专利名称：新的磷酸结合蛋白、含有它的药物组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明的主题是从人类血清中获得的新的磷酸结合蛋白(phosphate-binding protein)、含有它的药物组合物以及其用途，尤其是在高磷酸盐血症(hyperphosphataemia)和心血管疾病或关节炎的治疗框架中的用途。
背景技术：
磷酸是一种参与众多生物学机制的极其重要的分子。磷酸尤其存在于磷脂、能量产生机制(ATP，ADP)、细胞信号传导过程、遗传物质的组成及骨(以磷酸钙的形式)中。
高磷酸盐血症是一种与生物体中磷酸过量相关的病症，其尤其通过促进动脉粥样硬化和动脉钙化的过程，造成心血管疾病危险增加(Dorozhkin和Epple，2002；Amann等，2003；Blazheevich等，1975)。当关节中发生钙化时，高磷酸盐血症也可以引起关节炎(假性痛风)。
高磷酸盐血症期间血清中产生的磷酸钙盐沉积在软组织中，并且在不同组织血管(脑或心血管意外)、关节(假性痛风)、晶状体、肾间质组织(肾钙质沉着症)、皮下(瘙痒病(pruritis))、肺和胰腺中异位钙化。
因此，在患有肾功能不全的个体中有半数的死亡由与高磷酸盐血症有关的心血管疾病引起。在此方面，某些在肠腔中络合磷酸的磷酸螯合剂目前被用作药物。然而，并非所有这些螯合剂均是生理性的。这导致与其应用相关的某些并发症或限制。
含有镁的制剂由于出现消化道紊乱(腹泻)而受到限制，并且由于高镁血症的危险而被禁止。类似地，由于铝中毒危险(小红细胞性低血色素贫血、软骨病、肌病、痴呆)，必需避免因其有效性而长期使用的氢氧化铝处方，或者至少限制到非常短的时期。
钙盐处方是纠正低血钙和高磷酸盐血症(hyperphosphoraemia)的最佳手段，这一方面可使小肠吸收的钙量增加而不论是否钙三醇缺乏，且另一方面可使以磷酸钙的形式在肠腔中络合磷，而磷酸钙在粪便中排除。然而，含钙螯合剂的主要缺点是诱导高血钙，在某些系列中已经在20％患者中注意到此现象。此危险已经导致了能够限制高磷酸盐血症的其它产物的开发。
目前最多使用的药物是Renagel_(Ramsdell；1999)。这是一种能够螯合磷酸的不可吸收的阳离子聚合物。
本发明的目的是提供结合磷酸的新生理性蛋白质螯合剂，从而无需使用其它能导致并发症的离子并提供比目前螯合剂更宽的应用前景。
发明内容
本发明涉及蛋白质，所述蛋白质的特征在于其包含或其组成是-序列SEQ ID NO1，-或衍生自序列SEQ ID NO1的任何序列，尤其是通过置换、缺失或添加1或多个氨基酸得到的序列，条件是所述衍生的序列可结合磷酸，-或与序列SEQ ID NO1同源的任何序列，优选地与序列SEQ IDNO1有至少大约80％同源性，条件是所述同源序列可结合磷酸，-或以上定义的序列之一的任何片段，条件是所述片段可结合磷酸，尤其是由序列SEQ ID NO1中的至少大约20个连续氨基酸组成的任何片段。
本发明涉及以上定义的蛋白质，其特征在于该蛋白质包含或其组成是-序列SEQ ID NO2或序列SEQ ID NO3，-或者衍生自序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的任何序列，尤其是通过置换、缺失或添加1或多个氨基酸得到的序列，条件是所述衍生序列可结合磷酸，-或与序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3同源的任何序列，优选地与序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3有至少大约80％同源性，条件是所述同源序列可结合磷酸，-或以上定义的序列之一的任何片段，条件是所述片段可结合磷酸，尤其是由序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中的至少大约20个连续氨基酸组成的任何片段。
序列SEQ ID NO2对应于人磷酸结合蛋白质。该新蛋白已经从人类血浆中分离，其三维结构显示其属于“磷酸结合蛋白”(PBP)类。以下也将其称作HPBP(人磷酸结合蛋白)。
序列SEQ ID NO3对应于与序列SEQ ID NO2同源的蛋白质，该蛋白质与序列SEQ ID NO2有大约90％的百分同一性并与SEQ ID NO2具有相同的磷酸结合性质。
本发明序列的磷酸结合性质可以通过如下磷酸结合试验通过放射性标记来验证使蛋白质结合在硝化纤维素膜上(通过抽吸进行点印迹)。膜在放射性缓冲液(32P(10mCi/ml，Amersham-Biosciences)2M；Tris 50mM；pH8.0)中孵育。
在Tris50mM缓冲液，pH8.0中快速漂洗该膜2×1分钟。通过用膜曝光胶片(大约45min)，可以检测结合放射性磷酸的区(见之后的图3)。
本发明还涉及编码以上定义的蛋白质的核苷酸序列。
本发明还涉及含有上述核苷酸序列的重组载体，尤其是质粒、粘粒、噬菌体或病毒DNA。
根据一个有利的实施方案，本发明涉及以上定义的重组载体，该载体含有使插入所述载体的上述核苷酸序列所编码的多肽在宿主细胞中表达所必需的元件。
本发明还涉及宿主细胞，该宿主细胞尤其选自细菌、病毒、酵母、真菌、植物或哺乳动物细胞，且所述宿主细胞被转化，尤其是使用以上定义的重组载体转化。
本发明还涉及含有以上定义的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3作为活性成分并组合含有可药用载体的药物组合物。
本发明还涉及以上定义的药物组合物，其中本发明的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3，与具有对氧磷水解活性的对氧磷酶蛋白质变体组合。
在对氧磷酶变体中，可以提及人或非人来源的变体PON1、PON2、PON3，例如SEQ ID NO4(人PON1；Hassett等，1991)、SEQ ID NO5(人PON2；Primo-Parmo等，1996)、SEQ ID NO6(人PON3；Reddy等，2001)、SEQ ID NO7(兔PON1；Hassett等，1991)、SEQ ID NO8(大鼠PON1；Rodrigo等，1997)、SEQ ID NO9(小鼠PON1；Sorenson等，1995)、SEQ ID NO10(小鼠PON2；Primo-Parmo等，1996)和SEQ ID NO11(小鼠PON 3；Primo-Parmo等，1996)。
本发明还涉及以上定义的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ IDNO3，在制备旨在用于预防或治疗与高磷酸盐血症相关的疾病，例如心血管疾病和关节炎(假性痛风)的药物中的用途。
术语“高磷酸盐血症”指生物体中磷酸(phosphate)过量。更精确地，高磷酸盐血症定义为血浆中磷酸浓度增加到高于1.44mmol/l(45mg/l)，所述量通过总磷酸测定(在矿化步骤后进行比色法测定)而获得。
根据一个有利的实施方案，本发明蛋白质可以静脉内施用以便能够长期(大约1周)结合最大量的磷酸。通过随后清除该蛋白质，可以由此快速地消除大量磷酸。这使得可以加大透析期之间的间隔和缩短透析期。
本发明更尤其涉及以上定义的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3，在心血管疾病预防或治疗框架中的应用。
本发明还涉及本发明蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所表示的蛋白质，与诸如对氧磷酶蛋白质变体等蛋白质的组合在杀虫剂或神经毒剂(nerve agents)(例如，梭曼(soman)、VX、塔崩(tabun)或沙林(sarin))所引起的中毒的预防和治疗框架中或在动脉粥样硬化的治疗框架中的应用。
本发明还涉及包含至少一种以上定义的蛋白质(尤其是SEQ IDNO2或SEQ ID NO3)和至少一种对氧磷酶蛋白质变体的组合产品，其中所述以上定义的蛋白质和对氧磷酶蛋白质变体同时或分开使用或者分散在一段时间内使用，以旨在预防或治疗由杀虫剂或神经毒剂如梭曼、VX、塔崩或沙林引起的中毒。
本发明蛋白质(尤其是SEQ ID NO2)与对氧磷酶蛋白质变体的组合施用使得可以增加对氧磷酶的稳定性，尤其是在预防或治疗由杀虫剂或神经毒剂所引起的中毒的框架中。
本发明还涉及以上定义的蛋白质测定方法，特征在于其包括如下阶段-将抗本发明蛋白质的不同表位的兔单克隆抗体(抗-HPB)固定在平板上，向所述平板施加含有所述蛋白质(HPB)的待分析人类血清，-漂洗和洗涤平板，-向所述平板施加过氧化物酶标记的针对兔抗体的抗体(抗-IGrabbit-per)30分钟，以在兔单克隆抗体、本发明蛋白质和上述针对兔抗体的抗体之间形成三元复合体(抗-HPB-HPB-抗-IGrabbit-per)，-漂洗和洗涤平板，-使固定于平板上的过氧化物酶与其底物(商业试剂盒，化学发光过氧化物酶底物(Sigma))反应，在与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Sigma)反应30分钟结束时终止反应，-使用分光光度计测量前述步骤中形成的产物在450nm的光密度，将此测量结果和标准曲线比较，从而可以确定血清中本发明蛋白质(HPB)的浓度。
