Lfa－1拮抗剂化合物的制作方法

专利名称：Lfa－1拮抗剂化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与CD11/CD18粘附受体结合，尤其是淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的新化合物，以及含所述化合物的药物组合物，能用来治疗LFA-1介导的疾病。
背景技术：
炎症人外周血主要由血红细胞、血小板以及白细胞(white blood cells orleukocytes)组成。白细胞又细分为嗜中性粒细胞、淋巴细胞(主要为B细胞和T细胞亚型)、单核细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞。嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞有时也被称为“粒细胞”，或“多形核(PMN)粒细胞”，因为它们细胞质和多个核的颗粒外观。粒细胞和单核细胞经常被归类为“吞噬细胞”，因为它们能吞噬或摄取微生物和一般被称为“抗原”的异物(foreign mater)。单核细胞也被这样称呼是因为它们巨大的单核以及它们会转变成巨噬细胞。吞噬细胞在保护机体抵抗各种感染，并与淋巴细胞一起在炎症疾病中发挥重要作用。嗜中性粒细胞是人外周血中最常见的白细胞，其次是淋巴细胞。在一微升正常人外周血中，含有约6,000个白细胞，其中有约4,000个嗜中性粒细胞，1500个淋巴细胞，250个单核细胞，150个嗜曙红细胞以及25个嗜碱细胞。
在炎症反应的过程中，外周血中的白细胞通过一系列的细胞间相互作用集中到炎症或损伤部位(见

图1)。免疫功能的引发和维持是由细胞间的相互粘附作用以及白细胞与其他细胞之间的相互作用导致的信号传导来调节。炎症反应的一个重要步骤就是白细胞粘附到血管内皮细胞，从循环系统中向炎症部位迁移(图1)。T淋巴细胞的免疫识别需要T细胞受体与抗原(与主要的组织相容性复合物体结合)之间的相互作用以及能促进T细胞在抗原呈递细胞上的附着和T细胞激活信号转导的黏附受体的参与。淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)被确定为主要的整合素，介导淋巴细胞粘附及激活，从而引起正常的免疫应答和几种病理状态(Springer，T.A.，Nature 346425-434(1990))。细胞间粘附分子(ICAM)-1，-2，-3，是免疫球蛋白超家族的成员，并是内皮细胞、白细胞以及其他细胞类型上LFA-1的配体。LFA-1与ICAMs的结合，引发一系列的淋巴细胞功能，包括辅助T细胞接触抗原呈递细胞时产生淋巴因子，T-淋巴细胞介导的靶细胞溶解，自然杀死癌细胞，以及通过T细胞与B细胞相互作用产生免疫球蛋白。因此，淋巴细胞功能的很多方面参与了LFA-1整合素与其ICAM配体的相互作用。许多炎症疾病都直接涉及到这种LFA-1ICAM介导相互作用，包括移植排斥、皮炎、牛皮癣、哮喘和风湿性关节炎。
淋巴细胞上的LFA-1(CD11a/CD18)在慢性炎症和免疫应答中发挥关键作用，而白细胞整合素家族的其他成员(CD11b/CD18，CD11c/CD18和CD11d/CD18)对其他白细胞，如粒细胞和单核细胞，也发挥重要作用，尤其是在对感染剂的早期应答以及在急性炎症反应中。
多形核白细胞来源于嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞系，它作为机体的第一道防御屏障其基本功能是感知炎症刺激并穿过内皮细胞执行清除功能。整合素Mac-1(CD11b/CD18)被激活后，在这些细胞上的表达迅速上调，并与其多重配体结合，从而释放氧自由基、蛋白酶和磷脂酶。在某些慢性炎症状态下，这种集中受到不适当的调控，导致显著的细胞和组织损伤。(Harlan，J.M.，Acta Med Scand Suppl.，715123(1987)；Weiss，S.，New England J.ofMed.，320365(1989))。
LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)粘附受体分子的(CD11/CD18)家族包括四种密切相关的细胞表面糖蛋白LFA-1(CD11a/CD18)，Mac-1(CD11b/CD18)，p150.95(CD11c/CD18)和(CD11d/CD18)。除了巨噬细胞的一个亚群之外，LFA-1存在于所有成熟的白细胞的表面，并被认为是主要的淋巴整合素。Mac-1、p150.95和CD11d/CD18的表达主要仅限于骨髓谱系细胞(包括嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。功能研究表明LFA-1与数种配体相互作用，包括ICAM-1(Rothlein等，J.Immunol.1371270-1274(1986))、ICAM-2(Staunton等，Nature 339361-364(1989))、ICAM-3(Fawcett等，Nature 360481-484(1992)；Vezeux等，Nature 360485-488，(1992)；de Fougerolles and Springer，J.Exp.Med.175185-190(1990))以及前脑胞(Telencephalin)(Tian等，J.Immunol.158928-936(1997))。
CD11/CD18家族与调节细胞相互粘附作用大整合素受体家族在结构和遗传特性上相互关联，所述细胞粘附作用包括胚形成，对细胞外底物的粘附，以及细胞分化(Hynes，R.O.，Cell 48549-554(1987)；Kishimoto等，Adv.Immunol.46149-182(1989)；Kishimoto等，Cell 48681-690(1987)；Ruoslahti等，Science 238491-497(1987))。
整合素是一类跨膜异型二聚体，包括非共价结合的α亚基和β亚基。β亚基通常能与一个以上的α亚基结合，并且那些有一个共同的β亚基的异型二聚体被归类为整合素群的一个亚家族(Larson and Springer，″Structure andfunction ofleukocyte integrins，″Immunol.Rev.114181-217(1990))。
研究发现CD11/CD18家族的整合素分子及其细胞配体介导了多种细胞间相互作用，尤其是在炎症反应中。这些蛋白被证明在免疫系统的粘附功能中发挥极其重要的作用。(Kishimoto等，Adv.Immunol.46149-182(1989))。研究发现抗LFA-1的单克隆抗体能阻断白细胞对内皮细胞的粘附(Dustin等，J.cell.Biol.107321-331(1988)；Smith等，J.Clin.Invest.832008-2017(1989))并抑制T细胞的激活(Kuypers等，Res.Immunol.，140461(1989))，以及抗原特异性CTL杀伤所需共轭物的形成(Kishimoto等，Adv.Immunol.46149-182(1989))，T细胞增殖(Davignon等，J.Immunol.127590-595(1981))和NK细胞杀伤作用(Krensky等，J.Immunol.131611-616(1983))。
ICAMsICAM-1(CD54)为细胞表面粘附受体，是免疫球蛋白超家族一个成员(Rothlein等，J.Immunol.1371270-1274(1986)；Staunton等，Cell 52925-933(1988))。这个超家族的成员的特征是有一个或多个Ig同源区，每个同源区含有一个二硫桥环，该环含有排列在两个片层的多个反平行β折叠。已经确定三个同源区类型，每一类型都具有其典型长度和处在形成二硫键的半胱氨酸之间的氨基酸残基共有序列(Williams，A.F.等Ann Rev.Immunol.6381-405(1988)；Hunkapillar，T.等Adv.Immunol.441-63(1989))。ICAM-1在多种造血和非造血细胞上表达，并且，在各种炎症介质的作用下，在炎症部位表达上调(Dustin等，J.Immunol.，137256-254(1986))。ICAM-1是一种分子量为90,000-110,000道尔顿的糖蛋白，在未受刺激的内皮细胞上具有低的信使RNA水平，和中等的表面表达水平。LPS、IL-1和TNF能极大地上调ICAM-1的mRNA水平和表面表达水平，大约18-24小时表达达到最高水平(Dustin等，J.Cell.Biol.107321-331(1988)；Staunton等，Cell52925-933(1988))。ICAM-1具有五个细胞外Ig类似结构域(分别指定为1，2，3，4和5结构域D1，D2，D3，D4和D5)和一个细胞内或细胞质结构域。在Staunton等(Cell 52925-933(1988))中阐述了这些结构域的结构和序列。
ICAM-1最初被定义为LFA-1的反受体(counter-receptor)(Springer等，Ann.Rev.Immunol，5223-252(1987)；Marlincell 51813-819(1987)；Simmons等，Nature 331624-627(1988)；Staunton Nature 33961-64(1989)；Staunton等，Cell 52925-933(1988))。已经知道LFA-1/ICAM-1相互作用在淋巴细胞(Dustin等，J.Cell.Biol.107321-331(1988)；Mentzer等，J.Cell.Physiol.126285-290(1986))，单核细胞(Amaout等，J.Cell Physiol.137305(1988)；Mentzer等，J.Cell.Physiol.130410-415(1987)；te Velde等，Immunology61261-267(1987))，和嗜中性粒细胞(Lo等，J.Immunol.143(10)3325-3329(1989)；Smith等，J.Clin.Invest.832008-2017(1989))对内皮细胞的粘附中至少起部分作用。通过对ICAM-1的功能抑制性单克隆抗体的研究，发现了另外的LFA-1配体，ICAM-2和ICAM-3(Simmons，Cancer Surveys 24，CellAdhesion and Cancer，1995)，它们介导了淋巴细胞对其他白细胞以及非造血细胞的粘附。LFA-1和ICAM-2的相互作用被认为介导了自然杀伤细胞(natural killer cell)的活性(Helander等，Nature 382265-267(1996))，而ICAM-3结合被认为在淋巴细胞的激活和免疫应答的引发中起作用(Simmons，ibid)。这些配体在正常和异常的免疫应答中的精确作用有待进一步阐述。
T淋巴细胞介导的疾病功能抑制性单克隆抗体表明LFA-1在T淋巴细胞介导的杀伤、T辅助淋巴细胞的应答、自然杀伤作用、和抗体依赖性杀伤中起重要作用(Springer等，Ann.Rev.Immunol 5223-252(1987))。LFA-1抗体能阻断对靶细胞的粘附、激活和信号转导步骤。
许多疾病都是由T淋巴细胞介导的，人们也在从各种途径寻求这些疾病的治疗方法。类风湿性关节炎(RA)就是其中一种。当前对RA的治疗方法包括卧床休养，热敷，以及药物。水杨酸盐是目前较好的治疗药物，尤其当其他替代药物例如免疫抑制剂、肾上腺皮质类固醇引起比潜伏的疾病自身更严重的病症时。还可以用非类固醇类抗炎药物来治疗，其中一些对RA患者具有很好解热镇痛和抗炎效果。这些药物包括环孢菌素、消炎痛、保泰松、苯乙酸衍生物，例如布洛芬与非诺洛芬、萘乙酸类(萘普生)，吡咯烷酸(pyrrole-alkanoic acid)(tometin)，吲哚乙酸(苏林大)，卤代邻氨基苯甲酸(甲氯灭酸钠)，吡罗昔康，和二氟苯水杨酸。其他用来治疗RA的药物包括抗疟药，例如氯喹，金盐与青霉胺。这些替代药物经常产生严重的副反应，包括视网膜损伤以及肾脏和骨髓毒性。免疫抑制剂，如氨甲喋呤，因毒性太大只被用于治疗严重和顽固的RA。皮质激素也具有不良副反应(例如，白内障，骨质疏松症，和Cushing氏疾病综合征)从而使许多RA患者不能忍受。
另一种由T淋巴细胞介导的疾病是宿主对移植物的排斥反应。在实验模型和临床应用中，为了延长同种异体移植和异种移植物的存活，或为了避免宿主对移植物的排斥的尝试，都主要集中在对宿主/受体免疫器官的抑制。这种疗法的目的是预防性免疫抑制和/或对移植排斥的治疗。预防性免疫抑制中所用药物包括细胞毒性药物，抗代谢药，皮质激素类，和抗淋巴细胞血清。非特异性免疫抑制剂在预防性免疫抑制中有特殊效果(硫唑嘌呤，溴隐亭，甲基强的松龙(methylprednisdone)，强的松，和最近用到的环孢菌素A)，它们极大地提高了临床移植的成功率。类固醇的联合用药例如氢化泼尼松，或氢化泼尼松与硫唑嘌呤联合应用降低了肾移植后环孢菌素A的肾毒性。另外，在抗淋巴细胞球蛋白之后给药环孢菌素A已经使肾成功移植。在另一个待评价的方案中，受者在移植前接受全身淋巴照射，移植后使用最小的免疫抑制。
对排斥反应的治疗已经使用类固醇，2-氨基-6-芳基-5-取代嘧啶，异种抗淋巴细胞球蛋白，以及抗各种白细胞的单克隆抗体，包括OKT-3。一般性参见J.Pediatrics，1111004-1007(1987)，详细参见美国专利(专利号4,665,077)。
免疫抑制药物引起的主要并发症是感染。而且，全身免疫抑制通常伴随不良毒性反应(例如，肾移植后使用环孢菌素A引起的中毒性肾损害)和造血干细胞水平降低。免疫抑制药物还会引起肥胖、伤口难以愈合、类固醇高血糖症、类固醇精神病、白血球减少症、胃肠道出血、淋巴瘤、以及高血压。
针对这些并发症，移植免疫学家一直在探求抗原特异性地抑制免疫应答的方法(只丧失对供体同种抗原的应答)。此外，自体免疫性疾病方面的医生也在致力于寻找抑制自体免疫应答的方法，所述方法只失去对自体抗原的应答。一般通过调节要被移植组织的抗原性或介导排斥反应的特异性细胞来实现特异性免疫抑制。某些情况下，免疫或耐受的诱发主要取决于抗原呈递给免疫系统的方式。
