抗增殖药物的制作方法

专利名称：抗增殖药物的制作方法
技术领域：
本发明一般为治疗疾病和障碍的药物组合物和方法领域，特别涉及增殖性疾病，例如肿瘤和各种皮肤病。
背景技术：
精神药物(psychotropics)用于治疗精神分裂症(schizophrenia)及其它精神病。若干研究表明其对其它无关疾病的作用。Silver等人，(Society of Biological Psychiatry，35824-826，(1999))研究了若干精神药物，包括氟哌啶醇(haloperidol)和氟奋乃静(fluphenazine)对人神经母细胞瘤细胞系的抑制作用，证明氟哌啶醇、氟哌噻吨(flupentixol)、氟奋乃静、多巴胺以及去甲基丙米嗪(desmethyl imipramine)对细胞数目的抑制作用。
其它研究进一步表明，酚噻嗪(phenothiazine)对某些肿瘤细胞，例如白血病细胞、黑色素瘤、胶质瘤和白血病具有抗增殖作用(Nordenberg等人，Biochemical Pharmacology，581229-1239，(1999))。
另外，至少一个出版物US 5,104,858讲授了通过细胞接触某些酚噻嗪和噻吨，而使多药耐药性细胞对抗肿瘤剂敏感。
关于抗抑郁药(antidepressant)的报告不一致。发现氯米帕明(clomipramine)、丙米嗪和西酞普兰(citalopram)诱导髓样白血病HL-60细胞凋亡(Xia等人，J.Biochem Mol Toxicol13338-47(1999))。
5-羟色胺重摄取抑制剂氟西汀(fluoxetine)和齐美利定(zimelidine)抑制前列腺癌细胞增殖，该作用归因于抑制5-羟色胺摄取(Abdul M等人，J Urol154247-50(1995)).然而其它研究表明，体内给予小鼠氟西汀和阿米替林(amitryptiline)增强了纤维肉瘤、黑色素瘤和乳腺肿瘤的发展(Brandes LJ等人，Cancer Res523796-00(1992))。
其它对人的研究表明，抗抑郁药(三环(tricyclic)和帕罗西汀(paroxetine))与乳腺癌危险升高有关(Cotterchio M.等人，Am JEpidemiol，151951-7(2000))，或最近报告对乳腺癌全然没有影响(Wang P.S.J Clin.Epidemiol.54728-34，(2001))。
若干出版物也描述了利用精神药物和神经药物治疗具有明确可辨别精神病症状的皮肤病患者，例如与重性抑郁症(major depression)有关的银屑病、导致社交焦虑以及寄生虫病妄想症的白斑(Gupta M.A.等人，J.Am.Dermatol 14(4)633-645(1986)；Tennyson H和Levine N.Dermatol Clin.19(1)179-197(2001))。另一出版物还报告了氟西汀诱导的银屑病(Hemlock C.等人，Ann.Pharmacother.26(2)211-212(1992))。
发明概述本发明基于若干有关几种精神药物所得经验结果的惊人发现。
首先，本发明基于如下发现，即氯氮平(clozapine)和氯噻平(clotiapine)(三环神经安定药和抗精神病药)、帕罗西汀(二环抗抑郁药)和氟西汀(一环抗抑郁药)及其它相关的环状精神药物有效对抗多种肿瘤，包括胶质瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、肺癌和前列腺癌(包括激素依赖性以及激素非依赖性)以及对抗多药耐药性(MDR)B16黑色素瘤细胞(已知抗阿霉素和秋水仙碱)、神经母细胞瘤(SH-SY5T抗5-FU和阿霉素)。