因此，上述测定方法使用ELISA型免疫测定方法(Engvall等，1971)。
可以使用其它方法测定血浆中本发明蛋白质的浓度，例如-电泳方法，或者-该蛋白质活性的定量。
本发明还涉及上述定义的测定方法的如下用途，-用于体外诊断与高磷酸盐血症相关的疾病，尤其是当根据以上定义的方法测定的上述蛋白质(尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)的量少于健康个体血液中正常存在的该蛋白质的量时，或者-用于体外诊断与低磷酸盐血症相关的疾病，尤其是当根据以上定义的方法测定的上述蛋白质(尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)的量多于健康个体血液中正常存在的该蛋白质的量时，或者-用于体外诊断个体对此类病状的易感性。
本发明蛋白质的水平是心血管疾病危险易感性的指标。因此，具有低水平的所述蛋白质的个体将具有更高水平的游离磷酸，该磷酸将与血浆中钙一起沉淀以形成磷酸钙块，磷酸钙块是加剧尤其是心血管疾病或关节炎风险的因子。
该蛋白质的异常水平也是已存在的病状的征兆。例如，高磷酸盐血症能够触发蛋白质产量的增加以限制磷酸水平。低水平也能够揭示功能失调。
本发明还涉及上述的用途，用于在体外诊断与高磷酸盐血症相关的疾病(例如心血管疾病，尤其是与动脉粥样化斑块(atheromaplaques)的形成相关的心血管疾病)，或者用于体外诊断个体发生上述疾病之一的易感性。
本发明还涉及上述用途，用于体外诊断与低磷酸盐血症相关的疾病、或者用于体外诊断个体发生这些疾病的易感性。
在表征与低磷酸盐血症相关的疾病的临床或生理学征兆中，可以提及的是-骨的脱矿质化，-低磷酸盐血症的肌肉表现，其包括影响骨骼肌的近端肌病和影响平滑肌的吞咽困难和肠梗阻，-由于ATP缺乏而致的心肺功能缺陷(cardio pulmonarydeficiencies)，和-代谢性脑病变。
图1表示纯化人对氧磷酶和本发明蛋白质SEQ ID NO2中得到的最终级分的SDS-PAGE凝胶。
A道对应于分子量标记，B、C和D道对应于来源于不同袋的人类血浆的三个不同纯化产物。所有三者均包含人对氧磷酶和磷酸结合蛋白。
图2图示与磷酸分子结合的本发明蛋白质SEQ ID NO2的示意性结构。
图3对应于本发明蛋白质SEQ ID NO2的磷酸结合试验。
A至F道对应于来源于不同袋的人类血浆的本发明蛋白质的不同批次纯化产物；G道对应于1mg/ml的溶菌酶，H道对应于β-乳球蛋白。
图4是本发明蛋白质SEQ ID NO2和对氧磷酶的混合物的双向电泳凝胶。
图5是本发明的SEQ ID NO2的结晶蛋白质分子坐标。
实验部分蛋白质的分离蛋白质SEQ ID NO2根据Gan等的如下方法(1991)，从人血浆获得从Lyon-Beynost的Establissement de Transfusion Sanguine提供的冰冻血浆(大约200ml)袋中纯化蛋白质SEQ ID NO2。向血浆中加入1M(1％v/v)CaCl2，形成血纤蛋白凝块，通过过滤从血清中将之分离。然后血清与利用缓冲液A(Tris/HCl 50mM，CaCl21mM，NaCl4M，pH8)平衡的400ml亲和凝胶(Cibacron 3GA-琼脂糖，C-1535，Sigma)混和。在这些条件下，主要吸附HDL(“高密度脂蛋白”)。孵育6至8小时后，通过在2号烧结的多孔圆盘上过滤除去凝胶上未吸附的蛋白质。持续进行该洗涤，直到洗脱液中不再检测到蛋白质(280nmUV吸收)。然后用缓冲液B(Tris/HCl 50mM，CaCl21mM，pH8)平衡凝胶，再将凝胶放入XK50/30柱(Pharmacia)中。通过向缓冲液B中加入1g/l脱氧胆酸钠和0.1％ Triton X-100，进行洗脱。将显示芳基酯酶活性的级分注射在50ml阴离子交换凝胶(DEAE Sepharose FastFlow，Pharmacia)上，其中所述凝胶放置在XK26/70柱(Pharmacia)中并已经用缓冲液B和0.05％Triton X-100平衡。利用NaCl进行梯度洗脱。在87.5mM达到第一平台从而除去apo A-I(与对氧磷酶结合的蛋白质)、和大多数污染性蛋白质。人类对氧磷酶(PON1)大约在140mM NaCl浓度下洗脱。所有保留级分均显示对氧磷酶和芳基酯酶活性，这些活性根据以下试验验证。不合并这些洗脱的级分。所获级分的SDS-PAGE凝胶显示包含在38kDa至45kDa之间的条带(见图1)。每次纯化并不总是得到相同的表观质量分布。这种轻微的异质性可以由PON1上存在2个糖基化链来解释。
在这些批次中，除了PON1，还通过结晶、通过用C12-麦芽糖苷替代Triton以及使用硫酸铵作为沉淀剂分离出另一蛋白质。所获未知蛋白质的晶体通过放射晶体学进行表征，其对应于本发明序列SEQ ID NO2。结晶是目前纯化该蛋白质的唯一现有方法。
在1M NaCl存在下，在甘氨酸50mM/NaOH，CaCl21mM缓冲液(pH10.5)中测量对氧磷酶活性，并通过恒温调节在25℃的双光束分光光度计(Shimadzu UV 160A)确定该活性。根据412nm的吸光度变化，确定水解速度，其对应于作为时间的函数通过水解对氧磷释放的对硝基苯酚的形成，ε＝18290M-1cm-1(Smolen，1991)。
在Tris 50mM/HCl，CaCl21mM缓冲液，pH8中测量芳基酯酶活性，并通过恒温调节在25℃的双光束分光光度计(Shimadzu UV 160A)确定该活性。根据270nm的吸光度变化，确定水解速度，其对应于作为时间的函数通过水解乙酸苯基酯释放的苯酚的形成，ε＝1310M-1cm-1(Smolen，1991)。
结构通过X射线晶体学获得结晶的蛋白质SEQ ID NO2的结构。通过SIRAS(单同晶置换和反常散射)方法获得1.9_分辨率下的结构(图2)。
在ESRF的BM30线(Grenoble)上收集X射线衍射数据将晶体浸在含有铀盐的溶液中，获得重原子盐衍生物。
用XDS2000程序(Kabsch，1993)和CCP4软件包(COLLABORATIVECOMPUTATIONAL PROJECT，NUMBER 4，1994，“CCP4软件包蛋白质晶体学程序”，Acta Cryst.D50，760-763)对图像进行求积分、分级和组合。
使用CNS(BRUNGER，1998)和SnB(Weeks，1999)程序，以定位铀原子。使用SHARP程序(Copyright_ 2001-2002，The BusterDevelopment Group)以便通过SIRAS技术获得相位。
通过ARP/wARP(Perrakis，1997)程序，自动在电子密度图中构建了372个氨基酸。然后通过CNS程序修正此第一个模型。
由于电子密度图有非常良好的质量，故可以赋予该蛋白质的一级结构80％的可靠性。还可以定位磷酸分子。
所获结构根本不对应于人类对氧磷酶。通过从电子密度鉴定氨基酸所获得的序列说明，此人类蛋白质以及其基因在先前从未有过描述。因此，其是一种新蛋白质。
本发明蛋白质的结构显示出与大肠杆菌(Escherichia coli)磷酸结合蛋白质极大的同源性。此细菌中的该蛋白质的作用是跨周质转运磷酸。该细菌蛋白质存在于许多原核生物中但是未在真核生物中被发现。
电子密度还显示出磷酸分子与本发明新蛋白质结合，且结合方式与在大肠杆菌中的相同。
因此，可以得出如下结论来源于人类血浆的经表征的本发明蛋白质与该细菌蛋白质具有极大的同源性并且其能够结合并转运磷酸。
测序在凝胶中消化使用SDS-PAGE(未加热)通过电泳凝胶分离对氧磷酶-HPBP混合物。切出70kDa区域中对应于HPBP的几个条带。
利用自动消化系统Mass Prep Station(Waters Manchester，UK)，消化这些条带中包含的蛋白质。用50μl的25mM碳酸氢铵(NH4HCO3)和50μl乙腈洗涤凝胶条带2次。用50μl 10mM二硫苏糖醇溶液在57℃还原半胱氨酸，并用50μl 55mM碘代乙酰胺酰化。用乙腈脱水后，用10μl 12.5ng/μl改良的猪胰蛋白酶(Promega，Madisson，WI，U.S.A)或者用Lysobacter enzymogenes的Lys-C(Roche AppliedScience，Penzberg，Germany)在25mM NH4HCO3中酶促消化该蛋白质。消化在室温下过夜进行。用60％乙腈溶液和5％甲酸抽提切割的肽。
质谱分析MALDI-MS和MALDI-MS/MS在UltraflexTMTOF/TOF(Bruker，Daltonik GmbH，Bremen，德国)上进行MALDI-TOF质量测量。该仪器以25KV的最高加速电压以反射模式(refiectron mode)使用。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，制备在不锈钢靶上干燥的标准滴来准备样品。