在两个鼠科动物模型系统中发现移植前预处理过的同种异体移植组织能跨越MHC屏障碍而被长期接受，预处理是通过在组织培养中培养。Lafferty等，Transplantation，22138-149(1976)；Bowen等，Lancet，2585-586(1979)。有假设认为这种处理导致了客体淋巴细胞的耗竭，从而引起组织免疫原性所必需的刺激细胞群的缺失。参见Lafferty等，Annu.Rev.Immunol.，1143(1983)。Lafferty等，Science，188259-261(1975)(thyroid held in organ culture)，以及Gores等，J.Immunol.，1371482-1485(1986)和Faustman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，785156-5159(1981)(islet cells treated with murine anti-Ia antiseraand complement before transplantation)。另外，从用淋巴细胞毒性药物和γ射线预处理的供体动物上取得的甲状腺，进行十天的体外培养后，不会被任何正常的同种异体的受者所排斥(Gose和Bach，J.Exp.Med.，1491254-1259(1979))。所用这些技术都涉及供者淋巴细胞的消耗和清除。
在某些模型例如血管和肾脏移植中，II类匹配与延长的同种异体移植存活之间存在着关联性，而皮肤移植中则不存在此类关联(Pescovitz等，J.Exp.Med.，1601495-1508(1984)；Conti等，Transplant.Proc.，19652-654(1987))。所以，供者-受者HLA匹配已经被应用。此外，还发现移植前输血也有效果(Opelz等，Transplant.Proc.，4253(1973)；Persijn等，Transplant.Proc.，23396(1979))。联合应用移植前输血、供者-受者HLA匹配、和移植后免疫抑制治疗(环孢菌素A)，极大改善了移植存活率，并且发现其效果是累加的(Opelz等，Transplant.Proc.，172179(1985))。
移植反应还可用作用于MHC抗原的免疫受体的抗体减轻(Bluestone等，Immunol.Rev.905-27(1986))。而且，抗移植抗体的存在能延长移植物的存活，该抗体能诱发机体反应，而该反应反过来能产生特异性免疫抑制(Lancaster等，Nature，315336-337(1985))。机体对MHC抗原的免疫反应能通过作为器官移植的准备阶段的骨髓移植来特异性调节。因此，抗T细胞单克隆抗体被用来消耗供者骨髓移植物中的成熟T细胞，使骨髓移植时不会出现移植物抗宿主(graft-versus-host)疾病(Mueller-Ruchholtz等，Transplant Proc.，8537-541(1976))。此外，为骨髓移植保留的部分宿主淋巴细胞解决了在完全的同种异体的移植中出现的免疫功能不全的问题。
如图1所示，淋巴细胞对内皮的粘附是炎症过程中的关键步骤。依据T细胞和内皮细胞的激活状态，现在至少有三种已知的淋巴细胞粘附到内皮的途径。T细胞的免疫识别需要T细胞受体和粘附受体的参与，它们能促进细胞对抗原呈递细胞的附着和转导T细胞激活的调节信号。淋巴细胞功能相关(LFA)抗原-1(LFA-1，CD11a/CD18，αLβ2其中αL为CD11a，β2为CD18)被确定为参与导致几种病理症状的细胞相互粘附作用中的淋巴细胞上的主要整合素受体。ICAM-1，内皮细胞免疫球蛋白类粘附分子，是一个已知的LFA-1配体，并与移植排斥，牛皮癣，和关节炎直接相关。
LFA-1对于许多白细胞的功能来说是必需的，包括辅助T细胞对抗原呈递细胞的应答中淋巴因子的产生，杀伤T细胞介导的靶细胞溶解，以及通过T细胞/B细胞相互作用产生免疫球蛋白。T细胞和B细胞上的抗原受体的激活使得LFA-1以更高的亲和力与其配体结合。
最初对LFA-1功能的认识和研究是由直接抗LFA-1的单克隆抗体(MAbs)引起的(Davignon等，J.Immunol.，127590(1981))。LFA-1只存在于白细胞上(Krenskey等，J.Immunol.，131611(1983))，而ICAM-1分布在激活的白细胞，皮肤成纤维细胞，以及内皮细胞上(Dustin等，J.Immunol.137245(1986))。
以前曾对抗CD11a MAbs对许多T细胞依赖的免疫功能的影响进行了体外研究和对少数几种免疫应答的体内效果进行研究。在体外，抗CD11aMAbs抑制T细胞激活(Kuypers等，Res.Immunol.，140461(1989))，T细胞依赖的B细胞增殖和分化(Davignon等，supra；Fischer等，J.Immunol.，1363198(1986))，细胞毒性的T淋巴细胞引起的靶细胞溶解(Krensky等，supra)，免疫共轭物的形成(Sanders等，J.Immunol.，1372395(1986)；Mentzer等，J.Immunol.，1359(1985))，T细胞对血管内皮的粘附(Lo等，J.Immunol.，1433325(1989))。而且，发现直接抗CD11b/CD18的抗体5C6能防止巨噬细胞和T细胞的胰岛内(intra-islet)浸润，并能抑制小鼠胰岛素依赖型糖尿病的发展(Hutchings等，Nature，348639(1990))。
体外研究发现，LFA-1ICAM-1相互作用对于优化T细胞功能是必需的，以及抗CD11a MAbs诱发对蛋白抗原的耐受(Benjamin等，Eur.J.Immunol.，181079(1988))并延长小鼠肿瘤移植存活(Heagy等，Transplantation，37520-523(1984))，这些发现是检测MAbs对这些分子的作用从而避免人体移植排斥作用的基础。
在灵长类动物中也进行了实验。例如，猴子中实验表明，直接抗ICAM-1的MAb能避免或甚至逆转肾脏移植排斥(Cosimi等，″Immunosuppression ofCynomolgus Recipients of Renal Allografts by R6.5，a Monoclonal Antibody toIntercellular Adhesion Molecule-1，″in Springer等(eds.)，Leukocyte AdhesionMolecules New YorkSpringer，(1988)，p.274；Cosimi等，J.Immunology，1444604-4612(1990))。而且，对猕猴进行体内给药抗CD11a MAb延长了皮肤同种异体移植的存活(Berlin等，Transplantation，53840-849(1992))。
首次成功地将大鼠的抗鼠科动物CD111a抗体(25-3；IgG1)用于患有遗传疾病的儿童以避免骨髓不匹配单倍同一性(haploidentical)移植的排斥反应的报导，参见Fischer等，Lancet，21058(1986)。只观察到最小的副反应。还可参见Fischer等，Blood，77249(1991)；van Dijken等，Transplantation，49882(1990)；和Perez等，Bone Marrow Transplantation，4379(1989)。此外，抗体25-3能有效控制人中类固醇耐受的急性移植物抗宿主疾病(Stoppa等，Transplant.Int.，43-7(1991))。
然而，在另一个试点研究中，对患有白血病的成人移植中使用这种Mab(Maraninchi等，Bone-marrow-Transplant，4147-150(1989))，或使用直接抗LFA-1不可变链的抗CD18 MAb，(Baumae等，Transplantation，47472(1989))却得不到可重复的上述结果。而且，大鼠抗鼠科动物CD11a MAb，25-3，并不能控制在人的肾脏移植中急性排斥反应的进程(LeMauff等，Transplantation，52291(1991))。
关于对人类移植中使用单克隆抗体的评论，参见Dantal和Soulillou的文章，Current Opinion in Immunology，3740-747(1991)。一个稍早的报导中曾提到用抗LFA-1或抗ICAM-1 Mabs短暂治疗能稍微延长了小鼠中原发性血管化异位心脏(primarilly vascularized heterotopic heart)同种异体移植的存活(Isobe等，Science，2551125(1992))。在该模型中要想得到长期的移植存活，必须用两种Mabs联合治疗。
独立地，发现单独用抗LFA-1 MAb治疗有效地延长了异位(ear-pinnae)非原发性血管化小鼠心脏移植的存活，给药方案为每天以最大剂量4mg/kg/每天给药，然后每星期给药一次(Nakakura等，J.Heart Lung Transplant.，11223(1992))。非原发性血管化心脏同种异体移植比原发性血管化心脏同种异体移植更具有免疫原性，并且对用MAbs而引起的移植存活延长更具有抗性，(Warren等，Transplant.Proc.，5717(1973)；Trager等，Transplantation，44447587(1989))。后一参考文献讨论了使用高初始剂量和低后续剂量的L3T4抗体的治疗。
Yednock等(Nature，35663-66(1992))叙述了另一项用与Nakakura等(supra)用到的相似抗体治疗啮齿动物硬化症类(sclerosis-type)疾病的研究。其他的关于用抗LFA-1抗体，和ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3及其抗体来治疗LFA-1-介导的疾病的专利公开还包括WO 91/18011(11/28/91公开)，WO91/16928(11/14/91公开)，WO 91/16927(11/14/91公开)，加拿大专利申请2,008,368(6/13/91公开)，WO 90/03400，WO 90/15076(12/13/90公开)，WO90/10652(9/20/90公开)，EP 387,668(9/19/90公开)，WO 90/08187(7/26/90公开)，WO 90/13281，WO 90/13316，WO 90/13281，WO 93/06864，WO93/21953，WO 93/13210，WO 94/11400，EP 379,904(8/1/90公开)，EP 346,078(12/13/89公开)，美国专利5,002,869，美国专利5,071,964，美国专利5,209,928，美国专利5,223,396，美国专利5,235,049，美国专利5,284,931，美国专利5,288,854，美国专利5,354,659，澳大利亚专利申请15518/88(11/10/88公开)，EP 289,949(11/9/88公开)，和EP 303,692(2/22/89公开)，EP365,837，EP 314,863，EP 319,815，EP 468,257，EP 362,526，EP 362,531，EP 438,310。
关于使用LFA-1，和ICAM肽片断以及拮抗剂的专利公开包括美国专利5,149,780，美国专利5,288,854，美国专利5,340,800，美国专利5,424,399，美国专利5,470,953，WO 90/03400，WO 90/133 16，WO 90/10652，WO 91/19511，WO 92/03473，WO 94/11400，WO 95/28170，JP 4193895，EP 314,863，EP 362,526和EP 362,531。
成功地使用抗LFA-1或抗ICAM-1抗体，LFA-1或ICAM-1肽、片断或肽拮抗剂的上述方案比常规免疫抑制药物疗法有了改进。这些研究表明LFA-1和ICAM-1非常适合作为拮抗作用的靶标。更好地治疗LFA-1介导的疾病，包括自体免疫性疾病、移植物对宿主或宿主对移植物的排斥、T细胞炎性反应，并将副反应降至最小以及维持对自身的或外来抗原的特异耐受是本领域的一项重要任务。另外，还需要找到一种拮抗LFA-1ICAM-1相互作用的非肽拮抗剂。
白蛋白是一种大量存在的血浆蛋白，负责脂肪酸的运送。然而，白蛋白也结合并干扰许多药物化合物的药代动力学。因此，任何药物与血清血浆蛋白例如白蛋白的结合特性是其药理特性的一个重要方面。与血浆蛋白有高亲和力的药物化合物，仅以少量存在于血清中与其靶组织、细胞或蛋白作用。例如，一个给药后99％与血浆蛋白结合的化合物，其血浆中能与其靶标作用的浓度，只有98％与血浆蛋白结合的化合物的一半。因此人们非常希望找到一种具有低血清血浆蛋白亲和力的LFA拮抗化合物。
发明简介本发明一方面提供式(I)新化合物 其中Cy为非芳香族碳环或杂环，可被羟基、巯基、硫烷基、卤素、氧代、硫代、氨基、氨基烷基、脒基、胍基、硝基、烷基、烷氧基或者酰基任选取代；X为二价烃链，可被羟基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代任选取代并可任选被N、O、S、SO或SO2断开；Y为碳环或杂环，可被羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、烃、卤代烃、氨基、脒基、胍基、氰基、硝基、烷氧基或者酰基任选取代；L为单键或二价烃，可被羟基、卤素、氧代或硫代任选取代并可任选被N、O、S、SO或SO2替代一个或多个碳原子；或烃上3个碳原子被氨基酸残基替换。
R1为H、羟基、氨基，或可被氨基、碳环或杂环任选取代的O-碳环或烷氧基；R2-5独立为氢、羟基、巯基、卤素、氰基、氨基、脒基、胍基、硝基或烷氧基；或R3和R4一起形成一个稠合的碳环或杂环，可被羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基任选取代；R6为H或可被碳环或杂环任选取代的烃链；前提条件当Y为苯基时，R2，R4和R5为H，R3为Cl，且R1为OH，则X为除环己基以外的基团。
本发明还提供包含本发明化合物以及可药用的载体的药物组合物。
本发明还提供一种治疗哺乳动物中由LFA-1介导疾病或病理状态的方法，包括向所述哺乳动物施用有效剂量的本发明化合物。
发明详述本发明提供具有通式(I)的新化合物 其中Cy，X，Y，L和R1-6如上述定义。由于取代基Cy为非芳香环，与其他在这部分为芳香环的化合物相比，本发明化合物具有较低的血浆蛋白亲和力。
术语“非芳香族”是指不具有芳香性的碳环或杂环。要具有芳香性，环必须在一个平面上，每个环原子具有垂直于环平面的p-轨道，并要满足休克尔定律环的π电子数为(4n+2)，其中n为整数(即π电子数为2，6，10或14)。而这里所述的非芳香环则不满足其中一个或全部的芳香性的标准。
