专利名称：用于诊断和治疗异常细胞增殖的钴胺素衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在多细胞生物体内成像并快速摧毁不良增殖的细胞的方法。
背景技术：
异常的细胞增殖，尤其是过度增殖，是许多疾病的起源，最严重的是癌症。仅在美国就有约150万人被诊断为癌症且每年有50万人因此死亡。对癌症的抵抗已有些许成功，但还有许多障碍。抗癌药的严重副作用和耐药子代癌细胞的发育是主要的问题，同样是肿瘤及转移的最早且精确的定位。
过度增殖的细胞，例如许多癌细胞，依赖于营养物供应的增加、生长因子、能量和维生素。使用维生素供给途径，其是细胞生长所必须的并时常供应短缺，就可能使药物被运送到这些不必要的细胞中。
钴胺素(Cbl)，也就是已知的维生素B12并作为氰基-钴胺素(CN-Cbl)、羟基-钴胺素(HO-Cbl)或水合-钴胺素(H2O-Cbl)存在，是生命所必须的，并且其在体内的浓度非常低。高等生物体包括人在内不得不从其食物中获取维生素。钴胺素的生物合成限于一些原核生物内，例如厌氧菌。钴胺素对于神经系统的固有功能很重要并且是碳水化合物正确代谢所必需的。对于甲基-钴胺素(Me-Cbl)，其作用是作为蛋氨酸合酶的辅助因子。对于5′-脱氧腺苷基-钴胺素(Ado-Cbl)，其在甲基丙二酰辅酶A重排成琥珀酰-CoA中与甲基丙二酰辅酶A变位酶作用。钴胺素缺乏能导致恶性贫血。钴胺素还涉及核苷酸还原转化为脱氧核苷酸以生成DNA。
在哺乳动物中，多数钴胺素的细胞摄取都通过血清转运蛋白和细胞膜受体的调节。血浆中有两类钴胺素结合蛋白非糖基化蛋白钴胺传递蛋白II(TCII)和糖基化蛋白钴胺传递蛋白I和III(TCI和TCIII)，也称为R-结合蛋白或结合咕啉(haptocorrin)。TCI和TCIII是免疫可交叉反应的并仅在其碳水化合物组成中有区别。TCI是循环中发现主要的R-结合剂。出于简单性的原因，当指R-结合蛋白TCI和TCIII时，将使用术语TCI。两种类型的转运蛋白(载体)TCI和TCII在哺乳动物的血液中循环，其被钴胺素部分饱和(全)或部分不饱和的(apo)。较少载体的钴胺素摄取系统，其在正常细胞中的效率相当低，也存在于哺乳动物细胞中(参见Sennet，C.和Rosenberg，L.E.，Ann.Rev.Biochem.50，1053-86(1981))。
TCII在通过介导内吞作用的受体而将血浆钴胺素输送到所有的代谢活性细胞中发挥了作用。已知瘤形成初期中的细胞加速增殖必然增加通过介导内吞作用摄取的受体而从循环中载入TCII的钴胺素的消耗。上调TCII受体的数量已经在恶性细胞系中被广泛地证明能适合增加胸苷的代谢需求和甲硫氨酸生成、DNA合成的甲基化反应以及通过线粒体代谢的细胞能量学。
一般的TCII受体存在于所有的组织中，而第二个和更多的器官特异性TCII受体，称为megalin，在肾近曲小管和一些其它的吸收性上皮中大量表达。内吞作用的细胞内摄作用完成后，TCII就在溶酶体中降解，游离的钴胺素转移到细胞质中和核膜内部，在其中转化为Me-Cbl和Ado-Cbl。这两个形式能用作维生素B12的活性辅酶。TCII的基本作用能通过以下观察而被很好地确定TCII的遗传先天缺乏能导致巨红细胞性贫血、有害的神经障碍和死亡，如果不用过量钴胺素处理的话。
几乎所有的细胞都能生成TCII。许多细胞例如肝细胞、成纤维细胞、神经细胞、肠细胞和巨噬细胞能合成增加量的TCII。假设血管内皮是TCII的原始来源。有约20-30％的循环钴胺素结合到TCII上作为全-TCII。这是保证所有组织中谷氨酸细胞内摄作用的代谢有效形式(参见Rothenberg，E.etal.，inChemistry and Biochemistry ofB12，ed.R.Banerjee，New York，NY，1999，第441-473页)。
TCI存在与血和血浆以及大部分外分泌的分泌物和其它液体中。它主要在前肠组织、胃粘膜、唾液和泪腺以及内耳的分泌上皮中产生。TCI，不同于TCII，似乎不能输送其主要由细胞摄取的钴胺素，其在血中具有较长的半衰期并由此在任何给定的时刻都保持大于75％的循环钴胺素(和咕啉)。几乎所有的TCI都以全-TCI而循环。其作还不完全清楚。已有建议认为其功能是通过防止供给微生物所有类别的钴胺素和咕啉而作为抑菌剂。它还可以稳定腺苷-钴胺素并对保护其不被光解。与TCI相反，其中TCI在循环中的浓度比TCII高，TCII的水平能通过响应引入的谷氨酸重新合成apo-TCII而被快速提高。TCI的生成相当缓慢并不能响应于任何的触发影响而被实质刺激(参见Alpers，D.和Russell，G.，在Chemistry and Biochemistry of B12，supra，第411-441页)。
直到目前，哺乳细胞中的较少载体钴胺素摄取系统已经不被认为是向过度增殖的细胞提供钴胺素衍生物的另一个途径。无可置辩的是，通过良性哺乳细胞摄取钴胺素的重要生理学机制需要载体TCII和TCI(和消化道的内因子)。然而，体内和体外数据显示，游离的钴胺素还能穿过质膜而不累及载体蛋白。吸收游离钴胺素的其它能力的直接证据来自对于先天并完全缺乏TCII的儿童的研究，在这种儿童中胃肠外给予游离的钴胺素能导致细胞内钴胺素缺乏的临床和化学体征的显著减轻(参见Hall，C.E.etal.，Blood，53，251-263(1979))。体外研究显示，在海拉细胞和成纤维细胞中摄取游离的钴胺素。在海拉细胞中，游离钴胺素的摄取为1％到2％，参见(seen for)TCII-结合的钴胺素。在人成纤维细胞中，在两小时间隔内积聚了约20％的游离钴胺素，以TCII-结合的维生素形式被注意到。人成纤维细胞中的游离维生素摄取系统已经由Berliner和Rosenberg作了一些详细研究(Berliner，N.and Rosenberg，L.E.，Metabolism，30，230-236(1981))。游离CN-[57Co]-Cbl的摄取已经被建立，作为一个双相系统最初的成分摄取是迅速、饱和的并通过过量的未标记CN-Cbl和OH-Cbl而被特定抑制，且在30分钟内完成。第二个成分摄取是缓慢的，与时间呈线性并不被过量的未标记钴胺素所抑制，而且甚至在8小时后都不是稳定水平，这建议了非特异过程的特征性属性。摄取的最初模式具有介导较高特异性膜穿越的蛋白质的性质；它对巯基试剂敏感并通过环己酰亚胺而被显著抑制(Sennet，C.和Rosenberg，L.E.，Ann.Rev.Biochem.50，1053-86(1981))。这些性质与蛋白介导、促进哺乳动物游离钴胺素摄取的系统的存在相一致。
已经很好地确定了许多细菌和所有的真核原生生物是维生素B12营养缺陷的并能以比哺乳动物内因子，TCI和TCII，高的结合亲合力与它结合。细菌和原生动物的B12-结合蛋白是较少载体作用的细胞表面蛋白，其能以较高的结合亲合力结合到各类咕啉上(包括真钴胺素)。因此，在整个身体图像的内容内检测细菌感染，然后施用放射性标记的钴胺素衍生物，是并不令人惊奇的(Collins，D.A.等，MayoClin.Proc.75，568-580(2000))。研制哺乳动物细胞的过度增殖形式可以充分地使由已经存在的较少载体钴胺素摄取系统的更有效形式的多步致癌进行研制成为必须。
很多方法已经被公开并获取专利，其使用钴胺素作为各种生物学活性剂包括放射性金属同位素在内的载体(参见Collins，D.A.，美国专利申请号2003/0144198)。当使用放射性标记的钴胺素衍生物时，从动物和人中获得的结果显示了标记的肿瘤组织，而且还有在健康组织例如肾和肝中放射性的浓集。因此，成像和放射治疗绝不是最理想的。对一些身体健康部分的主要损伤的潜在性限制了目前为止记载的应用。
显然需要以高于正常细胞的浓度将诊断和治疗性钴胺素衍生物给予到迅速增殖的细胞的化合物、组合物和方法。本发明的目的是提供鉴别、合成、特征化和以对异常高增殖细胞的较高特异性而施用钴胺素衍生物，同时避免耐药细胞子代发展的新方法。
发明概述本发明基于以下发现与钴胺素本身相反，没有或较少结合到转运蛋白钴胺传递蛋白II(TCII)上的钴胺素衍生物，如果施用正确，那么在血和良性器官例如肾和肝中就具有与在肿瘤组织中的积聚速率相比较低的积聚速率，并能从血中更迅速地清除。通过选择作为维生素B12替代物的钴胺素衍生物，能在肿瘤组织中很好地降低形成耐药子代的危险性。
本发明涉及钴胺素衍生物，所述钴胺素衍生物(a)对钴胺传递蛋白II没有结合亲合力或具有低的结合亲合力，以及(b)保留作为维生素B12替代物的活性。
特别的是，本发明涉及钴胺素衍生物，其中(a)在结合试验中，当与没有改性的钴胺素的结合亲合力比较时，对钴胺传递蛋白II具有低于20％，优选低于5％的结合亲合力，以及
(b)在生长测定中保持大于2％的作为维生素B12替代物的活性。