仅使用肽(缓激肽1-7(m/z＝757.400)、人血管紧张素肽II(m/z＝1046.542)、人血管紧张素肽I(m/z＝1296.685)、P物质(m/z＝1347.735)、铃蟾肽(m/z＝1619.822)、肾素(m/z＝1758.933)、ACTH1-17(m/z＝2093.087)和ACTH 18-39(m/z＝2465.199))的已知溶液的单一同位素电荷峰，外部校准MALDI-MS谱。使用Flexanalysis 2.0程序自动注释这些单一同位素肽的质量。
利用分段的离子前体的“激光诱导分解”(LID)，不经在气相中的额外碰撞，获得亚稳态离子，通过分析该亚稳态离子获得了MS/MS谱。离子前体加速至8kV并利用时控离子门选择。这些碎片进一步在LIFT室中加速达到19kV，在通过离子反射器后测量其质量。
利用Full DeNovo Sequencing程序(Biotools，Bruker DaltonikGmbH，Bremen，德国)，对这些MS/MS谱之每一个进行从头测序。
Nano LC-MS/MS使用CapLC(Waters，Manchester，UK)进行Nano LC-MS/MS分析，其中所述CapLC与Q-TOF II正交四极杆(orthogonal hybridquadrupole)所加速的飞行时间质谱仪(Micromass，Manchester，UK)偶联。使用毛细管(Pepmap C18，75μm i.d.，15cm长，LC Packings)在200nL/min流速(通过分配前置柱保持恒定)下完成反相色谱分离。使用2pmol/μl GFP校准。
通过自动在MS模式和MS/MS模式间进行转换的MassLynx程序(Micromass，Manchester，UK)，控制质量数据获取。
产生的MS/MS谱逐个地从头测序，以便获得部分或完整序列。使用能够完全地处理.pkl文件以对每一个MS/MS谱从头自动测序的PepSeq程序(MassLynx，Micromass)和PEAKS Studio程序(Bioinformatics Solutions，Waterloo，Canada)，给出这些解释。
磷酸结合根据如下试验证实本发明蛋白质SEQ ID NO2对磷酸的结合将200μl本发明蛋白质SBQ ID NO2(图3的道A-F)或1mg/ml溶菌酶(G道)或β-乳球蛋白加至硝化纤维素上(通过抽吸方式进行点印迹)混和物在包含Tris 50mM；pH8.0；32P(10mCi/ml)2mM的混合中孵育2小时30分钟。
然后用Tris 50mM pH8.0漂洗2次1分钟，然后室温下暴露混合物45分钟。
然后可见(见图3)，本发明蛋白质已经结合放射性磷酸(A至F道)，而试验对照不与放射性磷酸结合(G和H道)。
蛋白质SEQ ID NO2的角色和用途为了分析该蛋白在血浆中的浓度，可以使用的方法是-电泳方法，-蛋白质的纯化，-该蛋白质的活性定量，-使用抗该蛋白质的多克隆/单克隆抗体，免疫测定该蛋白质。
与对氧磷酶联合双向电泳前述方案中描述的纯化的蛋白质(40μg)与100μl含有9.8M尿素、4％(v/v)Triton X100、2mM三丁基膦、0.2％(v/v)ampholine 3-10(Bio-Lytes 3-10；Bio-Rad)和0.001％(m/v)溴酚兰的溶液混和。使用Ready-to-Use聚丙烯酰胺凝胶条(IPG-Strips；Bio-Rad)(T4％；C3％)。Ampholine以共价方式结合聚丙烯酰胺，以致具有预先确立的线性pH梯度。所用pH梯度为3.0至10.0。
1.等电聚焦(IEF)使这些凝胶条与蛋白质样品在Protean IEF Cell装置(Bio-Rad)中接触，20℃活跃地重新水化(50V恒定)15小时。然后分3个阶段在20℃进行等电聚焦。首先，施加250V低电压15分钟；第二，经2小时自250V至4000V程序化梯度上升(安培数限制在50μA条)。第三，将电压在4000V恒定保持4小时。迁移后，凝胶条储存在-20℃。
根据前面的纯化方案，本发明HBPB与人类对氧磷酶(PON)(Fokine等，2003)共纯化。通过用上述方案制备双向凝胶，通过N端测序鉴定了2个点，分别为本发明蛋白质HPBP和人类对氧磷酶(见图4)。两个蛋白质具有几乎相同的分子量(大约40kDa)和不同的等电点(HPBP为6.9-8.5，PON1为4-5)。考虑到为了在凝胶上成功分离这2种蛋白质必需使用极端条件(9M尿素和4％triton)而且具有十分不同的等电点的这2个蛋白质在经过阴离子交换柱(DEAE sepharose)后仍保持被共纯化的状态，故得到结论这两个蛋白质通过形成复合物而联合。
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序列表<110>CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUEUNIVERSITE HENRI POINCARE DE NANCY<120>新的磷酸结合蛋白、含有它的药物组合物及其用途<130>WOB 03 BU CNR HPBP<150>FR 03/12729<151>2004-10-30<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>376<212>PRT<213>人<220>
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Pro Asp Val Leu Thr Ala Gly Phe Ala Pro Tyr Ile Gly Xaa Gly Ser20 25 30Gly Lys Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Asn Xaa Tyr Asn Gln Phe Gly35 40 45Thr Xaa Thr Thr Lys Xaa Val His Trp Ala Gly Ser Asp Ser Lys Leu50 55 60Thr Ala Xaa Xaa Leu Ala Thr Tyr Ala Ala Xaa Lys Xaa Pro Gly Trp65 70 75 80Gly Lys Leu Ile Xaa Val Pro Ser Val Ala Thr Ser Val Ala Ile Pro85 90 95Phe Arg Lys Ala Gly Xaa Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Lys Glu Leu100 105110Cys Gly Val Phe Ser Gly Arg Ile Ala Xaa Trp Ser Gly Ile Thr Gly115 120 125Ala Gly Arg Ser Gly Pro Ile Gln Val Val Tyr Arg Ala Glu Xaa Ser130 135 140Gly Thr Thr Glu Leu Phe Thr Arg Phe Leu Asn Ala Lys Cys Thr Thr145 150 155 160Gln Pro Gly Thr Phe Ala Val Thr Thr Val Phe Ala Asn Ser Tyr Ser165 170 175Leu Gly Leu Ser Pro Leu Ala Gly Ala Val Ala Ala Ile Gly Ser Val180 185 190Gly Val Met Ala Ala Asp Asn Asp Val Thr Thr Ala Gln Gly Arg Ile195 200 205Thr Tyr Ile Ser Pro Asp Phe Ala Ala Pro Xaa Leu Ala Gly Leu Xaa210 215 220Asp Ala Thr Lys Val Ala Arg Thr Gly Lys Gly Ser Ser Ser Gly Gly225 230 235 240Gly Ala Glu Gly Lys Ser Pro Ala Ala Ala Asn Xaa Ser Ala Ala Ile245 250 255Ser Val Val Pro Leu Pro Ala Ala Ala Xaa Arg Gly Asp Pro Asn Val260 265 270Trp Thr Pro Val Phe Gly Ala Val Thr Gly Gly Gly Val Val Ala Tyr275 280 285Pro Asp Ser Gly Tyr Pro Ile Leu Gly Phe Thr Asp Leu Ile Phe Ser290 295 300Glu Cys Tyr Ala Asn Ala Thr Gln Thr Gly Gln Val Arg Asn Phe Phe305 310 315 320Thr Lys His Tyr Gly Thr Ser Ala Asn Asp Asn Ala Ala Ile Gln Ala325 330 335