因此，本发明第一方面提供了治疗增殖性疾病的方法，其包含给予有此需要的受试者治疗有效量的至少一种活性成分，该活性成分为选自三环神经安定药和抗精神病药、二环抗抑郁药和一环抗抑郁药的环状精神药物，条件是，该三环神经安定药和抗精神病药不是酚噻嗪或噻吨，并且若该活性成分是一环抗抑郁药，则该增殖性疾病不是前列腺癌。
此处所用术语″治疗″是指给予治疗量的精神药物，其可有效改善与增殖性疾病有关的不希望的症状，在其发生之前有效防止该症状的表现，有效减缓该增殖性疾病的进展(如可能明显于肿瘤大小变化、形成转移等)，有效减缓症状恶化，有效加强缓解期的开始(例如在银屑病的情况下)，有效减缓进行性的疾病慢性期所致不可逆损伤，有效延迟所述进行期的开始，有效减轻疾病严重性或治疗该疾病，有效提高存活率或更快恢复，或有效防止疾病发生，或者上述两种或多种的组合。
此处所用术语″精神药物″是指包含至少一个芳香环并用作CNS活化剂的化合物。下文给出特定的环状精神药物的名称，应当理解为，该术语不仅涉及该药物的化学式(例如，化学文摘或医学手稿(例如Psychotropics 2000/2001 Lundbck Ed.)中所列)，而且涉及化学式的细微修饰(例如增强稳定性；提高对细胞通透性或者降低对血脑屏障(blood brain barrier，BBB)通透性、引起缓释等，但保持该药物对抗过度增殖性细胞的生物活性)；根据本发明该方面的一个实施方案，三环神经安定药和抗精神病药是二苯并噻平(dibenzothiepines)、二苯并氮(dibenzoazepines)、二苯并硫氮(dibenzothiazepines)、二苯并二氮(dibenzodiazepines)或二苯并氧氮(dibenzooxazepines)的衍生物，根据优选的实施方案，该三环神经安定药和抗精神病药是氯氮平或者氯噻平。
根据本发明另一实施方案，所述的活化剂是二环抗抑郁药，并且所述的二环抗抑郁药优选帕罗西汀。
另外，本发明的活性成分可能是一环抗抑郁药，根据本发明的一个实施方案，所述的一环抗抑郁药是苯丙胺衍生物。优选的一环抗抑郁药包括苯氧基-3-丙胺衍生物，例如托莫西汀(tomoxetine)、尼索西汀(nisoxetine)，最优选氟西汀。
根据一个实施方案，所述的增殖性疾病是肿瘤，包括良性和恶性肿瘤。特别地，利用上文定义的环状精神药物治疗的肿瘤为胶质瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌、多药耐药性癌以及与突变的p53基因有关的癌。
正如本领域技术人员可能理解，活性精神药物可能优选与细胞毒药物(例如阿霉素(doxorubicin))联合给药。因此，本发明也涉及治疗增殖性疾病，其中所述的精神药物与一种或多种细胞毒药物联合给药。
此处所述术语″联合″应当理解为，可能在给予精神药物之前、伴随该精神药物给药(共同给药)或其后不久，将细胞毒药物提供给有此需要的受试者。因此，本发明应当理解为涉及活性精神药物和细胞毒药物的任何组合形式。
本发明基于的另一发现是精神药物，例如氯氮平(三环神经安定药和抗精神病药)、氯米帕明(三环抗抑郁药)、帕罗西汀(二环抗抑郁药)和氟西汀(一环抗抑郁药)，有效使癌细胞对阿霉素敏感。
因此，本发明第二方面提供了使增殖性细胞对细胞毒药物敏感的方法，该方法包含将一定量的所述细胞毒药物与致敏量的至少一种精神药物联合给予有此需要的受试者，条件是，该精神药物不是吩噻嗪或噻吨。
此处所用术语″致敏量″是指有效诱导针对靶细胞药物毒性的精神药物的任意数量，如果没有该精神药物，则毒性药物所处浓度对所述靶细胞没有毒性。
根据本发明该方面的实施方案，该精神药物为环状神经安定药和抗精神病药或环状抗抑郁药。例如，三环神经安定药和抗精神病药包括氯氮平，而三环抗忧郁药包括氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪。