对TCII有较低结合亲合力或没有结合亲合力的本发明化合物的实例是载有治疗剂和/或诊断剂例如放射性金属的特定钴胺素衍生物。本发明的化合物基于以下试验的结果而被选择使用纯化的TCII进行的结合试验，和使用德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)作为测试微生物的生长测定。
本发明还涉及诊断哺乳动物中肿瘤性疾病或微生物感染的方法，包括(a)给疑似遭受肿瘤性疾病或感染的哺乳动物供给不含维生素B12的饮食一段时间，和(b)随后供给载有诊断剂的本发明的钴胺素衍生物。
本发明同样涉及治疗患有肿瘤性疾病或微生物感染的哺乳动物的方法，包括(a)给需要治疗的哺乳动物供给不含维生素B12的饮食一段时间，和(b)随后供给载有治疗剂的本发明钴胺素衍生物。
本发明还涉及根据本发明的钴胺素衍生物在诊断肿瘤性疾病或微生物感染的方法中或在治疗患有肿瘤性疾病或微生物感染的哺乳动物的方法中的用途。
本发明还涉及含有本发明钴胺素衍生物的药物组合物，特别是适于诊断用的药物组合物和适于治疗用的药物组合物，以及这种药物组合物分别在诊断方法和治疗性治疗方法中的用途。
本发明还涉及制备用在根据本发明的诊断和治疗性治疗中的化合物的中间体，尤其是被螯合剂取代结合放射性金属，但没有金属或非放射性金属结合到螯合剂上的化合物。
根据本发明的钴胺素衍生物对于攻击性、发展迅速的肿瘤性疾病例如癌症的诊断和/或治疗和/或病原微生物的局部感染的诊断和/或治疗具有特别高的价值。
附图简述
图1是说明了在凝胶移位检测中，放射性标记的实施例11的氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-OEt，TCII-非结合剂，与转运蛋白间的相互作用的图。t＝时间，cpm＝每分钟计数。
A)在SuperdexTM75柱上对被放射标记的衍生物进行的凝胶过滤分析(峰洗脱物在1.5kDa)B)对混有TCI的衍生物进行的凝胶过滤分析(峰从1.5kDa移动到44kDa)C)对混有TCII的衍生物进行的凝胶过滤分析(峰洗脱物在1.5kDa，这表明氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-OEt基本上是TCII-非结合剂)图2是说明了在凝胶移位检测中，放射性标记的实施例5的氰基钴胺素-b-丁基-PAPAcet，TCII-结合剂，与转运蛋白间的相互作用的图。t＝时间，cpm＝每分钟计数。
A)在SuperdexTM75柱上对被放射标记的衍生物进行的凝胶过滤分析(峰洗脱物在1.5kDa)B)对混有TCI的衍生物进行的凝胶过滤分析(峰从1.5kDa移动到44kDa)C)对混有TCII的衍生物进行的凝胶过滤分析(峰从1.5kDa移动到60kDa，这表明氰基钴胺素-b-丁基-PAPAcet确实与TCII进行了结合)图3、4、5和6说明组织分布的条形图y-轴每克组织被注入放射性的百分比x-轴器官1)血液，2)心脏，3)脾，4)肾，5)胃，6)肠，7)肝，8)肌肉，9)骨，10)肿瘤图3在饲喂正常食物的小鼠中静脉注射放射性氰基钴胺素(57Co-CN-Cbl)后的组织分布。
图4在饲喂缺乏维生素B12的食物的小鼠中静脉注射放射性氰基钴胺素(57Co-CN-Cbl)后的组织分布。
图5在饲喂正常食物的小鼠中静脉注射放射性氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-OEt(实施例11)后的组织分布。
图6在饲喂缺乏维生素B12的食物的小鼠中静脉注射放射性氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-OEt(实施例11)后的组织分布。
发明详述对钴胺素载体蛋白(或转运蛋白)没有或有非常低结合亲合力的钴胺素衍生物，当用于被提供维生素B12饮食的哺乳动物中时，能很好地降低在血液和重要器官例如肾和肝中的积聚，而同时在过度增殖的细胞中保持较高的摄取率，这样，便能更精确地诊断和治疗肿瘤性疾病和微生物的局部感染。
对TCII有较低结合亲合力并保持维生素B12活性的本发明化合物是例如式(I)的化合物 其中Rb、Rc、Rd和Re彼此独立地为间隔基-螯合剂基团、抗生素或抗增殖的治疗剂、具有4到20个碳原子有空间要求的有机基团或氢；
RR是间隔基-螯合剂基团或抗生素或抗增殖的治疗剂，其每一个均通过连接基团Z连接，或氢；条件是，残基Rb、Rc、Rd、Re和RR中至少三个是氢，且残基Rb、Rc、Rd和Re中至少一个不是氢；X是单齿配体；以及中央的钴(Co)原子任选是放射性同位素的形式。
在特别的实施方案中，Re是氢。
单齿配体X是例如氰基；卤素，例如氟、氯、溴或碘、氰氧基、异氰酸根合、硫氰酸根合或异硫氰酸根合；烷基，直链或支链并包含1到25个碳原子，优选1到4个碳原子，例如是甲基、乙基、正丙基、正丁基或异丁基，或还有正己基或正癸基，并任选被羟基、甲氧基或氨基取代，例如是羟基甲基、甲氧基甲基、氨基甲基、羟基乙基或甲氧基乙基；腈R-CN，异腈R-NC，羧酸根合R-COO-或硫醇根合R-S-，其中R是烷基，直链或支链并含有1到15个碳原子，优选1到6个碳原子，或芳基，例如苯基或萘基，例如乙腈、丙腈、苄腈、甲胩、苯胩、乙酸酯、丙酸酯、苯甲酸酯、甲基硫醇盐、乙基硫醇盐、正己基硫醇盐或硫酚盐；亚磷酸酯(RO)3P，其中取代基R是相同或不同的并表示包含1到6个碳原子的烷基或芳基，例如任选被取代的苯基或萘基，例如三甲基亚磷酸酯、甲基二苯基亚磷酸酯、三苯基亚磷酸酯或三邻甲苯基亚磷酸酯；羟基或水合基团；或5′-脱氧腺苷基团或相关的核苷。
优选的是，X是氰基、甲基、羟基、水合基团或5′-脱氧腺苷基团。最优选氰基。
作为取代基Rb、Rc、Rd、Re或RR的间隔基-螯合剂基团是用于通过间隔基将金属原子连接到钴胺素的NH或O官能团上的螯合剂，并任选载有金属原子，特别是放射性金属原子。
其中间隔基-螯合剂基团不载有金属原子的式(I)化合物是用于制备用在根据本发明诊断和/或治疗性治疗方法中的化合物的中间体。
作为取代基Rb、Rc、Rd、Re或RR的抗生素或抗增殖治疗剂是选自氨基糖苷类抗生素例如庆大霉素、四环素，抗代谢物例如硒蛋氨酸，大环内酯类例如红霉素和甲氧苄啶的抗生素，或是选自抗代谢物例如5-氟尿嘧啶，烷化剂例如奥沙利铂、达卡巴嗪、环磷酰胺或卡铂，细胞周期抑制剂例如长春碱或多西紫杉醇，DNA断裂剂(拓补异构酶抑制剂、插入剂、链断裂剂)例如多柔比星、博莱霉素或托泊替康的抗增殖剂，干扰信号转导途径的化合物例如半胱天冬酶活性修饰剂、细胞死亡受体的激动剂或拮抗剂，和核酸酶、磷酸酶和激酶的修饰剂例如甲磺酸伊马替尼、地塞米松、豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯、环孢素A、槲皮素或他莫昔芬，将与钴胺素的NH或O官能团直接相连或通过间隔基共价连接。
间隔基是2到10个碳原子，优选2到6个碳原子，例如2到5个碳原子的脂族链，其中一个或两个碳原子可以被氮和/或氧原子替代，脂族链可以被羟基、氧代基或氨基取代。特别的是，两个相邻的碳原子可以被酰胺官能团-NH-CO-或酯基-O-CO-替代。
连接钴胺素的NH或O官能团与螯合剂的特别间隔基是亚乙基、亚丙基、亚丁基或亚戊基，或是其中一个碳被氧或氮替代的这样的基团，或是其中一个碳原子被氧或氮替代且相邻碳原子被氧代基取代的这样的基团。
螯合剂是具有两个、三个或多个供电子原子的化合物，其中原子选自氮、氧和硫，其具有能结合金属原子的间距。特别的螯合剂是三齿螯合剂，其具有三个包含N、O和/或S供电子原子的金属结合位点，彼此间的间距能允许结合金属原子。作为供电子原子的氮原子是例如脂族胺、芳族胺或含氮芳香杂环的部分。作为供电子原子的氧原子是例如醇、醚、酯或羧基官能团。作为供电子原子的硫原子是例如硫醚或硫醇。供体可以通过例如脂肪碳链或包含酰胺键和/或醚官能团的链连接，并可以是氨基酸衍生物、聚醚等。
优选的螯合剂是式(II)至(IX)的螯合剂。羧基可以作为酯而存在，其断裂，伴有与金属原子形成络合物以生成配位羧酸根合基团。在这种酯化螯合剂中，酯可以是烷基酯，其烷基是直链或支链并包含1到25个碳原子，任选1到5个碳原子被氮或氧替代，或者一个或两个碳原子被硫或磷替代，并且其任选被苯基、吡啶基、羟基、卤素、氰基、氧代基或氨基取代。酯也可以是芳基或杂芳基酯，其中芳基或杂芳基具有3到10个碳原子和0、1或2个氧，0、1、2或3个氮或0或1个硫原子。这种酯残基可以适宜被取代以便使它们在特定反应条件下能断裂，例如所记载的关于通常用作羧酸保护基的酯的条件，参见Green，T.W.，和Wuts，P.G.M.，有机合成中的保护基，Wiley1999。
酯化螯合剂，例如被甲基、乙基或氰基乙基酯化的酯化螯合剂，也包含在优选的螯合剂的定义内。
