缓激肽b1受体拮抗剂的制作方法

专利名称：缓激肽b1受体拮抗剂的制作方法
本申请要求2003年10月22日提交的美国临时申请No.60/513,913和2004年1月24日提交的美国临时申请No.60/538,929的优先权，这两个申请纳入本文作为参考。
背景技术：
在任何一天，单单在美国就有200多万人因慢性疼痛而丧失劳动能力(T.M.Jessell & D.D.Kelly，疼痛和痛觉丧失(Pain and Analgesia)，PRINCIPLES OFNEURAL SCIENCE，第3版(E.R.Kandel，J.H.Schwartz，T.M.Jessell，编，(1991))。不幸的是，目前对于疼痛的治疗只是部分有效，并且很多治疗还具有改变生活方式、虚弱、和/或危险的副作用。例如，非甾体抗炎药物(″NSAIDs″)如阿司匹林、布洛芬和消炎痛对炎性疼痛只具有中等效果，但它们对肾脏有毒性，并且高剂量易于造成胃肠刺激、溃疡、出血、心血管危险性增加以及意识错乱。用阿片样物质治疗的患者常常会出现意识错乱和便秘，长期的阿片样物质治疗与耐受性和依赖性有关。局部麻醉剂如利多卡因和mixelitine在抑制疼痛的同时引起正常感觉的丧失。此外，当全身性使用时，局部麻醉剂与心血管不良作用相关。因此，当前在慢性疼痛的治疗方面，仍然有些需要没有得到满足。
疼痛是一种知觉，它基于从环境接收到的信号，并由神经系统传递和解释(综述参见Millan，M.J.，疼痛的诱导纵览.Prog Neurobiol 571-164(1999))。有害刺激如热和接触使皮肤中专化的感觉受体发送信号到中枢神经系统(″CNS″)。这个过程称为伤害感受，介导该过程的外围感觉神经元是伤害性感受器。根据从伤害性感受器传递的信号的强度以及CNS对该信号的提取和加工，人将会或者不会感受到有害刺激的疼痛。当一个人的痛觉恰当地与刺激的强度相符时，疼痛起到其原有的保护功能。然而，一些组织损伤造成一种称为痛觉增敏或促伤害感受(pronociception)的现象，其中，因为人的疼痛阈值被降低了，所以相对无害的刺激被感知为剧烈的疼痛。炎症和神经损伤均可导致痛觉增敏。因此，患有如晒伤、骨关节炎，大肠炎，心炎，皮炎，肌炎，神经炎，炎性肠疾病，胶原脉管疾病(collagen vascular diseases)(包括风湿性关节炎和狼疮)等炎症病症的人，其痛感常常会增强。类似地，创伤、手术、截肢、脓疮、灼痛、胶原脉管疾病、脱髓鞘疾病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、中风、丘脑痛综合征、糖尿病、疱疹感染、获得性免疫缺陷综合征(″AIDS″)、毒素和化疗造成的神经损伤都会造成疼痛过大。
由于对伤害性感受器在正常和痛觉增敏条件下传导外部信号的机制有了更好的了解，可以靶向痛觉增敏所涉及的过程，来抑制疼痛阈值的降低，从而减少疼痛的程度。
缓激肽(BK)和相关肽即胰激肽(Lys-BK)(见表3)介导激肽对心血管和肾系统的生理作用。然而，BK和胰激肽这些活性肽被血浆和其它生物体液中的肽酶迅速降解，并被从多种细胞中释放出来，因而据报道BK在血浆中的半衰期约为17秒(1)。在身体中，BK和胰激肽被羧肽酶N迅速代谢，该酶将羧基末端的精氨酸除去，产生去精氨酸化(des-Arg)的BK或去精氨酸化的血管舒展素。去精氨酸化-胰激肽是存在于人中的主要激肽之一，它介导人中激肽的病理生理学(pathphysiological)作用。去精氨酸化BK或去精氨酸化-胰激肽除了是有力的促炎症反应肽之外，还已知它们诱导血管舒张、血管渗透性和支气管收缩(综述见Regoli和Barabe，缓激肽和相关激肽的药理学，病理学Reviews，32(1)l-46(1980))。此外，去精氨酸化BK和去精氨酸化-胰激肽似乎对于炎症和炎性疼痛是尤其重要的介导者，并且参与这些过程的维持。还有很多证据表明，在以疼痛为显著特征的病症如脓毒性休克、关节炎、心绞痛和偏头痛中，去精氨酸化-胰激肽的产生过量。
介导激肽多效作用的膜受体是两个不同的类型，称为B1和B2。已从很多物种包括人中克隆并测序了这两种类型的受体(Menke，等，人b1缓激肽受体的表达性克隆.J.Biol.Chem.26921583-21586(1994)；Hess等，人缓激肽(BK-2)受体的克隆和病理学鉴定.Biochem.Biophys.Res.Commun.184，260-268(1992))。它们是典型的G蛋白偶联受体，有7个推定的跨膜结构域。在各种组织中，BK受体偶联于每一种已知的第二信使。B2受体似乎是缓激肽受体最主要的形式，它对BK的亲和性更高。基本上，所有对缓激肽的正常生理反应和很多病理生理逻辑性反应都是B2受体介导的。
另一方面，B1受体对去精氨酸化BK相对于对BK的亲和性更高(见表3)，而去精氨酸化BK对于B2受体没有活性。此外，B1受体通常不在大多数组织中表达。它们的表达受伤害或组织损伤以及在某些类型的慢性炎症或全身性创伤中被诱导(Marceau，F.，等，激肽B1受体综述.Immunpharmacology，301-26(1995))。而且，在家兔、大鼠和猪中，给予脂多糖(LPS)或炎性细胞因子之后，B1受体介导的反应从零水平上调(Marceau等，(1998))。
激肽的疼痛诱导特性以及B1受体的可诱导性表达使B1受体成为开发能够直接特异性作用于受伤组织而对正常组织的作用最小的抗炎、抗伤害性疼痛、抗痛觉增敏和镇痛药物时令人感兴趣的靶点。虽然已鉴定了多种靶向B1受体的肽拮抗剂，但由于它们被组织和血清肽酶非常迅速的降解以及有效的肾清除作用，这些拮抗剂在作为治疗性镇痛药方面的发展受到其较差的有效半衰期的限制。最近，在体外稳定性试验中已证明具有非天然氨基酸取代基的肽类似物对肽酶有抗性(综述见Regoli等，缓激肽受体和它们的拮抗剂.European Journalof Pharmacology，3481-10(1998)；Stewart，J.M.，等，缓激肽拮抗剂现有进展和未来展望.Immunopharmacology，43155-161(1999)；和Stewart，J.M.，等，代谢抗性缓激肽拮抗剂发展和应用.Biol.Chem.，38237-41(2001))。
已广泛认可，蛋白质与聚(乙二醇)(PEG)的共价偶联是一种显著延长治疗性蛋白质的体内循环半衰期的方法。PEG化主要是通过延迟肾清除作用(因为PEG部分大大增加了蛋白质的水力半径)来实现其作用(Zalipsky，S.，等，利用官能化聚(乙二醇)修饰多肽，聚(乙二醇)化学性质生物技术和生物医药应用，J.M.Harris，编.(1992)，Plenum PressNew York.p.347-370.)。PEG化对蛋白质的其它益处包括增加其溶解度、抗蛋白水解性降解和减少治疗性多肽的免疫原性。PEG化的优点已经从几种PEG化蛋白，包括PEG-腺苷脱氨酶(AdagenTM/Enzon Corp.)、PEG-L-天冬酰胺酶(OncasparTM/Enzon Corp.)、PEG-干扰素α-2b (PEG-IntronTM/Schering/Enzon)、PEG-干扰素α-2a(PEGASYSTM/Roche)和PEG-G-CSF(NeulastaTM/Amgen)的商品化以及其它很多临床试验阶段的药物所证实。另一方面，小的治疗性肽的PEG化具有特殊的难点，还没有被广泛应用。肽PEG化中最大的障碍之一是一定要保证最终的偶联物中保留了生物学活性。因为治疗性肽常常只包含活性所需的最小序列，因此它们往往很小，所以相对来说不耐受取代。相对于这些肽本身，PEG部分大得不成比例，因此更加有可能在空间上干扰肽受体结合的特异性相互作用，而这种相互作用是活性所需的。所以肽耐受PEG化并仍保持有用治疗药物的足够特异活性的能力是非常不可预料的，必须经过验证确定(Morpurogo，等，用PEG选择性烷化和酰化一种生长抑素类似物的α和ε氨基基团特定化学用于优化生物偶联物(Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates).Bioconjugate Chem.131238-1243(2002))。
很显然，需要新的、安全和有效的治疗炎症和疼痛的方法。提供这样一种B1特异性肽拮抗剂是有利的，通过增加B1特异性肽拮抗剂的循环周期(延迟清除)、溶解度、稳定性，和/或减少该分子的免疫原性，来获得在治疗过程中能够在身体中具有更好耐受性。循环半衰期增加将使给药频率减小，而给药频率减小将使医师和患者都更加方便，对于自我给药的患者尤其有用。给药频率减小的其它好处包括给予患者的药物减少以及顺应性增加。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供B1受体的新型结合制剂，与已知B1拮抗剂相比，这些制剂在体内具有明确的优良的药代动力学特性，并仍然充分拮抗B1受体的活性，从而可用于治疗或预防以下疾病炎症、疼痛和其它B1介导的病症，包括但不限于，哮喘和过敏性鼻炎。本发明提供的这些药物是B1受体的新型肽拮抗剂形式和偶联的肽拮抗剂形式。在一个实施方式中，本发明的新型B1受体肽拮抗剂包含SEQ ID NO15-54的任一所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方式，将独立地选自20种遗传编码的L-氨基酸或立体异构的D-氨基酸的一种或多种(优选1-9种)氨基酸残基偶联到SEQ ID NO15-54所示的肽序列的一端或两端。
在另一个实施方式中，本发明还提供偶联的肽，与已知B1肽拮抗剂相比，这些偶联的肽在体内具有明确的优良的药代动力学特性，并且仍然充分结合并拮抗B1受体活性从而能够在治疗上应用。
本发明的一个方面包括式(I)的偶联肽F-[(X1)-(Y1)n]I其中F是共价结合于X1或Y1的运载体(优选F是PEG部分或其衍生物)；X1和Y1各自分别独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；L1和L2各自独立为接头；n是0-3；和
P1和P2各自独立为缓激肽B1受体的肽拮抗剂。优选P1和P2包含SEQ ID NO5-26、43-60的任一所示的氨基酸序列及其衍生物。
本发明的另一方面是提供一种药物组合物，该组合物包含赋形剂载体材料，在所述赋形剂载体材料中分散有本发明的偶联肽。
本发明的另一方面是提供一种治疗性的治疗方法，该方法包括给予有此需要的哺乳动物药学有效量的包含赋形剂和本发明至少一种肽和/或偶联肽的组合物。
本发明的肽和/或偶联肽具有治疗由于B1活化而介导的疾病的治疗价值，所述由于B1舌化而介导的疾病包括但不限于，炎性和神经性起源的慢性疼痛和炎症、脓毒性休克、关节炎、骨关节炎、骨关节炎、心绞痛、哮喘、过敏性鼻炎和偏头痛。
可将本发明的肽和/或偶联肽与合适的药学载体材料配合并以有效量给予有此需要的患者如人(或其它哺乳动物)，从而将本发明的肽和/或偶联肽用于治疗性或预防性目的。
可通过对本文所述的肽和/或运载体-偶联肽的氨基酸序列进行保守性修饰，来获得其它有用的肽和/或偶联肽。保守性修饰所产生的肽和/或偶联肽与被修饰的肽和/或偶联肽的功能、物理和化学特性类似。本文所述肽和/或偶联肽的这些保守性修改形式也考虑为本发明的一种实施方式。
本发明另一方面涉及一种制备本文所述偶联肽的方法，该方法包括步骤将具有以下结构的化合物和运载体(F)反应，产生具有式F-[(X1)]、F-[(X1)]-F、F-[(X1)-(Y1)N]、F-(X1)-(Y1)N或F-(X1)-(Y1)N-F的偶联肽(X1)-(Y1)N其中，X1和Y1各自分别独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；L1和L2各自独立为接头；n是0-3；和P1和P2各自独立为缓激肽B1受体的肽拮抗剂。
优选F是PEG部分或其衍生物。更优选，P1和P2各自独立为包含至少一个SEQ ID NO5-60所示肽序列的缓激肽B1受体的肽拮抗剂。更优选，X1是SEQ IDNOS27-41所示的肽。在考虑下列本发明的详细描述之后，本发明的其它方面和优点将非常明显。
发明详述本发明基于一个令人吃惊的发现，即，可将一般认为非常不耐受取代的一类肽在N末端进行氨基酸取代和/或将N末端偶联于各种运载体，以提供有用的肽和/或肽偶联物，这些肽和/或肽偶联物与已知的同类肽相比，其效力非常持久，从而可用于治疗炎症和疼痛。因此本发明的肽和/或肽偶联物相对于已知的B1肽拮抗剂提供了巨大的治疗益处。更具体地说，本发明的发明人已发现，通过取代已知B1肽拮抗剂的N端氨基酸，和/或用具有确定大小和组成的肽基或非肽基接头将这些肽拮抗剂偶联于运载体(例如但不局限于聚乙二醇(PEG)分子)，可以克服已知B1肽拮抗剂的治疗性应用中以前所描述的一些缺点，在延长拮抗剂体内有效半衰期的同时使拮抗剂的活性和特异性被最大程度的保留。此外(或者)，发现尽管与较小PEG聚合物偶联的肽偶联物相比，与较大PEG聚合物偶联的B1肽拮抗剂虽然其体外活性稍微减少，但这种大的PEG-偶联物延长的循环半衰期使其在体内的停留时间和效力大大增加。此外，本发明人还发现，连接于B1受体肽拮抗剂的PEG分子的大小是优化拮抗剂固有的活性及其体内有效半衰期的关键因子。例如，在疼痛的相关体内模型中，证明一种乙酰化的B1肽拮抗剂在多次给药后最高可达到4小时的效力。令人吃惊的是，以本文所述方式与5kD和20kD PEG分子偶联的相同的肽在单剂快速注射后分别具有高达2天和至少4天的效力。
在描述本发明的肽和运载体或PEG偶联的缓激肽B1受体肽拮抗剂、其制备和使用方法之前，应理解，本发明不限于所述的具体肽和/或偶联的肽拮抗剂，因为本发明所涉及的肽和/或偶联的肽拮抗剂的方法可以有些许变化。应理解，本文所用的术语只是出于描述特定实施方式的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围只由所附的权利要求来限定。
考虑以本文所述目的和方式与运载体偶联的缓激肽B1受体结合肽包括但不限于，本文所述的新型B1结合肽拮抗剂以及本领域已知的B1结合肽拮抗剂，包括但不限于，下列出版物(均全文纳入本文作为参考)的任一篇所公开的任何肽Regoli等，缓激肽受体和它们的拮抗剂.Eur.J.of Pharma.，3481-10(1998)；Neugebauer，W.，等，具有多酶抗性的B1激肽受体拮抗剂.Can.J.Physiol.Pharmacol.，80287-292(2002)；Stewart，J.M.，等，缓激肽拮抗剂现有进展和未来展望.Immunopharmacology，43155-161(1999)；Stewart，J.M.，等，代谢抗性缓激肽拮抗剂发展和应用.Biol.Chem.，38237-41(2001)；PCT出版物WO98/07746；和美国专利No4,693,993、4,801,613、4,923,963、5,648,336、5,834,431、5,849,863、5,935,932、5,648,333、5,385,889、5,444,048和5,541,286。
除非特定情况下另有限定，否则整个说明书所使用的术语如下所限定。
以三种方式描述天然氨基酸残基氨基酸全称、标准的三字母或标准的单字母(如下表所示)。
A＝AlaG＝GlyM＝MetS＝SerC＝CysH＝HisN＝AsnT＝ThrD＝AspI＝IleP＝ProV＝ValE＝GluK＝LysQ＝GlnW＝TrpF＝PheL＝LeuR＝ArgY＝Tyr除非另有明确说明，否则本文中天然和非天然氨基酸包括氨基酸的D型-和L型-异构体。本文所用非天然氨基酸的缩写与美国专利No.5,834,431、PCT出版物WO 98/07746和Neugebauer，等(2002)中一样，这些文献均全文纳入本文作为参考。此外，缩写“Dab”和“D-Dab”分别指非天然氨基酸D-2-氨基丁酸的L型-和D型-异构体。缩写“3’PaI”和“D-3’PaI”分别指非天然氨基酸3’-吡啶基丙氨酸的L-和D-型异构体。缩写“Igl”包括“Igla”和“Iglb”(分别是α-(1-茚满基)甘氨酸和α-(2-茚满基)甘氨酸)。类似地，“DIgl”包括“D-Igla”和“D-Iglb”(分别是α-(1-茚满基)甘氨酸和α-(2-茚满基)甘氨酸的D型-异构体)。优选地，当在本文中使用时，Igl是Iglb，D-Igl是D-Iglb。
“运载体-偶联的肽”或“偶联的肽”指具有生物学活性并且在给予哺乳动物后提供治疗效果的化合物。这两部分包括(1)至少一种B1肽拮抗剂和(2)至少一种如下所限定与所述肽本身的残基或与肽基或非肽基接头(包括但不限于芳香基接头) (这些接头与所述肽的残基共价结合)共价结合的运载体。
“PEG偶联的肽”或“PEGy化的肽”指一种两部分的化合物，其具有生物学活性并且在给予哺乳动物后提供治疗效果。所述两部分包括(1)至少一种B1肽拮抗剂和(2)至少一种与所述肽本身的残基或与肽基或非肽基接头(包括但不限于芳香基接头) (这些接头与所述肽的残基共价结合)共价结合的聚乙二醇部分。
“聚乙二醇”或“PEG”指聚烷撑二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有结合的物质，未衍生或用结合或活化的部分(例如，硫醇、三氟甲磺酸酯(triflate)、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷、邻吡啶基二硫化物、乙烯砜、碘乙酰胺或马来酰亚胺部分)进行衍生。
PEG是熟知的水溶性聚合物，可通过商业途径购得或用本领域熟知的方法(Sandler和Karo，聚mer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。本申请中，术语“PEG”取其广义，包括任何单-或多官能形式的聚乙二醇分子，不管其大小或有无在PEG末端被修饰，PEG可以下式表示X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，II。
其中n是20-2300，X是H或末端修饰，如C1-4烷基。
优选地，本发明中所用的PEG其一端为羟基或甲氧基，即X是H或CH3(“甲氧基PEG”)。注意，当X＝CH3时，PEG的另一端(如式II所示末端为OH)通过醚氧键与活化部分共价连接。当X＝H时，PEG的两端都通过醚键连接于活化部分从而产生线形的双官能化PEG。用于化学结构时，术语“PEG”包括上式II(未显示羟基的氢)，其中的氧可与接头的自由碳原子反应以形成醚键。更具体地说，为了将PEG与肽连接，PEG必须是“活化”形式。活化的PEG可以式III表示(PEG)-(A)III其中，PEG(定义如上所述)与活化部分(A)的碳原子共价连接形成醚键，并且(A)含有可与肽氨基酸残基上的氨基、亚氨基或巯基基团反应的活性基团或可与该肽共价连接的接头部分反应的活性基团。
制备活化的PEG的方法是本领域熟知的，例如，见美国专利No.5,643,575，5,919,455，5,932,462和PCT出版物WO 95/06058(均全文纳入本文作为参考)。可以同很多常规的反应来制备合适的活化的PEG。例如，可根据Buckmann和Merr，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)的方法，用PEG-单甲基乙醚(可从Union Carbide购得)与N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应来制备PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯(M-NHS-PEG)。其它活化的PEG，如PEG-醛，可从商业途径获得，例如，Nektar Therapeutics(Huntsville，A1)或Enzon，Inc.(Piscataway，N.J.)。用于本发明目的的优选的活化PEG的例子是PEG-丙醛和PEG-丁醛，可从Nektar Therapeutics(Huntsville，A1)购得。PEG-丙醛的结构式是PEG-CH2CH2CHO，描述于美国专利No.5,252,714，该文献整体纳入本文作为参考。此外，双官能化PEG醛可用于制备二聚体偶联物。