另外，根据本发明的这一方面，所述的活性精神药物可能是二环抗抑郁药，例如帕罗西汀，或一环抗抑郁药，例如氟西汀。
本发明的致敏方法可应用于任何类型的癌细胞，包括MDR癌细胞。实际上，本发明的实施方案提供了使MDR癌细胞对阿霉素敏感的方法，其包含将一定量阿霉素与致敏量的至少一种选自氯氮平、氯米帕明、氟西汀和帕罗西汀的精神药物联合给予有此需要的受试者。
本发明另外基于如下发现，即酚噻嗪家族的神经和抗精神病药成员硫利达嗪，有效使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感。一些出版物描述了酚噻嗪诱导的细胞毒性，硫利达嗪的增强作用如今方才公开。
因此，本发明提供了使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的方法，其包含将适量该细胞毒药物与致敏量的硫利达嗪联合给予有此需要的受试者。
本发明基于的另一发现是，环状精神药物具有对抗增殖性皮肤病(例如银屑病和过度角化症)活性，也可能对抗基底细胞癌。
因此，本发明另一方面提供了治疗与精神病症状无关的增殖性皮肤病的方法，其包含给予有此需要的受试者治疗(例如皮肤病学)有效量的至少一种精神药物。
短语″与精神病症状无关″是指需要本发明治疗的受试者，除皮肤病以外，没有遭受任何可能直接或间接引起增殖性皮肤病、或与其形成有关的精神障碍。如上所述，精神药物可能影响与精神障碍有关的皮肤病，其具有若干指征，例如与重性抑郁症有关的银屑病、导致社交焦虑以及寄生虫病妄想症的白斑。尽管以上事实，本发明如今惊人地表明，不管有此需要的受试者是否患有其它障碍/疾病，可以通过给予所述受试者如上定义的精神药物，从而有效治疗增殖性皮肤病。
增殖性皮肤病可包括与皮肤细胞过度增殖有关的任何皮肤病，并特别包括银屑病、过度角化症和基底细胞癌。
根据本发明该方面的一个实施方案，用于治疗增殖性皮肤病的精神药物是酚噻嗪，优选包括硫利达嗪、奋乃静和氟奋乃静。
然而，根据本发明该方面的另一实施方案，该精神药物为环状抗抑郁药。环状抗抑郁药可能包括三环抗忧郁药，例如氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪，二环抗抑郁药，例如帕罗西汀，以及一环抗抑郁药，例如氟西汀。
可以利用本领域已知的任何给药方法，给予本发明的活性成分。为了治疗肿瘤或者使肿瘤细胞对细胞毒药物敏感，给药特别包括口服给药、肠胃外给药(例如i.v.、i.p.、s.c.)、直接注射到肿瘤部位、以及给予缓释剂。精神药物，包括环状神经安定药和抗精神病药以及抗抑郁药，可以在活性化疗期，任选与其它已知的具有抗增殖活性的抗肿瘤药物共同给药，也可以为了二级预防目的而在缓解状态给药(慢性摄取)。所述的药物甚至能够作用于耐药性肿瘤，故可能特别用于治疗抗阿霉素及其它细胞因子的肿瘤。
为了治疗增殖性皮肤病而应用口服和肠胃外给药，但优选局部给药，所述活性成分可能以油膏剂、洗剂、软膏剂(亲水性或亲脂性)或者悬浮液给药。特别优选acquosum软膏剂。
本发明也涉及治疗增殖性疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种活性成分和药学可接受的载体，该活性成分是选自上文定义的、与增殖性疾病的治疗方法有关的三环神经安定药和抗精神病药、二环抗抑郁药和一环抗抑郁药的环状精神药物。
此处所述药学可接受的载体，例如运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂，为本领域技术人员所熟知，并且公众易于得到。优选药学可接受的载体是对该活性化合物呈现化学惰性的，并且在使用条件下没有有害副作用或毒性。适合局部给药的载体的例子是药剂师通常使用的标准(aqueosum)eucerinum制剂。