放射性金属被认为是放射性同位素例如94mTc、99mTc、188Re、186Re、111In、90Y、64Cu、67Cu和177Lu，特别是99mTc、188Re、186Re和111In。
放射性同位素Co被认为是57Co和60Co。
具有4到20个碳原子有空间要求的有机基团是例如烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，其任选被羟基、烷氧基、氧、氨基、羧基、氨基甲酰基或烷氧羰基取代。芳基的实例是苯基、甲基苯基、二甲基苯基、羟基苯基或萘基。杂芳基的实例是吡啶基、吡咯基、咪唑基或苯并咪唑基。在烷基链中，碳原子可以被氮或氧原子替代。例如，在烷基链中，一个碳原子可以被氮(或氧)原子替代，并且相邻碳原子被氧代基取代，由此表示酰胺(或酯官能团)。有空间要求的有机基团的特别实例是异丁基、叔丁基、叔戊基、邻甲苯基、邻甲基苄基或2，6-二甲基苄基。
连接RR与间隔基-螯合剂基团或抗生素或抗增殖治疗剂的连接基团Z是键或选自以下的连接基团磷酸酯、膦酸酯、羧酸酯或1到10个碳原子的亚烷基以及它们的组合。这种连接基团连接了间隔基-螯合剂基团或任选包含如前所定义间隔基的治疗剂与钴胺素的氧原子。
在RR位被衍生化而其中Rb、Rc、Rd和Re都为氢的化合物通过TC得以验证，并且仍然有酶活性，因此被排除在本发明的范围内。
对本化合物的选择基于的是以下标准(a)当与(未修饰的)钴胺素相比，对TCII没有或有非常低的结合亲合力，例如小于20％，特别是小于10％，优选小于5％，更优选小于2％的结合亲合力；以及(b)在使用维生素B12依赖菌或哺乳动物细胞系的生长试验中，与(未修饰的)钴胺素的维生素B12活性相比，有作为维生素B12替代物的活性，例如大于2％的活性，特别是大于10％的活性，优选大于20％的活性。
对于钴胺素(Cbl)衍生物对TCII的结合亲合力试验来说，体外试验用具有获自兔血的部分纯化的TCII下进行。由大肠杆菌表达系统产生的重组TCII也能被用作底物。
本发明的钴胺素衍生物必须保持其作为维生素B12替代物的功能。结果，导致具有高增殖率细胞的耐药发展的危险性就将被大大降低。在所有的可能性下，能较长时间摄取对TCII有较低或没有结合亲合力的钴胺素衍生物的突变细胞将失去其母体细胞达到较高的增殖率的优势，这是由于高效的不依赖于TCII的维生素B12摄取机制。
对于钴胺素衍生物的维生素B12活性测定来说，通过使用德氏乳杆菌，国际推荐的氰基钴胺素(CN-Cbl)检测菌种，来进行实验，向不含氰基钴胺素的测定培养基中补充氰基钴胺素能导致氰基钴胺素-营养缺乏菌株的生长反应，这能通过定量固体扩散盘试验来测定。该试验用于确定钴胺素衍生物能替代氰基钴胺素作为生命支持催化剂的程度(％)。
本发明涉及在哺乳动物中诊断和治疗肿瘤性疾病和微生物局部感染的方法，其包含(a)给哺乳动物供给不含维生素B12的饮食一段时间，(b)随后供给载有诊断或治疗剂的本发明钴胺素衍生物，以及本发明钴胺素衍生物在这种方法中的用途。
在被提供不含维生素的饮食的哺乳动物中使用TCII非结合氰基钴胺素衍生物对将生物分布的阳性效果在表1中有所说明。
表1在小鼠中静脉注射放射性标记的衍生物后24小时的组织分布
实施例5氰基钴胺素-b-丁基-PAPAcet实施例6氰基钴胺素-b-丁基-氨基羧甲基-His-Ome实施例8氰基钴胺素-c-丁基-PAPAcet实施例10氰基钴胺素-b-乙基-PAMA-OEt实施例11氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-OEt实施例12氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-OEt实施例14氰基钴胺素-b-己基-PAMA-OEt实施例18氰基钴胺素-d-丙基-PAMA-OEt实施例20氰基钴胺素-b-丙基-His-Ome实施例22氰基钴胺素-b乙基-三胺实施例25氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺(phosphocolamin)-His-Ome表1汇总的生物分布分析结果表明，TCII非结合剂，例如作为实施例10、11、12、18和22的本发明化合物，在肿瘤中有比较高的积聚，是在血中的五倍或更高，是在重要器官肾和肝中发现的量的至少一半。实施例5、6、8、14、20和25的化合物不落入在本发明化合物的定义内，因为它们与TCII结合，在此仅作为参考化合物而被描述。
根据本发明的钴胺素衍生物对于攻击性、发展迅速的肿瘤性疾病例如癌症的诊断和/或治疗有特别高的价值。本发明的化合物能用于治疗包括恶性肿瘤在内的人器官高度增殖的细胞，例如黑素瘤、纤维肉瘤、卵巢癌、胰腺癌和骨肉瘤和急性白血病，这是提及的几个实例，并能绕过TCII介导的内吞作用。本发明的方法能对良性组织进行具体保护以免于TCII介导的钴胺素衍生物的有害摄取，其中钴胺素衍生物载有放射性同位素或/和能摧毁细胞的非放射性试剂。
本发明的化合物不仅能用于癌症成像和癌症治疗，而且还能对依赖于较高和直接摄取钴胺素的微生物局部感染进行显影和提供潜在的治疗。
载有抗增殖剂的本发明化合物能用于将非活性形式的试剂转运到过度增殖的细胞中，在此它能在细胞内进行酰胺分解后发挥其作用。
在肿瘤性疾病和/或传染病的治疗方法中，载有适宜治疗剂的本发明化合物能被单独给予或与一种或多种其它治疗剂联合给予，以具有确定组合形式的可能的联合治疗给予，或者本发明的化合物和一种或多种其它治疗剂交错给予或彼此独立地给予，或者联合给予确定的组合和一种或多种其它治疗剂。本发明的化合物，除此以外或另外，能被特别给予以用于肿瘤的治疗，联合化学疗法、免疫治疗、外科手术或这些的组合。长期治疗同样是可能的，如在其它治疗方案内容中的辅助治疗一样。
本发明还涉及含有本发明钴胺素衍生物的药物组合物，尤其是适于诊断用的药物组合物和适于治疗用的药物组合物。
优选药物组合物用于非胃肠道给药，例如静脉内、肌肉或皮下给药。组合物含有活性成分，其单独存在或与药学上可接受的载体组合。活性成分的剂量依赖于受治疾病和种类，其年龄、体重和个体状况、个体药代动力学数据和给药方式。
制备方法本发明的化合物通过本领域已知的标准方法制备。
优选的是，将氰基钴胺素，即其中Rb、Rc、Rd、Re和RR是氢，X是氰基的式(I)化合物，在受控的条件下用例如稀的无机酸下进行水解，并分离出来得到的其中一个氨基甲酰基CONH2被转化为COOH的单酸的混合物。类似地可以获得二酸。
然后，可以将氰基钴胺素-b、c、d或e-酸，即，其中CONHRb、CONHRC、CONHRd或CONHRe分别被COOH替代，且X是氰基的式(I)化合物与相应的胺Rb-NH2、RC-NH2、Rd-NH2和Re-NH2在形成酰胺胺的标准条件下，例如在肽化学中已知的条件分别反应。干扰酰胺形成的残基Rb、Rc、Rd、Re中的官能团优选是被保护的形式，并在酰胺形成后通过标准方法脱保护。对于其中间隔基含有酰胺官能团的化合物的制备来说，还能将氰基钴胺素-b、c、d或e-酸与二胺H2N(CH2)nNH2在形成酰胺的标准条件下进行反应，并进一步在形成酰胺的标准条件下将得到的H2N(CH2)n-官能化氰基钴胺素与相应的羧酸再次缩合，分别产生取代基Rb、RC、Rd、Re。
对于制备其中RC不是氢的化合物，优选的方法是根据Brown等人，Inorg.Chem.1995，3038的方法，先形成c-内酯，然后进行还原内酯开环反应。
对于制备其中RR不是氢的化合物，将氰基钴胺素(其中Rb、RC、Rd或Re不是氢的氰基钴胺素衍生物)与RR-L反应，其中L为适宜用于形成酯键的活化离去基团，例如卤素、混合酸酐的残基或另外的活性残基，所述另外的残基在肽或核酸合成中通常用于羧酸、磷酸或磷酸酯的形成。
下述的实施例用于阐述本发明，而不限制本发明的范围。
实施例试剂等级化学药物购自Merck，Dietikon(CH)，Aldrich or Fluka，Buchs(CH)，直接使用而不需要进一步纯化。
BOP＝1-苯并三唑基氧基三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐DCC＝二环己基碳二亚胺DIPEA＝二异丙基乙胺EDC＝1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺Fmoc＝(9H-芴-9-基甲氧基)羰基HOSu＝N-羟基琥珀酰亚胺MES＝2-(4-吗啉基)乙磺酸RT＝室温TBTU＝苯并三唑-1-基-N-四甲基脲四氟硼酸盐TEAP＝磷酸三乙基铵Teoc＝2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基TFA＝三氟乙酸在装有EG & GBerthold LB 508放射度监测器的Merck-HitachiL-7000系统上进行HPLC分析，使用Waters XTerra RP8柱(5□m粒度，1×100mm)，流速为1ml/分钟。在250和360nm记录色谱图。溶剂a主要是水缓冲液。乙酸钠缓冲液是通过在900ml水和100ml甲醇中混合2.9ml乙酸和4.55ml氢氧化钠2M制备的。氨基丁三醇是通过如下方法制备的将三(羟甲基)-氨基甲烷(605mg)溶解在水中，加入HCl 2M至pH为8.2，调节体积为1000ml，加入乙腈(10ml)。溶剂b一直为甲醇。
