组分的癌疫苗(作为癌疫苗的药学组分)。如下文所述，本发明中的CTL可有效用于过继性免疫疗法中。
对于黑色素瘤，已在从病人中获取肿瘤浸润T细胞并在体外大量培养，再转回同一个病人体内的过继性免疫疗法中观察到疗效(J.Natl.Cancer Inst.，861159，1994)。此外，在小鼠黑色素瘤中，当使用癌抗原肽TRP-2在体外刺激脾细胞以扩增针对该癌抗原肽特异性的CTL、并对移植了黑色素瘤的小鼠给药CTL时，观察到转移受到抑制(J.Exp.Med.，18545，1997)。这是由于特异性识别抗原呈递细胞的HLA抗原与癌抗原肽的复合物的CTL在体外进行了扩增所致。因此，可以确信通过在体外使用本发明的肽、或者多聚核苷酸或表达载体去刺激来自病人的外周血淋巴细胞以增殖癌特异性CTL、并将该CTL转回病人体内的治疗方法是有效的。因此，本发明中的CTL可以被用作过继性免疫疗法中癌疫苗的活性成分。
以本发明中CTL作为活性成分的癌疫苗优选地含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基或其它类似物，以稳定维持CTL。可通过例如，静脉、皮下或皮内等方式给药。剂量与上述所引用的参考文献中描述的相似。
通过将该癌疫苗再次导入HLA-A24阳性及livin阳性病人体内，可增强病人体内CTL对癌细胞的细胞毒活性，并杀死癌细胞。通过这种方式来治疗癌症。以本发明中CTL作为活性成分的癌疫苗可用于预防或治疗同livn基因表达增高相伴发的癌症——例如，肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、黑色素瘤(尤其是恶性黑色素瘤)、透明细胞肉瘤等癌症。
本发明提供了包含本发明的抗体的诊断试剂。
通过使用包含本发明中抗体的诊断试剂可以进行癌症的免疫诊断。为了进行免疫诊断，对本发明中的抗体进行适当标记。可以使用标记抗体通过检测从怀疑患有癌症的患者中所获取样品(譬如，血液、肿瘤组织)中的抗原(livin)或抗原肽(livin来源的抗原肽)，来检测是否患有癌症。具体而言，免疫诊断可通过免疫印迹、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫反应(ELISA)、荧光或发光试验以及其它类似方法来实现。
本发明还提供了包含本发明的肽及HLA-A24抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
在癌症免疫疗法中，可以通过检查治疗开始前病人体内直接针对癌抗原(癌抗原肽)的CTL前体的频率或数量、或者检查治疗过程中病人体内针对癌抗原(癌抗原肽)的CTL前体的频率或数量的方式，来获取对癌抗原(癌抗原肽)具有高度应答的病人的选择、监测治疗效果、或评估治疗稳定性的重要指标。包含癌抗原肽及HLA-A24抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体及HLA五聚体，可用作检测针对抗原(抗原肽)的CTL、尤其是检测CTL的频率或数量的试剂。
在本文用法中，HLA四聚体指通过生物素化由HLA抗原α-链及β2微球蛋白与肽(抗原肽)相连接所获得的复合物(HLA单体)、并与抗生物素蛋白结合进行四聚体化所制备的四聚体(Science 2792103-2106(1998)；及Science 27494-96(1996))。
HLA单体是可用于上述HLA四聚体制备、可通过生物素化使HLA抗原α-链及β2微球蛋白与肽(抗原肽)相连接所形成的单体。
HLA二聚体是一种通过融合HLA抗原α-链与Ig(免疫球蛋白，例如，IgG1)、并将融合产物结合至β2微球蛋白与肽抗原肽上所制备的二聚体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906671-6675(1993))。结合至HLA二聚体上的抗原肽特异的CTL可通过例如，经标记的抗IgG1抗体与IgG1结合的方式来检测。
HLA五聚体是一种近来发展的技术，指其中包含HLA抗原与抗原肽的五个复合物分子通过卷曲-螺旋结构域聚合在一起形成的五聚体。由于HLA抗原-抗原肽复合物可以使用荧光或其它类似物来标记，所以可以象HLA四聚体那样，使用流式细胞仪或类似仪器进行分析(参见，http://www.proimmune.co.uk/)。
上述HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体可委托ProImmune或BD Biosciences等制造商合成。目前，HLA四聚体及其它类似由不同抗原肽所组成的多聚体均已商品化(Medical & Biological LaboratoriesCo.，Ltd.，等)。
本发明中HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体的实例包括含有由SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列所组成的、可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别的肽以及HLA-A24抗原的HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体。其中，HLA四聚体或者HLA五聚体是优选的，并且HLA四聚体是更优选的。具体而言，含有由SEQ IDNO6-9中任一项所示的氨基酸序列所组成的肽以及HLA-A24抗原的HLA四聚体及HLA五聚体是优选的，含有由SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列所组成的肽以及HLA-A24抗原的HLA四聚体及HLA五聚体是更加优选的。其中，HLA四聚体是最优选的。
优选地，HLA单体、HLA四聚体及HLA五聚体可使用荧光进行标记，从而可通过流式细胞仪、荧光显微镜以及其它类似的已知检测方式，轻易地挑选出或检测所结合的CTL。实施例包括使用藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻素叶绿素蛋白(peridinylchlorophyll protein PerCP)、别藻蓝蛋白(APC)或其它类似物标记的HLA单体、四聚体及二聚体。
作为本发明中HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体组分的HLA-A24抗原(HLA-A24抗原α-链)，在Cancer Res.，554248-4252(1995)与GenBank序列号M64740中所示的HLA-A2402已知碱基序列的基础上，通过PCR等常规方法可轻易进行克隆。
优选地，作为本发明中HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体组分的β2微球蛋白来源于人。基于GenBank序列号AB021288中所示的人β2微球蛋白已知碱基序列，通过PCR等常规方法可轻易克隆人β2微球蛋白。
HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体的制备方法在上述其各自的参考文献中均已公开；不过，关于HLA四聚体的制备将在下文中简要描述。
首先，使用HLA-A24α-链表达载体与β2微球蛋白表达载体转化能够表达蛋白的、大肠杆菌或者哺乳动物细胞等适合的宿主细胞，并进行表达。在本文中大肠杆菌(譬如，BL21)是优选的。然后将所获得的单体HLA-A24复合物与本发明的肽进行混合，形成可溶的HLA-肽复合物。使用BirA酶对所获得的HLA-肽复合物中HLA-A24α-链的C-末端进行生物素化。将生物素化的HLA-肽复合物与荧光标记的抗生物素蛋白以摩尔比4∶1进行混合，便形成HLA四聚体。优选地，在上述每个步骤均通过凝胶过滤或其它类似手段纯化所获得的蛋白。
上述HLA单体、二聚体、四聚体及五聚体均可用作有效检测对来源于livin的HLA-A24结合性癌抗原肽具有特异性的CTL的试剂。
本发明中的CTL检测试剂可用于下列目的，例如1)在开始治疗前与本发明中的癌抗原肽一起使用，用来检测针对本发明中癌抗原肽的CTL前体的频率或数量。在此过程中，可评估病人对癌抗原肽的应答。
2)在治疗期间与本发明中的癌抗原肽(癌疫苗)一起使用，用来检测病人体内CTL前体的频率或数量。在此过程中，检测治疗效果、评估治疗的稳定性、确认治疗的有利进展以及其它类似项目均可实施。