此处的术语“烷氧基”包括饱和的，如O-烷基，以及不饱和的，如O-烯基和O-炔基等基团。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
术语“氨基”是指伯(-NH2)，仲(-NHR)，叔(-N(R)2)或季(-N+(R)4)胺，其中R为烃链、羟基、碳环、杂环或烃链，被碳环或杂环取代。
术语“氨基酸”是指天然的和非天然的α-，β-，D-和L-氨基酸残基。非天然的氨基酸包括那些具有不是天然存在侧链的氨基酸。
“羧基”在这里是指游离酸-COOH及其酯例如烷基，芳基和芳烷基酯。优选的酯为甲基，乙基，丙基，丁基，异丁基酯，仲丁基酯和叔丁基酯。
术语“碳环”是指一、二或三环碳环或4-16元环(包括桥环)，为饱和的，不饱和的或部分不饱和的包括芳香(芳基)环(除非特指为非芳香的)。优选的非芳香碳环包括环丙基，环丙烯基，环丁基，环丁烯基，环戊基，环戊烯基，环己基和环己烯基。优选的芳香碳环包括苯基和萘基。
术语“杂环”是指具有5-16环原子的单环，双环或三环，其中至少一个环原子为杂原子(即N，O和S和SO，或SO2)。该环可为饱和的，不饱和的或部分不饱和的，也可以是芳香环(除非特指为非芳香环)。杂环的实例包括哌啶，哌嗪，吡啶，吡嗪，嘧啶，哒嗪，吗啉，吡喃，吡咯，呋喃，噻吩(噻吩基)，咪唑，吡唑，噻唑，异噻唑，二噻唑，噁唑，异噁唑，二噁唑，噻二唑，噁二唑，四唑，三唑，噻三唑，噁三唑，噻二唑，噁二唑，嘌呤和其与苯稠合的衍生物。
术语“烃链”是指饱和的，不饱和的，直链的或支链的碳链如烷基，链烯基以及炔基。优选的烃链由1-12碳原子组成，更优选由1-6个碳原子组成，最优选1-4个碳原子组成，如甲基，乙基，丙基，丁基，烯丙基。
“可被任选取代的”的表述是指，除非另行说明，一个或多个特定的取代基通过共价键连接到被取代基团上。当为多个取代基时，这些取代基可以为相同或不同的基团。
Cy为非芳香碳环或杂环，可任选被羟基(-OH)，巯基(-SH)，硫烷基，卤素(例如，F，Cl，Br，I)，氧代(＝O)，硫代(＝S)，氨基，氨基烷基，脒基(-C(NH)-NH2)，胍基(-NH2-C(NH)-NH2)，硝基，烷基或烷氧基取代。在一个特选的实施方案中，Cy为3-5元环。在优选的实施方案中，Cy为可被羟基，巯基，卤素(优选为F或Cl)，氧代(＝O)，硫代(＝S)，氨基，脒基，胍基，硝基，烷基或烷氧基任选取代的5-或6-元非芳香杂环。在更优选的实施方案中，Cy为可被羟基，氧代，硫代，Cl，C1-4烷基(优选为甲基)，或C1-4烷酰基(优选为乙酰基，丙酰基或丁酰基)任选取代的5元非芳香杂环。在更优选的实施方案中，该非芳香杂环包含一个或多个杂原子(N，O或S)，并可被羟基，氧代，巯基，硫代，甲基，乙酰基，丙酰基或丁基任选取代。在特选的实施方案中，该非芳香杂环包含至少一个可被甲基或乙酰基任选取代的氮原子。在特别优选的实施方案中，该非芳香杂环选自哌啶，哌嗪，吗啉，四氢呋喃，四氢噻吩，噁唑烷，噻唑烷，可被羟基，氧代，巯基，硫代，烷基或烷氧基任选取代。在最优选的实施方案中，Cy为非芳香杂环，选自四氢呋喃-2-基，噻唑烷基-5-基，噻唑烷基-2-酮-5-基，和噻唑烷基-2-硫酮-5-基，环丙吡咯烷(cyclopropapyrrolidine)。
在另一个优选的实施方案中，Cy为可被羟基，巯基，卤素，氧代，硫代，氨基，脒基，胍基，烷基，烷氧基或者酰基任选取代的3-6元碳环。在特选的实施方案中，该碳环为饱和的或部分不饱和的。在特选的实施方案中，Cy碳环选自环丙基，环丙烯基，环丁基，环丁烯基，环戊基，环戊烯基，环己基，环己烯基。
X为C1-5二价烃连接基团(linker)，该基团任选地一个或多个碳原子被N，O，S，SO或SO2替代，并可被羟基，巯基，卤素，氨基，氨基烷基，硝基，氧代或硫代任选取代。在优选的实施方案中，X至少含有一个碳原子。替换取代之后会在烃链中或任意一端或两端形成酰胺成分(-NRC(O)-或-C(O)NR-)。另外的成分包括磺酰胺(-NRSO2-或-SO2NR)，酰基，醚，硫醚，胺。在特别优选的实施方案中，X为-CH2-NR6-C(O)-，其中其羰基-C(O)-部分与Cy相邻(如共价结合)，并且R6为烷基如甲基，更优选为氢。
Y为碳环或杂环，可任选被羟基，巯基，卤素，氧代，硫代，烃，卤代烃，氨基，脒基，胍基，氰基，硝基，烷氧基或酰基取代。在特选的实施方案中，Y为芳基或杂芳基可被卤素或羟基任选取代。在更优选的实施方案中，Y为苯基，呋喃-2-基，噻吩-2-基，卤素(优选为Cl)或羟基取代的苯，优选为间位取代。
L为二价烃，该烃任选地一个或多个碳原子被N，O，S，SO或SO2替代，并可被羟基，卤素，氧代，或硫代任选取代；或烃上的三个碳原子被氨基酸残基替代。优选地，L的长度为少于10个原子，更优选5个或更少，最优选5或3个原子。在特选的实施方案中，L选自-CH＝CH-C(O)-NR6-CH2-，-CH2-NR6-C(O)-，-C(O)-NR6-CH2-，-CH(OH)-(CH2)2-，-(CH2)2-CH(OH)-，-(CH2)3-，-C(O)-NR6-CH(R7)-C(O)-NR6-，-NR6-C(O)-CH(R7)-NR6-C(O)-，-CH(OH)-CH2-O-和-CH(OH)-CF2-CH2-，其中每个R6独立为H或烷基，R7为氨基酸侧链。优选的氨基酸侧链包括非天然存在的侧链，例如苯基，或天然的侧链。优选的侧链为Phe，Tyr，Ala，Gln和Asn上的侧链。在优选的实施方案中，L为-CH＝CH-C(O)-NR6-CH2-，其中-CH＝CH-基团与Y相邻(如共价连接)。在另一个优选的方案中，L为-CH2-NR6-C(O)-，其中亚甲基(-CH2-)与Y连接。
R1为H，OH，氨基，可被氨基、碳环或杂环任选取代的O-碳环或烷氧基。在优选的实施方案中，R1为H，苯基，或C1-4烷氧基，可被碳环，例如苯基，任选取代。在更优选的实施方案中，R1为H。在另一个特选的方案中，R1为甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，苯氧基或苄氧基。再另一个特选的方案中，R1为NH2。在更优选的实施方案中，R1为乙氧基。在另一个优选的实施方案中R1为异丁氧基。在另一个优选的实施方案中，R1为氨基取代的烷氧基，例如2-氨基乙氧基，N-吗啉基乙氧基，N，N-二烷氨基乙氧基，季铵羟基烷氧基(例如，三甲基铵羟基乙氧基)。
R2-5独立为H，羟基，巯基，卤素，氰基，氨基，脒基，胍基，硝基或烷氧基；或R3和R4合在一起形成一个稠合的碳环或杂环，可被羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基任选取代。在特选的实施方案中，R2和R3独立为H，F，Cl，Br或I。在另一个特选的实施方案中，R4和R5都为H。在另一个优选的实施方案中，R2，R3中的一个为卤素而另外一个为氢或卤素。在更优选的实施方案中，R3为Cl而R2，R4和R5分别为H。在另一个更优选的实施方案中，R2和R3都为Cl而R4和R5都为H。
R6为H或可被碳环或杂环任选取代的烃链。在优选的实施方案中，R6为H或烷基，如甲基，乙基，丙基，丁基，异丁基，仲丁基或叔丁基。在特选的实施方案中，R6为H。
在优选的实施方案中，本发明化合物具有通式(Ia)-(If)，
其中Cy，Y，L和R1-6如前定义。在特别优选的实施方案中，式(Ia)-(If)化合物中用星号(*)标注的碳原子为手性碳原子。在特选的实施方案中，该碳原子具有R-构型。在另一个优选的实施方案中，该碳原子具有S-构型。
本发明的特选化合物包括



及其盐，溶剂化物，水合物，酯。
应该意识到本发明化合物会并入手性中心，因此存在几何异构体和立体异构体。所有这些预期的异构体，无论是以纯的异构体形式或其混合物以及外消旋体，都包括在本发明的范围之内。立体异构化合物可用本领域已知的技术例如色谱法，如手性HPLC，或结晶法进行分离。
“可药用”盐包括酸和碱加成盐。可药用酸加成盐是指那些保留了游离碱的生物活性和特性的盐，没有不受欢迎的生物学或其他活性，与无机酸形成的，该无机酸可以是盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷酸等；和有机酸，选自脂肪族的，脂环族的，芳香族的，芳香脂肪族，杂环类，羧基类，和磺酸基类的有机酸，例如甲酸，乙酸，丙酸，羟基乙酸，葡糖酸，乳酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，马来酸，丙二酸，琥珀酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，天冬氨酸，抗坏血酸，谷氨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，embonic acid，苯乙酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸，水杨酸等。
可药用碱加成盐包括无机碱的加成盐，例如钠，钾，锂，铵，钙，镁，铁，锌，铜，锰，铝盐等。优选的为铵，钾，钠，钙和镁盐。可药用有机无毒性碱加成盐包括伯，仲，叔胺，取代胺包括天然的取代胺，环胺以及碱性离子交换树脂，例如异丙基胺，三甲基胺，二乙胺，三乙胺，三丙基胺，乙醇胺，2-二乙基氨基乙醇，三甲基胺(trimethamine)，二环己胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，hydrabamine，胆碱，甜菜碱，乙二胺，葡糖胺，甲基葡糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，聚胺树脂等的加成盐。特别优选的有机无毒性碱为异丙基胺，二乙胺，乙醇胺，三甲基胺，二环乙基胺，胆碱，和咖啡碱。
本发明化合物可以通过现有有机合成技术用市售原料和试剂或用从市场可得原料制备得到的原料试剂来制备。许多标准的化学技术以及工艺，参见March，J.，“Advanced Organic Chemistry”McGraw-Hill，New York，1977；和Collman，J.，“Principles and Applications of Organotransition MetalChemistry”University Science，Mill Valley，1987；和Larock，R.，“Comprehensive Organic Tansformations”Verlag，New York，1989。应该意识到除了上述这些步骤，根据化合物上的特殊取代基，还必须用一些适当的保护和脱保护步骤。文献Greene和Wuts(Protective Groups in OrganicChemistry，2d edition，John Wiley and Sons，1991)叙述了大量的保护基团，以及详细的加保护和脱保护方法。例如，适当的氨基保护基包括叔丁基羰基(Boc)，芴基甲基羰基(Fmoc)，2-三甲基甲硅基乙氧基羰基(Teoc)，1-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)，烯丙氧基羰基(Alloc)，和苄氧基羰基(Cbz)。羧基可用芴基甲基，或烷基酯如甲基或乙基，或链烯基酯例如烯丙酯保护。羟基可用三苯甲基，单甲氧基三苯甲基，二甲氧基三苯甲基，以及三甲氧基三苯甲基进行保护。
化合物也可以用美国专利申请09/6446,330(2000年9月14日提交)中阐述的有机合成方法进行制备，其全文在此引用作为参考文献。一般来说，化合物可按照反应流程1来制备。
流程1
如流程1所示，保护市售甘氨酸氨基酸残基的氨基(如，fmoc)和羧基(Pr)或固定在固体支持物。用适当的试剂将氨基保护基脱去，并与二苯基酮亚胺反应，然后用(iii)卤素-X-Cy烷化α碳得到中间产物(vi)。亚胺(vi)转变成游离胺(v)，然后与中间产物(vi)结合得到本发明化合物，该化合物可以任选地对羧基位置脱保护产生游离酸(vii)。根据取代基R1的定义，该游离酸可以被酯化或酰胺化。
在特定的技术方案中，本发明的式(Ib)化合物可按照流程2制备。
流程2
如流程2所示，市售或用市售原料合成的原始化合物(i)，与N-羟基甲基邻苯二甲酰胺反应而得到中间产物(ii)，将该产物与肼反应而产生游离胺(iii)。该胺通过与Boc2O和碳酸氢钠反应从而实现Boc保护(iv)，然后与三氟甲磺酸酐(triflic anhydride)反应得到中间化合物(v)。通过与醋酸钯(II)和1，3-双(二苯基膦丙烷(dppp)反应，随后又与二异丙基乙基胺(DIPEA)反应，该三氟甲磺酸酯(triflate)中间化合物(v)被转变成甲酯中间化合物(vi)。用TFA脱去(vi)的Boc基团，然后与羧酸(vii)反应从而得到中间化合物(viii)。在流程2的优选方案中，中间化合物(vii)Y-L-C(O)OH为呋喃丙烯酸或噻吩丙烯酸。用LiOH脱去(viii)的甲酯产生游离酸，该游离酸与N-Boc保护的二氨基丙酸/酯(x)反应以得到中间化合物(xi)。用TFA脱去(xi)的Boc基团，然后与羧基取代的非芳香环(xii)反应而得到本发明最终化合物(Ib)。
在另一特定方案中，本发明式(Ic)化合物可按照流程3制备。
流程3
如所示流程3，羧酸盐原料(i)与胺试剂(ii)Y-L-NHR6偶合从而得到中间化合物(iii)，该化合物与(iv)反应从而得到本发明化合物(v)。在流程3的优选方案中，Y-L-为可被羟基、卤素、烷基和烷氧基任选取代的苄基。更优选Y-L-为3-羟基-苄基。
在另一特定方案中，本发明式(Id)化合物可按照流程4制备。
流程4
如所示流程4，从流程2中制备的起始化合物(i)，被转化成碘代中间化合物(ii)，然后与炔(iii)反应得到中间化合物(iv)。炔(iii)是通过将Y-COOH与Br-C≡CH在THF中反应而制得。中间化合物(iv)通过与Rh/Al2O3在氢气氛中反应被转变成烷烃(v)，酯基团是通过与LiI在吡啶中反应被转变成游离酸从而得到(vi)。中间化合物(vi)与氨基酸(vii)反应而得到本发明化合物(viii)。在流程4的特选方案中，Y为可被烷基、羟基或卤素任选取代的苯基。在更优选的实施方案中，Y为3-氯-苯基或3-羟基-苯基。
在另一特定方案中，本发明式(Ie)化合物可按照流程5制备。