在装有两个Prostar 215泵和Prostar 320UVNis监测器的VarianProstar系统上进行制备HPLC分离，使用Waters XTerra Prep RP8柱(5Elm粒度，3×100mm和30×100mm)。对于3×100mm柱，流速为4ml/分钟，对于30×100mm柱，流速为30ml/分钟。
用VarianCary 50光谱仪上记录UVNis光谱，用Bio-Rad FTS-45光谱仪记录IR光谱，IR光谱中样品被压制成KBr片。用Merck HitachiM-8000光谱仪记录电雾化离子质谱(ESI-MS)。报告了铼化合物中187Re同位素的值。用Bruker DRX 500MHz光谱仪记录NMR光谱。报告相对于作为参照的残留溶剂质子的化学位移。
通过将化合物的水溶液应用到Chromafix RP18ce cartridge中，接着用水充分洗涤来对钴胺素衍生物(mg量)脱盐。
然后，用甲醇洗脱脱盐的产品，真空除去溶剂，高真空干燥产物。酚提取除去一定量的Bigger(多于50mg)中盐分，如描述于Meth.Enzymol.1971，18(3)，p.43中。
如Schibli等人.描述的用于制备戊基类似物的方法(Nucl.Med.Biol.2003，30，465)制备(N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙酯(丙基-PAMA-OEt)。该化合物在碱性条件下易于环化。因此，保存Boc保护的中间体，就在进一步功能化之前，在稀释HCI水溶液中搅拌除去Boc。用类似的方法制备乙基和己基衍生物。
通过将完全脱保护的([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)与(NEt4)2[Re(OH2)3(CO)3]反应来制备(N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸(CO)3。
如Pak等人.描述的方法(Chem.Eur.J.2003，9，2053-2061)制备1-羧甲基-N-Fmoc-组氨酸酯三氟乙酸甲酯。通过在HCl 0.05M搅拌化合物，之后室温真空脱水完成氯替换抗衡离子。
如van Staveren等人.描述的方法(Organic & MolecularChemistry 2004，2，2593)制备3-氨丙基-N-Teoc-组氨酸甲酯。
如Kunze描述的方法(Dissertation，University of Zurich，2004)制备3-(N-2-氰基乙氧基羰基甲基)-N-吡啶-2-基甲基-氨基)丙酸4-硝基-苯基酯。
实施例1氰基钴胺素单羧酸(b、d和e)如Pathare等人.描述的方法(Bioconjugate Chem.1996，217)使维生素B12(1.88g，1.39mmol)在HCl 0.1M(190ml)中水解。以下述的方法实施纯化酚提取物脱盐后，Dowex column分离出三个组分，一种只包含d-酸，第二种只包含b-酸和d-酸，第三种只包含b-酸和e-酸。通过制备HPLC(柱Waters XTerra Prep RP8，5□m，30×100mm；梯度洗脱a/b 0.5％min-1，起始用100％乙酸缓冲液a)分离b-酸和d-酸的混合物。用同样的系统分离b-酸和e-酸的混合物，但使用氨基丁三醇作为溶剂。分离得氰基钴胺素-b-酸，产率280.6mg(14.9％)，氰基-钴胺素-d-酸产率131.5mg(7.0％)，氰基钴胺素-e-酸，产率94.26mg(5.0％)。
实施例2氰基钴胺素-b-(2-氨基乙基)酰胺[氰基钴胺素-b-乙氨基]如Pathare等人.描述的用于十二烷类似物的合成方法(Bioconjugate Chem.1996，217)制备氰基钴胺素-b-(2-氨基乙基)酰胺。将乙烯二胺(132mg；0.147mi；2.2mmol)溶于DMF/H2O混合物(10ml；1/1v/v)。加入1M HCl调节pH至5。给溶液中加入氰基钴胺素-b-酸(60.0mg，44.4□mol)和KCN(57mg；0.87mmol)，然后调节pH至5.5。接着，加入EDC(84.2mg；0.43mmol)和HOSu(50.6mg；0.44mmol)。在RT搅拌混合物3天，在24小时的间隔加入另外部分的EDC和HOSu。为了进一步使用，真空蒸发干燥，然后用制备HPLC纯化(乙酸系统，梯度洗脱0.5％min-1s，起始为100％缓冲液a)，得到34mg(55％)氰基钴胺素-b(2-氨基乙基)酰胺。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1398.8[M+H]+，1420.1[M+Na]+，699.4[M+H]2+，711.1[M+H+Na]2+。
实施例3氰基钴胺素-b-(4-氨基丁基)酰胺[氰基钴胺素-b-丁胺]用如上述描述的合成乙基类似物的方法制备。
MS(MeOH，ESI-pos.)m/z＝1427.1[M+1]+，714.5[M+3]2+。
实施例4氰基钴胺素-b-乙基-PAPAcet将氰基钴胺素-b-乙胺(实施例2；24mg；17.2mol)溶于DMF/DMSO混合物中(5ml；4/1v/v)。给该混合物中加入3-[N-2-氰基乙氧基-羰基甲基-N-吡啶-2-甲基-氨基]-丙酸4-硝基苯酯(14mg，34.1□mol)和DIPEA(5□，29□mol)。在RT搅拌24小时后，真空蒸发干燥混合物。制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱0.5％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化，得到20mg(70％)氰基钴胺素-b-乙基-PAPAcet，红色固体。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1672.1[M+H]+，836.9[M+H]2+。
实施例5氰基钴胺素-b-丁基-PAPAcet将氰基钴胺素-b-丁胺(实施例3，5.5mg，3.9mmol)和3-[N-2-氰基乙氧基-羰基甲基-N吡啶-2-基甲基-氨基]丙酸4-硝基苯酯(2.5mg，6.1□mol)溶解于无水DMSO(0.5ml)和DMF(0.5ml)混合物中。加入DIPEA(5□，29□mol)达到pH为8至9，然后室温搅拌混合物。5小时后，HPLC分析证实完成了产物的制备。真空部分蒸发溶剂产物，加入乙醚，沉淀产物。离心混悬物，倾析3次，得到细粉末。制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱0.5％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化，得到纯产物，产率为2.7mg(41％)。
ESI-MSm/z＝850.1[M+2]2+UVNis□/nm(□moll-1cm-1)＝279.1(17300)，361.0(31200)，519.9(8700)，552.0(9700)。
实施例6氰基钴胺素-b-丁基-氨基羧甲基-组氨酸-OMe给氰基钴胺素-b-丁胺(49.6mg，34.8mmol)的无水DMSO(2ml)溶液中加入甲基1-羧甲基-N-Fmoc-组氨酸盐酸化物(35.5□mol)和BOP(46.2mg，104.4□mol)。加入DIPEA(12□，70.0□mol)，在RT搅拌溶液16小时。HPLC分析证实钴胺素起始原料完全转化为Fmoc保护的中间体。加入二乙醚沉淀中间体，离心混悬液，倾析两次得到细粉末。将中间体溶于DMF(5ml)中，加入哌啶(225□l)。在RT搅拌1.5小时，加入二乙醚沉淀产物，离心混悬液，倾析三次得到细粉末。制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱1％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化，得到纯产物，产率17.1mg(32.1％)。