载体的选择部分取决于特定的活性药物，以及用于给予本发明组合物的特定方法。因此，本发明药物组合物的具有各种合适的剂型。
本发明还涉及使增殖性细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物，其包含一定量的所述细胞毒药物以及上文定义的、与本发明使增殖性细胞对细胞毒药物敏感的方法有关的致敏有效量的精神药物。
本发明的一个优选实施方案提供了使MDR癌细胞对阿霉素敏感的药物组合物，其包含一定量的阿霉素以及致敏有效量的至少一种选自氯氮平、氯米帕明、氟西汀和帕罗西汀的精神药物。
本发明另一方面提供了使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物，其包含一定量的所述细胞毒药物以及致敏有效量的硫利达嗪。
本发明也涉及治疗与精神病症状无关的增殖性皮肤病的药物组合物，其包含上文定义的、与本发明治疗增殖性皮肤病的方法有关的治疗有效量的精神药物。
最后，本发明也涉及精神药物对抗增殖性疾病的不同用途。例如，本发明涉及选自三环神经安定药和抗精神病药、二环抗抑郁药和一环抗抑郁药的环状精神药物的用途，用于制备治疗增殖性疾病的药物组合物，该精神药物为上文定义的、与本发明治疗增殖性疾病的方法有关。
此外，本发明也公开了精神药物在制备使增殖性细胞(例如MDR癌细胞)对细胞毒药物敏感的药物组合物中的用途，条件是除硫利达嗪作为精神药物以外，该精神药物不是酚噻嗪或噻吨。
本发明还涉及精神药物在制备治疗与精神病症状无关的增殖性皮肤病的药物组合物中的用途。
现参照附图，通过实施例描述本发明。上文说明书仅详述了本发明的几个特定实施方案，本领域技术人员应当理解，本发明不限于此，并且其它精神药物可能应用于其它类型的增殖性疾病，而不背离附加的权利要求书所定义的本发明范围。
附图简述为理解本发明，并了解其实际上如何实施，现仅通过非限制性实施例，参照附图描述优选实施方案，其中

图1显示帕罗西汀对原发的小鼠脑细胞、原发神经元和神经母细胞瘤细胞存活力的作用；图2A-2B显示三氟拉嗪(trifluoperazine)和氟哌噻吨对前列腺癌(LN-Cap(图2A)、PC-3(图2B))存活力的作用；图3A-3C显示氯氮平对前列腺LN-Cap细胞、黑色素瘤B16和C6胶质瘤细胞(图3A)的作用，氯噻平对小鼠肺癌细胞(图3B)的作用，以及氯氮平对小鼠黑色素瘤(B16)野生型和MDR细胞(图3C)的存活力的作用；
图4A-4D显示不同抗抑郁药对神经母细胞瘤SH-SY5T细胞(图4A)、3LL肺癌(图4B)、LN-Cap前列腺细胞(图4C)以及B16黑色素瘤细胞(图4D)的作用；图5显示不同精神药物对小鼠接种3LL肺癌细胞30天后的肺重量的作用；图6A-6F显示环状精神药物对癌细胞系的阿霉素毒性的作用。图6A显示氯氮平诱导的LN-CapAp前列腺细胞的毒性；图6B显示氯米帕明诱导的B16黑色素瘤细胞的毒性，图6C显示氯米帕明诱导的B16-MDR黑色素瘤细胞的毒性；图6D显示帕罗西汀诱导的B16黑色素瘤细胞的毒性；图6E显示氯米帕明诱导的神经母细胞瘤SH-SY5T细胞的毒性；以及图6F显示氟西汀诱导的神经母细胞瘤SH-SY5T细胞的毒性；图6G显示氯氮平诱导的胶质瘤C6细胞系的毒性。