具体而言，可通过从受试病人体内分离含有CTL的生物样品(例如，PBMC)、用本发明中的HLA四聚体或其它类似物接触该生物样品、利用流式细胞仪或其它类似手段检测特异性针对结合至HLA四聚体上的本发明中肽的CTL的频率或数量等方式来检测CTL。
实施例将通过下述实施例进一步阐明本发明，但本发明无论在哪一方面均不受这些实施例的限制。
实施例1研究肽针对HLA-A*2402的结合亲和力基于livin氨基酸序列(NCBI数据库Entrez，AAG33622)合成了8个可能与HLA-A*2402(一种HLA-A24)结合的肽。每种肽具有与livin下列位置相对应的氨基酸序列。
47-55肽1Ala Trp Asp His Val Asp Gly Gln Ile(SEQ ID NO2)47-56肽2Ala Trp Asp His Val Asp Gly Gln Ile Leu(SEQ ID NO3)80-89肽3Ala Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu(SEQ ID NO4)83-91肽4Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu(SEQ ID NO5)140-148肽5Pro Trp Thr Glu His Ala Lys Trp Phe(SEQ ID NO6)146-154肽6Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu(SEQ ID NO7)146-155肽7Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu Leu(SEQ IDNO8)145-154肽8Ala Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu(SEQ IDNO9)这些来源于livin的肽以及来源于EB病毒的肽(Thr Tyr Gly ProVal Phe Met Ser Leu；SEQ ID NO60)通过F-moc法使用氨基酸合成仪进行合成。
这些肽针对HLA-A*2402的结合亲和力根据类似J.Immunol.1642565，2000中所述的方法来进行测定。于26℃温育RMA-S-A*2402细胞(J.Immunol.，1642574(2000))18小时，该细胞是通过将由HLA-A*2402与H-2Kb所组成的嵌合MHC基因，转入不表达MHC I类分子的小鼠淋巴瘤细胞系所获得的细胞系。用PBS溶液洗涤RMA-S-A*2402细胞，悬浮在含有3μl/mL的人β2微球蛋白以及100μl/mL每种肽的OPTI-MEM培养液(Invitrogen)中，于26℃温育3小时，再于37℃温育3小时。使用PBS溶液洗涤细胞，并用抗HLA-A24抗体于4℃处理30分钟。进一步地，使用PBS溶液洗涤细胞，并用PE标记的抗小鼠IgG抗体于4℃处理30分钟。清洗细胞，并悬浮在1ml含有1％福尔马林(用于固定)的PBS溶液中。使用流式细胞仪(FACScan，BD Bioscience)测量细胞，肽的结合亲和力通过平均荧光强度来获得。上述8种肽的结合亲和力如图1所示。
已报道可结合至HLA-A*2402上的EB病毒来源的肽(J.Immunol.1583325，1997)表现出很强的结合亲和力。结果表明所检测的8个肽中，肽5、6、7和8可顺利与HLA-A*2402结合。具体而言，肽7比阳性对照(EBV)表现出更高的结合亲和力。
实施例2利用livin来源的肽从人外周血单核细胞中诱导CTL根据与文献中所述的相同方法(J.Immunol.1691611，2002)，使用在实施例1中对HLA-A*2402表现出强烈结合亲和力的肽7(SEQID NO8)从外周血单核细胞中诱导CTL。在获得知情同意后，从一个患有肺癌的HLA-A24阳性病人中采集外周血，通过密度梯度离心法分离单核细胞并在AIM-V培养液(Invitrogen)中培养。培养24小时后，回收非粘附细胞并在含有100U/mL IL-2的AIM-V中进行培养。为了制备抗原呈递细胞，在含有100U/mL IL-4和1000U/mLGM-CSF的AIM-V培养液中培养粘附细胞5天，加入10μM的肽7之后，再培养1天。然后向培养物中加入10ng/mL TNF及1000U/mLIFN-α，并培养混合物。利用结合了抗CD8抗体的磁珠从非粘附细胞中分离CD8阳性T细胞，并与使用上述肽冲击致敏的抗原呈递细胞一起培养。
分离CD8阳性T细胞后剩下的非粘附细胞在含有1μg/mL PHA及100U/mL IL-2的AIM-V培养基中培养3天，然后在去除了PHA的培养基中培养4天，储藏用作第二或第三个肽刺激的抗原呈递细胞。已经受到肽刺激的CD8阳性T细胞，在第一个肽刺激后7天及14天时，通过加入储藏的使用肽7冲击致敏2小时及X射线辐射(5000rad)的抗原呈递细胞来进行第二和第三个肽刺激。第三次刺激一周后，通过51Cr释放实验测定T细胞的细胞毒活性。下述细胞被用作靶细胞livin阳性且HLA-A*2402阴性的LNY-1细胞(来源于肺癌的细胞系)；通过将HLA-A*2402基因稳定导入LNY-1细胞获得的LNY-1A24细胞；以及对NK细胞敏感、livin阴性且HLA-A*2402阴性的来源于慢性粒细胞白血病的细胞系K562(ATCC菌株号CCL-243)。靶细胞使用100μCi51Cr标记1小时。向5×103个靶细胞中加入10倍的效应细胞(用肽刺激的T细胞)。培养4小时后，测量细胞毒活性。在两个受试病人中所获得的结果如图2和图3所示。
使用肽7刺激的T细胞破坏livin阳性且HLA-A*2402阳性的LNY-1A24细胞，但不破坏livin阳性且HLA-A*2402阴性的LNY-1细胞或者livin阴性且HLA-A*2402阴性的K562。来源于livin的肽7所诱导的CTL，特异性地破坏HLA-A*2402限制性的表达livin的细胞的这个事实，表明肽7是一种HLA-A24结合性癌抗原肽。
工业应用根据本发明，提供了一种HLA-A24结合性癌抗原肽、一种编码上述肽的多聚核苷酸、一种包含肽或多聚核苷酸及其它类似物的CTL诱导物。本发明中的诱导物可用作癌疫苗。本发明中的癌疫苗可适用于多种HLA-A24阳性的癌症病人。
以独立文本列出的序列SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO7中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO9中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO10中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO11中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO13中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO14中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO19中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO20中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO21中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO22中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO24中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO25中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO26中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO27中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO28中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO29中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO30中