UVNis□nm(□molI-1cm-1)＝279.1(19200)，361.0(24700)，521.0(9600)，551.1(10700)。
实施例7氰基钴胺素-c-(4-氨丁基)-酰胺如Brown等人.描述的方法(Inorg.Chem.1995，3038)制备氰基钴胺素-c-酸。将1，4-二氨基丁烷(0.059ml；0.59mmol)溶于DMF/H2O混合物(10ml；1/1v/v)中。加入1M HCl调节pH至5.2。给溶液中加入氰基钴胺素-o-酸(16.0mg，11.8□mol)、KCN(15.3mg；0.236mmol)、EDC(9.0mg；47.2□mol)和HOSu(5.4mg；47.2□mol)。在RT搅拌混合物4天，加入另一部分的EDC和HOSu。一天后，再加入另一部分的EDC和HOSu。总共6天后，HPLC分析证实钴胺素衍生物已完全转化。为了进一步使用，真空蒸发干燥混合物，然后用制备HPLC纯化(RP C18柱，HCl 1mM作为缓冲液a，梯度洗脱30分钟内从20％甲醇至50％甲醇)，得到9.8mg(58％)氰基钴胺素-c-丁胺。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1427.7[M+2]+，713.5[M+1]2+。
实施例8氰基钴胺素-c-丁基-PAPAcet如在氰基钴胺素-b-丁基-PAPAcet(实施例5)的合成中描述的方法，氰基钴胺素-c-丁胺(7.0mg，4.9□mol)和3-[N-2-氰基乙氧基羰基甲基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]丙酸4-硝基苯酯(3.8mg，9.2□mol)反应并纯化，得到纯产物，产率3.8mg(78％)。
ESI-MSm/z＝1701.0[M+1]+，850.1[M+1]2+UVNis□m(□mol I-1cm-1)＝278.1(14500)，362.1(25400)，550.0(7900)。
实施例9氰基钴胺素-b-丁基-PAPA-Re(CO)3将氰基钴胺素-b-丁胺(实施例3，24.6mg，17.2□mol)和Re(CO)3(3-[N-羧甲基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]丙酸)(9.1mg，17.2□mol)溶于DMSO.BOP(22.9mg，51.7□mol)中，加入DIPEA(2.94□，17.2□mol)，室温搅拌混合物。连续4天每天都加入DIPEA和BOP。HPLC分析证实形成了两种产物。加入乙醚沉淀产物。离心混悬物，倾析3次，得到细粉末。制备HPLC纯化(乙酸系统，梯度洗脱0.5％min-1，起始为100％缓冲液)分离主要峰产物，产率2.3mg(7.0％)。
ESI-MSm/z＝1917.5[M+2]+，959.9[M+4]4+实施例10氰基钴胺素-b-乙基-PAMA-Oet将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中，随后加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。在不同的烧瓶中，将约5当量的(N-2-氨基乙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(乙基-PAMA-OEt)盐酸化物(通过在绝对EtOH/2M HCl混合物中(7.5ml 4/1v/v)搅拌过夜裂解Boc-保护的衍生物，随后真空除去挥发物而制备)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱1.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到12mg(51％)的氰基钴胺素-b-乙基-PAMA-Oet，红色固体。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1575.8[M+H]+，788.7[M+H]2+，799.3[M+H+Na]2+。
实施例11氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-Oet将新制备的(N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(361□mol)的水溶液(1ml)加入到氰基钴胺素b-酸(65.0mg，48.1□mol)中。加入EDC(46.1mg，240□mol)，用NaOH 0.1M调节pH为5.5。在RT搅拌15小时后，HPLC分析(乙酸钠缓冲液)表明形成约50％的产物。再次加入EDC(46.1mg，240□mol)，但是室温延长搅拌没有导致进一步形成产物。真空除去溶剂，制备HPLC(梯度a/b 0.5％min-1，起始为100％乙酸缓冲液a)纯化残余物。收集主成分，真空除去溶剂，产物脱盐，得到氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-Oet，产率25.8mg(16.2mmol，33.3％)。
ESI-MSm/z＝806.5[M+l+Na]2+，795.6[M+2]2+。
UVNis□nm(□mol I-1cm-1)＝278.0(8500)，361.1(26500)，549.1(8000)。
实施例12氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-Oet将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。随后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。在不同的烧瓶中，将约5当量的(N-4-氨基丁基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(丁基-PAMA-OEt)盐酸化物(通过在绝对EtOH/2M HCl混合物中(7.5ml 4/1 v/v)搅拌过夜裂解Boc-保护的衍生物，随后真空除去挥发物而制备)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1 v/v)。混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱1.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到15mg(63％)的氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-Oet，红色固体。
实施例13氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-OH于0℃下在无水THF中由溴乙酰溴和9H-芴基甲醇中制备溴乙酸9H-芴-9-基甲基酯。根据Schibli等人.使用用于合成Boc-pentyl-PAMA-OMe的方法(Nucl.Med.Biol.2003，30，465)从Boc-NH-(CH2)4NH2、吡啶-2-醛和溴乙酸9H-芴-9-基甲基酯制备Boc-丁基-PAMA-OFm([(4-叔-丁氧基-羰基氨基-丁基)-吡啶-2-基甲基-氨基]-乙酸9H-芴-9-基甲基酯)。
将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。随后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的烧瓶中，将约5当量的[(4-氨基-丁基)-吡啶-2-基甲基-氨基]-乙酸9H-芴-9-基甲基酯(丁基-PAMA-OFm)(通过在三氟乙酸/CH2Cl2混合物中(4ml 1/2v/v)搅拌1小时裂解Boc-保护的衍生物，随后真空除去挥发物而制备)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱1.5％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到15mg的氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-Ofm，红色固体。
将氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-OFm(15mg)溶于3ml的HNEt2/DMF混合物(2/1v/v)中，在RT搅拌2小时。真空除去溶剂，制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱1.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到9mg的氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-OH，红色固体。