图7显示给药24或48小时后，奋乃静对神经母细胞瘤细胞系凋亡的作用；图8显示硫利达嗪、氯氮平和奋乃静诱导的神经胶质瘤C6细胞中p53基因产物的western印迹分析；图9显示不同抗抑郁药对B-16 MDR黑色素瘤细胞的作用；图10显示接种黑色素瘤B16细胞、于接种后21和27天用硫利达嗪治疗的小鼠的肺重量；图11显示接种黑色素瘤细胞、经饮用水中硫利达嗪治疗的小鼠的肺重量；图12显示接种黑色素瘤细胞、经阿霉素和阿霉素+硫利达嗪(饮用水中)治疗的小鼠的肺重量；图13A-13B显示三环精神药物对角化细胞(包括HaCat细胞(图13A)和HaCatI5细胞)存活力的作用；图14A-14B显示一环、二环和三环精神药物对HaCatI5角化细胞(图14A)或HaCatII4角化细胞(图14B)存活力的作用；图15A-15B显示酚噻嗪；阿霉素和5-FU对HaCat(图15A)和HaCatI5(图15B)角化细胞存活力的作用；
图16显示硫利达嗪对HaCat细胞中DNA片段化的作用。
发明详述实施例1精神药物的治疗能力给予不同细胞系一些酚噻嗪、三环神经安定药和抗抑郁药、二环抗抑郁药、一环抗抑郁药、氟哌啶醇(一种丙基苯基甲酮，butyrophenone)等。利用中性红(NR)、Almar蓝(AB)和Hoechst染料荧光法评价不同细胞系(人神经母细胞瘤(SK-N-SH)和(SH-SY5T)；大鼠恶性胶质瘤(C6)；小鼠黑色素瘤(B-16)、人前列腺(LN-CapAp)；以及PC-3、小鼠肺肉瘤(3LL)和人乳腺(MCF7))的DNA含量，确定细胞毒活性。按每日给药安全剂量与每种药的平均IC50(μM)的比值，计算潜在的治疗能力。结果如下表1A、1B和1C所示。
该结果证明了精神药物抑制癌细胞的增殖的有效性。观察到环状精神药物氯米帕明(三环神经安定药和抗抑郁药)、帕罗西汀(二环神经安定药和抗抑郁药)、以及氟西汀(一环神经安定药和抗抑郁药)(表1B)的特别作用，而其它组精神药物没有实质作用，例如表1C所示。
在原发组织培养物，包括小鼠胚胎全脑培养物、小鼠选择性胚胎、神经元培养物以及大鼠新生肌细胞培养物中测试不同药物，例如奋乃静、氟哌啶醇、氯氮平、利培酮(risperidone)和舒必利(sulpiride)的作用。获得的结果(数据未显示)证明，反应显著下降，全脑组织对测试的全部药物总体缺乏敏感性，IC50＞200μM(奋乃静除外)。神经元和肌细胞培养物的敏感性显示，对奋乃静的IC50分别为60μM和35-55μM。
aIC50值以μM表示
也评价了帕罗西汀对原发组织培养物的作用。图1显示原发小鼠脑、选择的神经元(利用5-氟尿苷(5-Fluorouridine)处理小鼠全脑胚胎培养物获得)以及人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5T)对浓度10μM-100μM帕罗西汀的敏感性比较。处理后24小时，利用中性红(NR)技术确定帕罗西汀处理后细胞的存活力。如图1所示，观察到神经母细胞瘤细胞比原发组织对帕罗西汀的敏感性提高。
此结果连同表1A-1C所示结果表明，肿瘤组织，例如黑色素瘤、神经母细胞瘤、前列腺癌和肺癌，对所测试药物的细胞毒作用的敏感性显著高于其原发组织。
下文各个实施例显示环状精神药物对多种细胞系(前列腺、黑色素瘤和胶质瘤)的效力，支持了表1B的结果。如表1B所示，发现帕罗西汀(二环抗抑郁药)和氟西汀(一环抗抑郁药)对抗这些细胞系非常有效，其效果类似于高效三环抗抑郁药氯米帕明。
实施例2酚噻嗪(三环神经安定药和抗精神病药)对前列腺细胞的作用在雄激素依赖性(LN-Cap)和雄激素非依赖性(PC-3)的两种人前列腺癌细胞系中研究三氟拉嗪和氟哌噻吨的作用。图2A和2B显示这些细胞系与药物(浓度为1μM-100μM)温育的结果，表明两种药物均有效抑制细胞增殖。
实施例3三环神经安定药对各种恶性细胞系的作用将不同浓度(10μM-100μM)的氯氮平应用于不同癌细胞系，包括前列腺(LN-CapAp)、黑色素瘤B16、C6胶质瘤，如上所述确定细胞存活力。
图3A所示结果表明，在氯氮平存在下，所测试细胞系的存活力显著下降。
另一实验测定了相同浓度氯噻平对小鼠肺癌(3LL)细胞存活力的作用。图3B也显示了其它三环精神药物对该细胞系的作用，表明氯噻平也有效降低恶性细胞的存活力。