流程5 如所示流程5，起始化合物(i)与三氟甲磺酸酐和2，6-二甲基吡啶反应得到中间化合物(ii)，该化合物通过与乙酸钯(II)、1，3-双(二苯基膦)丙烷(dppp)反应，随后又与二异丙基乙基胺(DIPEA)在DMF和甲醇中反应而被转化成甲酯(iii)。该酯(iii)与CrO3在乙酸和乙酸酐中反应而得到醛(iv)，该乙醛与格利雅试剂溴化乙炔基镁在THF中反应而得到炔中间化合物(v)。碘试剂(vi)Y-I与(v)反应得到中间化合物(vii)，该化合物通过与Rh/Al2O3在氢气氛下反应被转化成烷烃(viii)。在吡啶中，用LiI将甲酯转化成游离酸(ix)，该游离酸与氨基酸残基(x)偶合从而得到本发明化合物(xi)。在流程5的优选方案中，Y为可被羟基、卤素、烷基和烷氧基任选取代的苯基。在更优选的方案中，Y为3-羟基-苯基或3-氯-苯基。
本发明化合物对LFA-1的结合优于对Mac-1的结合。因此，本发明一方面提供一种抑制LFA-1与ICAMs(细胞粘附分子)结合的方法，包括使LFA-1与式(I)化合物相接触。该方法可以基于溶液和基于细胞的分析方法，在体内和体外实施。其中，在已知的配体(putative ligand)的存在下(例如ICAM-1)，将本发明化合物作用于LFA-1。本发明化合物可以被标记，例如用放射性同位素标记，或用荧光基团标记例如荧光素黄异硫氰酸酯(FITC)，以利于检测配体的结合或减少。因此，本发明化合物在诊断和检验方面具有应用价值。
本发明化合物在治疗或预防LFA-1活性介导的疾病或症状方面具有应用价值。因此本发明一方面提供一种治疗哺乳动物中(如人)，由LFA-1介导的疾病和症状的方法，包括向所述哺乳动物施用有效剂量的化合物。″有效剂量″是指在给药后能降低LFA-1活性的一定数量的化合物；或指在给药后预防、抑制、或降低LFA-1介导的疾病或症状的严重程度所必须的一定数量的化合物。
本发明化合物或其组合物能治疗的疾病包括牛皮癣；与炎性肠病有关的反应(例如Crohn氏疾病和溃疡性结肠炎)，皮炎，脑膜炎，脑炎，眼色素层炎(uveitis)，过敏性症状例如湿疹和哮喘，有关T细胞渗入的疾病和慢性炎症反应，皮肤过敏性反应(包括毒叶藤(poison ivy)和毒葛(poison cak)；动脉粥样硬化，自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮，糖尿病，多发性硬化症，Reynaud氏综合症，自身免疫性甲状腺炎，实验的自身免疫性脑脊髓炎，Siorgen氏综合症，青少年糖尿病，由细胞因子和T淋巴细胞介导的与迟发过敏性有关的免疫反应，典型地存在于肺结核，肉样瘤病，多发性肌炎，肉芽肿病和脉管炎；恶性贫血；与白血球渗出有关的疾病；中枢神经系统炎性疾病；败血病或外伤继发的多器官损伤综合症；自身免疫溶血性贫血；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；各种移植，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物的疾病，HIV和鼻病毒感染，肺纤维化，脱发症，硬化病(scletedoma)，子宫内膜异位，白癜风，由嗜中性粒细胞介导的缺血性再灌注(reperfusion)损伤例如急性心肌梗塞，PTCA后的再狭窄，入侵性(Invasive)过程例如心肺搭桥(bgpass)手术，脑水肿，中风，脑外伤，出血性休克，烧伤，缺血性肾病，多器官衰竭，伤口愈合和瘢痕形成，动脉粥样硬化。
化合物的实际给药量和给药途径取决于特定的疾病或症状以及其他因素，例如患者的身材大小，年龄，性别以及种族，并且用常规分析来确定。一般说来，静脉给药的剂量按病人体重约0.01-1000mg/kg/每天，优选为0.1到20mg/kg，更优选0.3到15mg/kg。可以以每天给药一次和多次的方式持续给药几天或几星期或几年，也可以每星期给药数次的方式持续给药几星期和几年。考虑特定药物的血浆生物利用度的同时，其他途径的给药剂量以能达到与上述的静脉给药相似的血浆浓度为准。
在本发明的方法中，化合物可以口服(包括从口腔，舌下，吸入)，从鼻腔给药，直肠给药，阴道给药，静脉给药(包括动脉内给药)，真皮内给药，皮下给药，肌内注射以及局部给药。化合物可以与本领域的常规试剂例如载体、稀释剂、增稠剂，辅剂等一起被制备成适合给药的组合物。因此，本发明另一方面提供包含式(I)化合物的药物组合物，含有可药用载体、赋形剂或辅剂，还可能包括附加的活性成分例如抗炎药，如NSAIDs。
剂型包括溶液，粉末，片剂，胶囊，明胶胶囊，栓剂，局部软膏剂，乳膏，吸入式气雾剂。非肠道外给药的剂型包括含有缓冲剂、稀释剂和其他适当添加剂的无菌水溶液。还可使用适合非肠道外给药，且不会与本发明化合物发生有害反应的可药用有机或无机载体物质。合适的可药用载体包括，但不限于，水，盐溶液，酒精，聚乙二醇，凝胶，乳糖，直链淀粉，硬脂酸镁，滑石，硅酸，粘性石蜡，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等。这些剂型都进行灭菌，需要的时候，与辅剂混合，例如，不与本发明化合物发生有害反应的润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色香料和/或芳香物质等。混悬水溶液可含有能增强粘性的物质包括，例如，羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或右旋糖酐。任选地，混悬剂还含有稳定剂。
本发明化合物具有很高的口服生物利用度。因此，在优选的实施方案中，本发明化合物通过口服给药。口服给药的组合物包括粉末或颗粒，水或非水介质的混悬液或溶液，胶囊，单元小袋剂，锭剂(troches)，片剂或SECs(柔软有弹性的胶囊或囊片(caplets))。在这些剂型中，可根据需要添加增稠剂，芳香剂，稀释剂，乳化剂，分散助剂，载体，载体物质或粘合剂。可用这些剂型有效地将化合物输送到消化道，更好地暴露于粘膜。因此，这些剂型由能有效地保护化合物防止被胃里过高的pH破坏，或随时间持续释放化合物的材料组成，以促进组合物更有效地分布到特定的粘膜上。本领域已知的肠包衣抗酸片剂、胶囊和囊片；肠溶膜典型包括乙酸酯邻苯二甲酸酯(acetate phthalate)，丙二醇和脱水山梨糖醇单油酸酯(sorbitanmonoleate)。
本领域有许多制备食物给药(alimentary delivery)剂型的方法。一般参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro编辑，MackPublishing CO.，Easton，PA，1990。本发明剂型可以通过已知的方法利用惰性的、无毒的、可药用的赋形剂或溶剂转变成惯用的剂型，例如片剂，包衣片，丸剂，颗粒，气雾剂，糖浆剂，乳剂，混悬液以及溶液。在所有的情况下，该药用活性化合物的浓度应该占混合物总重量的约0.1％至约99％，也就是说足够地能达到所希望的剂量范围的浓度。该剂型可以通过下列方法制备，例如，用溶剂和/或赋形剂稀释化合物，适当情况下用乳化剂和/或分散剂，以及，例如，当水作为稀释剂时，适当情况下用有机溶剂作为辅助溶剂。
制备组合物时还可添加粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；分散剂(例如，淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域已知的方法进行包衣。适当情况下，还可添加芳香剂，着色剂和/或甜味剂。
本发明适合口服给药的剂型可以以分散单元的形式，例如胶囊，扁囊剂(cachets)或片剂，其中每个单元含有预定数量的活性组分；以粉末或颗粒的形式；以水的或非水的溶液或混悬液的形式；或以水包油乳剂或油包水液体乳剂的形式出现。片剂可通过压片或模压的方法制得，其中可任选地添加一种或多种附加成分。压片是通过压片机来完成，其中以自由流动形式，例如粉末或颗粒中的活性组分任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或或分散剂混合。模制的片剂是在合适的仪器里模压用惰性液体稀释剂湿润的化合物粉末状混合物而制得。片剂可以任选地被包衣或做刻痕标记(scored)，也能配制成活性组分的缓释或控释配方。
实施例在实施例中用到了下列缩略语Boc＝叔丁氧基羰基；Boc2O＝叔丁氧基羰基酐；DMA＝二甲基乙酰胺；DMF＝二甲基甲酰胺；Hobt＝1-羟基苯三唑；TFA＝三氟乙酸；DCM＝二氯甲烷；MeOH＝甲醇；HOAc＝乙酸；HCl＝盐酸；H2SO4＝硫酸；乙腈；Na2·EDTA＝乙二胺四乙酸钠；TBAF＝氟化四丁基铵；EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；TEA＝三乙胺；Mg2SO4＝硫酸镁；TES＝三乙基硅烷；Et2O＝乙醚；BBr3＝三溴化硼实施例1 化合物16，17，38-40，46-50的合成
在一个圆底烧瓶中悬吊一个搅拌器，然后往烧瓶里注入浓硫酸(水体积的2.7倍)和水，用乙醇/冰浴冷却到约-5℃。一旦冷却，在剧烈搅拌下加入1当量2，6-二氯苯酚和1当量N-(羟甲基)邻苯二甲酰亚胺。在低温下反应4小时，然后温热至室温持续搅拌过夜。一般情况下，反应会进行到圆底烧瓶里只有固体阶段。此时将乙酸乙酯和水加入并搅拌。大块固体打碎后，将沉淀过滤并用乙酸乙酯和水洗涤。产物真空干燥过夜后，不需要进一步纯化即可使用。
将1当量干燥后的产物与甲醇(每克起始物加22.5毫升)加入到装有水冷凝器与搅拌棒的圆底烧瓶中。加入1.2当量肼一水合物，然后将混合物回流4小时。冷却至室温后，小心加入浓盐酸(每克起始物加4.5毫升)。加完浓盐酸后，将混合物回流过夜(大于8小时)。反应冷却至0℃，过滤除去沉淀的副反应产物。然后将滤液真空浓缩。
将粗胺残余物溶解在3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，混合物搅拌过夜。将反应物浓缩，将残余物在水和乙醚中分配。用乙醚萃取水层，合并有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩成固体。从热的甲醇和水中重结晶得到纯的产物。
在圆底烧瓶里，将1当量的Boc保护的胺和1.5当量的2，6-二甲基吡啶溶解于DCM中，必要时可稍微加热。一旦这些起始原料完全溶解，在氮气下，用干冰-乙醇浴将其冷却到-78℃。一旦冷却，加入2.5当量的三氟甲磺酸酐，搅拌下，反应温度缓慢回升到室温。通常在4小时内，用薄层色谱法实时监控反应。一旦完成，将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和水中分配。有机层用0.1N硫酸、饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次，然后用硫酸镁干燥，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用DCM洗脱，得到纯的三氟甲磺酸酯。
在高压Parr容器的玻璃套(glass insert)中，将1当量三氟甲磺酸酯溶解于DMF和甲醇。然后将起始原料在一氧化碳下搅拌脱气10分钟。加入0.15当量醋酸钯(II)和0.15当量的1，3-双(二苯基膦)丙烷，再在一氧化碳下搅拌脱气10分钟，搅拌过程中，加入2.5当量二异丙基乙基胺。合适地组装好容器后，用300psi一氧化碳气体充气，加热至70℃，搅拌过夜。将容器冷却后排气。转移混合物到圆底烧瓶中，然后真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用1％丙酮和1％TEA的DCM溶液洗脱，得到纯的甲酯。
将Boc保护的胺溶解在TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯，再次真空浓缩。将胺的TFA盐溶解于乙醚，用10％的碳酸钾水溶液洗涤两次，用盐水洗涤一次。有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
1当量的游离碱性胺，3当量的呋喃丙烯酸，3当量的EDC和1当量的Hobt溶解于DMA中。将反应物进行室温搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油在乙醚中悬浮，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
将2.3当量碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液，并将此混合物回流加热8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化，就可以使用。
1当量的酸和2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯，2当量的EDC，1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯并重新真空浓缩。1当量的这种胺，2当量的适合的市售羧酸(化合物16，N-乙酰基-D-脯氨酸；化合物17，N-乙酰基-L-脯氨酸；化合物38，(-)-2-氧代-4-噻唑烷羧酸；化合物39，1-环己烯-1-羧酸；化合物40，(4R)-(-)-2-硫代(thioxo)-4-噻唑烷羧酸；化合物45，环丁烷羧酸；化合物46，环戊烷羧酸；化合物47，环己烷羧酸；化合物48，3，4-二氢-2，2-二甲基-4-氧代-2H-吡喃-6-羧酸；化合物49，1，3-二硫戊环-2-羧酸乙酯(用3当量LiOH·H2O的THF/水(3/1)溶液皂化2当量的这种乙基酯。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。用1M的盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化即可直接使用)；化合物50，环丙烷羧酸；化合物51，四氢-2-糠酸)、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚，用0.1 N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例2 化合物1-15，41，43的合成
在一个圆底烧瓶中悬吊一个高效搅拌器，然后往烧瓶里注入浓硫酸(水体积的2.7倍)和水，用乙醇/冰浴冷却到约-5℃。一旦冷却，在剧烈搅拌下加入1当量的2，6-二氯苯酚和1当量的N-(羟甲基)邻苯二甲酰亚胺。在低温下反应4小时，然后温热至室温持续搅拌过夜。通常反应会进行到圆底烧瓶里只有固体的阶段。此时将乙酸乙酯和水加入并搅拌。大块的固体破碎后，将沉淀过滤，并用乙酸乙酯和水洗涤。产物真空干燥过夜后，不需要进一步纯化即可使用。