Asn Ala Phe Val Pro Leu Pro Ser Asn Trp Lys Ala Ala Val Arg Ala340 345 350Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Asn Ala Leu Ser Ile Gly Asp Ser Ala Val355 360 365Cys Gly Gly Lys Gly Arg Pro Glu370 375<210>2<211>376<212>PRT<213>人<400>2Asp Ile Asn Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Gln Lys Leu Tyr Leu Thr1 5 10 15Pro Asp Val Leu Thr Ala Gly Phe Ala Pro Tyr Ile Gly Val Gly Ser20 25 30Gly Lys Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Asn Lys Tyr Asn Gln Phe Gly35 40 45Thr Asp Thr Thr Lys Asn Val His Trp Ala Gly Ser Asp Ser Lys Leu50 55 60Thr Ala Thr Glu Leu Ala Thr Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Pro Gly Trp65 70 75 80Gly Lys Leu Ile Gln Val Pro Ser Val Ala Thr Ser Val Ala Ile Pro85 90 95Phe Arg Lys Ala Gly Ala Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Lys Glu Leu100 105 110Cys Gly Val Phe Ser Gly Arg Ile Ala Asp Trp Ser Gly Ile Thr Gly115 120 125Ala Gly Arg Ser Gly Pro Ile Gln Val Val Tyr Arg Ala Glu Ser Ser130 135 140Gly Thr Thr Glu Leu Phe Thr Arg Phe Leu Asn Ala Lys Cys Thr Thr145 150 155 160Gln Pro Gly Thr Phe Ala Val Thr Thr Val Phe Ala Asn Ser Tyr Ser165 170 175Leu Gly Leu Ser Pro Leu Ala Gly Ala Val Ala Ala Ile Gly Ser Val180 185 190Gly Val Met Ala Ala Asp Asn Asp Val Thr Thr Ala Gln Gly Arg Ile195 200 205Thr Tyr Ile Ser Pro Asp Phe Ala Ala Pro Thr Leu Ala Gly Leu Asp210 215 220Asp Ala Thr Lys Val Ala Arg Thr Gly Lys Gly Ser Ser Ser Gly Gly225 230 235 240
Gly Ala Glu Gly Lys Ser Pro Ala Ala Ala Asn Val Ser Ala Ala Ile245 250 255Ser Val Val Pro Leu Pro Ala Ala Ala Asp Arg Gly Asp Pro Asn Val260 265 270Trp Thr Pro Val Phe Gly Ala Val Thr Gly Gly Gly Val Val Ala Tyr275 280 285Pro Asp Ser Gly Tyr Pro Ile Leu Gly Phe Thr Asp Leu Ile Phe Ser290 295 300Glu Cys Tyr Ala Asn Ala Thr Gln Thr Gly Gln Val Arg Asn Phe Phe305 310 315 320Thr Lys His Tyr Gly Thr Ser Ala Asn Asp Asn Ala Ala Ile Gln Ala325 330 335Asn Ala Phe Val Pro Leu Pro Ser Asn Trp Lys Ala Ala Val Arg Ala340 345 350Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Asn Ala Leu Ser Ile Gly Asp Ser Ala Val355 360 365Cys Gly Gly Lys Gly Arg Pro Glu370 375<210>3<211>376<212>PRT<213>人<400>3Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Glu Lys Leu Tyr Leu Thr1 5 10 15Pro Asp Val Leu Thr Ala Gly Phe Ala Pro Tyr Ile Gly Thr Gly Ser20 25 30Gly Lys Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Asn Ser Tyr Asn Gln Phe Gly35 40 45Thr Asn Thr Thr Lys Asp Val His Trp Ala Gly Ser Asp Ser Lys Leu50 55 60Thr Ala Ser Gln Leu Ala Thr Tyr Ala Ala Asn Lys Gln Pro Gly Trp65 70 75 80Gly Lys Leu Ile Glu Val Pro Ser Val Ala Thr Ser Val Ala Ile Pro85 90 95Phe Arg Lys Ala Gly Gly Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Lys Glu Leu100 105 110Cys Gly Val Phe Ser Gly Arg Ile Ala Asn Trp Ser Gly Ile Thr Gly115 120 125Ala Gly Arg Ser Gly Pro Ile Gln Val Val Tyr Arg Ala Glu Val Ser130 135 140
Gly Thr Thr Glu Leu Phe Thr Arg Phe Leu Asn Ala Lys Cys Thr Thr145 150 155 160Gln Pro Gly Thr Phe Ala Val Thr Thr Val Phe Ala Asn Ser Tyr Ser165 170 175Leu Gly Leu Ser Pro Leu Ala Gly Ala Val Ala Ala Ile Gly Ser Val180 185 190Gly Val Met Ala Ala Asp Asn Asp Val Thr Thr Ala Gln Gly Arg Ile195 200 205Thr Tyr Ile Ser Pro Asp Phe Ala Ala Pro Ser Leu Ala Gly Leu Asn210 215 220Asp Ala Thr Lys Val Ala Arg Thr Gly Lys Gly Ser Ser Ser Gly Gly225 230 235 240Gly Ala Glu Gly Lys Ser Pro Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ala Ala Ile245 250 255Ser Val Val Pro Leu Pro Ala Ala Ala Asn Arg Gly Asp Pro Asn Val260 265 270Trp Thr Pro Val Phe Gly Ala Val Thr Gly Gly Gly Val Val Ala Tyr275 280 285Pro Asp Ser Gly Tyr Pro Ile Leu Gly Phe Thr Asp Leu Ile Phe Ser290 295 300Glu Cys Tyr Ala Asn Ala Thr Gln Thr Gly Gln Val Arg Asn Phe Phe305 310 315 320Thr Lys His Tyr Gly Thr Ser Ala Asn Asp Asn Ala Ala Ile Gln Ala325 330 335Asn Ala Phe Val Pro Leu Pro Ser Asn Trp Lys Ala Ala Val Arg Ala340 345 350Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Asn Ala Leu Ser Ile Gly Asp Ser Ala Val355 360 365Cys Gly Gly Lys Gly Arg Pro Glu370 375<210>4<211>355<212>PRT<213>人<400>4Met Ala Lys Leu Ile Ala Leu Thr Leu Leu Gly Met Gly Leu Ala Leu1 5 10 15Phe Arg Asn His Gln Ser Ser Tyr Gln Thr Arg Leu Asn Ala Leu Arg20 25 30Glu Val Gln Pro Val Glu Leu Pro Asn Cys Asn Leu Val Lys Gly Ile35 40 45