其它优选的胺反应性PEG包括甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基丙酸盐(酯)(mPEG-SPA)和甲氧基-PEG琥珀酰亚胺丁酸盐(酯)(mPEG-SBA)、mPEG-苯并三唑碳酸盐(酯)或mPEG-p-硝基苯基碳酸盐(酯)，它们可购自Nektar Therapeutics(Huntsville，A1)、Enzon，Inc.(Piscataway，N.J.)或NOF Corporation(Tokyo，Japan)，有各种不同的分子量可以选择。其它优选的活化PEG部分包括硫醇反应性官能团，包括但不限于，PEG乙烯砜，其结构式为PEG-CH2CH2SO2-CH＝CH2，mPEG-碘醋酸酯和如下所示的mPEG-硫脂 MPEG-硫酯 MPEG-碘乙酰胺用于产生本发明PEG偶联肽的其它优选的活化PEG是PEG-马来酰亚胺。对于制备本发明的PEG偶联肽，马来酰亚胺单甲氧基PEG尤其有用。
用于产生本发明PEG偶联肽的更优选的活化PEG是有一个以上活化残基的多价PEG。优选的多价PEG部分包括但不限于如下所示的这些
根据实际需要，可采用任何分子量的PEG，例如，约1,000道尔顿(Da)-100,000Da(n是20-2300)。PEG中重复单元的数目n接近于以道尔顿表示的分子量。优选活化接头上的PEG组合起来的分子量适于药学应用。因此，PEG分子的组合分子量不应超过100,000Da。
优选地，用于本发明PEG偶联肽中的PEG的组合分子量或总分子量约为3,000Da-60,000Da(总的n为70-1,400)，更优选约为8,800Da-36,000Da(总的n约为200-820)。最优选的PEG组合分子量约为20,000Da-24,000Da(总ni约为450-540)。
其它聚烷撑二醇化合物，如聚丙二醇，可用于本发明。其它合适的聚烷撑二醇化合物包括但不限于，以下类型的带电荷或中性聚合物葡聚糖、多聚乙酰神经氨糖酸或其它基于碳水化合物的聚合物，氨基酸聚合物，和生物素衍生物。
术语“包含”指肽或偶联肽可在给定序列的N-或C-端的一端或两端包括另外的分子部分，包括但不限于，氨基酸。当然，这些另外的分子部分不应显著干扰肽或偶联肽的活性。
本文所用术语“天然肽”指本文所述或本领域已知的未偶联的B1肽拮抗剂。
术语“衍生”、“衍生物”或“或衍生的”分别包括过程和产生的肽或偶联肽，其中，(1)肽或偶联肽具有环状部分，例如，在偶联肽中半胱氨酸残基之间的交联；(2)肽或偶联肽是交联的或具有交联位点，例如，肽或偶联肽有半胱氨酸残基从而在培养中或体内形成交联的二聚体；(3)具有-NH2末端基团的偶联肽的N末端被-NRR1、NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR、琥珀酰亚胺基团、取代或未取代的苄氧羰基-NH-所取代，其中R和R1以及环状取代基如本文下面所定义；(5)C末端被-C(O)R2或-NR3R4取代，其中R2、R3和R4如本文下面所定义；和(6)偶联的肽，其中，单独的氨基酸部分用可以与所选的侧链或末端残基反应的物质进行修饰。本文下面进一步描述衍生物。
术语“B1”指缓激肽B1受体(见，Judith M Hall，BK受体综述.Pharmac.Ther.56131-190(1992))。除外另有具体说明，B1或缓激肽B1受体指人缓激肽B1受体(hB1)。优选地，hB1是野生型受体。更优选的，hB1是GenBank登录号AJ238044中所述的缓激肽受体。
本文所用术语“肽”指分子量为4-40个氨基酸的分子，优选10-20个氨基酸的分子，最优选15-18个氨基酸的分子。本文所用术语“二肽”指有两个氨基酸的分子。术语“三肽”指有三个氨基酸的分子。
蛋白-蛋白相互作用的结构分析也可用于说明模拟大蛋白配基的结合活性的肽。在这种分析中，晶体结构可说明蛋白配基的关键残基的性质和相对取向，从而可据此设计类似的肽。见，例如，Takasaki等，Nature Biotech.，第15卷，1266-1270页(1997)。也可用这些分析方法来研究受体蛋白和本发明的肽、运载体-偶联肽或PEG偶联肽的相互作用，从而可据此对所述肽和肽偶联物进行进一步修饰，增加其结合亲和性。
本文所用术语“有效量”和“治疗有效量”当用于描述肽、运载体-偶联的、肽或PEG偶联的B1肽拮抗剂时，指足以产生所需效果(即，用本发明的肽、运载体-偶联的肽或PEG偶联的B1肽拮抗剂来治疗)的量或剂量。在本发明中，所需结果例如是所需的炎症和/或疼痛的减轻，或可观察到B1的一种或多种生物学活性水平的降低。更具体地说，治疗有效量是指一段时间内肽和/或偶联肽在以此药物进行体内治疗的患者中足以抑制与本文所述病症如炎症或疼痛相关的临床上定义的病理过程的量。该有效量可根据所选的具体肽和/或偶联B1肽拮抗剂而变化，也可根据与治疗对象相关的很多因素、情况、以及疾病严重性而变化。例如，如果所述肽和/或偶联的B1肽拮抗剂体内给药，则患者的年龄、体重和健康状况以及从动物预临床试验中获得的剂量反应曲线和毒性数据都在考虑之列。如果所述药物在体外与细胞接触，则也要设计很多预临床体外研究来评价一些参数，如吸收、半衰期、剂量、毒性等。一种给定药物的有效量或治疗有效量的确定在本领域一般技术人员的能力范围之内。
术语“药理学活性的”指所述的物质被确定为具有影响药物参数或疾病状态(例如，疼痛)的活性。在本发明中，该术语通常指B1诱导的或B1介导的疾病或异常医学状况或疾病，更具体地说，指炎症或疼痛的拮抗作用。
术语“拮抗剂”、“抑制剂”和“反促效药”(例如，见，Rianne A-F.de Ligt，等，British Journal of Pharmacology 2000，130，131)指阻抑、阻碍、降低、减少或以某种方式干扰感兴趣的相关蛋白的生物学活性的分子。本发明优选的“拮抗剂”或“抑制剂”是在B1活性体外试验中结合并抑制B1、IC50为500nM或更少的分子。本发明更优选的“拮抗剂”或“抑制剂”是在B1活性体外试验中结合并抑制B1、IC50为100nM或更少的分子。本发明最优选的“拮抗剂”或“抑制剂”是在B1活性体外试验中结合并抑制B1、IC50为50nM或更少、并且预防、缓解或消除疼痛(如至少一种普遍接受的动物疼痛体内模型所检测)、和/或在浮肿、炎症或疼痛的动物体内模型中抑制生化攻击的分子。
此外，本文也涵盖本发明的肽或偶联肽的生理上可接受的盐。本文所用词组“生理上可接受的盐”和“药理学上可接受的盐”可互换，包括已知的或以后发现是药学上可接受(即可用于治疗恒温动物)的任何盐类。一些具体例子包括乙酸盐、三氟乙酸盐、氢卤酸盐如盐酸盐和氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、草酸盐、无机酸和有机酸的盐，这些酸包括但不限于，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、反丁烯二酸、琥珀酸、马来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、苦杏仁酸等。当本发明化合物包含酸性官能团如羧基时，对于羧基合适的药学上可接受的阳离子对是本领域一般技术人员熟知的，包括碱金属、碱土金属、铵、季铵阳离子等。″药理学上可接受的盐″的其它例子见下以及Berge等，J.Pharm.Sci.661(1977)。
“保护基团”一般指本领域熟知的用于防止被选择的反应基团如羧基、氨基、羟基、巯基等进行不必要的反应(如亲核、亲电子、氧化、还原反应等)的基团。优选的保护基团是本文所述的合适的保护基团。氨基保护基团的例子包括但不限于，芳烷基、取代的芳烷基、环化链烯基烷基和取代的环化链烯基烷基、烯丙基、取代的烯丙基、酰基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、甲硅烷基等。芳烷基的例子包括但不限于，苄基、邻-甲基苄基、三苯甲基和二苯甲基，它们可被卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基、酰胺基、酰基等任选取代，以及盐，如盐、铵盐。芳基的例子包括苯基、萘基、茚满基、蒽基、9-(9-苯基芴基)、菲基、杜烯基等。环化链烯基烷基或取代的环化亚烷基烷基(cycloalkylenylalkyl)优选具有6-10碳原子，包括但不限于环己烯基甲基等。合适的酰基、烷氧基羰基和芳烷氧基羰基包括苄氧羰基、叔丁氧羰基、异丁氧羰基、苯甲酰基、取代的苯甲酰基、丁酰基、乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基等。可用保护基团的混合物来保护同样的氨基，例如伯胺基团可用芳烷基和芳烷氧基羰基保护。氨基保护基团也可与它们所连接的氮形成杂环，例如，1，2-双(亚甲基)苯、邻苯二甲酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、马来酸亚胺基等，这些杂环基团还可进一步包括毗邻的芳基和环烷基环。此外，这些杂环可以是单、双或三取代的，例如硝基邻苯二甲酰亚胺基。也可通过例如与盐酸、甲苯磺酸、三氟乙酸等形成加成盐，来保护氨基以防发生不必要的反应，如氧化反应。很多氨基保护基团也适于保护羧基、羟基或巯基。例如，芳烷基。烷基，例如叔丁基，也是保护羟基和巯基的合适基团。
甲硅烷基是被一个或多个烷基、芳基和芳烷基任选取代的硅原子。合适的甲硅烷基保护基团包括但不限于三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、二甲基苯基甲硅烷基、1，2-双(二甲基甲硅烷基)苯、1，2-双(二甲基甲硅烷基)乙烷和二苯基甲基甲硅烷基。氨基基团的甲硅烷基化提供了单-或双甲硅烷基氨基基团。氨基醇化合物的甲硅烷基化可产生N，N，O-三-甲硅烷基衍生物。将甲硅烷基官能团从甲硅烷基醚官能团上去除可很容易地通过，例如，在一个单独的反应步骤中或在与醇反应时就地(in situ)用金属氢氧化物或氟化铵试剂处理来完成。合适的甲硅烷基化试剂是三甲基甲硅烷基氯、叔丁基-二甲基甲硅烷基氯、二苯基甲基甲硅烷基氯或它们与咪唑或DMF的组合产物。将胺甲硅烷基化的方法和除去甲硅烷基保护基团的方法是本领域技术人员熟知的。从相应的氨基酸、氨基酸酰胺或氨基酸酯制备这些胺衍生物的方法是有机化学领域包括氨基酸/氨基酸酯或氨基醇化学领域的技术人员熟知的。
在不影响分子其它部分的情况下将保护基团除去。这些方法是本领域熟知的，包括酸水解、氢解等。优选的方法包括，在合适的溶剂系统如醇、乙酸等或其混合物中，用碳上的钯通过氢解将保护基团如苄氧羰基基团除去。可在合适的溶剂系统，如二烷或亚甲基氯中用无机或有机酸如HCl或三氟乙酸中除去叔丁基-羰基保护基团。可容易地中和产生的氨基盐，得到游离的胺。可在本领域技术人员熟知的水解和氢解条件下除去羧基保护基团，如甲基、乙基、苄基、叔丁基、4-甲氧基苯基甲基等。
应注意，本发明的化合可包含可能以互变异构形式存在的基团，如环状或非环状脒基和胍基、杂原子取代的杂芳基(Y′＝O、S、NR)等，如下例中所示
虽然本文只命名、描述、显示和/或要求保护了一种形式，但这种命名、描述、显示和/或要求保护的形式本身包括了所有互变异构形式。
本发明还考虑本发明化合物的前药。前药是活性或非活性化合物，通过体内生理作用如水解、代谢等对其进行化学修饰，使前药在给予患者后成为本发明的化合物。制备和使用前药的适合性和技术是本领域技术人员熟知的。对于包括酯在内的前药的总体描述见Svensson和Tunek，药物代谢综述，165(1988)和Bundgaard，药物设计，Elsevier(1985)。被保护的(masked)羧酸根阴离子的例子包括很多酯，如与烷基(例如，甲基、乙基)、环烷基(例如，环己基)，芳烷基(例如，苄基、对甲氧基苄基)和烷基羰基氧代烷基(例如，新戊酰基氧代甲基)形成的酯。胺已被保护为芳基羰基氧代甲基取代的衍生物，其在体内被酯酶切割释放出游离的药物和甲醛(Bundgaard J.Med.Chem.2503(1989))。同样，含有酸性NH基团，例如咪唑、酰亚胺、吲哚等药物，已被N-酰基氧代甲基保护(Bundgaard，药物设计，Elsevier(1985))。羟基已被保护为酯和醚。EP 039,051(Sloan和Little，4/11/81)公开了曼尼西碱异羟肟酸前药，及其制备和使用。
偶联肽的结构总述。本发明运载体-偶联肽可用下式表示F-[(X1)-(Y1)n](IV)其中X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-p2的肽；F是共价结合X1或Y1的运载体；L1和L2不存在或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；和P1和P2(如果存在)各自独立为缓激肽B1受体肽拮抗剂。
式IV的运载体-偶联肽其优选实施方式为，P1和P2(如果存在)各自独立为具有SEQ ID NO5-60所示任一肽序列或其衍生物的缓激肽B1受体肽拮抗剂。
运载体-偶联肽的其它优选实施方式包括式IV的运载体-偶联肽，其中P1和P2(如果存在)定义为下式NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中
a0是碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸、有一个或两个带有碱性侧链的残基的二肽或三肽，或不存在；a1、a2、a3和a4各自独立为碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸；a6是Ser；a5、a7和a8各自独立为芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸，条件是a5、a7和a8的至少一个选自D-或L-构型的Chg、Cpg、Igla、Iglb、Niga和Nigb；a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在或各自独立为任何天然氨基酸。
更优选的，P1和P2(如果存在)定义为下式NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性氨基酸，含有一个或两个带碱性侧链的残基的二肽；a1是碱性氨基酸；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5和a8是茚满基氨基酸；a6是Ser；a7是D-茚满基氨基酸；a8是Cpg；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在或各自独立为任何天然氨基酸。
更优选的，P1和P2(如果存在)定义为下式NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性氨基酸，含有一个或两个碱性侧链的二肽；a1是碱性氨基酸；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Cpg；a6是Ser；a7是DTic；
a8是Cpg；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在或各自独立为任何天然氨基酸。
更优选的，本发明的运载体-偶联肽包括式IV的运载体-偶联肽，其中n＝0且X1是选自SEQ ID NO27-41所示的肽及其衍生物的肽。
本发明还提供结合并拮抗缓激肽B1受体(B1)活性的PEG偶联肽，与未偶联的B1肽拮抗剂相比，其明确地具有优良的药代动力学特性。本发明的PEG偶联肽可用下式(V)表示F-[(X1)-(Y1)n]V其中X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；F是共价结合X1或Y1的PEG部分；L1和L2不存在或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；和P1和P2(如果存在)各自独立为缓激肽B1受体肽拮抗剂。
式V的PEG偶联肽其优选实施方式为，P1和P2(如果存在)各自独立为具有SEQ ID NO5-60所示任一肽序列和其衍生物的缓激肽B1受体肽拮抗剂。
PEG偶联肽的其它优选实施方式包括式V的PEG偶联肽，其中P1和P2(如果存在)定义为下式NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸，碱性二肽或三肽；a1、a2、a3和a4各自独立为碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸；a6是Ser；a5、a7和a8是芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸，条件是a5、a7和a8的至少一个选自D-或L-构型的Chg、Cpg、Igla、Iglb、Niga和Nigb；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在或各自独立为任何天然氨基酸。
更优选的，P1和P2(如果存在)定义为下式NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性氨基酸，碱性二肽；
a1是碱性氨基酸；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5和a8是茚满基氨基酸；a6是Ser；a7是D-茚满基氨基酸；a8是Cpg；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在或各自独立为任何天然氨基酸。
更优选的，P1和P2(如果存在)定义为下式NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性氨基酸，碱性二肽；a1是碱性氨基酸；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Cpg；a6是Ser；a7是DTic；a8是Cpg；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在或各自独立为任何天然氨基酸。
更优选的，本发明的PEG偶联肽包括式V的PEG偶联肽，其中n＝0且X1是含有SEQ ID NO27-41所示氨基酸及其衍生物的肽。更优选的，本发明的PEG偶联肽包括，其中n＝0且X1是含有SEQ ID NO27-41所示氨基酸及其衍生物的肽的情况。更优选的，本发明的PEG偶联肽可以下式表示F’-Rz’VI或其生理学上可接受的盐，其中F’是多价运载体；R在各情况下独立为-(X1)-(Y1)n，其中R共价结合于F’；X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；
L1和L2不存在或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；Z是2-8；和P1和P2各自独立为缓激肽B1受体肽拮抗剂。
更优选的，本发明的PEG偶联肽包括式VI的PEG偶联肽，其中n是0，Z是4-8，且X1是含有SEQ ID NO27-41所示氨基酸及其衍生物的肽。
也考虑作为本发明一部分的是具有下述肽序列的肽偶联物，所述肽序列是本文所述P1和P2(如果存在)的片段(即亚序列)、类似物或衍生物，其中，这些偶联肽的体外和/或体内抗-B1活性与本文具体描述的肽偶联物基本相同。