将1当量的干燥后的产物与甲醇(每克起始物加22.5毫升)加入到装有水冷凝器与搅拌棒的圆底烧瓶中。加入1.2当量肼的一水合物，然后将混合物回流4小时。冷却至室温后，小心加入浓盐酸(每克起始物加4.5毫升)。加完浓盐酸后，将混合物回流过夜(大于8小时)。反应冷却至0℃，过滤除去沉淀的副反应产物。然后将滤液真空浓缩。
将粗胺残余物溶解在3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，混合物搅拌过夜。将反应物浓缩，将残余物在水和乙醚中分配。用乙醚萃取水层，合并有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩成固体。从热的甲醇和水中重结晶得到纯的产物。
在圆底烧瓶里，将1当量的Boc保护的胺和1.5当量的2，6-二甲基吡啶溶解于DCM中，必要时可稍微加热。一旦这些起始原料完全溶解，在氮气下，用干冰-乙醇浴将其冷却到-78℃。一旦冷却，加入2.5当量的三氟甲磺酸酐，搅拌下，反应温度缓慢回升到室温。通常在4小时内，用薄层色谱法实时监控反应。一旦完成，将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和水中分配。有机层用0.1N硫酸、饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次，然后用硫酸镁干燥，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用DCM洗脱，得到纯的三氟甲磺酸酯。
在高压Parr容器的玻璃套中，将1当量三氟甲磺酸酯溶解于DMF和甲醇。然后将起始原料在一氧化碳下搅拌脱气10分钟。加入0.15当量醋酸钯(II)和0.15当量的1，3-双(二苯基膦)丙烷，再在一氧化碳下搅拌脱气10分钟，搅拌过程中，加入2.5当量二异丙基乙基胺。合适地组装好容器后，用300psi一氧化碳气体充气，加热至70℃，搅拌过夜。将容器冷却后排气。转移混合物到圆底烧瓶中，然后真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用1％丙酮和1％TEA的DCM溶液洗脱，得到纯的甲酯。
将Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯并重新真空浓缩。将胺的TFA盐溶解于乙醚，用10％的碳酸钾水溶液洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
1当量的游离碱性胺，3当量的呋喃丙烯酸，3当量的EDC和1当量的Hobt溶解于DMA中。将反应物进行室温搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
2.3当量碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液中，并将此混合物回流加热8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化，就可以使用。
1当量的酸，2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯，2当量的EDC，1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM洗脱，得到纯的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯并重新真空浓缩。1当量的这种胺，2当量的适合的市售羧酸((N-Boc酸从市场上购得。另外的酸是将购得的游离胺通过下列步骤加上Boc保护基而得到将胺溶解于3∶2 THF/水溶液。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液以除去THF，剩余水层用己烷进行分配。然后，用1N盐酸将水层酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用)化合物1 D，L-2-哌啶酸；化合物2，3-哌啶甲酸；化合物3，异哌啶甲酸；化合物4，N-Boc-L-脯氨酸；化合物5，N-Boc-D-脯氨酸；化合物6，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸；化合物7，N-Boc-L-焦谷氨酸；化合物8，N-Boc-D-焦谷氨酸；化合物9，L-2-哌啶酸；化合物10，D-顺-4-羟基脯氨酸；化合物11，L-顺-4-羟基脯氨酸；化合物12，D-羟基脯氨酸；化合物13，(2S，3S)-3-甲基吡咯烷-2-羧酸；化合物14，N-Boc-L-羟基脯氨酸；化合物15，Boc-D-噻唑烷-4-羧酸；化合物41，L-3-羟基脯氨酸；化合物43，反-3-氮杂双环[3.1.0]-己烷-2-羧酸)、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9∶1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9∶1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
恰当地，将Boc保护的残余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯并重新真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例3 化合物18-21的合成
将1当量的4-氨基-2，6-二氯苯酚溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量固体碳酸氢钠和1.1当量Boc2O，然后将反应液搅拌过夜。浓缩反应液，残余物分配于水和乙醚中。水层用乙醚萃取，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩得到固体。从乙醚/已烷中重结晶得到纯的产物。
1当量的苯酚溶解于含有2.6当量2，6-二甲基吡啶的DCM中，将混合物冷却至-78℃。加入1.25当量的三氟甲磺酸酐，将反应液温热至室温，搅拌过夜。浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(9∶1已烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯的三氟甲磺酸酯。
一边搅拌一边将0.15当量1，3-双(二苯基膦)-丙烷和2.5当量TEA加入到含有1当量三氟甲磺酸酯的混合溶液中，该混合溶液为DMF/甲醇2/1混合液。向此溶液通入一氧化碳气体，持续15分钟，然后加入0.15当量Pd(OAc)2，在70℃下搅拌5-7小时，搅拌是在一氧化碳气体中进行(利用充满一氧化碳的气球)。真空浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取两次，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，通过硅胶塞(plug)过滤，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(已烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)进行纯化，从而得到纯的甲酯。
将1当量的Boc-苯胺溶解于甲醇中，并将该溶液用氯化氢饱和。将该溶液在50℃下加热3小时，然后真空浓缩。得到的淡黄色固体在35％硫酸中加热，直到完全溶解。加入冰水冷却混合物，析出硫酸氢胺盐沉淀。用冰浴冷却反应瓶，并剧烈搅拌混合物，滴加含有1.1当量亚硝酸钠水溶液。将溶液在0℃下搅拌1.5小时。加入10当量KI的水溶液，然后迅速加入17当量CuI。将反应物室温下搅拌14小时，用乙醚萃取3次。合并有机层，用1M碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(95∶5己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯的芳基碘(aryl iodide)甲酯。
将1当量3-氯苯甲醛的THF溶液冷却至-78℃，加入1.1当量0.5M溴化乙炔基镁/THF。在室温下搅拌反应液3小时，用乙醚稀释，用10％柠檬酸洗涤两次。合并水层，用乙醚再次萃取。合并有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(4∶1至3∶2己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯的炔。
1当量的芳基碘甲酯溶解于乙酸乙酯中，向该溶液用吸液管持续通入氮气10分钟进行脱气。加入1.25当量的炔，然后加入0.02当量的二氯双(三苯基膦)钯(II)、0.04当量的CuI和5当量的TEA。将反应液搅拌14小时，用乙酸乙酯稀释，用5％ Na2·EDTA、盐水洗涤两次，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯进行梯度洗脱)，从而得到纯的芳基炔。
1当量的芳基炔溶解于甲醇中，向该溶液用吸液管持续通人氮气10分钟进行脱气。加入5％Rh/Al2O3，利用气球将氢气通入溶液，将溶液在氢气氛下(利用气球)进行搅拌7小时，接着将反应物通过硅藻土垫过滤，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯梯度洗脱)，从而得到纯的产物。
2.3当量的碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液中，并将此混合物回流加热8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化。
1当量的酸，2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯，2当量的EDC，1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯并重新真空浓缩。1当量的这种胺，2当量的适合的市售羧酸((N-Boc酸从市场上购得。其他酸是将购得的游离胺通过下列步骤加上Boc保护基而得到将胺溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液以除去THF，剩余水层用己烷进行分配。然后，用1N盐酸将水层酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用)实施例18，N-Boc-D-脯氨酸；实施例19，N-Boc-L-脯氨酸；实施例20，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸；实施例21，异哌啶甲酸；2当量的EDC，1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
Boc保护的残余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯并重新真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例4化合物22-25的合成
1当量的4-氨基-2，6-二氯苯酚溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将反应液搅拌过夜。浓缩反应液，残余物分配于水和乙醚中。水层用乙醚萃取，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩得到固体。从乙醚/己烷中重结晶得到纯净的产物。
1当量的苯酚溶解于含有2.6当量2，6-二甲基吡啶的DCM中，将混合物冷却至-78℃。加入1.25当量的三氟甲磺酸酐，将反应液温热至室温，搅拌过夜。浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(9∶1己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的三氟甲磺酸酯。
一边搅拌一边将0.15当量1，3-双(二苯基膦)-丙烷和2.5当量的TEA加入到含有1当量三氟甲磺酸酯的混合溶液中，该混合溶液为DMF/甲醇的2/1混合液。向此溶液通入一氧化碳气体，持续15分钟，然后加入0.15当量的Pd(OAc)2，在70℃下搅拌5-7小时，搅拌是在一氧化碳气体中进行(利用充满一氧化碳的气球)。真空浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取两次，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，通过硅胶塞过滤，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(己烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)，从而得到纯净的甲酯。
将1当量的Boc-苯胺溶解于甲醇中，并将该溶液用氯化氢饱和。将该溶液在50℃下加热3小时，然后真空浓缩。得到的淡黄色固体在35％硫酸中加热，直到完全溶解。加入冰水冷却混合物，析出硫酸氢胺沉淀。用冰浴冷却反应瓶，并剧烈搅拌混合物，滴加含有1.1当量亚硝酸钠的水溶液。将溶液在0℃下搅拌1.5小时。加入10当量KI水溶液，然后迅速加入17当量CuI。将反应物室温下搅拌14小时，用乙醚萃取3次。合并有机层，用1M碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(95∶5己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的芳基碘甲酯。
边搅拌边将1.3当量DIPEA加入到由1当量3-羟基苯甲酸、1.3当量N，O-二甲基羟基胺盐酸盐、1.3当量HOBt和1.3当量EDC在DMF中形成的多相混合物中。在室温下搅拌28小时直到所有的固体彻底溶解。浓缩该混合物，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取三次，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(乙醚)，从而得到纯净的hydroxamate。