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO31中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO32中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO33中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO34中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO35中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO36中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO37中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO38中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO39中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO40中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO41中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO42中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO43中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO44中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO45中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO46中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO47中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO48中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO49中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO50中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO51中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO52中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO53中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO54中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO55中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO56中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO57中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO58中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO59中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO60中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO61中所示的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO62中所示的氨基酸序列是合成肽。
在SEQ ID NO63所示的氨基酸序列中，第二位的氨基酸残基Xaa为苯丙氨酸残基(Phe)、酪氨酸残基(Tyr)、甲硫氨酸残基(Met)或色氨酸残基(Trp)，第十位的氨基酸残基Xaa为苯丙氨酸残基(Phe)、亮氨酸残基(Leu)、异亮氨酸残基(Ile)、色氨酸残基(Trp)或甲硫氨酸残基(Met)。
序列表<110>Sato，NoriyukiSumitomo Pharmaceuticals Co.，Ltd.
<120>来源于Livin的HLA-A24结合性癌抗原肽<130>533726<150>JP2003-273236<151>2003-07-11<160>63<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>280<212>PRT<213>智人<400>1Met Gly Pro Lys Asp Ser Ala Lys Cys Leu His Arg Gly Pro Gln Pro1 5 10 15Ser His Trp Ala Ala Gly Asp Gly Pro Thr Gln Glu Arg Cys Gly Pro20 25 30Arg Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu Asp Thr Cys Arg Ala Trp35 40 45Asp His Val Asp Gly Gln Ile Leu Gly Gln Leu Arg Pro Leu Thr Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala65 70 75 80
Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp85 90 95Trp Pro Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu Leu Ala Ala Ala Gly100 105 110Phe Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr115 120 125Gly Gly Leu Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Pro Trp Thr Glu His130 135 140Ala Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg145 150 155 160Asp Phe Val His Ser Val Gln Glu Thr His Ser Gln Leu Leu Gly Ser165 170 175Trp Asp Pro Trp Glu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Pro Val Ala Pro Ser180 185 190Val Pro Ala Ser Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Val195 200 205Gln Ser Glu Ser Ala Gln Glu Pro Gly Ala Arg Asp Val Glu Ala Gln210 215 220Leu Arg Arg Leu Gln Glu Glu Arg Thr Cys Lys Val Cys Leu Asp Arg225 230 235 240Ala Val Ser Ile Val Phe Val Pro Cys Gly His Leu Val Cys Ala Glu245 250 255
Cys Ala Pro Gly Leu Gln Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Val Arg260 265 270Ser Arg Val Arg Thr Phe Leu Ser275 280<210>2<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>2Ala Trp Asp His Val Asp Gly Gln Ile1 5<210>3<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>3Ala Trp Asp His Val Asp Gly Gln Ile Leu1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>人工的