术语“类似物”指代表一个或多个氨基酸取代、删除和/或增加的分子，其分别衍生自式(IV)和(V)所示肽、偶联肽(未偶联的P1和P2(如果存在))和/或运载体偶联的或PEG偶联的肽的任何肽基接头(L)的氨基酸的线性阵列，并且这些分子与本文具体描述的类似的未偶联肽或偶联肽相比，其体外和/或体内抗-B1活性基本相同。
根据本发明的偶联肽类似物通常在(P)(P1和/或P2(如果存在))或(L)(L1和/或L2(如果存在))序列中有一个或多个氨基酸取代、删除或插入。一般认可保守性氨基酸变化最不可能打乱多肽的结构和功能，并且认可保守性氨基酸变化一般包括用一个结构和/或功能类似的氨基酸(例如，侧链大小、电荷和/或形状类似的氨基酸)取代另一个氨基酸。这些取代的性质是本领域熟知的，示例性氨基酸取代总结于表1和表2。
表1氨基酸取代
表2氨基酸取代
如果新的半胱氨酸仍然保留了游离巯基的话，将A、F、H、I、L、M、P、V、W、或Y变为C是更优选的。
可在需要某些取代的时候由本领域技术人员确定所需的氨基酸取代(保守的或非保守的)。例如，可用氨基酸取代来鉴定本文所述肽序列中重要的残基、提高或降低本文所述未偶联的和/或偶联肽的亲和性。
在某些实施方式中，保守性氨基酸取代还可包括取代为非天然存在的氨基酸残基，它们通常是用化学合成掺入的。
如前所述，可根据共同的侧链性质(可用于序列修饰)将天然存在的残基分类。例如，非保守性取代可包括将某一类的一个氨基酸替换为另一类的一个氨基酸。这些取代的残基可引入到与非人直向同源物(orthologs)同源的肽区域中，或引入到与该分子不同源的区域中。此外，为了对链的取向施加影响，也可以用P或G进行修饰。
做这种修饰时，可考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。根据疏水性和电荷特征，每个氨基酸都被赋予了一个亲水性指数，它们是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域中理解氨基酸亲水性指数对于蛋白相互作用的生物学活性的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。已知某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或分数的其它氨基酸而仍然保留类似的生物学活性。基于亲水性指数进行这些改变时，优选亲水性指数在±2、尤其优选±1、更尤其优选±0.5之内的氨基酸取代。
本领域中也理解，可在亲水性的基础上进行有效的类似氨基酸的取代。蛋白的最大局部平均亲水性(受其邻近氨基酸亲水性的控制)，与其免疫原性和抗原性相关，即与该蛋白的生物学性质相关。
下列氨基酸残基的亲水值为精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于类似的亲水性值进行这些改变时，优选亲水性值在±2、尤其优选±1、更尤其优选±0.5之内的氨基酸取代。也可在亲水性的基础上从氨基酸初级序列鉴定表位。这些区域也称为“表位核心区”。
本领域技术人员利用熟知的技术能够确定本文所述未偶联的和/或偶联肽的合适类似物。本领域技术人员也会知道可以用化学上类似的氨基酸取代天然肽中存在的残基而保留其活性(保守性氨基酸残基取代)。因此，即使是对于生物学活性或对于结构很重要的区域，也可进行保守性氨基酸取代，而不破坏其生物学活性或不对未偶联的和偶联肽的结构有不利影响。
此外，本领域技术人员可综览结构-功能研究，这些研究在未偶联的和/或偶联肽序列中鉴定对于活性或结构来说很重要的残基。通过比较，可以预测肽序列中氨基酸残基的重要性。对于用这种方法预测其为重要氨基酸的本发明未偶联的和/或偶联肽的氨基酸残基，本领域技术人员可以选择用化学上类似的氨基酸取代来替换它们。
已有很多科学出版物专门论述了二级结构的预测。见Moult J.，Curr.Op.inBiotech.，7(4)422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47251-276and Chou等，Biophys.J.，26367-384(1979)。而且，现在可用计算机程序来辅助二级结构的预测。
预测二级结构的其它方法包括“穿线”(“threading”)(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)15-9(1996))、“模式分析”(“profile analysis”)(Bowie等，Science，253164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)4355-8(1987))，和“进化连锁”(“evolutionary linkage”)见Home，见上，和Brenner，见上)。
根据本发明的肽和/或偶联的肽类似物和衍生物和本文具体描述的类似的肽和/或偶联的肽可用于同样的目的(即，体外和/或体内B1活性的拮抗剂)。
肽。本发明的肽包括含有SEQ ID NO15-35和39-54所示序列的肽。本发明运载体-或PEG偶联肽中的肽序列P1和P2(如果存在)(P)如所述包括，结合并拮抗(例如，减少)B1活性的肽。本发明优选的运载体-或PEG偶联肽包括选自SEQ ID NO5-60及其衍生物的至少一个肽序列。更优选的，本发明的运载体-或PEG偶联肽包括选自SEQ ID NO27-41及其衍生物的至少一个肽序列。
表3-缓激肽
运载体。本文所用术语“运载体”指防止治疗性肽或蛋白质降解和/或增加其半衰期、减少毒性、降低免疫原性或增加其生物学活性的分子。可用于本发明的运载体是本领域已知的(例如，见PCT出版物WO 98/07746，全文纳入本文作为参考)并且是本领域技术人员很容易获得的。本发明中，优选的运载体包括但不限于，聚甲基乙二醇，聚羟基丙二醇，聚丙二醇及其氧化物，聚甲基丙二醇，聚羟基-环氧丙烷，直链和支链聚丙二醇及其衍生物，聚乙二醇和聚丙二醇及其单甲基醚、单十六烷基醚、单正丁基醚、单叔丁基醚和单油烯基醚，聚烷撑二醇和羧酸的酯，聚烷撑二醇和胺以及其它聚亚烷基氧化物和二醇的脱水缩合产物及其衍生物，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚乙烯醇，聚(乙烯醋酸酯)，共聚物聚(乙烯醋酸酯-共-乙烯醇)，聚乙烯基唑烷酮，聚(乙烯基甲基唑烷酮和聚(乙烯基甲醚)，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸)，聚羟基乙基甲基丙烯酸酯，聚(丙烯酰胺)和聚(甲基丙烯酰胺)和它的其它酰胺，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，聚(N-乙酰氨基丙烯酰胺)以及聚(N-乙酰氨基甲基丙烯酰胺，以及这些酰胺的其它N-取代衍生物。
本发明的一方面要求存在连接于非肽基接头部分或肽基接头的氨基酸残基的至少一个运载体(F)，所述非肽基接头部分或肽基接头的氨基酸残基共价结合于B1肽拮抗剂。在本发明中，如本文所述，优选的运载体构成PEG分子。如本文所述，更优选的运载体构成多价PEG分子。
本文具体公开或所指的运载体-或PEG偶联的分子可以在(X1)-(Y1)n(如上所定义)区域内有少量修饰，以形成根据本发明的类似物，只要其基本保留了对B1的拮抗性。
在本发明运载体-或PEG偶联的肽和它们的类似物之间，优选(P)区非末端残基的差别不多于3个。更优选的，本发明考虑的类似物包括在本发明运载体-或PEG偶联肽(P)区的任何特定非末端位点至多具有两个氨基酸取代、插入或缺失。最优选的，在本发明运载体-或PEG偶联肽以及所考虑的它们的类似物之间，尤其是在特定的(P)区中，差别的形式为一个或多个“保守性修饰”。
接头。本文所用术语“接头”指L1和L2(如果存在)，如式Iv或V所示(见上)，此处缩写为(L)。优选的，(L)是天然存在的肽基(即由肽键连接在一起的氨基酸)，由1-9个氨基酸组成。更优选的，(L)由1-9个氨基酸组成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在更优选的实施方式中，所述肽基接头的1-9个氨基酸选自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。更优选的，肽基接头由肽键连接的大多数空间上不受阻碍的氨基酸(如甘氨酸和丙氨酸)组成。因此，优选的肽基接头是聚(Gly)1-8，尤其是(Gly)3(SEQ ID NO100)，(Gly)5(SEQ ID NO101)和(Gly)7(SEQ ID NO102)以及聚(Gly-Ala)2-4和聚(Ala)1-8。肽基接头的其它具体例子包括(Gly)5Lys(SEQ IDNO103)和(Gly)5LysArg(SEQ ID NO104)。Gly和Ala的其它组合也是优选的。为了解释上述的术语，例如，(Gly)5Lys指Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys。肽基接头可包含N-端半胱氨酸、另一个巯基或亲核试剂，以与运载体连接。更优选的接头包含N-端半胱氨酸或高半胱氨酸残基或其它2-氨基-乙硫醇或3-氨基-丙硫醇部分，以便与马来酰亚胺、碘代乙酰胺或硫酯官能化的运载体连接。肽与马来酰亚胺活化的PEG反应形成最初的3-硫烷基琥珀酰亚胺加合物(1c)，用过量的碱处理该加合物(1c)将稳定性较差的琥珀酰亚胺加合物转化为具有水解稳定性的6-甲基氨甲酰基-5-氧代-硫代吗啉-3-甲酰胺形式(1d，方案1)。或者用可从商业途径获得的硫酯或碘代乙酰氨基PEG(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)如方案2和3所示进行化学选择性连接。
方案1 方案2
方案3 另一个优选的接头是大的、柔性接头，它包含随机的Gly/Ser/Thr序列(GSGSATGGSGSTASSGSGSATH；SEQ ID NO105)，据估计其约为1k的PEG分子。此外，肽基接头可包含非肽基区段，如式-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-(刚性接头-AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-)的6碳脂肪族分子。
或者，含有活性亲核基团的非肽基接头可存在于X1和Y1(如果存在)中。例如，可用烷基接头如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可进一步被任何空间上不发生阻碍的基团例如低级烷基(例如，C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl，Br)、CN、NH2、苯基等取代。示例性非肽基接头是PEG接头(如下所示)
其中，n使得接头分子量为100-5000道尔顿(kD)，优选100-500kD，m＝1-3。优选的，非肽基接头是芳族接头。可用本文所述同样的方法改变接头以形成衍生物。
此外，可用PEG醛进行还原性烷基化或用PEG的羟基琥珀酰亚胺或碳酸酯进行酰化反应，将PEG部分连接于N末端胺或所选侧链的胺。任意上述接头都可用于该方法中。或者，可将合适官能化的PEG直接连接于SEQ ID NO5-26或SEQ ID NO43-60所示的任意缓激肽B1受体肽拮抗剂，或直接连接于共价结合于SEQ ID NO5-26或SEQ ID NO43-60所示的任意缓激肽B1受体肽拮抗剂的肽基接头的氨基酸残基。
应理解，因为所述运载体和/或目标肽可能是多价的，本发明的方法可能产生多种运载体肽结构。例如，一价运载体和一价肽将产生1∶1偶联物，二价肽和一价运载体可形成带有两个载体部分的肽偶联物，而二价运载体和一价肽可产生两个肽实体连接于一个运载体部分的肽偶联物；采用更高价运载体可形成多个肽实体结合于单个运载体的簇状(clusters)肽偶联物，而更高价肽将被多个运载体部分包围。肽部分可含有一个以上与活化的运载体反应的反应基团，必须时刻考虑形成复合结构的可能性。当需要形成简单结构如1∶1的运载体和肽的加合物，或采用二价运载体形成肽∶运载体∶肽的加合物时，使用预定比例的活化运载体和肽材料，预定的浓度，以及在预定的条件(例如，反应时间、温度、pH等)下反应以形成所述产物的比例，然后将所述产物与其它反应产物分离。可通过相对简单的反复试验来获得试剂的反应条件、比例和浓度，这些试验在本领域一般技术人员的能力范围之内，如果需要可将比例放大。类似地，用本领域技术人员熟知的常规技术实现产物的纯化和分离。然而，如本说明书和权利要求所用，单数形式的一种、一个、该或这种(“a”、“an”、“the”)包括多个、多种，除非上下文有明确的其它规定。因此，例如，“一种运载体-偶联肽拮抗剂”或“一种PEG偶联的肽拮抗剂”包括指这些偶联物的混合物，“该治疗方法”包括本领域技术人员已知或阅读本说明书后可以知晓的该类型治疗方法的一种或多种。
通过将mPEG-马来酰亚胺与具有半胱氨酸氨基酸残基的肽和多肽的巯基连接的PEG化通常是在有或没有有机溶剂的磷酸盐缓冲液中进行的。PEG化的肽和多肽的高度溶解性以及吡咯烷-2，5-二酮环在水中可能的不稳定性阻碍了该方法在大规模生产中的应用以及PEG化的肽和蛋白质的纯化中的应用。因此，本文中我们公开了用于连接mPEG-马来酰亚胺与具有半胱氨酸残基的肽和多肽的巯基的一种新的非水性条件。这种新的方法产生中到高产率的PEG化肽和多肽，并将Michael加成和氨基分解组合在一起(方案4)。这两种条件使得可以通过沉淀将PEG化肽和多肽直接分离。
方案4 在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，可用包括下述一种或多种溶剂的溶剂取代甲醇(MeOH)甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、二氯甲烷(DCM)、乙腈(AcN)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAc)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，可用包括下述一种或多种溶剂的溶剂取代TBME二乙醚、甲基异丙基醚和二异丙基醚。
在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，方案4所述反应1)可在约20℃-60℃的温度下进行。优选地，案4所述反应1)可在约30℃-50℃的温度下进行。更优选的，案4所述反应1)可在约35℃-45℃的温度下进行。最优选地，案4所述反应1)可在室温下进行。
在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，方案4所述反应2)可在约20℃-60℃的温度下进行。优选地，案4所述反应2)可在约30℃-50℃的温度下进行。更优选的，案4所述反应2)可在约35℃-45℃的温度下进行。最优选地，案4所述反应2)可在室温下进行。
在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，方案4所述沉淀反应可至少进行10分钟。更优选的，方案4所述沉淀反应可至少进行60分钟。最优选的，方案4所述沉淀反应约进行60分钟。
在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，可进行一次以上的沉淀、过滤和/或纯化反应。
在方案4所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，可进行一次以上的沉淀和/或纯化反应。
在这种方法策略中，部分保护的肽尤其有用，因为它们允许多官能化肽的特定位点被选择性修饰。用肽合成领域技术人员熟知的已建立的去保护方法从PEG偶联物中去除保护基团。可用肽合成领域技术人员已知的正交保护方法来制备适于该用途的部分保护的肽。部分保护的缓激肽B1受体肽拮抗剂的合成和偶联图解于方案5中。可用很容易获得的正交保护的碱性氨基酸来制备侧链可作为偶联位点的类似物。
方案5 可用类似的方法将如表3中所示(SEQ ID NO5-60)的B1拮抗剂肽的部分保护形式偶联于PEG部分。
在方案5所述方法的一个实施方式中，部分保护的肽5c的胺侧链被叔丁基氨甲酰基(Boc)部分保护，产生的肽在有机溶剂如1，2-二氯乙烷(DCE)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中与上述PEG醛的任一反应。可加入脱水剂如粉末状4°A分子筛加速中间体亚胺的形成。室温搅拌1-24小时后，加入1-4当量的三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠将产生的亚胺还原。
在方案5所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，与部分保护肽如5c的反应可在约20℃-60℃的温度下进行。优选地，方案5中与部分保护肽如5c的反应可在约20℃-50℃的温度下进行。更优选的，方案5中与部分保护肽如5c的反应可在约35℃-45℃的温度下进行。方案5中与部分保护肽如5c的大多数反应可在室温下进行。
在方案5所述方法的另一个实施方式中，部分保护的肽5c的胺侧链被叔丁基氨甲酰基(Boc)部分保护，产生的肽在有机溶剂如1，2-二氯乙烷(DCE)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷(NMP)或其混合物中与上述的PEGN-羟基琥珀酰亚胺或对硝基苯基酯PEG试剂的任一反应。活化的PEG酯可以是单官能化或线形双官能化的，这两种均可通过商业途径从供应商如Nektar或NOF获得。此外，在制备本发明偶联物时，含有3-6个羟基琥珀酰亚胺或对硝基苯基酯部分的支链多官能化PEG活化的酯尤其有用。
在方案5所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，与部分保护肽如5c的反应可在约20℃-60℃的温度下进行，反应时间约为4小时-10天。优选地，方案5中与部分保护肽如5c的反应可在约20℃-50℃的温度下进行，反应时间约为12小时-5天。更优选的，方案5中与部分保护肽如5c的反应可在约35℃-45℃的温度下进行，反应时间约为1-5天。方案5中与部分保护肽如5c的大多数反应可在室温下进行，反应时间约为1-4天。
在方案5所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，方案5中侧链保护基团的去除可在约-20℃到60℃的温度下进行。该反应可在相容性溶剂如二氯甲烷中用约5体积％三氟乙酸(TFA)-50体积％TFA进行。优选的，方案5中酸介导保护基团的去除可在约0℃到40℃的温度下进行，用约10-25体积％的TFA。更优选的，方案5中酸介导保护基团的去除可在约0℃到25℃的温度下进行，用约10-20体积％的TFA，在二氯甲烷中进行。最优选的，方案5中酸介导保护基团的去除可在室温下进行，用约20体积％的TFA，在二氯甲烷中进行。
在方案5所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，可用反相HPLC、尺寸排除层析、离子交换层析或膜透析来纯化方案4中所述的产物5d。更优选的，可联合或次序使用上述两种或多种纯化技术以提供本发明纯化的偶联物。
在方案5所述方法的另一个实施方式中，结合上述或下述的任何实施方式，可进行一次以上的纯化。
衍生物。本发明还考虑本发明肽和/或偶联肽的衍生物。这些衍生物可进一步改善本发明所述运载体-或PEG偶联肽的溶剂度、吸收性、生物学半衰期等。或者，增加的部分可消除或减弱本发明所述肽和/或偶联肽的任何不利的特性。示范性衍生物包括下述运载体-或PEG偶联的肽，其中1.所述肽和/或偶联的肽或其某些部分是环状的。例如，肽和/或偶联的肽的肽部分可被修饰以含有两个或多个半胱氨酸残基(例如，在肽基接头中)，它可通过形成二硫键而环化。环化衍生物的制备参见文献WO 00/24782。