1当量hydroxamate，2.2当量的叔丁基二甲基氯硅烷和3当量的咪唑(imidizole)溶解于DMF，在室温下搅拌。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。反应完成后，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。
边搅拌边向1当量的保护的hydroxamate的THF的-78℃溶液中，滴加1.2当量的1.5MDIBAL的甲苯溶液。将反应混合物在-78℃下再搅拌3小时，或直到薄层色谱法检测到产品完全生成，只有微量的反应物。通过将反应液加入到装有乙醚和0.35M硫酸氢钠的分液漏斗中使反应中止。混合物分层。水层用乙醚萃取三次。合并有机层，用1N盐酸和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，然后用硫酸镁干燥，通过硅胶塞过滤，真空浓缩。得到的醛不需要进一步的纯化。
将1当量的保护的醛的THF溶液冷却至-78℃，加入1.1当量的0.5M溴化乙炔基镁/THF。在室温下搅拌反应液3小时，用乙醚稀释，用10％柠檬酸洗涤两次。合并水层，用乙醚再次萃取。合并有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(4∶1至3∶2己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的炔。
1当量的芳基碘甲酯溶解于乙酸乙酯中，向该溶液用吸液管持续导入氮气10分钟进行脱气。加入1.25当量的炔，然后加入0.02当量的二氯双(三苯基膦)钯(II)，0.04当量的CuI和5当量的TEA，将反应液搅拌14小时，用乙酸乙酯稀释，用5％Na2·EDTA、盐水洗涤两次，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯梯度洗脱)，从而得到纯净的芳基炔。
1当量的芳基炔溶解于甲醇中，向该溶液用吸液管持续通人氮气10分钟进行脱气。加入5％Rh/Al2O3，利用气球将氢气通入溶液，将溶液在氢气下(利用气球)搅拌7小时，接着将反应物通过硅藻土垫过滤，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯梯度洗脱)，从而得到纯净的产物。
2.3当量的碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液中，并将此混合物加热回流8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化。
1当量的酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中并重新真空浓缩。1当量的这种胺，2当量的适合的市场可得的羧酸((N-Boc酸从市场上购得。其他酸是将购得的游离胺通过下列步骤加上Boc保护基而得到将胺溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液以除去THF，剩余水层用己烷进行分配。然后，用1N盐酸将水层酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。实施例22，N-Boc-L-脯氨酸；实施例23，N-Boc-D-脯氨酸；实施例24，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸；实施例25，D-羟基脯氨酸)、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
Boc保护的硅基甲残余物与3当量的TBAF溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中并重新真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例5 化合物26-28，31的合成
1当量的2-氯对苯二酸二甲酯溶解于DCM中，氮气保护下用冰/丙酮浴冷却到-5℃。用30分钟滴加1当量的BBr3的DCM溶液。将反应物温热至室温，并搅拌，直到用薄层色谱法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)检测显示反应完全。将溶液倾倒在冰上，冰可能融化。混合物在乙酸乙酯中分配，真空浓缩。将产物溶于水，再加入饱和碳酸氢钠，直到pH保持在8以上。该溶液用同等体积的DCM分配一次以除去未反应的二酯。将该碱性溶液在0℃用浓盐酸化至pH＝1-1.5，然后用同等体积的乙酸乙酯萃取沉淀两次。有机层用盐水分配一次，再用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。HPLC检测到期望的位置异构体(regioisomer)产物与非期望的异构体产物之间的比例为7∶1。
该单酯溶解于DCM，转移到一个预先称重的装有搅拌棒的帕尔(Parr)烧瓶中。将烧瓶在氮气保护下用干冰/乙醇浴冷却至-5℃。一旦冷却，搅拌时注入约30当量的异丁烯到溶液中。加入2.1当量的浓硫酸，用一个线拴住的橡皮塞封住烧瓶，搅拌时将反应物温热至室温。搅拌溶液直至澄清(1-2天)。当溶液变得澄清时，用冰浴将其冷却至0℃。拔出塞子，用氮气将过量的异丁烯吹出。加入饱和碳酸氢钠中和酸，然后将混合物真空浓缩，直到完全除去DCM。该溶液在乙酸乙酯中分配。有机层用稀盐酸、饱和碳酸氢钠分配两次，用盐水分配一次，用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。
1当量的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，将混合物小心用浓盐酸化至pH2，然后真空浓缩以除去THF。水层用乙醚洗涤两次，合并有机层，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。苯甲酸叔丁酯不用进一步纯化就可使用。
将1当量的3-甲氧基苯基氰与乙醇、0.02当量的盐酸和10％(w/w)的10％碳钯一起放入帕尔瓶中。该容器被放入帕尔振荡器，充满50psi氢气，振荡12小时。通过硅藻土垫过滤，并用乙醚按1∶10稀释。放置过夜后，析出细白针状晶体。将产物过滤，用乙醚洗涤，真空干燥。得到的胺盐酸盐不用进一步纯化就可使用。
用3当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA的DMA溶液将3当量的苯甲酸叔丁基酯连接到1当量的胺盐酸盐。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。产物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液纯化得到纯的叔丁酯。
将叔丁酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯，然后真空浓缩两次。
将得到的化合物溶解于DCM中，氮气保护下用冰/丙酮浴冷却到-5℃。用30分钟滴加2当量的BBr3的DCM溶液。将反应物温热至室温，搅拌直到用薄层色谱法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)检测显示反应完全。将溶液倾倒在冰上，冰可能融化。混合物用乙酸乙酯分配两次，合并有机层，用硫酸镁干燥，滤液通过硅胶塞，然后真空浓缩，得到纯净的苯甲酸。
1当量的苯甲酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中并重新真空浓缩。1当量的这种胺、2当量的适合的市售羧酸((N-Boc酸从市场上购得。其他酸是将购得的游离胺通过下列步骤加上Boc保护基而得到将胺溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液除去THF，剩余水层用己烷进行分配。然后，用1N盐酸将水层酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。实施例26，环己烷羧酸；实施例27，异哌啶甲酸；实施例28，D，L-2-哌啶酸；实施例31，3-哌啶甲酸；)、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
恰当地，Boc保护的残余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后真空再浓缩，得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例6 化合物29，30的合成
1当量的2-氯对苯二酸二甲酯溶解于DCM中，氮气保护下用冰/丙酮浴冷却到-5℃。用30分钟滴加1当量的BBr3下的DCM溶液。将反应物温热至室温，搅拌直到用薄层色谱法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)检测显示反应完全。将溶液倾倒在冰上，冰可能融化。混合物在乙酸乙酯中分配，然后真空浓缩。将产物溶于水中，再加入饱和碳酸氢钠，直到pH保持在8以上。该溶液用同等体积的DCM分配一次以除去未反应的二酯。将该碱性溶液在0℃用浓盐酸化至pH＝1-1.5，然后用同等体积的乙酸乙酯萃取沉淀两次。有机层用盐水分配一次，再用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。HPLC检测到期望的位置异构体(regioisomer)产物与非期望的异构体产物之间的比例为7∶1。
该单酯溶解于DCM中，转移到一个预先称重的装有搅拌棒的帕尔烧瓶中。将烧瓶在氮气保护下用干冰/乙醇浴冷却至-5℃。一旦冷却，在搅拌中注入约30当量的异丁烯到溶液中。加入2.1当量的浓硫酸，用一个线拴住的橡皮塞封住烧瓶，搅拌时将反应物温热至室温。搅拌溶液直至澄清(1-2天)。当溶液变得澄清时，用冰浴将其冷却至0℃。拔出塞子，用氮气将过量的异丁烯吹出。加入饱和的碳酸氢钠中和酸，然后将混合物真空浓缩，直到完全除去DCM。该溶液在乙酸乙酯中分配。有机层用稀盐酸、饱和碳酸氢钠分配两次，用盐水分配一次，用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。
1当量的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用浓盐酸小心将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩除去THF。水层用乙醚洗涤两次，合并有机层，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的苯甲酸叔丁基酯不用进一步纯化就可使用。
将1当量的3-甲氧基苯基氰与乙醇、0.02当量的盐酸和10％(w/w)的10％碳钯一起放入帕尔瓶中。该容器被放入帕尔振荡器中，充满50psi氢气，振荡12小时。通过硅藻土垫过滤，并用乙醚按1∶10稀释。放置过夜后，析出细白针状晶体。将产物过滤，用乙醚洗涤，真空干燥。得到的胺盐酸盐不用进一步纯化就可使用。
用3当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA的DMA溶液将3当量的苯甲酸叔丁基酯连接到1当量的胺盐酸盐上。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。产物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱纯化得到纯净的叔丁酯。
将叔丁酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后真空浓缩两次。
将得到的化合物溶解于DCM中，氮气保护下用冰/丙酮浴冷却到-5℃。用30分钟滴加2当量的BBr3的DCM溶液。将反应物温热至室温，搅拌直到用薄层色谱法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)检测显示反应完全。将溶液倾倒在冰上，冰可能融化。混合物用乙酸乙酯分配两次，合并有机层，用硫酸镁干燥。滤液通过硅胶塞，然后真空浓缩，得到纯净的苯甲酸。
1当量的苯甲酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物在室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的Boc甲酯。
1当量的市售哌啶甲酸溶解于3∶2THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液除去THF，水层用己烷分配。将水层用1N盐酸酸化至pH2，然后用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的Boc保护的哌啶甲酸不用进一步纯化就可使用。
将Boc甲酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空浓缩。1当量的这种胺、2当量的得到的Boc保护的哌啶甲酸、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的产物。
将Boc保护的产物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后真空浓缩两次得到纯净的胺。1当量的这种胺、2当量的适当的市售酸(实施例29；丙酸；实施例30，乙酸)、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的产物。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例7 化合物32-34的合成