实施例14氰基钴胺素-b-己基-PAMA-Oet将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。随后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的烧瓶中，将约5当量的(6-氨基己基-N-吡啶-2-甲基-氨基)乙酸乙基酯(己基-PAMA-OEt)氢氧化物(通过在绝对乙醇/2M HCl混合物中(7.5ml 4/1v/v)搅拌过夜裂解Boc-保护的衍生物，随后真空除去挥发物而制备)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱1.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到10mg(41％)的氰基钴胺素-b-丁基-PAMA-OEt，红色固体。
MS(MeOH，ESI-pos.)m/z＝816.9[M+2H]+，1632[M+H]+实施例15氰基钴胺素-b-乙基-PAMA-Re(CO)3将氰基钴胺素-b-乙基-PAMA-OEt(实施例10，11mg；7.0μmol)溶于4ml的2M NaHCO3溶液中。加入11mg的(NEt4)2[ReBr3(CO)3](14.2mol)的1.5ml MeOH溶液。在85℃加热混合物1小时。使混合物达到RT后，用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱2.0％每分钟，起始缓冲液a)纯化。产率11mg(86％)。
实施例16氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-Re(CO)3将氰基钴胺素-b-酸(26.7mg，19.8□mol)、Re([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)(CO)3(29.2mg，60□mol)、EDC(11.5mg，60□mol)和HOSu(6.9mg，60□mol)溶于水(5ml)和DMSO(0.5ml)的混合物中，用稀释HCl和NaOH调节pH至5.5。在RT搅拌5小时后，HPLC分析(乙酸缓冲液)表明约33％的产物生成。再次加入EDC和HOSu。在室温搅拌混合物3天，在24小时间隔加入EDC和HOSu。真空除去水，加入二乙醚沉淀产物。离心油状混悬液并脱盐。用二乙醚洗涤两次，直到形成细沉淀。高真空干燥粗产物，制备HPLC(梯度洗脱a/b 1％min-1，起始为100％乙酸缓冲液a)纯化，脱盐，得到氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-Re(CO)3，产率9.1mg(23％)。
ESI-MSm/z＝1831.7[M+1]+，916.1[M+1]2+。
UVNis□nm(□mol I-1cm-1)＝278.0，361.1，519.9，551.1。
实施例17氰基钴胺素-b-己基-PAMA-Re(CO)3将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。随后加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。在不同的烧瓶中，将约5当量的[Re([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)(CO)3]-CF3COOH(通过于0℃在CH2Cl2和TFA(2/1 v/v)中对保护的合成物进行Boc裂解，随后在RT真空除去挥发物而制备)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。
混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱2.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到11mg(40％)的氰基钴胺素-b-己基-PAMA-Re(CO)3。
MS(MeOH，ESI-pos.)m/z＝936.5[M+2H]2+，948.3[M+H+Na]2+，1873.8[M+H]+。
实施例18氰基钴胺素-d-丙基-PAMA-OEt如合成氰基钴胺素-b-丙基-PAMA-OEt(实施例11)的方法用N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基)乙酸乙基酯(7□mol)和EDC(6.6mg，34□mol)反应制备氰基钴胺素-d-酸(9.3mg，6.9□mol)。分离产物，产率为3.6mg(33％)ESI-MSm/z＝1612[M+Na]+，1590[M+1]+，806[M+1+Na]2+，795.1[M+2]2+UWVis□nm(□mol I-1cm-1)＝279.0(13400)，361.1(23300)，549.1(7200)。
实施例19氰基钴胺素-d-丙基-PAMA-Re(CO)3将氰基钴胺素-d-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(1.5ml)中。随后，加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的烧瓶中，将约5当量的Re([N-3-氨丙基-N-吡啶-2-基甲基-氨基]乙酸)(CO)3溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1v/v)。混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱2.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到20mg(73％)的氰基钴胺素-d-丙基-PAMA-Re(CO)3。
实施例20氰基钴胺素-b-丙基-组氨酸-OMe将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。随后加入DMF(2ml)和NEt3(1ml)。
在不同的烧瓶中，将约4当量的3-氨丙基-N-Teoc-组氨酸甲酯溶于DM中。混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。搅拌45分钟后，随后真空蒸发干燥。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱2.0％min-1，起始为缓冲液a)纯化残余物，得到16mg的红色固体。(67％)MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1710.4[M+H]+，855.0[M+2H]2+，866.7[M+Na+H]2+。
在0℃，将19mg这种Teoc-保护的化合物样品溶于TFA/CH2Cl2混合物(4/1 v/v)。在该温度搅拌4小时后，分析HPLC表明起始原料完全转化。在RT真空除去溶剂。给残余物中加入无水Et2O，随后真空除去溶剂。总共进行该步骤3次，以便除去微量的TFA。制备HPLC纯化(乙酸系统，梯度洗脱0.5％每分钟，起始为100％缓冲液a)，产物为11mg的标题化合物。
MS(MeOH；ESI-pos.)m/z＝1565.2[M+H]+，1587.2[M+Na]+，783.4[M+2H]2+，794.1[M+Na+H]2+实施例21氰基钴胺素-b-丙基-组氨酸-Re(CO)3将氰基钴胺素-b-酸(20.0mg，14.8□mol)溶于DMSO(0.8ml)中。随后加入DMF(2ml)和NEt3(0.1ml)。
在不同的烧瓶中，将约5当量的[Re(3-氨丙基-N-Teoc-组氨酸甲酯)(CO)3]CF3COOH(通过于0℃在CH2Cl2和TFA(2/1 v/v)中对保护的合成物进行Boc裂解，随后在RT真空除去挥发物而制备)溶于DMF/NEt3混合物中(4.5ml；8/1 v/v)。
混合两种溶液，随后加入TBTU(32.1mg，0.1mmol)。在RT搅拌45分钟后，真空除去溶剂。用制备HPLC(乙酸系统，梯度洗脱2.0％min-1，起始为100％缓冲液a)纯化残余物，得到7mg(73％)的氰基钴胺素-b-丙基-组氨酸-Re(CO)3。