<220>
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<223>合成肽<400>5Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>6Pro Trp Thr Glu His Ala Lys Trp Phe1 5<210>7<211>9
<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成肽<400>12
Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成肽
<400>15Gly Ala Arg Asp Val Glu Ala Gln Leu1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
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<220>
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<213>人工的<220>
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1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成肽
<400>29Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成肽<400>31Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Pro Arg1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>32Ala Pro Gly Leu Gln Leu Cys Pro Ile1 5<210>33<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
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<220>
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<223>合成肽<400>39Ser Ile Val Phe Val Pro Cys Gly His Leu1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成肽<400>43
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<223>合成肽<400>44His Val Asp Gly Gln Ile Leu Gly Gln Leu1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>45Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu Leu1 5 10<210>46<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽
<400>46Gly Pro Arg Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>47Leu Val Cys Ala Glu Cys Ala Pro Gly Leu1 5 10<210>48<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>48Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu Ala Ser Phe1 5 10<210>49<211>10<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成肽<400>49Arg Ala Trp Asp His Val Asp Gly Gln Ile1 5 10<210>50<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>50Ala Pro Val Arg Ser Arg Val Arg Thr Phe1 5 10<210>51<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>51Phe Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe1 5 10<210>52<211>10<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>52Cys Leu Asp Arg Ala Val Ser Ile Val Phe1 5 10<210>53<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>53His Ala Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gln Phe1 5 10<210>54<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>54Asp Pro Trp Thr Glu His Ala Lys Trp Phe1 5 10
<210>55<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>55Gly Ala Thr Leu Ser Arg Gly Pro Ala Phe1 5 10<210>56<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>56Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe1 5 10<210>57<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>57Lys Val Cys Leu Asp Arg Ala Val Ser Ile
1 5 10<210>58<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>58Cys Ala Pro Gly Leu Gln Leu Cys Pro Ile1 5 10<210>59<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>59Arg Asp Val Glu Ala Gln Leu Arg Arg Leu1 5 10<210>60<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽
<400>60Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu1 5<210>61<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>61Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15Ala Ser His Leu Glu20<210>62<211>16<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>62Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>63<211>10<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa is Phe，Tyr，Met or Trp.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa is Phe，Leu，Ile，Trp or Met.