2.所述肽和/或运载体-或PEG偶联的肽是交联的或被赋予了可在分子间进行交联的特性。例如，偶联肽的肽部分可被修饰以含有一个Cys残基，并从而可与类似的分子形成分子间二硫键。
3.一个或多个肽基[-C(O)NR-]连接(肽键)被非肽键连接取代。示例性非肽基连接是-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-OC(O)NR-]、磷酸酯、-CH2-磺胺[-CH2-S(O)2NR-]、脲[-NHC(O)NH小-CH2-仲胺、和烷基化肽[-C(O)NR6-，其中R6是低级烷基]。
4.X1中偶联肽的N末端半胱氨酸残基可被N末端衍生基团取代。示例性N末端衍生基团包括-NHR1，其中R1是单烷基。
用双官能化试剂进行衍生对于将运载体-偶联肽或其官能化衍生物交联到水不溶性基质或其它大分子运载体是有用的。常用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸形成的酯，同基双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺基酯如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双官能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生试剂如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫代]-丙酰亚氨酸酯(propioimidate)产生可光活化的中间体，这些中间体在有光存在时可形成交联。或者，采用反应性的水不溶性基质如溴化氰活化的糖类以及美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中所述的反应性基材进行蛋白质固定。
可方便地将糖类(寡糖)基团连接到已知是蛋白质中的糖基化位点的位点。一般，将O-连接的寡糖连接到丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接的寡糖连接到天冬酰胺(Asn)残基，当该天冬酰胺残基是Asn-Aaa-Ser/Thr序列的一部分时，其中Aaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。Aaa优选是除脯氨酸之外的19种天然存在的氨基酸之一。N-连接和O-连接的寡糖的结构以及每一类型中发现的糖残基是不同的。在这两种(N-连接和O-连接的)寡糖上常常会发现的一种糖是N-乙酰基神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，由于它带有负电荷，可能赋予糖基化的偶联肽以酸性特征。这些位点可掺入到本发明运载体-偶联肽的接头中。可用本领域已知的合成或半合成方法将这些位点进一步糖基化。
其它可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，半胱氨酸中硫原子的氧化，赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(Creighton，蛋白质结构和分子特性(ProteinsStructure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，79-86页(1983))。
除非本文另有规定，本文所述的肽和/或偶联肽的合成，包括合适的氨基酸衍生物的制备、其活化和偶联以形成肽、肽的纯化方法以及纯度测定，包括在肽化学领域的一般知识范围内，如Houben-Weyl“Methoden der OrganischenChemie”第16卷，I & II部分，(1974)所述的液相合成。对于固相合成方法，合适的技术也是本领域已知的，包括Merrifield，Chem.多肽，335-361页(Katsoyannis和Panayotis编)(1973)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，第85卷，2149页(1963)；Davis等，Biochem.Intl.，第10卷，394-414页(1985)；Stewart和Young，固相肽合成(1969)；美国专利No.3,941,763；Finn等，蛋白质(第3版)，第2卷，105-253页(1976)；以及Erickson等，蛋白质(第3版)，第2卷，257-527页(1976)中所述的技术。肽合成领域的化学家将能够用标准的溶液技术，或用手动或自动的固相方法来合成所述的肽。固相合成是制备各肽的优选技术，因为其具有成本低。
药物组合物总述。本发明还提供例如在炎症和疼痛(包括但不限于炎性疼痛和相关的痛觉增敏和异常疼痛)的预防或治疗中使用本发明的肽和/或运载体-偶联肽的方法。本发明的肽和/或运载体-偶联肽对与B1活化相关或由其介导的其它疼痛病症的预防或治疗也具有治疗性价值，所述与B1活化相关或由其介导的其它疼痛病症包括但不限于，丘脑痛综合征、糖尿病、毒素和化疗、脓毒性休克、关节炎、脉管和非脉管混合性综合征、一般的炎症、关节炎、风湿病、狼疮、骨关节炎、炎性肠疾病、炎性眼疾病、炎性或不稳定性膀胱疾病、银屑病、具有炎性成分的皮肤症状、晒伤、心炎、炎性肠疾病、皮炎、肌炎、神经炎、胶原脉管疾病、慢性炎性病症、表皮组织损伤或功能异常、单纯性疱疹、糖尿病性神经病变疼痛、疱疹后神经痛、皮肤灼痛、交感维持痛(sympatheticallymaintained pain)、去传入综合征、紧张性头痛、心绞痛、偏头痛、手术疼痛，呼吸、生殖泌尿、胃肠或血管区域的内脏活力紊乱、创伤、烧伤、过敏性鼻炎、哮喘、过敏性皮肤反应、搔痒症、白癫风、一般肠胃病、大肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡，血管舒缩或过敏性鼻炎。
本发明还提供本发明的肽和/或运载体-偶联肽在预防或治疗以下疾病中的应用急性头痛、牙痛、背痛、下腰痛、创伤疼痛、手术疼痛、截肢或脓肿引起的疼痛、灼痛、脱髓鞘病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、中风、丘脑痛综合征、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征(″AIDS″)、毒素和化疗、一般的头痛、偏头痛、丛集性头痛、脉管和非脉管混合性综合征、紧张性头痛、一般炎症、关节炎、风湿病、狼疮、骨关节炎、炎性肠疾病、炎性眼疾病、炎性或不稳定性膀胱疾病、银屑病、具有炎性成分的皮肤症状、晒伤、心炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原脉管疾病、慢性炎性病症、炎性皮肤以及相关痛觉增敏和异常性疼痛、神经性疼痛以及相关痛觉增敏和异常性疼痛、糖尿病性神经病变疼痛、灼痛、交感维持痛、去传入综合征、哮喘、过敏性鼻炎、表皮组织损伤或功能异常、单纯性疱疹、疱疹后神经痛，呼吸、生殖泌尿、胃肠或血管区域的内脏活力紊乱、创伤、烧伤、过敏性皮肤反应、搔痒症、白癫风、一般肠胃病、大肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡，和支气管病。
因此，本发明还涉及本发明的一种或多种肽和/或运载体-偶联肽在制备用于治疗例如下述疾病的药物中的应用急性头痛、牙痛、背痛、下腰痛、创伤疼痛、手术疼痛、截肢或脓肿引起的疼痛、灼痛、脱髓鞘病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、中风、丘脑痛综合征、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征(″AIDS″)、毒素和化疗、一般的头痛、偏头痛、丛集性头痛、脉管和非脉管混合性综合征、紧张性头痛、一般炎症、关节炎、风湿病、狼疮、骨关节炎、炎性肠疾病、炎性眼疾病、炎性或不稳定性膀胱疾病、银屑病、具有炎性成分的皮肤症状、晒伤、心炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原脉管疾病、慢性炎性病症、炎性皮肤以及相关痛觉增敏和异常性疼痛、神经性疼痛以及相关痛觉增敏和异常性疼痛、糖尿病性神经病变疼痛、灼痛、交感维持痛、去传入综合征、哮喘、过敏性鼻炎、表皮组织损伤或功能异常、单纯性疱疹、疱疹后神经痛，呼吸、生殖泌尿、胃肠或血管区域的内脏活力紊乱、创伤、烧伤、过敏性皮肤反应、搔痒症、白癫风、一般肠胃病、大肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡，和支气管病。
本文所用“治疗”是指获得有益或所需的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需的治疗结果包括但不限于下列的一种或多种疼痛和/或炎症的任何方面的改善或缓解，所述疼痛和/或炎症包括急性、慢性、炎性、神经性、或手术后疼痛。出于本发明的目的，有益或所需的治疗结果包括但不限于下列的一种或多种严重性的减轻、与疼痛和/或炎症相关的一种或多种症状(包括疼痛和/或炎症的任何方面)的缓解，如疼痛和/或炎症时间的缩短，和/或疼痛程度或疼痛感觉的减少。
这些药物组合物或药物可通过注射、口服、肺部、鼻部、透皮或其它给药形式给予。一般而言，本发明包括的药物组合物含有有效量的至少一种本发明的肽和/或至少一种本发明的运载体-偶联肽(其量可有效防止、缓解、或消除本文所述的疼痛或任何其它的医学症状)，以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这些组合物包括具有各种缓冲成分(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂如去污剂和增溶剂(例如，Tween 80、聚山梨酸酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如，硫柳汞(Thimerosol)，苄基醇)以及填充物质(bulking substances)(例如，乳糖，甘露醇)；将这些物质掺入到聚合的运载体-偶联肽例如聚乳酸、聚羟乙酸等的颗粒制剂中，或掺入脂质体中。也可用透明质酸，它可提高药物在循环中的持续时间。这些组合物也可影响本发明运载体-偶联肽的物理状态、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。见，例如，雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，MackPublishing Co.，Easton，PA，1435-1712页(1990)，纳入本文作为参考。这些组合物也可制成液体形式，或作为干粉(例如冻干形式)。也考虑可植入的缓释剂型，作为透皮制剂。
口服剂型。考虑可用于本发明的是口服固体剂型，见上《雷明顿药物科学》第89章所述，纳入本文作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、含片或锭剂、扁囊剂或弹丸剂。也可用脂质体或类蛋白胶囊化来配制本发明的组合物(例如，美国专利No.4,925,673所述的类蛋白微球)。可用脂质体胶囊化，可用各种聚合物将脂质体衍生化(见，例如，美国专利No.5,013,556)。可能的固体剂型描述于Marshall，K.，Modern Pharmaceutics，第10章，G.S.Banker和C.T.Rhodes(1979)，纳入本文作为参考。一般，制剂中包括本发明的运载体-偶联肽，以及惰性成分，这些惰性成分保护运载体-偶联肽抵抗胃部环境，并使运载体-偶联肽在肠内释放。
还特别涉及的是本发明肽和/或运载体-偶联肽自身的口服剂型。在这方面，如果需要，可对肽和/或运载体-偶联肽进行化学修饰从而使口服递送有效。可使用修饰的脂肪族氨基酸的盐，如N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸钠(SNAC)，作为增强本发明运载体-偶联肽吸收的载体。见美国专利No.5,792,451，题目为“口服药物递送组合物和方法”(“Oral Drug Delivery Composition andMethods”)。
本发明的肽和/或运载体-偶联肽在制剂中可以是精细的多颗粒，以约1毫米粒径的颗粒或弹丸的形式存在。用于胶囊形式给药的材料剂型也可以是粉末，或轻微压缩的块状物(plug)，或甚至是片剂。可通过压缩制备治疗剂。
可包括着色剂和调味剂。例如，可配制(例如通过脂质体或微球胶囊化)所述肽和/或运载体-偶联肽或其任何衍生物，然后包括在可食用的产品中，例如含有着色剂和调味剂的冷饮料。
可用惰性物质稀释或增加本发明肽和/或运载体-偶联肽的体积。这些稀释剂可包括糖类，尤其是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。某些无机盐，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠，也可用作填充剂。一些可通过商业途径获得的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
可在固体剂型的治疗制剂中包括崩解剂。用作崩解剂的物质包括但不限于，淀粉，包括基于淀粉的商业可获得的崩解剂Explotab。也可用乙醇酸淀粉钠、Amberlite、羧基甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、羧酸甲基纤维素、天然海绵和膨润土。崩解剂的其它形式是不溶性阳离子交换树脂。粉末状树胶也可用作崩解剂和粘合剂，可包括粉末状树胶如琼脂、梧桐胶或西黄芪胶。藻酸及其钠盐也是有用的崩解剂。
也可用粘合剂将药物组合物中的各组分保持在一起以形成一个硬的片剂，粘合剂包括来自天然产品的物质，如阿拉伯胶、西黄芪胶、淀粉和明胶。其它粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧基甲基纤维素(CMC)。聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)也可用在醇溶液中使治疗剂成粒。
制剂中也可包括抗摩擦试剂以防止配制过程中粘结。润滑剂可用作治疗剂和模壁之间的层，润滑剂包括但不限于，硬脂酸，包括其镁盐和钙盐，聚四氟乙烯(PTFE)，液体石蜡，植物油和蜡。也可用可溶性润滑剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁，各种分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可添加可改善配制过程中运载体-偶联肽的流动特性和在压缩过程中辅助重排的助流剂。这些助流剂可包括淀粉、滑石粉、热解法二氧化硅和水合硅铝酸盐。
为了帮助本发明的肽和/或运载体-偶联肽溶解到水性环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。这类表面活性剂包括阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠、和十六烷基磺酸钠。可用阳离子去污剂，这类阳离子去污剂可包括氯化苯甲烃铵或氯化苯乙胺。可包括在制剂中作为表面活性剂的可能的非离子去污剂是聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸盐、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂单独存在于制剂中或以不同比例的混合物存在于制剂中。
制剂中也可包含添加剂以增强所述肽和/或运载体-偶联肽的吸收。可能具有这种特性的添加剂包括各种脂肪酸，例如，油酸、亚油酸和亚麻酸。
可能需要可控的缓释剂型。可将本发明的肽和/或运载体-偶联肽掺入到允许通过扩散或浸出机制释放药物的惰性基质，例如树胶。也可将缓慢退化的基质，例如藻酸盐或多糖掺入到制剂中。本发明可控缓释剂型的另一种形式是用基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法制备的，即药物被半透膜包围，因为渗透效应，该半透膜允许水通过，推动药物通过一个小开孔释放出来。一些肠溶衣也具有缓释效应。
肺部递送形式。本文还考虑本发明药物组合物的肺部递送。吸气时所述肽和/或运载体-偶联肽(或其衍生物)被递送到哺乳动物肺部，穿过肺内层表皮到血流中。这方面可能有所帮助的与大分子的肺部递送有关的报道包括Adjei等，Pharma.Res.，第7卷，565-569页(1990)；Adjei等，Internatl.J.Pharmaceutics，第63卷，135-144页(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等，J.Cardiovasc.Pharmacol.，第13卷(增刊5)，143-146(1989)(内皮素-1)；Hubbard等，Annals Int.Med.，第3卷，206-12页(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.，第84卷，1145-1146页(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等，蛋白质的烟雾化(″Aerosolization ofProteins″)，Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II，Keystone，Colorado(1990)(重组人生长激素)；Debs等，J.Immunol.，第140卷，3482-3488卷(1988)(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)；以及美国专利No.5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。
考虑可用于本发明的是设计用于治疗性产品肺部递送的机械装置，包括但不限于，喷雾器、定量剂量吸入器、粉末吸入器，本领域技术人员对于这些都非常熟悉。适于用于本发明的商业上可获得的装置的一些具体例子是Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生产的Ultravent喷雾器；Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生产的Acorn II喷雾器；Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina生产的Ventolin定量剂量吸入器；以及Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts生产的Spinhaler粉末吸入器。
所有这些装置都要求使用适于分散本文所述的肽和/或运载体-偶联肽和/或其衍生物的制剂。通常，每一种制剂对于所用的某一类型的装置是专一性的，除使用治疗中有用的稀释剂、赋形剂佐剂和/或载体之外，可能还包括使用合适的推进剂材料。
用于肺部组合物的药学上可接受的载体包括糖，如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。其它用于制剂的成分包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可使用天然或合成的表面活性剂。可使用PEG(甚至是与肽的衍生作用单独使用)。也可例如在缓冲制剂中使用葡聚糖，如环糊精、胆汁盐、纤维素和纤维素衍生物。还可使用氨基酸，例如在缓冲制剂中。