MS(MeOH；ESI-pos.)911.6[M+2H]2+，923.2[M+H+Na]2+，933.9[M+2Na]2+，1822.1[M+H]+，1845.6[M+Na]+实施例22氰基钴胺素-b-乙基-三胺将三亚乙基四胺(55.4□，369□mol)溶于DMF(2.5ml)和水(2.5ml)的混合物中。加入KCN(9.6mg，147□mol)，加入HCl水溶液调节pH至6。加入氰基钴胺素-b-酸(10.0mg，7.4□mol)、EDC(5.7mg，29□mol)和HOSu(3.4mg，29□mol)。6小时、24小时、48小时和120小时后加入相同量的EDC和HOSu。HPLC分析(乙酸缓冲液)表明缓慢生成产物，48小时后达到75％的转化率，延长搅拌时间该转化率不再提高。搅拌144小时后，真空除去溶剂，用制备HPLC纯化产物，使用TFA 0.1％水溶液作为缓冲液a，用甲醇作为溶剂b，梯度洗脱1％min-1，起始为80％缓冲液a。分离产物，得到氰基钴胺素-b-乙基-三胺x 3TFA，产率为7.5mg(55％)。
ESI-MSm/z＝743.1[M+2]2+。
UVNis□nm(□mol I-1cm-1)＝278.0(13000)，316.0(23100)，519.0(6500)，549.0(7200)。
实施例23氰基钴胺素-b-乙基-三胺-Re(CO)3在50℃下pH 7.4(0.1M，0.33ml)的磷酸缓冲液中搅拌氰基钴胺素-b-乙基-三胺(5mg，2.7□mol)和(Et4N)2[ReBr3(CO)3](2.2mg，2.9□mol)。1小时后，HPLC分析表明起始原料完全转化成一个产物。4小时后，反应混合物脱盐，得到产物，根据HPLC分析，该产物为约2/1比例的两种立体异构体的混合物。用99mTc标记氰基钴胺素-b-乙基-三胺发现相同结构的两种立体异构体。
ESI-MSm/z＝1755.9[M+1]+，878.5[M+2]2+。
实施例24氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺在室温和通入N2气下，搅拌氰基钴胺素(30mg，22.14μmol)、DCC(457mg，2.214mmol)和N-Fmoc-磷酸胆胺(78.9mg，217.2μmol)的无水DMF(2ml)和无水吡啶(1ml)溶液24小时。加入2ml水后，滤出沉淀的二环己基脲，在60℃下，减压蒸除水和吡啶。用5％哌啶的DMF溶液将残余溶液稀释成8ml的体积，室温搅拌2.5小时。二乙醚沉淀产物，离心并洗涤多次。用制备HPLC(梯度洗脱30分钟100％→20％a，0％→80％MeOH；a＝0.1％AcOH，10％乙腈水溶液；流速10ml/分钟；柱M&N VP 250/21Nucleosil 100-7C18)纯化产物。产率82％，红色固体。
31P-NMR(500，CD3OD)δ0.00(s，1P)，0.53(s，1P)MS(ESI+，MeOH)m/z＝1478[M+1]+，762[M+2+2+Na]2+实施例25氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺-组氨酸-OMe将氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺(50mg，33.8μmol)和1-(羧甲基)-N Fmoc-组氨酸甲酯盐酸化物(25mg，50.7μmol)溶于无水DMSO(4ml)中，用24μl的DIPEA调节pH至6-7。给溶液中加入固体BOP(45mg，101.5μmol)，在RT搅拌。1小时后，反应混合物的pH变成酸性，再次调节至中性。5小时后，通过分析HPLC没有检测到任何起始原料。用二乙醚沉淀后，在1∶1的DMF和哌啶(10ml)混合物中脱保护1.5小时。沉淀后，如描述的纯化氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺方法(实施例24)用制备HPLC纯化，得到产物，产率为46％。
31P-NMR(500，D2O)δ-2.16，-0.37；MS(ESI+，MeOH)m/z＝1690(M+1)+，845.6(M+2)+实施例26氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺-磷酸胆胺-Re(CO)3使用如制备氰基钴胺素-5′-磷酸胆胺-OMe(实施例25)的方法，用1-(羧甲基)组氨酸酯的Re(CO)3络合物代替1-(羧甲基)-N-Fmoc-组氨酸甲酯盐酸化物。纯产物的产率为37％。
31P-NMR(500，D2O，333K)δ50.97，2.23
MS(ESI+，MeOH)m/z＝[M+1]+1945，929(片段)IR(KBr，cm-1)3400，2128，2020，1901，1902，1664，1499，1399，1219，1073
表2实施例的式(I)的钴胺素衍生物结构，X＝CN
实施例27常用标记方法如Alberto等人.描述的方法(J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136)使用碳酸硼试剂盒从前体[99mTc(OH2)3(CO)3]+的溶液制备得到[99mTcO4]。
10ml的有橡皮塞的玻璃瓶用N2吹扫。加入20□的氰基-钴胺素衍生物(0.01M的水溶液)溶液、20□的MES缓冲液(1.0M)和200□的[99mTc(OH2)3(CO)3]+溶液，反应混合物保存在75℃下1至2小时。进行具有-detection的HPLC分析，证实99mTc种类的完全转化。在这些条件下，断开螯合剂中的酯保护基，得到羧基化(carboxylato)复合物。
对于体内研究和结合转运载体的研究，需要非常高的比活性。因此，将100□的标记溶液注入分析HPLC系统中来分析有放射性和无放射性衍生物。在静脉注射前，用浓度为10gCi每只动物浓度的生理盐水洗脱具有最高γ活性(约300□)的洗脱组分。分离条件为乙酸缓冲液，XTerra RP8柱子，对于b-和d-衍生物使用梯度洗脱0％甲醇(0分钟)，30％甲醇(15分钟)，100％甲醇(25分钟)，对于其它化合物使用如Schibli等人.描述的TEAP系统(Bioconjugate Chem.2000，343-351)。
实施例28从兔全血中制备钴胺传递蛋白II(TC II)通过对氰基钴胺素-琼脂糖基质(Sigma)的亲合色谱法纯化TCII。
首先用200ml 50mM Tris/1M NaCl pH 8.0洗涤凝胶(5ml)，之后用200ml 0.1M甘氨酸/0.1M葡萄糖/1M NaCl pH 10洗涤，再用200ml 50mM Tris/1M NaCl洗涤。将200ml两次的离心的全血(在4℃下，第一次5000rpm 15分钟，第二次20′000rpm 20分钟)应用到亲和层析柱，如前述顺次洗涤该柱。先用20ml 4.0M胍HCl/50mM Tris pH 8.0洗脱Bound TC II，第二步中再用7.5M胍HCl/50mMTris pH 8.0洗脱。大部分bound TC II已经用4M胍HCl洗脱。在4℃透析探针的大量抗H2O性。典型地，产率为5-30nmol/l，转化成7.5-10□g的TC II(MW50kDa)每只兔。
实施例29从细菌中制备钴胺传递蛋白II(重组TCII)钴胺传递蛋白IIcDNA表达于E.Coli系FA113，具有双摘除蛋白的K12衍生物表达于trxB和gor基因，其中细胞质形成氧化环境，并允许二硫化物形成。钴胺传递蛋白II蛋白包含PreScission蛋白酶位点，其已经被N-末端组氨酸标记。使用镍螯合琼脂糖从E.Coli提取物的可溶性组分中分离蛋白。用8M尿素从结合到螯合柱的钴胺传递蛋白II中除去氰基钴胺素，之后用咪唑释放钴胺传递蛋白II。在某些制备中，用特定的蛋白酶除去组氨酸-标记。
实施例30制备钴胺传递蛋白I(TC I；HaDtocorrin)使用的原料为钴胺传递蛋白1、素食的人类受试者的唾液。在4℃以20′000rpm离心唾液20分钟，与PBS 1∶1混合，无菌过滤。钴胺传递蛋白I的结合能力通常为10ng/ml。
实施例31氰基钴胺素衍生物与转运蛋白TC I和TC II)的相互作用(图1和图2)通过凝胶移位检测测定放射性标记的(57Co、99mTc、188Re、111In)氰基钴胺素衍生物的相互作用。在室温下，使放射性标记的氰基钴胺素(0.05ng至1ng)与过量的转运蛋白反应15分钟。将混合物应用到凝胶过滤柱(Superdex75，Amersham Biosciencies)，流动缓冲液为PBS和0.1％Tween 20。生物活性氰基钴胺素，其粘合到转运蛋白，分子重量迁移为约1.4kDa至40-70kDa，取决于转运蛋白。用57Co-氰基钴胺素(ICNBiomedicals GmbH，Germany；10μCi/50ng)进行转运蛋白结合能力的滴定。