另一实验将浓度为10μM-100μM的氯氮平应用于小鼠黑色素瘤(B16)野生型和MDR细胞。该实验结果如图3C所示，表明氯氮平有效降低野生型和MDR两种癌细胞的存活力。
实施例4环状抗抑郁药对各种恶性细胞系的作用将不同浓度(10μM-100μM)环状抗抑郁药应用于神经母细胞瘤SH-SY5T、3LL肺癌、前列腺(LN-CapAp)、黑色素瘤B16，如上所述测定细胞存活力。氯米帕明(三环)、丙米嗪(三环)、帕罗西汀(二环)和氟西汀(一环)。图4A-4E显示指定药物对不同细胞系的作用，均显示抑制不同肿瘤存活的显著能力。
实施例5环状精神药物对肿瘤的体内作用使用4周龄雌性C57黑色小鼠评价环状精神药物对肿瘤细胞的体内作用。具体地，将动物分为5组(每组6-8只小鼠)。通过尾静脉i.v.注射，动物接种小鼠Lewis肺癌(3LL，每只50万)，然后每日i.p.注射下列各种药物，处理3周(1)盐水(对照)；(2)硫利达嗪(15mg/kg)；(3)氯米帕明(30mg/kg)；(4)氟西汀(30mg/kg)；以及(5)帕罗西汀(30mg/kg)。
在处理期间，每日检查动物，每周记录体重两次。4周处理期间的存活率为对照8/8，硫利达嗪7/7，氯米帕明7/7，氟西汀5/7(两只动物于第3和第4周死亡，但未发现肺转移或其它肿瘤的迹象)，以及帕罗西汀5/6(一只动物于第3周死亡，没有转移或肿瘤的迹象)。处理4周以后，处死小鼠，解剖其肺并称重。肺重量如图5所示，表明与对照组相比，所有活性剂均有效降低肿瘤大小。
实施例6利用低浓度神经安定药和抗抑郁药致敏阿霉素的细胞毒性实施例6A氯氮平在前列腺LN-Cap细胞中诱导的阿霉素毒性将前列腺LN-Cap细胞分为三组1.单独利用氯氮平处理的细胞(20μM和25μM)。
2.单独利用阿霉素处理的细胞(1μM)3.利用氯氮平和阿霉素(同时给药)按组1和2指定浓度处理的细胞。
图6A显示在前列腺癌细胞系中利用氯氮平诱导的阿霉素(一种广泛用于治疗恶性疾病的细胞毒药物)毒性。具体地，该图所示结果证明，在单独使用氯氮平无效的浓度下，联合使用阿霉素可增强后者对所测试细胞系的毒性。
实施例6B氯米帕明在B16黑色素瘤细胞系中诱导的阿霉素毒性评价三环抗抑郁药氯米帕明对黑色素瘤B16中的阿霉素毒性的作用。
氯米帕明(10、15和20μM)单独或与阿霉素(1、2.5和5μM)联合应用于B16黑色素瘤细胞。图6B所示结果表明，低浓度氯米帕明可有效降低细胞存活力，如果与毒剂阿霉素联合给药，则细胞存活力基本上下降到低于对照的15％。
如果将氯米帕明与阿霉素联合应用于MDR B16黑色素瘤，则细胞存活力以剂量依赖性方式显著下降，证明抗抑郁药对阿霉素的增强作用(图6C)。将帕罗西汀应用于B16黑色素瘤细胞，也观察到同样作用(图6D)。
将氯米帕明(图6E)和氟西汀(图6F)应用于阿霉素抗性的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5T)，也显示以剂量依赖性方式增强阿霉素的毒性。最后，如果将氯氮平应用于神经胶质瘤C6细胞，也显示诱导对这些细胞的阿霉素毒性(图6G)。
实施例7奋乃静对神经母细胞瘤细胞系凋亡的作用神经母细胞瘤细胞系(SK-NSH)给予不同浓度的奋乃静(2.5μM-40μM)。利用装备氩离子激光器(激发波长488nM)和双重分辨模块(doublet discrimination module，DDM)的荧光活化细胞分选仪(FACScan)(Becton and Dickenson，Heidelberg，CA)，通过碘化丙啶染色细胞的流式细胞光度术，测定凋亡细胞的百分比。使用Lysis II(BD)软件进行数据采集。根据先前建议的标准评价凋亡细胞核的变化。