此外，考虑使用脂质体、微胶囊或微球，包涵体复合物或其它类型的载体。
适于与喷雾器(喷气型或超声波型)一起使用的制剂，通常其所包含的本文所述的肽和/或运载体-偶联肽以约0.1-25毫克(mg)生物学活性物质/毫升溶液的浓度溶于水。该制剂还可包含缓冲剂和简单的糖(例如，为了使肽稳定和控制渗透压)。喷雾制剂也可含有表面活性剂，以降低或防止由于在形成气溶胶的过程中溶液的雾化而导致的表面诱导的蛋白质聚集。
与定量剂量吸入装置一起使用的制剂一般包含细分的粉末，这些粉末含有的本发明所述肽和/或运载体-偶联肽在表面活性剂的辅助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如含氯氟烃、氢化含氯氟烃，氢化氟烃或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，及其组合物。合适的表面活性剂包括去水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。
用粉末吸入装置分散的制剂包含细分的干粉，这些干粉含有本发明所述的肽和/或运载体-偶联肽，还可包含填充剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，填充剂的量有助于粉末从装置中分散，例如是制剂的50-90重量％。
鼻部递送形式。也考虑所述肽和/或运载体-偶联肽的鼻部递送。鼻部递送使得在将治疗性产品给予鼻之后本发明的肽和/或运载体-偶联肽直接进入血流，产品不必在肺部沉积。用于递送的制剂包括与葡聚糖或环糊精一起配制的制剂。也考虑通过穿过其它粘性膜来递送。
泵送。在本发明的某些实施方式中，考虑局部递送本发明的肽和/或偶联肽用于治疗或预防B1介导的疾病。本发明考虑局部递送的一种方法是在药物发生作用的局部位点注射药物。
局部递送的另一种方法包括将输送药物的导管插入到所需的身体位点，用泵推动药物通过导管。与内部植入导管一起使用的外部磨损(worn)药物泵是本领域技术人员熟知的。
用于局部递送的另一种方法包括可植入性药物递送装置。已经开发了可植入泵解决了本领域技术人员熟知的使用外部泵和导管系统的技术缺点。可植入性药物递送泵常包括储存器，用于储存药物；注射口，可注射新鲜药物制剂并且以一定时间间隔将旧药物从储存器中去除；以及任选的导管，用于将药物递送到所需的地点。优选的可植入性装置包括但不限于，Duros植入器(AlzaCorporation，Mountain View，CA)、SynchroMed I或II灌注系统(Medtronic，Inc.，Minneapolis)等。
此外(或者)，本发明提供用于本文上述和/或本领域技术人员已知的任何缓释或持释剂型或微粒剂型的肽和/或偶联的肽。
剂量。可通过本领域熟知的方法来测定给予的本发明肽和/或偶联肽的有效剂量，这些方法考虑到的参数包括生物学半衰期、生物可利用度和毒性。在优选实施方式中，本领域技术人员用从本领域技术人员熟知的常规体外和体内研究中获得的数据来确定有效剂量范围。例如，体外细胞培养试验，如下面实施例6所述的示范性试验，本领域技术人员根据该试验提供的数据，将能够很容易地确定抑制一定量的B1诱导的活性所需的肽或偶联肽的平均抑制浓度(IC)或平均有效浓度(EC)(例如50％，IC50；或90％，IC90)。然后本领域技术人员用获得自一种或多种常规动物模型的药代动力学数据(例如下面实施例9所述的药代动力学数据)，可以选择合适的剂量，从而获得与确定的IC值相同或超过该值的肽最小血浆浓度(Cmin)。用于治疗某疾病或病症的治疗方法中包括的给药剂量将由治疗医师来决定，他将考虑影响治疗药剂作用的各种因素，如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，待治疗疾病的严重程度，给药时间，以及其它临床因素。通常，日剂量方案应在1.0-10000微克(μg)肽和/或运载体-偶联肽/千克(kg)体重，优选1.0-1000μg/千克体重，最优选1.0-150μg/千克体重。
联合治疗。另一方面，本发明包括治疗(或在其它实施方式中为预防)疼痛和/或炎症、或与B1活化相关的任何病症或疾病的方法，该方法包括给予一定量的本发明肽和/或偶联肽以及一定量的NSAID。术语“NSAID”指非甾体抗炎化合物。肽拮抗剂和/或偶联的肽拮抗剂和NSAID的相对用量和比例可以改变。在有些实施方式中，给予足够的肽(一种或多种)和/或偶联肽(一种或多种)，从而使得实现同等的疼痛或炎症缓解所需的NSAID的正常剂量可以减少。在有些实施方式中，给予足够的本发明肽(一种或多种)和/或偶联肽(一种或多种)，从而使得实现同等的疼痛或炎症缓解所需的NSAID的正常剂量可以减少，所述疼痛或炎症缓解至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约为50％，至少约为60％，至少约为70％，至少约为80％，或至少约90％，或更多。所述实现同等的疼痛或炎症缓解所需的NSAID的正常剂量的减少可以反映在某次给药时的给药量上，和/或在给定时间段内的给药量上(给药频率减少)。
在另一方面，本发明提供增强NSAID对疼痛或炎症的治疗的方法，该方法包括联合给予有效量的NSAID以及有效量的至少一种本发明所述的肽和/或至少一种本发明所述的偶联肽。本文所用“联合给予”(或“联合给药”)包括NSAID和本发明的肽和/或偶联肽以有效量给予个体的所用情况。本文所用“联合给药”包括同时给药和/或在不同的时间给药。联合给药还包括作为同一制剂(即，本发明的肽和/或偶联肽和NSAID存在(组合)于同一组合物中)给药，和/或作为分开的组合物给药。应理解，本发明的肽(一种或多种)和/或偶联肽(一种或多种)和至少一种NSAID可以不同的给药频率和/或时间间隔给药。例如，本发明的偶联肽可每周给药一次，而NSAID可更频繁的给药。应理解，可用相同或不同的给药途径给予本发明的肽(一种或多种)和/或偶联肽(一种或多种)和NSAID，在给药周期中可变成不同的给药方案。甚至可在疼痛或炎症开始之前给药。因此，在另一方面，本发明提供治疗患者的疼痛和/或炎症、降低其发病率、缓解和/或延迟其发生或发展的方法，所述方法包括联合给予有效量的本发明至少一种肽和/或至少一种偶联肽和有效量的至少一种NSAID。这些方法包括治疗或预防任何病因的任何疼痛和/或炎症，包括通常给予NSAID进行治疗的疼痛和/或炎症。这些方法也适于治疗或预防本文上述或下述由B1活化而介导或与其相关的任何病症或疾病。在有些实施方式中，所述疼痛和/或炎症是手术后疼痛。在有些实施方式中，所述疼痛和/或炎症与烧伤或创伤有关。在有些实施方式中，所述疼痛和/或炎症与类风湿性关节炎有关。在有些实施方式中，所述疼痛和/或炎症与骨关节炎有关。在有些实施方式中，所述疼痛和/或炎症与疱疹后神经痛有关。在有些实施方式中，NSAID选自阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、消炎痛、甲氧萘丙酸、萘普生、双氯芬酸、酮基布洛芬、托美汀、苏灵大、甲灭酸、甲氯灭酸、双氟尼酸、Rufenisal、匹罗昔酮、舒多昔康、伊索昔康、塞来考昔、罗非考昔、DUP-697、氟舒胺、美洛昔康、6甲氧基-2萘基乙酸、MK-966、萘普酮、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC58215、T-614，或这些的混合物。
实施例下列实施例只是用于阐述性目的，不是或不应解释为以任何方式限制本发明。本领域技术人员将理解，可对本文所述化合物进行修饰和改变而不脱离本发明的精神或范围。可根据下述的一种或多种方法来合成本发明的化合物。应注意，示出了一般方法，因为这涉及具有未指明立体化学的化合物的制备。然而，这些方法一般可用于具有特定立体化学的化合物，例如，某基团的立体化学是(S)或(R)。此外，利用熟知的方法，例如通过逆转(inversion)，常可用具有一种立体化学((例如，(R))的化合物常制备具有相反立体化学(即，(S))的化合物。
实施例1B1受体肽拮抗剂和PEG偶联的B1受体肽拮抗剂的合成和纯化用本领域熟知的合成技术来合成本发明的各种肽。合成本发明各种肽的优选方法采用FMOC方法利用碳化二亚胺的活化，如下所述。
第1部分用碳化二亚胺化学方法溶解Fmoc-氨基酸加到树脂上。
将Fmoc-氨基酸(3-4当量)溶解到干的DCM/NMP混合物(NMP或DMF用来帮助完全溶解)中。将溶于NMP的N-羟基苯并三唑(HOBt，与氨基酸当量相同)加入到氨基酸溶液中。溶于DCM的N，N’-二环己基-碳化二亚胺(DCC，与氨基酸当量相同)加入到氨基酸溶液中。混合该溶液约20分钟。然后将活化的酸溶液加到树脂上(如果需要，在加到树脂上之前除去沉淀物)。搅动该反应直到茚三酮测试检测到树脂为阴性。偶联结束后，收集树脂，用DMF洗涤几次。
第2部分从肽-树脂除去N-端Fmoc。
用哌啶/DMF(2/8)处理Fmoc-保护的肽基树脂3分钟。排干(drain)树脂，该处理持续15分钟。用DMF洗涤树脂，然后用DCM洗涤数次。如果下一步包括如步骤3所述将肽从树脂上断裂下来，则此时要将树脂风干。
第3部分TFA断裂和去保护。
将步骤2中经干燥的树脂置于烧瓶中，加入10-25ml断裂液(95％TFA，2.5％水，1.5％三异丙基硅烷和1％乙二硫醇)/g树脂。搅动该反应3-4小时，减压过滤除去树脂，用TFA洗涤两次。减压下用旋转蒸发将滤液浓缩到～20％。冷却该液体至-50℃，用10倍体积的冷干乙醚沉淀。收集沉淀物。然后将肽溶解在含有0.5％TFA的水/乙腈混合物中，冻干。然后用C18HPLC，梯度为10％乙腈/0.1％TFA水溶液-50％乙腈/0.1％TFA水溶液，纯化粗产物。对于1克粗产物，在Agilentprep HPLC上，使用250×50mm C18柱，流速为90毫升/分钟，在215和254nm检测两种波长。将注射液分级，然后用质谱分析各级分。根据质谱将各管富集，减压浓缩以除去乙腈，冻干获得白色粉末状的B1肽拮抗剂。用HPLC-MS和Maldi-TOF质量检测器(mass determination)进行表征。
如下所述制备本发明各种PEG偶联的肽合成选自SEQ ID NO5-60的各种活性缓激肽B1受体肽拮抗剂，在其N末端有不同的肽基接头，用前述方法(例如SEQ ID NO27-41)使各肽拮抗剂末端倒数第二位含有半胱氨酸。用例如下述方法A或方法B，通过定点将马来酰亚胺活化的聚合物偶联于这些肽类似物的N末端半胱氨酸的巯基，用不同大小和构型的聚乙二醇(PEG)将肽类似物进行衍生化。用离子交换层析纯化产生的PEG-肽偶联物，冻干浓缩或透析过滤浓缩，在体外和体内生物试验前将其透析到缓冲液中。
方法A在50mM NaHPO4、5mM EDTA、pH 6.5中，将含有半胱氨酸的肽与PEG-马来酰亚胺(2.5-5mg/ml肽和反应化学计量学上过量1.2倍摩尔的马来酰亚胺硫醇)反应，制备PEG偶联的肽。室温(20-25℃)搅拌该反应1-1.5小时。搅拌一结束，就用摩尔过量10倍的β-巯基乙醇(β-ME)马来酰亚胺终止反应，室温再搅拌30-60分钟。
注射5μl反应液到4.6×250mm，5微米的C4柱(Grace Vydac，Columbia，MD；商品号#214TP54)上，用反相HPLC(RP-HPLC)检测反应进程。用溶于0.1％三氟乙酸的5-90％乙腈线性梯度洗脱未反应的肽和PEG-肽偶联物。通常，反应中消耗了＞90％的肽类似物。
线形马来酰亚胺活化的PEG聚合物(MW＝5kD或20kD，PD＝1.01-1.02)由Shearwater Corp.或NOF Corp，(Toyko，Japan)提供。
纯化在阳离子交换层析中用10mM NaOAc，20％EtOH，pH 4预平衡的SP SepharoseHP柱(Amersham Biosciences)纯化PEG偶联的肽。加样之前，用10倍的20％乙醇稀释反应混合物，并用冰乙酸将pH调整到3.5。将经稀释的反应混合物加到合适大小的柱上，肽树脂的比例不超过2.5mg/ml。
然后用两倍柱体积的(CVs)10mM NaOAc，20％EtOH，pH 4洗涤该柱，用溶于10-20CV的10mM NaOAc，20％EtOH，pH 4中的0-200mM NaCl线性梯度洗脱。监测254nm或220nm的吸光度来检测未修饰的肽和PEG-肽偶联物。在这些条件下，过量的PEG和β-ME被洗出到未结合的流出组分中，偶联物在大约50mM NaCl起的宽峰内洗脱，游离肽被很好地拆分开，其在大约200mM NaCl时洗脱。
洗脱的峰值组分用RP-HPLC评估，根据与PEG-肽偶联物一致的滞留时间和均一性进行富集。干燥浓缩富集的峰值偶联物，然后用水重建，相对缓冲液透析。或者，可用透析过滤来浓缩，对偶联物进行缓冲液交换。
用RP-HPLC分析最终的PEG-肽偶联物合并物，通常～98％是偶联物。用氨基酸分析、肽测序和吸光光谱来测定偶联物的组成和浓度。
用上述的CEX方法(

图1(A))，室温下在pH＝7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，监测一段时间内方案1中1c所示化合物的溶液稳定性。结果显示化合物1c由于琥珀酰亚胺部分的水解很快转化为1d以及另外的两种产物(用IR、MS/MS和NMR试验联合测定的结构)。
方法B在装有机械搅拌器、温度探测器和N2进口的3颈圆底烧瓶中，30℃下将mPEG-马来酰亚胺(1.0当量)溶解于无水MeOH中。mPEG-马来酰亚胺完全溶解后，将含有N末端半胱氨酸残基的肽(1.3eq.)加入到澄清的溶液中，室温搅拌3小时。反相HPLC显示mPEG-马来酰亚胺消失，出现了最初的3-硫烷基-琥珀酰亚胺加合物的新峰。下一步，10当量的二异丙基-乙胺(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)加入到溶液中，25℃至少搅拌24小时。在离子交换层析中用TOSOHAAS SP-5PW(20μm)作为固定相，监测该反应。CEX分析显示，转化率超过98％，剩余的3-硫烷基-琥珀酰亚胺加合物少于1.5％。加入叔丁基甲基乙醚(TBME)(体积是反应中所用甲醇的两倍)，产生的混浊液体室温搅拌2小时。滤去白色沉淀物，室温真空干燥过夜以产生粗制的6-甲基-氨甲酰基-5-氧代-硫代吗啉-3-氨甲酰交联产物(1d)。
纯化用RP-HPLC以MeOH-H2O-AcOH系统(c18YMC ODS NQ作为固定相)纯化上述粗产物，以产生经分析反相色谱测定纯度＞98％的6-甲基-氨甲酰基-5-氧代-硫代吗啉-3-氨甲酰交联产物。将纯化的组分收集在一起，真空下浓缩至干燥，将产生的白色残留物溶解在足够产生澄清溶液的最小量的热MeOH(～30℃)中，然后用TBME(体积是所用MeOH的两倍)处理。产生的混浊溶液室温搅拌1小时，滤去沉淀物，室温真空干燥至少16小时。获得米色纯产物(1d)，总产率为74％，＞98％CEX和RPC纯度。用氨基酸分析、肽测序、多核NMR方法和吸光光谱的组合来测定偶联物的组成和肽含量。用上述的CEX方法，室温在pH＝7的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，监测一段时间内化合物1d的溶液稳定性。证明该化合物的稳定性显著更高，6天内未观察到显著变化。
在带有二极管阵列或可变波长检测器和恒温自动上样器的Agilent 1100HPLC系统进行分析反相(RP)和阳离子(CEX)层析。表征层析条件如下。
1.RP-HPLC方法的条件柱YMC ODS-AQ，3μm，120，4.6×100mm柱温度.40℃流动相A)溶于水的0.1％TFAB)溶于MeOH的0.1％TFA流速1.1毫升/分钟梯度时间％B0 510 4030 9535 9535.1540 5检测UV，220nm注入体积20L或50L，取决于样品浓度样品浓度2.5-10mg/mL样品稀释液Dulbecco’s PBS和用于稳定性研究的其它缓冲液2.常用分析阳离子层析方法柱TOSOH，TSK-GEL，SP-5PW，10μm，7.5×75mm柱浓度25℃流动相A)溶于水/EtOH(8∶2)中的20mM NaH2PO4，pH’3.5B)溶于水/EtOH(8∶2)中的20mM NaH2PO4和0.5M NaCl，pH 3.5流速1.0毫升/分钟梯度时间B％0 03 025 4540 100
4510045.1 0500检测UV，220nm注入体积10-50μL，取决于样品浓度样品浓度2.5-10mg/mL样品稀释液Dulbecco’s PBS和用于稳定性研究的其它缓冲液实施例2用PEG硫酯进行PEG偶联的B1受体肽拮抗剂的合成和纯化。
在50mM NaHPO4、5mM EDTA、pH7中，将含有半胱氨酸的肽与PEG-马来酰亚胺(2.5-5mg/ml肽和反应化学计量学上过量1.2倍摩尔的马来酰亚胺硫醇)反应，制备PEG偶联的肽。室温(20-25℃)搅拌该反应18-26小时。搅拌一结束，就用10倍摩尔过量的β-巯基乙醇(β-ME)马来酰亚胺终止反应，室温再搅拌30-60分钟。用上述实施例中所述的方法A纯化该反应混合物。
实施例3用PEG硫酯或碘代乙酸酯进行PEG偶联的B1受体肽拮抗剂的合成和纯化。
在50mM NaHPO4、5mM EDTA、pH7中，将含有N末端半胱氨酸的肽与PEG-OPTE(邻吡啶基硫酯)(2.5-5mg/ml肽和反应化学计量学上过量1.2倍摩尔的活化的PEG肽)反应，制备PEG偶联的肽。室温(20-25℃)搅拌该反应18-26小时。搅拌一结束，就用10倍摩尔过量的半胱氨酸过量PEG试剂终止反应，室温再搅拌30-60分钟。用上述实施例1中所述的方法A纯化该反应物。
或者，可如上所述用PEG-碘乙酰胺来形成偶联物，其中PEG部分通过硫醚键连接(方案3)。这种情况下，使用1.5摩尔当量的活化PEG反应物，反应时间增加到24小时，用w/10摩尔当量的β巯基乙醇终止反应，如上述实施例所述进行纯化。
实施例4用PEG丙醛进行PEG偶联的B1受体肽拮抗剂的合成和纯化。
可用美国专利5,824,784(全文纳入本文作为参考)所述的方法，用PEG选择性修饰B1受体肽拮抗剂如SEQ ID NO5-60和27-41任一所示肽拮抗剂的N末端。例如，将SEQ ID NO6所示的肽(245mg，0.14mmol)溶解于10mL含有100mMNaH2PO4和60mM NaCNBH3的溶液中。充分搅拌将该混合物冷却到4℃，用2.35克20K mPEG丙醛(Nektar Therapuetics，Hu ntsville，AL)处理。搅拌该混合物3天，然后如实施例1方法B所述用RP和CEX层析纯化。
或者，根据方案5中所示的方法，含有胺反应性官能团的PEG可与部分保护的B1肽拮抗剂反应。偶联反应之后，用固相和液相肽合成领域技术人员熟知的方法将侧链保护基团切离，如上所述纯化产生的PEG-肽构建物。多官能PEG醛(3-6个反应性基团)也可与摩尔过量的保护肽反应，产生多价PEG构建物，其中多个肽以根据化学区域和化学计量上确定的方式连接。
实施例5用PEG N羟基-琥珀酰亚胺进行PEG偶联的B1受体肽拮抗剂的合成和纯化。
根据方案5所示的方法，可用部分保护的B1肽拮抗剂，在如SEQ ID NO5-60所示的任一B1受体肽拮抗剂的特定N末端或侧链氮原子上进行选择性PEG化。例如，将部分(保护的)十肽(1.43g，1.025mmol)在2.5ml无水DMF中的溶液与3.5g(0.18mmol)Sunbright PTE-200GS(20kD 4-臂琥珀酰亚胺基戊二酸酯(gluterate)，NOF，Tokyo，Japan)和溶于25mL二氯甲烷的1.0mL二异丙基乙胺混合。产生的无色溶液室温搅拌2天，然后减压蒸发。产生的残留物溶于25mL去离子水中，置于10,000MW截断值的透析膜(Pierce，Rockford Il，USA)中。化合物对水透析24小时(更换3次缓冲液)，然后冻干以产生保护的四价PEG产物。将产生的白色固体溶于60mL二氯甲烷中，用20mL无水TFA处理。室温搅拌两天后，减压蒸发该反应混合物，然后如上所述溶解并透析。透析过的材料冻干，然后如上所述用离子交换层析进行纯化，产生白色固体状的四价产物。在一个类似方法中，可采用含有1-6个琥珀酰亚胺基戊二酸酯(gluterate)的PEG来制备单-或多官能的肽构建物。