实施例32用188Re-三羰基标记氰基钴胺素衍生物在一锅中进行188Re-三羰基的制备和氰基钴胺素衍生物的标记。7.5mg BH3NH3与20mg的维生素C钠、100μl的氰基-钴胺素衍生物(10-3M)、900μl的[188ReO4]-发生器洗脱物(0.9％盐水；40mCi至270mCi)、20mg的H3PO4(85％)混合，通入一氧化碳(CO)20分钟。在60℃加热混合物1/2至2小时，在90℃加热1/2至2小时。用反相HPLC柱(Waters Xterra RP8)，在磷酸缓冲液，用线性甲醇梯度洗脱，分离标记的氰基钴胺素与未标记的氰基钴胺素。生理盐水洗脱活性级分，静脉注射，用于成像目的为10pCi每动物的浓度，用于治疗目的为高达2mCi每动物浓度。
实施例33肿瘤细胞球对电离放射的敏感性在放射生物学中，患有肿瘤细胞球和肿瘤异种移植物的小鼠对放射反应的类似性使细胞球成为体内研究的良好可选择的模型。在37℃下多细胞肿瘤球在旋转烧瓶中连续搅拌生长至平均直径为400Fm。收集细胞球，在新鲜介质中洗涤，然后在24孔平底组织培养板中用无放射性或188Re-标记的氰基钴胺素衍生物。剂量范围为1μCi至20μCi每孔。用可见荧光标记物、所有球直径的测定，半固体凝胶中测定分散球的克隆源性测定来测定细胞毒性。
实施例34小鼠中放射性标记的氰基钴胺素衍生物的生物分配(图3、4、5、6)对于使用57Co-氰基钴胺素的生物分配研究，将0.2μCi/1ng的放射性标记的氰基钴胺素与180μl的生理盐水混合，并静脉注射给患肿瘤的balb/c小鼠(同源小鼠黑素瘤B16-F10)。在指定的时间后(5分钟至24小时)，处死动物，称重器官，用γ计数器计数。对于使用99mTc-标记的氰基钴胺素的生物分配研究，将10μCi/0.5ng的放射性氰基钴胺素与生理盐水混合，用法如前。对于使用111In-标记的氰基钴胺素的生物分配研究，将2□Ci/5ng的放射性氰基钴胺素与正常盐水，用法如前。为了研究缺乏维生素食物的影响，比较用正常食物饲喂的小鼠中标记的氰基钴胺素的分配与在维生素B12缺乏的食物中的生物分配，时间为2周。
实施例35患肿瘤的小鼠中188Re-标记的氰基钴胺素衍生物的治疗研究在balb/c小鼠中，同源黑素瘤生长至于约200mg(用管径测量)的大小。静脉注射增加剂量(0.1至2mCi)的放射性标记的氰基-钴胺素结构物和无放射性的结构物。用用管径测量评价肿瘤体积。当肿瘤达到800mg大小时，处死动物。在一系列试验中，用分级方案(regiment)处理动物每周分次给予放射性氰基钴胺素3次。观察动物再生的肿瘤60天。
权利要求
1.钴胺素衍生物，所述钴胺素衍生物(a)对钴胺传递蛋白II没有结合亲合力或具有低的结合亲合力，以及(b)保留作为维生素B12替代物的活性。
2.根据权利要求1的钴胺素衍生物，其中所述钴胺素衍生物(a)在结合试验中，当与没有改性的钴胺素的结合亲合力比较时，对钴胺传递蛋白II具有低于20％的结合亲合力，以及(b)在生长测定中保持大于2％的作为维生素B12替代物的活性。
3.根据权利要求1的钴胺素衍生物，其中所述钴胺素衍生物(a)在结合试验中，当与没有改性的钴胺素的结合亲合力比较时，对钴胺传递蛋白II具有低于10％的结合亲合力，以及(b)在生长测定中保持大于10％的作为维生素B12替代物的活性。
4.根据权利要求1的钴胺素衍生物，其中所述钴胺素衍生物(a)在结合试验中，当与没有改性的钴胺素的结合亲合力比较时，对钴胺传递蛋白II具有低于5％的结合亲合力，以及(b)在生长测定中保持大于10％的作为维生素B12替代物的活性。
5.根据权利要求1至4中任一项的钴胺素衍生物，所述钴胺素衍生物载有治疗剂和/或诊断剂。
6.根据权利要求1至5中任一项的钴胺素衍生物，钴胺素衍生物载有放射性金属。
7.根据权利要求1至6中任一项的钴胺素衍生物，钴胺素衍生物为式(I)的化合物 其中Rb、Rc、Rd和Re彼此独立地为间隔基-螯合剂基团、抗生素或抗增殖的治疗剂、具有4到20个碳原子有空间要求的有机基团或氢；RR是间隔基-螯合剂基团或抗生素或抗增殖的治疗剂，其每一个均通过连接基团Z连接，或氢；条件是，残基Rb、Rc、Rd、Re和RR中至少三个是氢，且残基Rb、Rc、Rd和Re中至少一个不是氢；X是单齿配体；以及中央的钴(Co)原子任选是放射性同位素的形式。
8.根据权利要求7的钴胺素衍生物，其中Re为氢。
9.根据权利要求7或8的钴胺素衍生物，其中间隔基-螯合剂基团包含间隔基，其是2到10个碳原子的脂族链，其中一个或两个碳原子可以被氮和/或氧原子替代，并且该脂族链可以被羟基、氧代基或氨基取代，和螯合剂，其是具有两个、三个或更多个选自氮、氧和硫的供电子原子的化合物，其具有能结合金属原子的间距，和任选的金属原子。
10.根据权利要求9的钴胺素衍生物，其中所述螯合剂选式(II)至式(IX)的螯合剂， 其中，羧基可以作为酯存在。
11.根据权利要求6至10中任一项的钴胺素衍生物，其中放射性金属为94mTC、99mTc、188Re、186Re、111In、90Y、64Cu、67Cu或177Lu。
12.根据权利要求7至11中任一项的钴胺素衍生物，其中X为氰基、甲基、羟基、水合基团或5′-脱氧腺苷基。
13.根据权利要求12的钴胺素衍生物，其中X为氰基。
14.根据权利要求7至12中任一项的钴胺素衍生物，其中中央的钴原子为放射性同位素57Co或60Co。
15.根据权利要求10的钴胺素衍生物，其中Rb为任选地载有金属原子的间隔基-螯合剂基团，间隔基为2至4个碳原子的脂族链，并且螯合剂为式(II)的螯合剂，其中基团COOH任选地为酯形式；Rc、Rd、Re和RR为氢；且X为氰基。
16.根据权利要求15的钴胺素衍生物，其中Rb为任选地载有金属原子的间隔基-螯合剂基团，间隔基为4个碳原子的脂族链，并且螯合剂为式(II)的螯合剂，其中基团COOH任选地为乙基酯形式；Rc、Rd、Re和RR为氢；且X为氰基。
17.根据权利要求10的钴胺素衍生物，其中Rd为任选地载有金属原子的间隔基-螯合剂基团，间隔基为3个碳原子的脂族链，并且螯合剂为式(II)的螯合剂，其中基团COOH任选地为酯形式；Rb、Rc、Re和RR为氢；且X为氰基。
18.根据权利要求10的钴胺素衍生物，其中Rb为任选地载有金属原子的间隔基-螯合剂基团，间隔基为2个碳原子的脂族链，并且螯合剂为式(III)的螯合剂；Rc、Rd、Re和RR为氢；且X为氰基。
19.药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1至18中任一项的钴胺素衍生物。
20.诊断哺乳动物中肿瘤性疾病或微生物感染的方法，包括(a)给疑似遭受肿瘤性疾病或感染的哺乳动物供给不含维生素B12的饮食一段时间，和(b)随后供给载有诊断剂的权利要求1至18中任一项的钴胺素衍生物。
21.治疗患有肿瘤性疾病或微生物感染的哺乳动物的方法，包括(a)给需要治疗的哺乳动物供给不含维生素B12的饮食一段时间，和(b)随后供给载有治疗剂的权利要求1至18中任一项的钴胺素衍生物。
22.根据权利要求1至18中任一项的钴胺素衍生物在诊断肿瘤性疾病或微生物感染的方法中或在治疗患有肿瘤性疾病或微生物感染的哺乳动物的方法中的用途。
23.根据权利要求22的用途，其是用于癌症成像。
24.根据权利要求1至18中任一项的钴胺素衍生物在制备用于在诊断肿瘤性疾病或微生物感染的方法中或在治疗患有肿瘤性疾病或微生物感染的哺乳动物的方法中使用的药物组合物中的用途。
25.根据权利要求24的用途，其中所述用途是钴胺素衍生物在制备用于癌症成像的药物组合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及钴胺素衍生物，所述衍生物(a)与转运蛋白钴胺传递蛋白II(TCII)没有结合亲合力或具有低的结合亲合力，以及(b)保留作为维生素B12替代物的活性，任选地载有治疗剂和/或诊断剂，例如放射性金属。与在肿瘤组织中的积聚速度相比，这些化合物在血液和良性器官例如肾和肝中具有低很多的积聚速率，并能从血液中更迅速地清除。本发明还涉及在哺乳动物中诊断和治疗肿瘤性疾病或微生物感染的方法，包含(a)给哺乳动物供给不含维生素B12的饮食一段时间，以及(b)随后供给载有诊断剂和/或治疗剂的本发明钴胺素衍生物。通过选择起维生素B12替代物作用的钴胺素衍生物，能大大降低在肿瘤组织中形成耐药子代的危险性。
文档编号A61P35/00GK1902214SQ200480038278
公开日2007年1月24日 申请日期2004年12月21日 优先权日2003年12月22日
发明者H·－J·特赖希勒, R·阿尔伯托, R·维贝尔, M·T·屈恩茨, J·吕施, S·蒙维勒, D·R·范施塔夫伦 申请人:索里达哥股份有限公司, 苏黎世大学, 保罗·谢勒学院