Glu Thr Gly Ser Glu Asp Met Glu Ile Leu Pro Asn Gly Leu Ala Phe50 55 60Ile Ser Ser Gly Leu Lys Tyr Pro Gly Ile Lys Ser Phe Asn Pro Asn65 70 75 80Ser Pro Gly Lys Ile Leu Leu Met Asp Leu Asn Glu Glu Asp Pro Thr85 90 95Val Leu Glu Leu Gly Ile Thr Gly Ser Lys Phe Asp Val Ser Ser Phe100 105 110Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Thr Asp Glu Asp Asn Ala Met Tyr115 120 125Leu Leu Val Val Asn His Pro Asp Ala Lys Ser Thr Val Glu Leu Phe130 135 140Lys Phe Gln Glu Glu Glu Lys Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Ile Arg145 150 155 160His Lys Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asp Ile Val Ala Val Gly Pro Glu165 170 175His Phe Tyr Gly Thr Asn Asp His Tyr Phe Leu Asp Pro Tyr Leu Gln180 185 190Ser Trp Glu Met Tyr Leu Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Val Val Tyr Tyr195 200 205Ser Pro Ser Glu Val Arg Val Val Ala Glu Gly Phe Asp Phe Ala Asn210 215 220Gly Ile Asn Ile Ser Pro Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala Glu Leu225 230 235 240Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp Thr Leu245 250 255Thr Pro Leu Lys Ser Leu Asp Phe Asn Thr Leu Val Asp Asn Ile Ser260 265 270Val Asp Pro Glu Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly275 280 285Met Lys Ile Phe Phe Tyr Asp Ser Glu Asn Pro Pro Ala Ser Glu Val290 295 300Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Thr Glu Glu Pro Lys Val Thr Gln Val305 310 315 320Tyr Ala Glu Asn Gly Thr Val Leu Gln Gly Ser Thr Val Ala Ser Val325 330 335Tyr Lys Gly Lys Leu Leu Ile Gly Thr Val Phe His Lys Ala Leu Tyr340 345 350Cys Glu Leu355
<210>5<211>354<212>PRT<213>人<400>5Met Gly Ala Trp Val Gly Cys Gly Leu Ala Gly Asp Arg Ala Gly Phe1 5 10 15Leu Gly Glu Arg Leu Leu Ala Leu Arg Asn Arg Leu Lys Ala Ser Arg20 25 30Glu Val Glu Ser Val Asp Leu Pro His Cys His Leu Ile Lys Gly Ile35 40 45Glu Ala Gly Ser Glu Asp Ile Asp Ile Leu Pro Asn Gly Leu Ala Phe50 55 60Phe Ser Val Gly Leu Lys Phe Pro Gly Leu His Ser Phe Ala Pro Asp65 70 75 80Lys Pro Gly Gly Ile Leu Met Met Asp Leu Lys Glu Glu Lys Pro Arg85 90 95Ala Arg Glu Leu Arg Ile Ser Arg Gly Phe Asp Leu Ala Ser Phe Asn100 105 110Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile Asp Asn Asp Asp Thr Val Tyr Leu115 120 125Phe Val Val Asn His Pro Glu Phe Lys Asn Thr Val Glu Ile Phe Lys130 135 140Phe Glu Glu Ala Glu Asn Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Val Lys His145 150 155 160Glu Leu Leu Pro Ser Val Asn Asp Ile Thr Ala Val Gly Pro Ala His165 170 175Phe Tyr Ala Thr Asn Asp His Tyr Phe Ser Asp Pro Phe Leu Lys Tyr180 185 190Leu Glu Thr Tyr Leu Asn Leu His Trp Ala Asn Val Val Tyr Tyr Ser195 200 205Pro Asn Glu Val Lys Val Val Ala Glu Gly Phe Asp Ser Ala Asn Gly210 215 220Ile Asn Ile Ser Pro Asp Asp Lys Tyr Ile Tyr Val Ala Asp Ile Leu225 230 235 240Ala His Glu Ile His Val Leu Glu Lys His Thr Asn Met Asn Leu Thr245 250 255Gln Leu Lys Val Leu Glu Leu Asp Thr Leu Val Asp Asn Leu Ser Ile260 265 270Asp Pro Ser Ser Gly Asp Ile Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly Gln275 280 285
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Pro Arg Glu Val Lys Val Val Ala Lys Gly Phe Cys Ser Ala Asn Gly210 215 220Ile Thr Val Ser Ala Asp Gln Lys Tyr Val Tyr Val Ala Asp Val Ala225 230 235240Ala Lys Asn Ile His Ile Met Glu Lys His Asp Asn Trp Asp Leu Thr245 250255Gln Leu Lys Val Ile Gln Leu Gly Thr Leu Val Asp Asn Leu Thr Val260 265 270Asp Pro Ala Thr Gly Asp Ile Leu Ala Gly Cys His Pro Asn Pro Met275 280 285Lys Leu Leu Asn Tyr Asn Pro Glu Asp Pro Pro Gly Ser Glu Val Leu290 295 300Arg Ile Gln Asn Val Leu Ser Glu Lys Pro Arg Val Ser Thr Val Tyr305 310 315 320Ala Asn A5n Gly Ser Val Leu Gln Gly Thr Ser Val Ala Ser Val Tyr325 330 335His Gly Lys Ile Leu Ile Gly Thr Val Phe His Lys Thr Leu Tyr Cys340 345 350Glu Leu<210>7<211>359<212>PRT<213>家兔<400>7Met Ala Lys Leu