表4aX1肽
表4bY1肽
实施例6B1活性的肽/PEG偶联肽拮抗剂的体外B1抑制活性试验用下面A、B和C所述的试验，鉴定了能够选择性抑制B1活性(相对于B2活性)的肽和/或偶联的肽。
A.用钙通量(Calcium Flux)讲行的人B1受体功能的体外试验Gq关联的B1受体的活化导致细胞内钙的增加。因此，钙敏感的发光蛋白(水母发光蛋白)可用作B1受体活化的指示剂。水母发光蛋白是一个21-kDa的发光蛋白，当其连接于生色团辅因子腔肠素(coelenterazine)时形成生物发光复合物。钙与该复合物结合后，腔肠素的氧化反应导致脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)、酰胺腔肠素(coelenteramide)、CO2和光(其可被常规的发光检测仪检测)的产生。
已建立了稳定的CHO D-/人B1受体(GenBank登录号AJ238044)/水母发光蛋白细胞系，这些细胞在旋转瓶中维持在悬浮液中，该悬浮液含有1∶1比例的DMEM和HAM F12(Gibco 11765-047)、高葡萄糖(Gibco 11965-084)、10％热灭活透析血清(Gibco 26300-061)、1X非必需氨基酸(Gibco 11140-050)、1X谷氨酰胺-Pen-Strep(Gibco 10378-016)和潮霉素300μg/ml(Roche 843555)。在发光计试验15-24小时之前，将25,000细胞/孔(2.5E6细胞/10毫升/板)接种到底部透明侧面呈黑色的96孔试验板中(Costar#3904)。
将培养基从孔中去除，换以不含血清的60μl HAM’s F12，其中添加有30mM HEPES(pH7.5)和15μM腔肠素(腔肠素h Luciferin#90608；AssayDesigns(Ann Arbor，MI)。然后将培养板孵育1.5-2小时。用添加有30mM HEPES，pH 7.5的Ham’s F12制备含有1∶3或1∶5拮抗剂化合物的稀释液的10点IC50化合物板，和促效药活化剂板(20nM去精氨酸化10-胰激肽终浓度，EC80)。腔肠素孵育之后，用自动闪光发光计平台将B1拮抗剂化合物分散到细胞板中，位于细胞板下的CCD相机以5秒的时间间隔拍摄细胞板的12张照片，以确定这些化合物是否具有任何促效药活性。然后，将hB1促效药去精氨酸10-胰激肽加入到细胞板中，再记录12张照片以确定这些拮抗剂的IC50。
B.用钙通量进行的hB2受体功能的体外试验用购自PerkinElmer(Wellesley，MA；商品号RBHB2C000EA)的hB2重组细胞系(CHO-K1)，在荧光照相板读数仪(FLIPR)上分析hB2受体活化诱导的细胞内钙通量。细胞培养在T225烧瓶中，其中含有Ham’s F 12营养混合物(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA；商品号11765-047)、10％胎克隆II牛血清(HyClone，Logan，UT；商品号SH3006603)、1mM丙酮酸钠(100mM贮液，Invitrogen Corp.，商品号12454-013)和0.4mg/ml遗传霉素(G418；50mg/ml活性遗传霉素，Invitrogen，商品号10131-207)。隔天更换培养基。FLIPR试验前24小时，用PBS(Invitrogen)洗涤hB2/CHO细胞一次，每烧瓶中加入10ml Versene(1∶5000，Invitrogen，商品号15040-066)。37℃孵育5分钟后，除去Versene，将细胞从烧瓶分离，重悬在培养基中。计数细胞，将25,000细胞/孔接种到底部透明侧面呈黑色的96孔试验板(Costar，Acton，MA；商品号3904)中。细胞在37℃CO2培养箱中孵育过夜。
将培养基从细胞吸走，换以65μl染色缓冲液。该染色缓冲液是将溶解在DMSO(含有10％[w/v]pluronic acid)中的0.5mM Fluo-4AM贮液(MolecularProbes，Eugene，OR)在Clear Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)中稀释到浓度为1μM来制备的，所述DMEM含有0.1％BSA、20mM HEPES和2.5mM羧苯磺丙胺(羧苯磺丙胺抑制阴离子转运蛋白的活性，因此增加细胞的染色)。细胞在室温染色1小时。用试验缓冲液洗涤细胞两次，以将多余的染液除去。所述试验缓冲液由含有20mM HEPES、0.1％BSA和2.5mM羧苯磺丙胺的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)组成。洗涤步骤之后，各孔中剩余的体积为100μL，细胞板可以在FLIPR系统中进行检测了。用试验缓冲液制备含有1∶3或1∶5拮抗剂稀释液的单点(10u M终浓度)POC拮抗剂化合物板或10点IC50化合物板，以及促效药活化剂板(0.3nM缓激肽终浓度，EC80)。将细胞板和化合物板加到FLIPR中，在试验过程中，在细胞板的所有96个孔中同时进行荧光读数。读取10个1秒时的读数以建立各孔的稳定基线，然后从B1拮抗剂板中取出25μL迅速(50μL/秒)加入各孔。以1秒的时间间隔中检测荧光信号(1分钟)，然后以6秒的时间间隔检测(2分钟)，共检测3分钟以测定这些化合物是否具有任何的促效药活性。然后在细胞板中加入B2促效药，缓激肽，再记录3分钟以确定拮抗剂为10μM(POC板)时的抑制百分比或IC50。
相对于偶联较大PEG聚合物的肽，在hB1水母发光蛋白试验中检测的运载体-或PEG偶联肽的IC50值平均体外活性稍微有所降低。例如，SEQ ID NO36所示的肽以及SEQ ID NO37所示的该肽的乙酰化形式，对hB1受体的IC50值分别为3.0nM(+/-5nM，n＝8)和3.2nM(+/-3.2nM，n＝9)。而如本文所述偶联于PEG的相同的肽，证明其IC50值约增加10倍。在hB2FLIPR试验中，高达10μM时，天然、乙酰化的和PEG偶联形式的肽失活。这些化合物对hB1或hB2受体没有显示出促效药活性。
C.hB1受体结合肽基于组织的体外试验用下述的体外人脐静脉(HUV)收缩性试验来测定本发明的肽和/或运载体-偶联肽对缓激肽B1受体的拮抗剂活性和选择性。
将内皮裸露的血管(endothelium-denuded vessels)悬浮在20ml器官浴(organbath)中，所述器官浴含有充氧的(95％O2和5％CO2)和预热的(37℃)标准生理盐溶液，该生理盐溶液具有以下组成(以mM表示)NaCl 118.0、KCl 4.7、MgSO41.2、CaCl22.5、KH2PO41.2、NaHCO325.0和葡萄糖11.0(pH 7.4)。用KCl等摩尔置换NaCl，制备高浓度K+溶液(80mM KCl)。整个试验中还存在Hoe140(1μM)，mergetpa(1μM)和卡托普利(10μM)，目的分别是阻抑B2受体和防止肽降解。将该组织与测力传感器相连，以记录等长张力(isometric tension)，然后使其在优化的静止张力下平衡足够长的时间。用带有8个器官浴(各自有多通道数据获取)的半自动器官分离系统进行这些试验。首先将组织接触高浓度K+溶液(80mM KCl)以获得有控制的收缩。洗涤以及随后的60分钟平衡之后，将组织接触累计递增浓度的参照促效药Lys-desArg9-BK，以获得在不存在(对照制剂)或存在各种浓度的测试化合物或参照拮抗剂Lys-desArg9[Leu8]-BK(测试制剂)时的浓度响应曲线，测试化合物或参照拮抗剂Lys-desArg9[Leu8]-BK在接触Lys-desArg9-BK之前15分钟加入。在各制剂中产生了对Lys-desArg9-BK的浓度响应曲线。
检测到的参数是各促效药浓度诱导的张力的最大变化，结果表示为对KCl的对照响应的百分数。用浓度响应曲线的线性回归分析来计算促效药的EC50值(产生最大响应的一半时的浓度)。测试化合物和Lys-desArg9[Leu8]-BK的拮抗剂效力计算为pA2值(使促效药的浓度响应曲线向右偏移2倍的-log浓度)，该值是根据Van Rossum(Van Rossum，J.M.，累计剂量响应曲线.II.用于在分离的器官中建立剂量响应曲线的技术和药物参数的评价(Technique for the making ofdose-response curves in isolated organs and the evaluation of drug parameters).Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.，143299-330(1963))计算的。仅仅用导致促效药浓度响应曲线有明显向右偏移的拮抗剂浓度来计算pA2值。pA2值是三次测定的平均值±s.e.m.。用斯氏t测验来测定差别的统计学显著性，p＜0.05认为具有统计学显著性。
D.肽和/或偶联肽的体外B1抑制活性也可通过检测各肽和/或偶联肽在脊根神经节(DRG)的神经元培养物中阻抑B1激活的CGRP、P物质的释放以及钙信号转导，来评价所述肽和/或偶联肽作为B1活性抑制剂(即，B1“中和”)的有效性。
脊根神经节的神经元培养物。无菌条件下从19天(E19)大的胚性大鼠的所有脊髓区段上逐一分离脊根神经节，所述胚性大鼠是从同步怀孕、麻醉致死的Sprague-Dawley大鼠的子宫中手术分离取得的(Charles River，Wilmington，MA)。在含有5％热灭活的马血清(GibcoBRL)的冰冷的L-15培养基(GibcoBRL，Grand Island，NY)中收集DRG，除去任何的疏松结缔组织和血管。在不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)，pH7.4(GibcoBRL)中洗涤DRG两次。然后用木瓜蛋白酶解离系统(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)将DRG解离到单细胞悬浮液中。简言之，在消化溶液(含有溶于Earle’s平衡盐溶液(EBSS)的20U/ml木瓜蛋白酶)中37℃下孵育DRG50分钟。在由MEM/Ham’sF12(1∶1)、1mg/ml卵类粘蛋白抑制剂、1mg/ml卵清蛋白和0.005％脱氧核糖核酸酶I(DNase)组成的解离培养基中，用表面经火处理过的巴斯德移液管研磨使细胞解离。解离的细胞在200xg离心5分钟，重悬在EBSS(含有1mg/ml卵类粘蛋白抑制剂、1mg/ml卵清蛋白和0.005％DNase)中。在含有10mg/ml卵类粘蛋白抑制剂、10mg/ml卵清蛋白的梯度溶液中200xg离心细胞悬浮液6分钟，以除去细胞碎片，然后通过88-μm的尼龙筛(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)过滤以去除任何团块。用血细胞计数器来测定细胞数目，以10×103细胞/孔将细胞接种到100μg/ml聚-鸟氨酸(Sigma，St.Louis，MO)和1μg/ml小鼠层粘连蛋白(GibcoBRL)-包被的96-孔板中，在完全培养基中培养。完全培养基由最小基础培养基(MEM)和Ham’s F12(1∶1)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和10％热灭活的马血清(GibcoBRL)组成。该培养物保持在37℃、5％CO2和100％湿度。为了控制非神经元细胞的生长，培养基中含有5-氟-2’-脱氧尿苷(75μM)和尿嘧啶核甙(180μM)。
用B1和抗B1肽和/或抗-B1偶联肽处理。铺板后2小时，以10ng/ml(0.38nM)浓度的重组人β-B1或重组大鼠β-B1处理细胞。在各培养板中加入含有系列稀释的抗-B1抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)的阳性对照。以3.16倍系列稀释的10种浓度加入测试肽或测试的偶联肽(例如，来自实施例1的肽或偶联肽)。加入培养物中之前，所有的样品都稀释在完全培养基中。孵育时间通常约为40小时，然后检测VR1表达。
DRG神经元中VR1表达的测定。用溶于Hanks’平衡盐溶液的4％的多聚甲醛将培养物固定15分钟，用Superblock(Pierce，Rockford，IL)阻抑，然后室温下用溶于Tris.HCl(Sigma)-缓冲的盐水(TBS)的0.25％Nonidet P-40(Sigma)透化处理1小时。用含有0.1％Tween 20(Sigma)的TBS洗涤细胞一次，室温与家兔抗-VRl IgG(由Amgen制备)孵育1-1.5小时，然后室温与Eu-标记的抗家兔第二抗体(Wallac Oy，Turku，Finland)孵育1小时。每次与抗体孵育之后，用TBS洗涤(3×5分钟，缓慢摇动)。在培养物中加入增强溶液(150μl/孔，Wallac Oy)。然后在时间分辨荧光计(Wallac Oy)中检测荧光信号。通过与0-1000ng/ml B1滴度的标准曲线比较，确定用所述运载体-偶联肽处理的样品中VR1的表达。通过与未经B1处理的对照相比，确定B1对DRG神经元中VR1表达的百分抑制率(与最大可能抑制相比)。
各个PEG偶联的B1肽拮抗剂的受体结合和功能活性的削弱与添加的PEG基团的大小直接相关，对效力造成约5-200倍的降低。约5-7残基的聚甘氨酸接头可以很好地保存(B1肽拮抗剂的)功能，而更长的接头几乎不显示出改进(“柔性接头”)或证明其对活性有损害(“刚性接头”)。最后，表8用多种不同的PEG偶联的B1肽拮抗剂说明了本申请涵盖的宽度。
表8肽和PEG化的肽拮抗剂对人B1受体(hB1)的结合亲和性(Ki)和功能效力(IC50)
a用方案4中所述的在单罐反应(one-pot)的方法产生；b在N末端残基进行还原性氨基化，ε胺；c在N末端残基酰化，ε胺；d在N末端残基酰化，α胺实施例7肽和/或偶联肽稳定性的测定A.大鼠肾脏刷状缘微绒毛试验根据Booth等(Biochemical Journal，142575(1974))所述的方法制备肾隔膜(kidney membrane)。用Bradford(Anal.Biochemistry.，72248-254(1976))方法测定蛋白浓度。
B.大鼠或人肺S9匀浆物试验如Skidgel等(Biochemical Pharmacology 333471(1984))所述制备大鼠或人的肺。
在PBS溶液(pH＝7.1)中制备1mM浓度的测试化合物。将测试化合物加到方法A或B中获得的组织制品中(蛋白的终浓度为2mg/ml)，37℃孵育。在多个时间点，用乙腈、溶于乙腈的0.1M HCl或溶于水的10％TFA沉淀蛋白。离心将蛋白除去，滤出液再通过0.1μM的膜过滤。然后用反相HPLC(4.6×300mmNovapak HR C 18(Waters Corporation，Milford，MA)，流速＝1mL/min，线性梯度从10％ACN(0.1％蚁酸)-90％水(0.1％蚁酸)至50％ACN(0.1％蚁酸)-50％水(0.1％蚁酸，20分钟)，用质谱检测。相对于内部标准品，将时间T时测试化合物的浓度拟合于一级损耗函数(first order loss function)([化合物]t＝[化合物]0(1-e(-kt))；“[化合物]0”和“[化合物]t”分别是时间为零时测试化合物的浓度和取样时测试化合物的浓度；变量“t”是取样分析的时间；k是测试化合物浓度变化的速率)。变量“k”是用JMP统计学软件包提供的非线性回归方法测定的。假设测试化合物的浓度随着时间减少，‘k’值是负的。用下式从得自模型的“k”值计算半衰期T＝(Ln 2)/k。
实施例8抗-B1肽和运载体偶联的抗B1-肽在大鼠和猴子疼痛模型中的体内抗伤害性疼痛活性A.去鼠神经性疼痛模型。 如Kim和Chung(大鼠中由脊髓区段神经连接造成的外围神经性病变的实验模型.Pain 50355-363，(1992))首先描述的，用异氟烷吸入性麻醉法将雄性Sprague-Dawley大鼠(200g)麻醉，将L5和L6水平的左侧腰脊髓神经紧连(4-0丝绸缝合)于背根神经节的末梢，在坐骨神经之前。闭合切口，使大鼠复原。该方法在左后爪造成机械性(可触知的)异常性疼痛，这是通过记录在多大压力时受影响的爪子(与神经伤害的位置同侧)从各等级的刺激(von Frey filaments 4.0-148.1mN)缩回而评价的，所述各等级的刺激通过金属网孔观察罩垂直施加到爪子的跖面(爪垫之间)。如Chaplan，S.R.，等(大鼠爪子中可触知的异常性疼痛的定量评价.J.Neurosci.Meth，5355-63(1994))所述，连续增加和降低刺激强度并用Dixon非参数测验来分析数据，确定爪缩回域值(PWT)。
正常大鼠和假手术大鼠(分离了神经但没有连接)至少忍受148.1mN(相当于15g)的压力而没有反应。脊髓神经连接的大鼠在其受影响的爪上响应的压力小至4.0mN(相当于0.41g)。只有那些没有表现出动作障碍(例如爪子拖拉和下垂)并且PWT低于39.2mN(相当于4.0g)的大鼠才被包括在本研究中。手术后至少7天，通过s.c.注射用测试肽或测试运载体偶联肽(通常筛选剂量分别约为1mg/kg和60mg/kg)或对照稀释液(PBS)处理大鼠一次，此后每天测定PWT，测定7天。
B.大鼠CFA炎性疼痛模型。用异氟烷吸入性麻醉法将雄性Sprague-Dawley大鼠(200g)轻度麻醉，用完全弗氏佐剂(CFA)0.15ml注射左后爪。该方法在左后爪造成机械性(可触知的)异常性疼痛，这是通过记录在多大压力时受刺激的爪子(与神经伤害的位置同侧)从各等级的刺激(von Frey filaments 4.0-148.1mN)缩回而评价的，所述各等级的刺激通过金属网孔观察罩垂直施加到爪子的跖面(爪垫之间)。如Chaplan等(1994)所述，连续增加和降低刺激强度并用Dixon非参数测验来分析缩回数据，确定PWT。只有那些没有表现出动作障碍(例如爪子拖拉和下垂)或皮肤破损并且PWT低于39.2mN(相当于4.0g)的大鼠才被包括在本研究中。CFA注射后至少7天，通过s.c.注射用测试肽或测试运载体偶联肽(通常筛选剂量为60mg/kg)或对照溶液(PBS)处理大鼠一次，此后每天测定PWT，测定7天。用下列公式％MPE＝100*(经处理大鼠的PWT-对照大鼠的PWT)/(15-对照大鼠的PWT)，将平均爪缩回域值(PWT)转换为最大可能效果的百分数(％MPE)。因此，15g(148.1mN)的截断值相当于100％的MPE，对照反应相当于0％的MPE。
预期本发明优选的肽和运载体-偶联肽分别在约1mg/kg和60mg/kg产生具有PD关联的抗伤害性疼痛效果。
B.绿猴LPS炎症模型。可基本如deBlois和Horlick(British Journal ofPharmacology.132327-335(2002))(全文纳入本文作为参考)所述，用被B1促效药局部攻击的雄性绿猴(Cercopithaecus aethiops St Kitts)评价肽和/或偶联肽作为B1活性抑制剂的有效性。