<400>63Lys Xaa Phe Pro Ser Cys Gln Phe Leu Xaa1 5 10
权利要求
1.一种肽，其由SEQ ID NO1所示的livin氨基酸序列中8-11个连续的氨基酸所组成、可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
2.权利要求1所述的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的肽，其包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列。
4.一段9-11个氨基酸的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列，且其可与HLA-A24抗原结合并被CTL所识别。
5.权利要求4所述的肽，其包含SEQ ID NO2-59中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
6.权利要求5所述的肽，其包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的第二位和/或C-末端氨基酸残基被另一氨基酸残基替代后所得的氨基酸序列，其中用于替代第二位氨基酸残基的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；用于替代C-末端氨基酸残基的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
7.表位肽，其包含权利要求1至6中任一项所述的肽。
8.肽二聚体，其是由权利要求1至7中任一项所示的肽中的含有半胱氨酸残基的肽的单体通过二硫键相结合形成的。
9.权利要求8所述的肽二聚体，其是含有SEQ ID NO7-9中任一项所示的氨基酸序列的肽单体通过二硫键相结合形成的肽二聚体。
10.编码权利要求1至7中任一项所述的肽的多聚核苷酸。
11.含有权利要求10所述多聚核苷酸的表达载体。
12.含有权利要求11所述的表达载体的细胞。
13.用于生产上述权利要求1至9中任一项所述的肽的方法，其特征在于，在肽可表达的条件下培养权利要求12中的细胞。
14.抗体，其可与权利要求1至9中任一项所述的肽特异结合。
15.抗原呈递细胞，其可呈递权利要求1至9中任一项所述的肽与HLA-A24抗原的复合物。
16.权利要求15所述的抗原呈递细胞，其可呈递含有SEQ IDNO6-9中任一项所示的氨基酸序列的肽与HLA-A24抗原的复合物。
17.CTL，其识别权利要求1至9中任一项所述的肽与HLA-A24抗原的复合物。
18.权利要求17所述的CTL，其识别包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的肽与HLA-A24抗原的复合物。
19.药用组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的肽、权利要求11所述的表达载体、权利要求12所述的细胞、权利要求15或16所述的抗原呈递细胞、或者权利要求17或18所述的CTL、以及药学上可接受的载体。
20.权利要求19所述的药用组合物，其用作CTL诱导物。
21.权利要求19所述的药用组合物，其用作癌疫苗。
22.癌症诊断试剂，其包括权利要求14所述的抗体。
23.HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体，其包含权利要求1至9中任一项所述的肽和HLA-A24抗原。
24.权利要求23所述的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体，其包含SEQ ID NO6-9中任一项所示的氨基酸序列的肽和HLA-A24抗原。
25.用于检测特异性作用于来源于livin的HLA-A24结合性癌抗原肽的CTL的试剂，该试剂含有作为其成分的权利要求23或24所述的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
26.权利要求25所述的试剂，其用于癌疫苗效果的评估。
全文摘要
本发明提供由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中8－11个连续的氨基酸所组成的部分肽段，其可与HLA－A24抗原结合并被细胞毒性T细胞(CTL)所识别。本发明还提供编码该肽的多聚核苷酸、以及包含该肽或者该多聚核苷酸的癌疫苗。
文档编号A61K35/76GK1849395SQ200480026340
公开日2006年10月18日 申请日期2004年7月7日 优先权日2003年7月11日
发明者佐藤升志, 乌越俊彦, 针生宽之, 广桥良彦 申请人:大日本住友制药株式会社, 佐藤升志