Thr Ala Leu Thr Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu1 5 10 15Phe Asp Gly Gln Lys Ser Ser Phe Gln Thr Arg Phe Asn Val His Arg20 25 30Glu Val Thr Pro Val Glu Leu Pro Asn Cys Asn Leu Val Lys Gly Ile35 40 45Asp Asn Gly Ser Glu Asp Leu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Leu Ala Phe50 55 60Ile Ser Ala Gly Leu Lys Tyr Pro Gly Ile Met Ser Phe Asp Pro Asp65 70 75 80Lys Pro Gly Lys Ile Leu Leu Met Asp Leu Asn Glu Lys Asp Pro Val85 90 95Val Leu Glu Leu Ser Ile Thr Gly Ser Thr Phe Asp Leu Ser Ser Phe100 105 110Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Thr Asp Glu Asp Asn Ile Val Tyr115 120 125
Leu Met Val Val Asn His Pro Asp Ser Lys Ser Thr Val Glu Leu Phe130 135 140Lys Phe Gln Glu Lys Glu Lys Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Ile Arg145 150 155 160His Lys Leu Leu Pro Ser Val Asn Asp Ile Val Ala Val Gly Pro Glu165 170 175His Phe Tyr Ala Thr Asn Asp His Tyr Phe Ile Asp Pro Tyr Leu Lys180 185 190Ser Trp Glu Met His Leu Gly Leu Ala Trp Ser Phe Val Thr Tyr Tyr195 200 205Ser Pro Asn Asp Val Arg Val Val Ala Glu Gly Phe Asp Phe Ala Asn210 215 220Gly Ile Asn Ile Ser Pro Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala Glu Leu225 230 235 240Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp Thr Leu245 250 255Thr Pro Leu Lys Ser Leu Asp Phe Asn Thr Leu Val Asp Asn Ile Ser260 265 270Val Asp Pro Val Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly275 280 285Met Arg Ile Phe Tyr Tyr Asp Pro Lys Asn Pro Pro Ala Ser Glu Val290 295 300Leu Arg Ile Gln Asp Ile Leu Ser Lys Glu Pro Lys Val Thr Val Ala305 310 315 320Tyr Ala Glu Asn Gly Thr Val Leu Gln Gly Ser Thr Val Ala Ala Val325 330 335Tyr Lys Gly Lys Met Leu Val Gly Thr Val Phe His Lys Ala Leu Tyr340 345 350Cys Glu Leu Ser Gln Ala Asn355<210>8<211>355<212>PRT<213>褐鼠<400>8Met Ala Lys Leu Leu Gly Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Leu Ala Leu1 5 10 15Tyr Lys Asn His Arg Ser Ser Tyr Gln Thr Arg Leu Asn Ala Phe Arg20 25 30Glu Val Thr Pro Val Asp Leu Pro Asn Cys Thr Leu Val Lys Gly Ile35 40 45
Glu Ala Gly Ala Glu Asp Leu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Leu Thr Phe50 55 60Phe Ser Thr Phe Leu Lys Tyr Pro Gly Ile Lys Ser Phe Asp Pro Ser65 70 75 80Lys Pro Gly Lys Ile Leu Leu Met Asp Leu Asn Glu Lys Glu Pro Ala85 90 95Val Ser Glu Leu Ala Ile Met Gly Asn Thr Leu Asp Met Ser Ser Phe100 105 110Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile Asp Glu Asp Asn Thr Val Tyr115 120 125Leu Leu Val Val Ser His Pro Asp Ser Ser Ser Thr Val Glu Val Phe130 135 140Lys Phe Gln Glu Glu Glu Arg Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Ile Thr145 150 155 160His Glu Leu Leu Pro Ser Ile Asn Asp Ile Ala Ala Val Gly Pro Glu165 170 175Ser Phe Tyr Ala Thr Asn Asp His Tyr Phe Ala Asp Pro Tyr Leu Arg180 185 190Ser Trp Glu Met Tyr Leu Gly Leu Ser Trp Ser Asn Val Val Tyr Tyr195 200 205Ser Pro Asp Lys Val Arg Val Val Ala Asp Gly Phe Asp Phe Ala Asn210 215 220Gly Ile Gly Ile Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala Glu Leu225 230 235 240Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp Thr Leu245 250 255Thr Pro Leu Lys Val Leu Ser Phe Asp Thr Leu Val Asp Asn Ile Ser260 265 270Val Asp Pro Val Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly275 280 285Met Arg Ile Phe Phe Tyr Asp Ser Glu Asn Pro Pro Gly Ser Glu Val290 295 300Leu Arg Ile Gln Ser Ile Leu Ser Glu Asp Pro Lys Val Thr Val Val305 310 315 320Tyr Ala Glu Asn Gly Thr Val Leu Gln Gly Thr Thr Val Ala Ala Val325 330 335Tyr Lys Gly Lys Leu Leu Ile Gly Thr Val Phe His Arg Ala Leu Cys340 345 350Cys Tyr Leu355