为了测定本发明的PEG-偶联肽拮抗剂是否抑制B1诱导的水肿，在CaribbeanPrimates Ltd.实验农场(St Kitts，West Indies)的雄性绿猴(Cercopithaecus aethiops StKitts)身上进行了下述研究。实验方法是经CR-CHUM(Montreal，Canada)和Caribbean Primates Ltd.(St Kitts，West Indies)的动物关心委员会查看和接受的。将体重6.0±0.5kg(n＝67)的动物麻醉(50mg开他敏kg-1)，用单次静脉注射LPS(90μgkg-1)或通过隐静脉注射盐水(1ml)来预处理动物。
1.炎症研究用腹侧皮肤皱襞试验来评价激肽诱导的水肿(Sciberras等，1987)。简言之，用卡托普利注射经麻醉的动物(1mg kg-1，试验前30分钟)。在腹侧区域单次皮下注射dKD、BK或运载体(2mM抑氨肽酶素溶于100μl Ringer′s乳酸盐中)。用已校准的测径器检测皮肤皱襞厚度的增加30-45分钟。结果表示为皮下注射前和皮下注射后皮肤皱襞厚度之差。卡托普利和抑氨肽酶素分别用于减少激肽羧基和氨基末端的降解。
拮抗剂SCHILD分析在不存在或存在不同浓度的PEG-肽拮抗剂时，在给予LPS之后24小时时测定dKD(1-100nmol)诱导的水肿的剂量响应关系。BK(30nmol)用作阳性对照。
拮抗剂时间过程单次弹丸给药(bolus administration)后4、24、48、72和/或96小时测定拮抗剂的抑制性的时间过程。BK(30nmol)用作阳性对照。
药物盐酸开他敏、LPS、抑氨肽酶素和卡托普利购自Sigma(MO，U.S.A.)。所有的肽都得自Phoenix Pharmaceuticals(CA，U.S.A.)。
统计学数据数值表示为平均值±平均值标准误差(平均值的s.e.)。在水肿研究中，从皮下攻击后的皮肤皱襞厚度中减去注射前皮肤皱襞的厚度。用适于苹果电脑的Delta Graph 4.0软件进行曲线拟合和计算EC50。用方差的双向分析来比较数据，然后进行不成对的单尾斯氏t测验，采用Bonferroni校正。p＜0.05认为具有统计学显著性。
在水肿形成试验中，将LPS给予绿猴使它们对B1受体促效药敏感性从零水平开始增加。相比较地，对B2受体促效药BK的响应未受影响。
令人吃惊的是，单次皮下注射10mg/kg相同的肽类似物的代表性5kD PEG偶联肽和20kD PEG偶联肽就足以减轻已建立的B1促效药诱导的炎性反应，并抑制随后的每日促效药攻击分别为3天和4天。在96小时内未观察到对B1攻击的快速耐受性(tachyphalaxis)。该作用还被测定为对B1而非B2具有选择性。而且，5K PEG-偶联物响应于dKD攻击而抑制水肿的时间长于未偶联的(天然的)肽，但两种分子都迅速发挥作用且在1.25小时的效力都相当。
实施例9大鼠药代动力学研究通过静脉内(iv)或皮下(sc)途径，以大丸剂将各种肽或偶联肽(在水性介质中)给予雄性Sprague-Dawley大鼠。在多个时间点(例如，注射后0、15、30分钟和/或1、2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96、120、240和/或320小时)收集血液样品置于肝素化(heparized)管中。离心从细胞团块中除去血浆，冰冻或立即处理。用分析物-特异性LC-MS/MS或ELISA方法定量测定血浆中感兴趣的化合物。用非区化(non-compartmental)方法计算各种标准药代动力学参数，如清除率(CL)、表观清除率(CL/F)、分布体积(Vss)、平均停留时间(MRT)、曲线下面积(AUC)和终末半衰期(t1/2)(例如见表9)。
表9大鼠中肽和PEG化的肽B1拮抗剂的药代动力学研究
a由方案4所述的在单罐反应(one-pot)的方法所产生。
bN末端残基还原性氨基化，ε胺；c1mpk sc；dN末端残基酰化，ε胺；e0.5mpk sc；fN末端残基酰化，α胺；g30mpk sc；h1mpk iv；i3mpk iv应理解，对如上所述的本发明可进行多种变化。因此，本发明的范围由下述权利要求所限定。
序列表<110>埃姆艮股份有限公司(Amgen Inc.)<120>缓激肽B1受体拮抗剂<130>A-836B<140>未记录<141>2004-10-22<150>60/538,929<151>2004-01-24<150>未给予<151>2004-10-21<150>60/513,913<151>2003-10-22<160>60<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>9<212>PRT<213>人<400>1Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>人<400>2Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5 10<210>3<211>11<212>PRT<213>人工<220>
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<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp
<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>15Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>16<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Thz<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>16Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>17<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为3Pal<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)
<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>17Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>18<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为4Pal<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>18Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>19<211>9<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为Cha<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>位置4处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>位置6处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>位置8处的Xaa限定为DTic<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Cpg<400>19Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为2Nal<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>位置4处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>位置6处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>位置8处的Xaa限定为DTic<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Cpg<400>20Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>位置4处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>位置6处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>位置8处的Xaa限定为DTic<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Cpg
<400>21Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5<210>22<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为DLys<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>22Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>23<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>23
Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>24<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2处的Xaa限定为Cha<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>24Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>25<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2处的Xaa限定为Abu<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>25Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10
<210>26<211>11<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置1处的Xaa限定为2Nal<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(1)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>26Leu Xaa Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>27<211>13<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<400>27Cys Gly Gly Gly Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu1 5 10<210>28<211>15<212>PRT<213>人工肽<220>
<223>人工
<400>28Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu1 5 10 15<210>29<211>15<212>PRT<213>人工肽<220>
<223>人工<400>29Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Gly Phe Ser Pro Leu1 5 10 15<210>30<211>17<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<400>30Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro1 5 10 15Leu<210>31<211>12<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>位置3处的Xaa限定为CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2<400>31Cys Gly Xaa Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu1 5 10<210>32<211>16<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>位置13处的Xaa限定为MePhe<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>位置15处的Xaa限定为D-Beta-NaI<400>32Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Leu Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile1 5 10 15<210>33<211>16
<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>位置11处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>位置13处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>位置15处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>位置16处的Xaa限定为Cpg<400>33Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10 15<210>34<211>18<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>位置12处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>位置14处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>位置16处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>位置17处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>34Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser1 5 10 15
Xaa Xaa<210>35<211>16<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>位置12处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>位置14处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>位置16处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>位置17处的Xaa限定为Cpg<400>35Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10 15<210>36<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic
<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>36Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>37<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>位置6处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>位置8处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>位置11处的Xaa限定为Cpg<400>37Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>38<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<400>38Cys Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu1 5 10<210>39<211>16<212>PRT
<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>位置11处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>位置13处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>位置15处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>位置16处的Xaa限定为Cpg<400>39Cys Gly Gly Gly Gly Gly Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10 15<210>40<211>16<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>位置11处的Xaa限定为Thz<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>位置13处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>位置15处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>位置16处的Xaa限定为Cpg<400>40Cys Gly Gly Gly Gly Gly Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10 15<210>41<211>16<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>位置8处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>位置11处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>位置14处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>位置15处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>位置16处的Xaa限定为Cpg<400>41Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10 15<210>42<211>15<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<400>42Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu1 5 10 15<210>43<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为D-Dab<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>43