1当量的2-氯对苯二酸二甲酯溶解于DCM中，氮气保护下用冰/丙酮浴冷却到-5℃。用30分钟滴加1当量的BBr3的DCM溶液。将反应物温热至室温，搅拌直到用薄层色谱法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)检测显示反应完全。将溶液倾倒在冰上，冰可能融化。混合物在乙酸乙酯中分配，真空浓缩。将产物溶于水，再加入饱和的碳酸氢钠，直到pH保持在8以上。该溶液用同等体积的DCM分配一次以除去未反应的二酯。将该碱性溶液在0℃用浓盐酸化至pH＝1-1.5，然后用等体积的乙酸乙酯萃取沉淀两次。有机层用盐水分配一次，再用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。HPLC检测到期望的位置异构体(regioisomer)产物与非期望的异构体产物之间的比例为7∶1。
该单酯溶解于DCM中，转移到一个预先称重的装有搅拌棒的帕尔烧瓶中。将烧瓶在氮气保护下用干冰/乙醇浴冷却至-5℃。一旦冷却，搅拌时注入约30当量的异丁烯到溶液中。加入2.1当量的浓硫酸，用一个线拴住的橡皮塞封住烧瓶，搅拌时将反应物温热至室温。搅拌溶液直至澄清(1-2天)。当溶液变得澄清时，将其在冰浴中冷却至0℃。拔出塞子，用氮气将过量的异丁烯吹出。加入饱和的碳酸氢钠中和酸，然后将混合物真空浓缩，直到完全除去DCM。该溶液在乙酸乙酯中分配。有机层用稀盐酸、饱和的碳酸氢钠分配两次，用盐水分配一次，用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。
将1当量的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用浓盐酸小心将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩除去THF。水层用乙醚洗涤两次，合并有机层，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的苯甲酸叔丁酯不用进一步纯化就可使用。
将1当量的3-甲氧基苯基氰与乙醇、0.02当量的盐酸和10％(w/w)的10％碳钯一起放入帕尔瓶中。该容器被放入帕尔振荡器上，充满50psi氢气，振荡12小时。通过硅藻土垫过滤，并用乙醚按1∶10稀释。放置过夜后，析出细白针状晶体。将产物过滤，用乙醚洗涤，真空干燥。得到的胺盐酸盐不用进一步纯化就可使用。
用3当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA的DMA溶液将3当量的苯甲酸叔丁基酯连接到1当量的胺盐酸盐上。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。产物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱纯化得到纯净的叔丁酯。
将叔丁酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后真空浓缩两次。
将得到的化合物溶解于DCM中，氮气保护下用冰/丙酮浴冷却到-5℃。用30分钟滴加2当量的BBr3的DCM溶液。将反应物温热至室温，搅拌直到用薄层色谱法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)检测显示反应完全。将溶液倾倒在冰上，冰可能融化。混合物用乙酸乙酯分配两次，合并有机层，用硫酸镁干燥，滤液通过硅胶塞，然后真空浓缩，得到纯净的苯甲酸。
1当量的苯甲酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物在室温下搅拌并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的Boc甲酯。
1当量的市售异哌啶甲酸溶解于3∶2THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液除去THF，水层用己烷分配。将水层用1N盐酸酸化至pH2，然后用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的Boc保护的异哌啶甲酸不用进一步纯化就可使用。
Boc甲酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空浓缩。1当量的这种胺、2当量的得到的Boc保护的异哌啶甲酸、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的产物。
将Boc保护的产物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后真空浓缩两次，得到纯净的胺。1当量的这种胺、2当量的适当的市售酸(实施例32；丙酸；实施例33，丁酸；实施例34，乙酸)、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的产物。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例8 化合物36的合成
1当量的2，6-二氯-4-甲基苯酚溶解于含有2.6当量的2，6-二甲基吡啶的DCM中，将混合物冷却至-78℃。加入1.25当量的三氟甲磺酸酐，搅拌反应液，温热至室温过夜。浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(9∶1己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的三氟甲磺酸酯。
搅拌的同时将0.15当量的1，3-双(二苯基膦)-丙烷和2.5当量的TEA加入到含有1当量的三氟甲磺酸酯的混合溶液中，该混合溶液为2/1的DMF/甲醇混合液。向此溶液通入一氧化碳气体，持续15分钟。然后加入0.15当量的Pd(OAc)2，在70℃下搅拌5-7小时，搅拌是在一氧化碳气体中进行(利用充满一氧化碳的气球)。真空浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取两次，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，通过硅胶塞过滤，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(己烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)，从而得到纯净的甲苯基甲酯。
1当量的甲苯基甲酯(tolyl methyl ester)溶解于乙酸酐和乙酸中，用冰-盐浴(-5℃)冷却，然后加入浓硫酸。滴加CrO3(2.6当量的)的乙酸酐和乙酸溶液，将反应液在-5℃搅拌3.5小时。将溶液倾入冰水中并搅拌30分钟。混合物用乙醚萃取三次。合并有机层，用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩得到油状物。向油状物中加入甲苯，再将溶液真空浓缩。重复此步骤直到产生晶状固体。将该固体溶解于甲醇和浓盐酸中，然后加热回流12小时。将反应物真空浓缩，残余物用硅胶快速色谱进行纯化(9∶1己烷/乙醚)，从而得到纯净的醛。
将1当量的醛的THF溶液冷却至-78℃，加入1.1当量的0.5M溴化乙炔基镁/THF。在室温下搅拌反应液3小时，用乙醚稀释，用10％柠檬酸洗涤两次。合并水层，用乙醚再次萃取。合并有机层，用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(4∶1至3∶2己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的炔。
1当量的3-碘代苯酚、2.2当量的叔丁基二甲基氯硅烷和3当量的咪唑(imidizole)溶解于DMF中，在室温下搅拌。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。反应完成后，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用饱和的碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。得到的产物不用进一步纯化就可使用。
1当量的硅基碘化物溶解于乙酸乙酯中，向该溶液用吸液管持续通入氮气10分钟进行脱气。加入1.25当量的炔、然后加入0.02当量的二氯双(三苯基膦)钯(II)、0.04当量的CuI和5当量的TEA。将反应液搅拌14小时，用乙酸乙酯稀释，用5％Na2·EDTA、盐水洗涤两次，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯进行梯度洗脱)，从而得到纯净的芳基炔。
1当量的芳基炔溶解于甲醇中，向该溶液用吸液管持续通入氮气10分钟进行脱气。加入5％Rh/Al2O3，利用气球将氢气通入溶液，将溶液在氢气下(利用气球)进行搅拌7小时，接着将反应物通过硅藻土垫过滤，真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯进行梯度洗脱)，从而得到纯净的产物。
2.3当量的碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液中，并将此混合物加热回流8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化。
1当量的酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC，1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中并重新真空浓缩。将1当量的这种胺、2当量的Boc-L-噻唑烷-4-羧酸、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
Boc保护的硅基残余物与3当量的TBAF一起溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，并重新真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例9化合物37的合成
1当量的2，6-二氯-4-甲基苯酚溶解于含有2.6当量的2，6-二甲基吡啶的DCM中，将混合物冷却至-78℃。加入1.25当量的三氟甲磺酸酐，将搅拌的反应液温热至室温过夜。浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(9∶1己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的三氟甲磺酸酯。
搅拌同时将0.15当量的1，3-双(二苯基膦)-丙烷和2.5当量的TEA加入到含有1当量的三氟甲磺酸酯的混合溶液中，该混合溶液为2/1的DMF/甲醇混合液。向此溶液通入一氧化碳气体，持续15分钟。然后加入0.15当量的Pd(OAc)2，在70℃下搅拌5-7小时，搅拌在一氧化碳气体中(利用充满一氧化碳的气球)进行。真空浓缩反应液，将残余物在乙醚和水中分配。水层用乙醚萃取两次，合并有机层，然后用硫酸镁干燥，通过硅胶塞过滤，然后真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(流动相为己烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)，从而得到纯净的甲苯基甲酯。
1当量的甲苯基甲酯溶解于乙酸酐和乙酸中，在冰-盐浴(-5℃)中冷却，然后加入浓硫酸。滴加CrO3(2.6当量的)的乙酸酐和乙酸溶液，将反应液在-5℃搅拌3.5小时。将溶液倾入冰水中，并搅拌30分钟。混合物用乙基醚萃取三次。合并有机层，用饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩得到油状物。向油状物中加入甲苯，再将溶液真空浓缩。重复此步骤直到产生晶状固体。将该固体溶解于甲醇和浓盐酸中，然后加热回流12小时。将反应物真空浓缩，残余物用硅胶快速色谱进行纯化(9∶1己烷/乙醚)得到纯净的醛。
将1当量的醛的THF溶液冷却至-78℃，加入1.1当量的0.5M溴化乙炔基镁/THF。在室温下搅拌反应液3小时，用乙醚稀释，用10％柠檬酸洗涤两次。合并水层，用乙醚再次萃取。合并有机层，用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱(4∶1至3∶2己烷/乙醚)进行纯化，从而得到纯净的炔。
1当量的1-氯-3-碘代苯溶解于乙酸乙酯中，向该溶液用吸液管持续通入氮气10分钟进行脱气。加入1.25当量的炔，然后加入0.02当量的二氯双(三苯基膦)钯(II)、0.04当量的CuI和5当量的TEA。将反应液搅拌14小时，用乙酸乙酯稀释，用5％Na2·EDTA、盐水洗涤两次，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯进行梯度洗脱)，从而得到纯净的芳基炔。
1当量的芳基炔溶解于甲醇中，向该溶液用吸液管持续通人氮气10分钟进行脱气。加入5％Rh/Al2O3，利用气球将氢气通入溶液中，将溶液在氢气下(利用气球)进行搅拌7小时，接着将反应物通过硅藻土垫过滤，真空浓缩。残余物用硅胶快速色谱进行纯化(从乙醚到乙酸乙酯梯度洗脱)，得到纯净的产物。
2.3当量的碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液中，并将此混合物加热回流8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化。
1当量的酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
1当量的市售D-羟基脯氨酸溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，然后将混合物搅拌过夜。浓缩反应液除去THF，水层用己烷分配。将水层用1N盐酸酸化至pH2，然后用乙酸乙酯分配两次。合并有机层，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。得到的N-Boc-D-羟基脯氨酸不用进一步纯化就可使用。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中。并重新真空浓缩。1当量的这种胺、2当量的Boc-D-羟基脯氨酸、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。Boc保护的硅基残余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，并重新真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例10 化合物35的合成