<210>9<211>355<212>PRT<213>小家鼠<400>9Met Ala Lys Leu Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Leu Ala Leu1 510 15Tyr Lys Asn His Arg Ser Ser Tyr Gln Thr Arg Leu Asn Ala Phe Arg20 25 30Glu Val Thr Pro Val Glu Leu Pro Asn Cys Asn Leu Val Lys Gly Ile35 40 45Glu Thr Gly Ala Glu Asp Leu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Leu Thr Phe50 55 60Phe Ser Thr Gly Leu Lys Tyr Pro Gly Ile Lys Ser Phe Asp Pro Ser65 70 75 80Lys Pro Gly Lys Ile Leu Leu Met Asp Leu Asn Lys Lys Glu Pro Ala85 90 95Val Ser Glu Leu Glu Ile Ile Gly Asn Thr Leu Asp Ile Ser Ser Phe100 105 110Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Thr Asp Glu Asp Asn Thr Val Tyr115 120 125Leu Leu Val Val Asn His Pro Asp Ser Ser Ser Thr Val Glu Val Phe130 135 140Lys Phe Gln Glu Glu Glu Arg Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Ile Thr145 150 155 160His Glu Leu Leu Pro Ser Ile Asn Asp Ile Ala Ala Ile Gly Pro Glu165 170 175Ser Phe Tyr Ala Thr Asn Asp His Tyr Phe Ala Asp Pro Tyr Leu Arg180 185 190Ser Trp Glu Met Tyr Leu Gly Leu Ser Trp Ser Asn Val Val Tyr Tyr195 200 205Ser Pro Asp Lys Val Gln Val Val Ala Glu Gly Phe Asp Phe Ala Asn210 215 220Gly Ile Gly Ile Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala Glu Leu225 230 235 240Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp Thr Leu245 250 255Thr Pro Leu Lys Val Leu Asn Phe Asp Thr Leu Val Asp Asn Ile Ser260 265 270Val Asp Pro Val Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly275 280 285
Met Arg Ile Phe Phe Tyr Asp Ala Glu Asn Pro Pro Gly Ser Glu Val290 295 300Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Ser Glu Asp Pro Lys Ile Thr Val Val305 310 315 320Tyr Ala Glu Asn Gly Thr Val Leu Gln Gly Thr Thr Val Ala Ser Val325 330 335Tyr Lys Gly Lys Leu Leu Ile Gly Thr Val Phe His Lys Ala Leu Tyr340 345 350Cys Asp Leu355<210>10<211>354<212>PRT<213>小家鼠<400>10Met Gly Arg Met Val Ala Leu Gly Phe Ala Gly His Arg Val Ala Leu1 5 10 15Leu Gly Glu Arg Phe Leu Ala Leu Ser Ser Arg Leu Lys Gly Ser Arg20 25 30Glu Val Glu Ser Val Asp Leu Pro Asn Cys His Leu Ile Lys Gly Ile35 40 45Glu Thr Gly Ala Glu Asp Ile Asp Ile Leu Pro Asn Gly Leu Ala Phe50 55 60Phe Ser Val Gly Leu Lys Phe Pro Gly Leu His Ser Phe Ala Pro Asp65 70 75 80Lys Pro Gly Gly Ile Leu Met Met Asp Leu Asp Glu Arg Pro Pro Ser85 90 95Leu Glu Glu Leu Arg Val Ser Trp Gly Phe Asp Leu Ala Ser Phe Asn100 105 110Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile Asp Asp Asp Asp Thr Val Tyr Leu115 120 125Phe Val Val Asn His Pro Gln Phe Ser Asn Thr Val Glu Ile Phe Lys130 135 140Phe Gln Glu Ala Glu Asn Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Ile Lys His145 150 155 160Glu Leu Leu Pro Ser Val Asn Asp Ile Ile Ala Val Gly Pro Ala His165 170 175Phe Tyr Ala Thr Asn Asp His Tyr Phe Ser Asp Pro Phe Leu Lys Tyr180 185 190Leu Glu Thr Tyr Leu Asn Leu His Trp Ala Asn Val Val Tyr Tyr Ser195 200 205
Pro Glu Glu Val Lys Leu Val Ala Glu Gly Phe Asp Ser Ala Asn Gly210 215 220Ile Asn Ile Ser Pro Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Val Ala Asp Ile Leu225 230 235 240Ala His Glu Ile His Val Leu Glu Lys Gln Pro Asn Met Asn Leu Thr245 250 255Gln Leu Lys Val Leu Gln Leu Gly Thr Leu Val Asp Asn Leu Ser Ile260 265 270Asp Pro Ser Ser Gly Asp Ile Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly Gln275 280 285Arg Leu Phe Val Tyr His Pro Asn His Pro Pro Thr Ser Glu Val Leu290 295 300Arg Ile Gln Asn Ile Leu Ser Glu Lys Pro Ser Val Thr Thr Val Tyr305 310 315 320Ile Asn Asn Gly Ser Val Leu Gln Gly Ser Ser Val Ala Thr Ile Tyr325 330 335Asp Arg Lys Leu Leu Val Gly Thr Leu Tyr Gln Lys Ala Leu Tyr Cys340 345 350Glu Leu<210>11<211>354<212>PRT<213>小家鼠<400>11Met Gly Lys Leu Val Ala Leu Thr Leu Leu Gly Ala Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Ile Gly Glu Arg Leu Leu Asn Phe Arg Glu Arg Val Ser Thr Thr Arg20 25 30Glu Ile Lys Ala Thr Glu Pro Gln Asn Cys His Leu Ile Glu Gly Leu35 40 45Glu Asn Gly Ser Glu Asp Ile Asp Ile Leu Pro Ser Gly Leu Ala Phe50 55 60Ile Ser Thr Gly Leu Lys Tyr Pro Gly Met Pro Ala Phe Ala Pro Asp65 70 75 80Lys Pro Gly Arg Ile Phe Leu Met Asp Leu Asn Glu Gln Asn Pro Glu85 90 95Ala Gln Ala Leu Glu Ile Ser Gly Gly Leu Asp Gln Glu Ser Leu Asn100 105 110Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile Asp Lys Asp Asn Thr Ala Tyr Leu115 120 125