Xaa Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为D-Dab<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>44Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg
<400>45Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>46<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为DOrn<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>46Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为D-3′Pal<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>47Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>48<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为D-3′Pal<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>位置7处的Xaa限定为Cpg<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>位置9处的Xaa限定为Dtic<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>位置10处的Xaa限定为Cpg<400>48Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10<210>49<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>位置1处的Xaa限定为D-Lys<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2处的Xaa限定为D-2-Nal<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>位置5处的Xaa限定为Hyp<220>
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<220>
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<220>
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<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>位置8处的Xaa限定为D-Beta-NaI<400>60Leu Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile1 权利要求
1.一种组合物，具有下式F-[(X1)-(Y1)n]，或其生理学上可接受的盐，其中X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；F是共价结合于X1或Y1的运载体；L1和L2不存在，或各自独立具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；和P1和P2各自独立为缓激肽B1受体肽拮抗剂。
2.一种组合物，具有下式F’-Rz，或其生理学上可接受的盐，其中F’是多价运载体；R在各情况下独立为-(X1)-(Y1)n，其中R共价结合于F’；X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；L1和L2不存在或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；Z是2-8；和P1和P2各自独立为缓激肽B1受体肽拮抗剂。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，P1和P2各自独立为选自SEQID NO5-26，43-60及其衍生物的缓激肽B1受体肽拮抗剂。
4.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，X1是具有选自SEQ ID NO27-41及其衍生物的氨基酸序列的肽。
5.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，n是1且P2是具有SEQ IDNO42所示序列的肽。
6.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，n是0。
7.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，P1和P2各自独立为肽拮抗剂，所述肽拮抗剂选自由下式所定义的肽NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸或碱性二肽；a1、a2、a3和a4各自独立为碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸；a6是Ser；a5、a7和a8各自独立为芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸，条件是a5、a7和a8的至少一个选自D-或L-构型的Chg、Cpg、Igla、Iglb、Niga和Nigb；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在，或各自独立为天然氨基酸。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于a0不存在，或是碱性氨基酸或碱性二肽；a1是碱性氨基酸或碱性二肽；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5和a8是茚满基氨基酸；a6是Ser；a7是D-茚满基氨基酸；a8是Cpg；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在，或各自独立为天然氨基酸。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于a0是选自下组的氨基酸Arg、D-Arg、Orn、D-Orn、Lys、Dlys，或由独立地选自下组的两个氨基酸组成的二肽Arg、D-Arg、Orn、D-Orn、Lys、Dlys；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Cpg；a6是Ser；a7是DTic；和a8是Cpg。
10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于a0是Lys-Lys；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Iglb；a6是Ser；a7是DIglb；和a8是Oic。
11.如权利要求7所述的组合物，其特征在于a0是DArg；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Igl；a6是Ser；a7是DIgl；和a8是Oic。
12.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，P1和P2各自独立为肽拮抗剂，所述肽拮抗剂选自由下式所定义的肽NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性氨基酸或碱性二肽；a1是Arg；a2是Pro；a3是Pro；a4是Gly；a5是Me-Phe；a6是Ser；a7是D-β-NaI；和a8是Ile。
13.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述L1是肽基接头，其具有选自SEQ ID NO100-SEQ ID NO105的氨基酸序列。
14.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述L1是肽基接头，其具有选自SEQ ID NO100-SEQ ID NO105的氨基酸序列。
15.一种方法，用于治疗、预防或缓解与B1活性相关或由其介导的疾病或病症，该方法包括给予人或动物对象治疗有效量的权利要求1或2所述的组合物。
16.一种方法，用于治疗、预防或缓解与B1活性相关或由其介导的疾病或病症，该方法包括给予人或动物对象治疗有效量的权利要求3所述的组合物。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
19.一种药物组合物，所述组合物含有权利要求1或2所述的组合物和至少一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
20.一种组合物，具有下式F-[(X1)-(Y1)n]，或其生理学上可接受的盐，其中X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；F是共价结合于X1或Y1的PEG；L1和L2不存在，或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；和P1和P2各自独立为缓激肽B1受体肽拮抗剂。
21.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述F’是多价PEG。
22.如权利要求20或21所述的组合物，其特征在于，P1和P2各自独立为选自SEQ ID NO5-60及其衍生物的缓激肽B1受体肽拮抗剂。
23.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，X1是具有选自SEQ ID NO27-41及其衍生物的氨基酸序列的肽。
24.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，n是0且Z是2-8。
25.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，Z是4。
26.一种组合物，具有下式F-[(X1)-(Y1)n]，或其生理学上可接受的盐，其中X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；F是共价结合于X1或Y1的运载体；L1和L2不存在，或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；和P1和P2各自独立为肽拮抗剂，所述肽拮抗剂选自下式所定义的肽NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸或碱性二肽；a1、a2、a3和a4各自独立为碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸；a6是Ser；a5、a7和a8各自独立为芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸，条件是a5、a7和a8的至少一个选自D-或L-构型的Chg、Cpg、Igla、Iglb、Niga和Nigb；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在，或各自独立为天然氨基酸。
27.一种组合物，具有下式F’-Rz，或其生理学上可接受的盐，其中F’是多价运载体；R在各情况下独立为-(X1)-(Y1)n，其中R共价结合于F’；X1和Y1分别各自独立为式-L1-P1和-L2-P2的肽；L1和L2不存在，或各自独立为具有0-9个氨基酸残基的接头；n是0-3；Z是2-8；和P1和P2各自独立为肽拮抗剂，所述肽拮抗剂选自下式所定义的肽NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0不存在，或是碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸或碱性二肽；a1、a2、a3和a4各自独立为碱性或中性芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸；a6是Ser；a5、a7和a8各自独立为芳族、脂肪族、杂环或脂环族氨基酸，条件是a5、a7和a8的至少一个选自D-或L-构型的Chg、Cpg、Igla、Iglb、Niga和Nigb；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在，或各自独立为天然氨基酸。
28.如权利要求26或27所述的组合物，其特征在于，a0不存在，或是碱性氨基酸或碱性二肽；a1是碱性氨基酸；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5和a8各自独立为茚满基氨基酸；a6是Ser；a7是D-茚满基氨基酸；a8是Cpg；和a9、a10、a11、a12、a13和a14不存在，或各自独立为天然氨基酸。
29.如权利要求26或27所述的组合物，其特征在于a0是选自下组的氨基酸Arg、D-Arg、Orn、D-Orn、Lys、Dlys，或由独立地选自下组的两个氨基酸组成的二肽Arg、D-Arg、Orn、D-Orn、Lys、Dlys；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Cpg；a6是Ser；a7是DTic；和a8是Cpg。
30.如权利要求26或27所述的组合物，其特征在于a0是D-Arg，或选自Lys-Lys、DLys-Lys和DOrn-Lys的二肽；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Iglb；a6是Ser；a7是DIglb；和a8是Oic。
31.如权利要求26或27所述的组合物，其特征在于a0是D-Arg或Lys-Lys二肽；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Igl；a6是Ser；a7是DIgl；和a8是Oic。
32.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于P1和P2各自独立为肽拮抗剂，所述肽拮抗剂选自由下式所定义的肽NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH其中a0是选自下组的氨基酸Arg、D-Arg、Orn、D-Orn、Lys、Dlys，或由独立地选自下组的两个氨基酸组成的二肽Arg、D-Arg、Orn、D-Orn、Lys、Dlys；a1是Arg；a2是Pro；a3是Hyp；a4是Gly；a5是Me-Phe；a6是Ser；a7是D-β-NaI；和a8是Ile。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述L1是肽基接头，其具有选自SEQ ID NO100-SEQ ID NO105的氨基酸序列。
34.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量选自下组i.5,000道尔顿；ii.20,000道尔顿；iii.24,000道尔顿；iv.30,000道尔顿；v.40,000道尔顿；和vi.60,000道尔顿。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物能够在体外拮抗B1受体活性并且在哺乳动物体内具有治疗学上可接受的半衰期。
36.一种方法，用于治疗、预防或缓解与B1活性相关或由其介导的疾病或病症，该方法包括给予人或动物对象治疗有效量的权利要求34所述的组合物。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
38.一种药物组合物，所述组合物含有权利要求34所述的组合物和至少一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
39.如权利要求34所述的组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的应用，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
40.一种缓激肽B1受体肽拮抗剂，所述肽拮抗剂包含选自SEQ ID NO15-35、39-54及其衍生物的氨基酸序列，或其生理学上可接受的盐。
41.一种缓激肽B1受体肽拮抗剂，所述肽拮抗剂包含选自SEQ ID NO15-35的氨基酸序列，或其生理学上可接受的盐。
42.如权利要求41所述的肽，其特征在于，其包含选自SEQ ID NO15-26的氨基酸序列。
43.如权利要求40所述的肽，其特征在于，所述N末端氨基酸是D型-氨基酸。
44.如权利要求43所述的肽，其特征在于，所述N末端氨基酸选自D-Dab、Dlys、Darg和DOrn。
45.一种药物组合物，其包含缓激肽B1受体肽拮抗剂，所述肽拮抗剂含有选自SEQ ID NO15-35的氨基酸序列和至少一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
46.一种方法，用于治疗、预防或缓解与B1活性相关或由其介导的疾病或病症，该方法包括给予人或动物对象治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含缓激肽B1受体肽拮抗剂，所述肽拮抗剂含有选自SEQ ID NO15-35的氨基酸序列和至少一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
48.权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的应用，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
49.权利要求45所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的应用，所述疾病或病症选自炎症、炎性疼痛、急性疼痛、牙痛、背痛、下腰痛、外伤造成的疼痛、手术性疼痛、炎性肠疾病、哮喘和过敏性鼻炎。
全文摘要
本发明涉及一些生物学活性肽和偶联肽，它们可用作对抗与致病因子B1关联的疾病或病症的治疗性或预防性药物。在本发明一个优选实施方式中，提供了生物学活性的PEG－偶联肽。在本发明的一个方面，本发明的药学活性PEG－偶联肽可用于治疗炎症或疼痛。
文档编号A61P29/00GK1897976SQ200480038150
公开日2007年1月17日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年10月22日
发明者G·吴, Y·-S·李, C·V·格格, B·C·小艾斯丘, T·施托尔茨, 卢跃列, D·C·答米克 申请人:埃姆艮股份有限公司