在一个圆底烧瓶中悬吊一个高效的搅拌器，然后往烧瓶里注入浓硫酸(水体积的2.7倍)和水，用乙醇/冰浴冷却到约-5℃。一旦冷却，在剧烈搅拌下加入1当量的2，6-二氯苯酚和1当量的N-(羟甲基)邻苯二甲酰亚胺。在低温下反应4小时，然后温热至室温，持续搅拌过夜。通常反应会进行到圆底烧瓶里只有固体的阶段。此时将乙酸乙酯和水加入并搅拌。大块的固体破碎后，将沉淀过滤，并用乙酸乙酯和水洗涤。产物真空干燥过夜后，不需要进一步纯化即可使用。
将1当量的干燥后的产物与甲醇(每克起始物加22.5毫升)加入到装有水冷凝器与搅拌棒的圆底烧瓶中。加入1.2当量的肼一水合物，然后将混合物回流4小时。冷却至室温后，小心加入浓盐酸(每克起始物加4.5毫升)。加完浓盐酸后，将混合物回流过夜(大于8小时)。反应冷却至0℃，过滤除去沉淀的副反应产物。然后将滤液真空浓缩。
将粗胺残余物在3∶2 THF/水溶液中溶解。加入1.1当量的固体碳酸氢钠和1.1当量的Boc2O，混合物搅拌过夜。将反应物浓缩，将残余物在水和乙醚中分配。用乙醚萃取水溶液，合并有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩成固体。从热的甲醇和水中重结晶得到纯净的产物。
在圆底烧瓶里，将1当量的Boc保护的胺和1.5当量的2，6-二甲基吡啶溶解于DCM中，必要时可稍微加热。一旦这些起始原料完全溶解，在氮气下，用干冰乙醇浴将其冷却到-78℃。一旦冷却，加入2.5当量的三氟甲磺酸酐，搅拌下，反应温度缓慢回升到室温。用薄层色谱法实时监控反应，一般4小时内反应完毕。一旦完成，将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和水中分配。有机层用0.1N硫酸、饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次，然后用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用DCM洗脱，得到纯净的三氟甲磺酸酯。
在高压Parr容器的玻璃套中，将1当量的三氟甲磺酸酯溶解于DMF和甲醇中。然后将起始物在一氧化碳下搅拌脱气10分钟。加入0.15当量的醋酸钯(II)和0.15当量的1，3-双(二苯基膦)丙烷，再在一氧化碳下搅拌脱气10分钟，搅拌过程中，加入2.5当量的二异丙基乙基胺。正确组装好容器后，充满300psi一氧化碳气体，加热至70℃，搅拌过夜。将容器冷却排气。转移混合物到圆底烧瓶中，然后真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用1％丙酮和1％TEA的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，并重新真空浓缩。将胺的TFA盐溶解于乙醚中，用碳酸钾的10％水溶液洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
1当量的游离碱性胺、3当量的呋喃丙烯酸、3当量的EDC和1当量的Hobt溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
2.3当量的碘化锂加入到1当量的甲酯的吡啶溶液中，并将此混合物加热回流8小时。将反应物真空浓缩，将残余物在乙酸乙酯和1N盐酸中分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，并用1M碳酸氢钠洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。将残余物溶解于NMM中，然后将溶液真空浓缩。将残留物用DCM溶解，然后用1N盐酸洗涤三次。有机层用硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到足够高纯度的苯甲酸，不需要继续纯化。
1当量的酸、2当量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
Boc保护的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空浓缩。
将1.05当量的碘甲烷和2.1当量的碳酸钾的DMF溶液加入到1当量的这种胺中。将反应物室温下搅拌，用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监测。一旦反应完成，用乙酸乙酯和水稀释。将水层在乙酸乙酯中分配，合并有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。
1当量的这种胺、2当量的Boc-L-噻唑烷-4-羧酸、2当量的EDC、1当量的Hobt和3当量的DIPEA溶解于DMA中。将反应物室温下搅拌，并且用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控。一旦反应完成，将混合物真空浓缩。将得到的油悬浮于乙醚中，用0.1N硫酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用5％甲醇的DCM液洗脱，得到纯净的甲酯。
1当量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3当量的LiOH·H2O。用薄层色谱法(DCM/甲醇，9/1)监控反应。一旦反应完成，用1M盐酸将混合物酸化至pH2，然后真空浓缩。将得到的固体悬浮于乙醚中，用0.1M盐酸洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机层用硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩。
将残余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分钟后，将反应物真空浓缩。将得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空浓缩。得到的酸用反相HPLC进行纯化，并用电喷雾质谱确证，然后冻干成粉末。
实施例11 PLM2抗体捕获LFA-1ICAM-1分析抗人体CD18的非功能抑制性单克隆抗体PLM-2(如Hildreth等，Molecular Immunology，Vol.26，No.9，pp.883-895，1989所述)，用PBS稀释至5μg/ml，并以100μl/孔包被96-孔平底培养板，4℃保持过夜。在室温下，将培养板用在分析缓冲液(0.02M Hepes，0.15M NaCl，和1mM MnCl2)中的0.5％BSA封闭1小时。用50mM Tis pH7.5，0.1M NaCl，0.05％Tween20和1mM MnCl2冲洗培养板。用分析缓冲液，将纯化的全长重组人LFA-1蛋白稀释至2μg/ml，按100μl/孔加入到培养板中，在37℃培养1小时。洗板三次。每孔加入50μl两倍终浓度的溶在分析缓冲液中经过适当稀释了的抑制剂，37℃培养30分钟。每孔加入50μl、用分析缓冲液中稀释至161ng/ml(终浓度为80ng/ml)的纯化的重组人的5结构域ICAM-Ig，在37℃培养2小时。冲洗培养板，室温下用山羊抗HuIgG(Fc)-HRP检测结合的ICAM-Ig1小时。冲洗培养板，室温下每孔用100μlTMB底物显色5-10分钟。每孔用100μl H3PO4(1M)停止显色，在读板仪下450nM处读取。PLM2的分析结果如下表1-4所示。
实施例12 血清/血浆蛋白结合受试化合物的结合是按照Borga等(Journal of Pharmacokinetics &Biopharmaceutics，1997，25(1)63-77)和Godolphin等(Therapeutic drugmonitoring，1983，5319-23)所阐述的步骤进行的。室温下，双份10μl受试化合物原液(1μg/μL)搀入到1mL缓冲液或用二氧化碳调到pH7.4的血清/血浆中。样品装在瓶里，在装有振荡器的37℃水浴中培养15分钟进行平衡。保留200μl掺入缓冲液的样品作为滤前液。800μl掺入缓冲液的样品和1ml的血清掺入的样品在超滤离心仪(Amicon Inc.)中37℃下，1500g离心30分钟。用LC/MS-MS分析滤前液和滤后液，测定受试化合物与血清/血浆蛋白的结合百分比，从扣除(accounting for)由缓冲液对照得到的非特异性结合的滤前液和滤后液的数值得到。
在取代基Cy处含有非芳香环的本发明化合物具有很低的血清血浆蛋白结合特性，有利于维持与治疗相关的血清水平。如表1-4所示，相对于在取代基Cy处含有非芳香环的本发明化合物，含有芳香环的参照化合物一直显示较高的血浆蛋白结合百分率。
表1

表2

表3
表4
权利要求
1.具有通式(I)的化合物，及其盐、溶剂化物、水合物。 其中Cy为非芳香族碳环或杂环，可被羟基、巯基、硫烷基、卤素、氧代、硫代、氨基、氨基烷基、脒基、胍基、硝基、烷基、烷氧基或者酰基任选取代；X为二价烃链，可被羟基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代任选取代并可任选被N，O，S，SO或SO2断开；Y为碳环或杂环，可被羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、硫烷基、氨基、氨基烷基、碳环或杂环基、烃基、卤代烃基、氨基、脒基、胍基、氰基、硝基、烷氧基或者酰基任选取代；L为单键或可被羟基、卤素、氧代或硫代任选取代并可任选被N、O、S、SO或SO2或氨基酸残基断开的少于3至5个原子的二价烃链；R1为H，羟基，氨基，O-碳环或烷氧基，所述基团可被氨基、碳环或杂环任选取代；R2-5独立为H，羟基，巯基，卤素，氰基，氨基，脒基，胍基，硝基或烷氧基；或R3和R4合在一起形成稠合碳环或杂环，可被羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基任选取代；R6为H或可被碳环或杂环任选取代的烃链；前提条件是当Y为苯基时，R2、R4和R5为H，R3为Cl，且R1为OH，则X为除环己基以外的基团。
2.根据权利要求1的化合物，其中Cy为5或6元非芳香族杂环，可被羟基、巯基、硫烷基、卤素、氧代、硫代、氨基、氨基烷基、脒基、胍基、硝基、烷基、烷氧基或酰基任选取代。
3.根据权利要求2的化合物，其中所述杂环包括一个或两个杂原子并可被羟基、氧代、巯基、硫代、烷基或烷酰基任选取代。
4.根据权利要求3的化合物，其中所述杂环选自哌啶、哌嗪、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、噁唑烷，环丙基吡咯烷和噻唑烷，可被羟基、氧代、巯基、硫代、烷基或烷酰基任选取代。
5.根据权利要求4的化合物，其中所述杂环选自哌啶、哌嗪、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、噁唑烷，噻唑烷，可被羟基、氧代、巯基、硫代、烷基或烷酰基任选取代。
6.根据权利要求1的化合物，其中Cy为3-6元碳环，可被羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基、烷基、烷氧基或酰基任选取代。
7.根据权利要求6的化合物，其中所述碳环为部分不饱和。
8.根据权利要求7的化合物，其中Cy为环丙基，环丙烯基，环丁基，环丁烯基，环戊基，环戊烯基，环己基和环己烯基。
9.根据权利要求1的化合物，其中X为C1-5二价烃，任选其中一个或多个碳原子被N，O，S，SO或SO2替代，且该烃可被羟基、氧代或硫代任选取代。
10.根据权利要求1的化合物，其中X为-CH2-NR6-C(O)-，其中羰基部分-C(O)-与Cy共价连接，且R6为H或烷基。
11.根据权利要求1的化合物，其中Y为可被羟基或卤素任选取代的碳环或杂环。
12.根据权利要求11的化合物，其中Y为呋喃-2-基，噻吩-2-基或苯基，其中所述苯基可被卤素或羟基任选取代。
13.根据权利要求1的化合物，其中L为二价烃，其中一个或多个碳原子被N，O，S，SO或SO2任选替代，且该烃可被羟基、卤素、氧代或硫代任选取代；或该烃的三个碳原子被氨基酸残基替代。
14.根据权利要求13的化合物，其中L为-CH＝CH-C(O)-NR6-CH2-，-CH2-NR6-C(O)-，-C(O)-N6-CH2-，-CH(OH)-(CH2)2-，-(CH2)2-CH(OH)-，-(CH2)3-，-C(O)-NR6-CH(R7)-C(O)-NR6-，-NR6-C(O)-CH(R7)-NR6-C(O)-，-CH(OH)-CH2-O-或-CH(OH)-CF2-CH2-，其中每个R6独立为H或烷基，且R7为氨基酸侧链。
15.根据权利要求14的化合物，其中R1为H、OH、氨基，以及O-碳环或烷氧基，所述基团可被碳环任选取代。
16.根据权利要求15的化合物，其中R1为H或C1-4烷氧基。
17.根据权利要求1的化合物，其中R2和R3中至少一个为卤素，且另一个为H或卤素。
18.根据权利要求17的化合物，其中R2和R3都为Cl。
19.根据权利要求18的化合物，其中R4和R5都为H。
20.一种药物组合物，含有权利要求1的化合物、可药用的辅药、稀释剂或载体。
21.一种抑制LFA-1与蛋白配体结合的方法，包括将LFA-1与权利要求1的化合物相接触。
22.一种治疗哺乳动物中由LFA-1介导疾病和状态的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1的化合物。
23.根据权利要求2的方法，其中所述疾病或状态为关节炎，牛皮癣，器官移植排斥，哮喘，和肠道炎性疾病。
23.一种抑制哺乳动物的炎性疾病和状态的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1的化合物。
全文摘要
本发明涉及具有下列通式(I)的新化合物，其中Cy，X，Y，L和R
文档编号A61K31/198GK1592746SQ01821797
公开日2005年3月9日 申请日期2001年11月26日 优先权日2000年11月28日
发明者丹尼尔·J·伯迪克, 托马斯·R·加德克, 小詹姆斯·C·马斯特斯, 戴维·奥雷, 马克·E·雷诺兹, 马克·S·斯坦利 申请人:杰南技术公司