Tyr Val Val Asn His Pro Asn Met Asp Ser Thr Val Glu Ile Phe Lys130 135 140Phe Glu Glu Gln Gln Arg Ser Leu Ile His Leu Lys Thr Leu Lys His145 150 155 160Glu Leu Leu Lys Ser Val Asn Asp Ile Val Val Leu Gly Pro Glu Gln165 170 175Phe Tyr Ala Thr Arg Asp His Tyr Phe Thr Ser Tyr Phe Leu Val Leu180 185 190Leu Glu Met Ile Leu Asp Pro His Trp Thr Ser Val Val Phe Tyr Ser195 200 205Pro Lys Glu Val Lys Val Val Ala Gln Gly Phe Ser Ser Ala Asn Gly210 215 220Ile Thr Val Ser Leu Asp Gln Lys Phe Val Tyr Val Ala Asp Val Thr225 230 235 240Ala Lys Asn Ile His Ile Met Lys Lys His Asp Asn Trp Asp Leu Thr245 250 255Pro Val Lys Val Ile Gln Leu Gly Thr Leu Val Asp Asn Leu Thr Val260 265 270Asp Pro Ala Thr Gly Asp Ile Leu Ala Gly Cys His Pro Asn Pro Met275 280 285Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Pro Glu Asp Pro Pro Gly Ser Glu Val Leu290 295 300Arg Ile Gln Asp Ser Leu Ser Asp Lys Pro Arg Val Ser Thr Leu Tyr305 310 315 320Ala Asn Asn Gly Ser Val Leu Gln Gly Ser Thr Val Ala Ser Val Tyr325 330 335His Lys Arg Met Leu Ile Gly Thr Ile Phe His Lys Ala Leu Tyr Cys340 345 350Asp Leu
权利要求
1.一种蛋白质，特征在于，其包含或其组成为-序列SEQ ID NO1，-或衍生自序列SEQ ID NO1的任何序列，尤其是通过置换、缺失或添加1或多个氨基酸而衍生得到的序列，条件是所述衍生的序列可结合磷酸，-或与序列SEQ ID NO1同源的任何序列，优选地与序列SEQ IDNO1有至少大约80％同源性，条件是所述同源序列可结合磷酸，-或以上定义的序列之一的任何片段，条件是所述片段可结合磷酸，尤其是由序列SEQ ID NO1中的至少大约20个连续氨基酸组成的任何片段。
2.根据权利要求1的蛋白质，特征在于，其包含或其组成为-序列SEQ ID NO2或序列SEQ ID NO3，-或者衍生自序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的任何序列，尤其是通过置换、缺失或添加1或多个氨基酸而衍生得到的序列，条件是所述衍生的序列可结合磷酸，-或与序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3同源的任何序列，优选地与序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3有至少大约80％同源性，条件是所述同源序列可结合磷酸，-或以上定义的序列之一的任何片段，条件是所述片段可结合磷酸，尤其是由序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中的至少大约20个连续氨基酸组成的任何片段。
3.编码权利要求1或2中定义的蛋白质的核苷酸序列。
4.含有权利要求3的核苷酸序列的重组载体，尤其是质粒、粘粒、噬菌体或病毒DNA。
5.权利要求4的重组载体，该载体含有使插入所述载体的权利要求3的核苷酸序列所编码的多肽在宿主细胞中表达所必需的元件。
6.宿主细胞，该宿主细胞尤其选自细菌、酵母、真菌细胞、植物细胞、或哺乳动物细胞，所述宿主细胞被权利要求4或5的重组载体转化。
7.含有权利要求1或2的蛋白质作为活性成分并组合含有可药用载体的药物组合物。
8.权利要求7的药物组合物，其包含序列SEQ ID NO2或SEQ IDNO3所表示的蛋白质作为活性成分。
9.权利要求8的药物组合物，其中权利要求1或2中定义的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3，与对氧磷酶蛋白质变体，尤其是SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO11组合。
10.权利要求1或2的蛋白质，尤其是序列SEQ ID NO2或SEQID NO3所表示的蛋白质，在制备药物中的用途，所述药物旨在用于预防或治疗关节炎或与高磷酸盐血症相关的疾病，例如心血管疾病，或者在与对氧磷酶蛋白质变体，尤其是SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO11联合的情况下在预防或治疗由杀虫剂或神经毒剂如梭曼、VX、沙林或塔崩引起的中毒的框架中使用，或者在治疗动脉粥样硬化的框架中使用。
11.组合产品，其包含至少一种权利要求1或2的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3，和至少一种对氧磷酶蛋白质变体，尤其是SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO11，其中所述至少一种权利要求1或2的蛋白质和至少一种对氧磷酶蛋白质变体同时或分开使用或者分散在一段时间内使用，以旨在预防或治疗由杀虫剂或神经毒剂如梭曼、VX、塔崩或沙林引起的中毒。
12.权利要求1或2的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的分析方法，特征在于其包括以下阶段-将抗权利要求1或2的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ IDNO3，的不同表位的兔单克隆抗体固定在平板上，向所述平板施加含有所述蛋白质的待分析人类血清，-漂洗和洗涤平板，-向所述平板施加用过氧化物酶标记的针对兔抗体的抗体30分钟，以在兔单克隆抗体、所述蛋白质和上述针对兔抗体的抗体之间形成三元复合体，-漂洗和洗涤平板，-使固定于平板上的过氧化物酶与其底物反应，且在与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应30分钟结束时终止反应，-使用分光光度计测量前述阶段中形成的产物在450nm的光密度，将此测量结果和标准曲线比较，从而能确定血清中存在的权利要求1或2的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的浓度。
13.权利要求12的分析方法的用途，用于体外诊断与高磷酸盐血症相关的疾病，尤其是当根据权利要求12的方法测定到的权利要求1或2的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的量少于健康个体血液中正常存在的该蛋白质的量时，或者用于体外诊断与低磷酸盐血症相关的疾病，尤其是当根据权利要求12的方法测定到的权利要求1或2的蛋白质，尤其是SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的量多于健康个体血液中正常存在的该蛋白质的量时，或者用于体外诊断个体对此类病状的易感性。
14.权利要求13的用途，用于在体外诊断与高磷酸盐血症相关的疾病，例如心血管疾病，尤其是与动脉粥样斑块的形成相关的心血管疾病，或者用于体外诊断个体发生上述疾病之一的易感性。
15.权利要求14的用途，用于体外诊断与低磷酸盐血症相关的疾病、或者用于体外诊断个体发生上述疾病之一的易感性。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质，特征在于，其包含或其组成为(i)序列SEQ ID NO1；(ii)或衍生自序列SEQ ID NO1的任何序列，尤其是通过置换、缺失或添加1或多个氨基酸而衍生得到的序列，条件是所述衍生序列结合磷酸；(iii)或与序列SEQ ID NO1同源的任何序列，优选地与序列SEQ ID NO1有至少大约80％同源性，条件是所述同源序列可结合磷酸，或(iv)以上定义的序列之一的任何片段，条件是所述片段可结合磷酸，尤其是由序列SEQ ID NO1中的至少大约20个连续氨基酸组成的任何片段。
文档编号A61K38/00GK1898261SQ200480038222
公开日2007年1月17日 申请日期2004年10月29日 优先权日2003年10月30日
发明者E·沙布里埃, C·孔特雷拉斯-马特尔, J·丰特西利亚-坎帕斯 申请人:国家科研中心, 亨利庞加莱南锡第一大学