结果如图7所示。可以发现，20μM或更高浓度的奋乃静在24和48小时以后诱导致命的严重凋亡。
实施例8精神药物对p53突变基因表达的作用肿瘤抑制蛋白质p53是涉及维持基因组完整性以及防止细胞增殖的转录因子。在癌症疾病中经常发生p53基因突变，与预后不良、抗性产生以及治疗困难有关。
利用western印迹分析，评价下列药物硫利达嗪、氯氮平和奋乃静对胶质瘤C6细胞系中p53突变基因表达的作用。
图8所示数据表明，三种药物诱导p53突变体表达显著下降，以硫利达嗪(30和60μM)活性最高(平均降低75％)，氯氮平和奋乃静(60μM)平均降低30％。
实施例9环状抗抑郁药对多药耐药性(MDR)肿瘤的作用尽管有些酚噻嗪与某些恶性肿瘤有关，但现有技术一直没有明确表明，酚噻嗪或其它环状精神药物特别适于那些据发现耐受其它细胞毒药物的肿瘤。
也测试了环状抗抑郁药，例如氯米帕明、丙米嗪、氟西汀和帕罗西汀对野生型B16小鼠黑色素瘤和转化的(MDR)B16黑色素瘤细胞的作用。图9所示结果表明，两种细胞系对环状抗抑郁药高度敏感，帕罗西汀、氟西汀、氯米帕明和丙米嗪的IC50水平为15-20μM。
这些结果清楚表明，环状抗抑郁药可以抑制耐受阿霉素的恶性细胞的存活。
实施例10腹膜内给予硫利达嗪的体内研究实施例10(A)使用5-7周龄的雄性C57黑色小鼠。动物通过尾静脉i.v.注射(200,000细胞/小鼠)接种B16黑色素瘤细胞。利用硫利达嗪(2.5、5、10和20mg/kg，i.p.x 3次/周)处理小鼠，接种前一周开始处理，持续到接种以后。在预实验中，注射较高浓度(30、50和100mg/kg)的药物，每周3次，发现毒性导致镇静、呼吸抑制及死亡，从而进行浓度选择。实验期间每周记录三次体重，并登记存活。细胞接种24天后，处死动物，解剖肺并称重。
结果结果(数据未显示)表明，所治疗动物的存活率为2.5mg/kg为4/5；5mg/kg为3/4；10和20mg/kg为5/5。肺重量与硫利达嗪的使用剂量负相关，发现与低剂量2.5mg/kg相比，20mg/kg治疗组的肺重量显著下降(p＝0.05)。没有发现各组体重之间的差异。
实施例10(B)使用5-7周龄雌性C57小鼠，将动物分为3个处理组1.对照接种B16、载体处理；2.硫利达嗪10mg/kg；3.硫利达嗪15mg/kg(i/p注射x 3/周)。
一半动物于21天后处死，一半于27天后。登记肺重量和转移数。
结果21天后，与对照相比，硫利达嗪组的动物显示转移数下降趋势平均转移数为28.5、46.1和53.8+(分别为硫利达嗪15mg/kg、硫利达嗪10mg/kg和对照)。未发现肺重量的差异。实验第27天处死动物，发现硫利达嗪剂量和肺重量之间的反比关系。(平均数对照、硫利达嗪10mg/kg和硫利达嗪15mg/kg分别为685、520和335毫克)。硫利达嗪15mg/kg与对照动物之间的差异显著(p＜0.05)。就转移数而言，对照动物中(6/7)显示融合性肺，硫利达嗪(10mg/kg)也显示6/7小鼠的融合性，硫利达嗪(15mg/kg)只显示2/7小鼠的融合性。获得的结果(数据未显示)如图10所示，表明肠胃外途径给予的硫利达嗪看起来诱导了动物对抗肿瘤(B16黑色素瘤)生长和转移传播的肠胃外活性。该药物也提高了存活率。有效剂量为15-20mg/kg(发现较低剂量没有明显效果)。发现高于30mg/kg的浓度(肠胃外途径)有毒性。
实施例11经口服途径给予硫利达嗪的体内研究实施例11(A)使用5-7周龄的雌性黑色C57小鼠。小鼠接种黑色素瘤B16细胞并随机分组(5-6/笼)。将动物分为三组1.对照，B16无治疗；2.硫利达嗪每日20-30mg/kg；3.硫利达嗪每日30-40mg/kg。
将硫利达嗪溶于饮用水中，形成透明溶液(即低浓度)或很轻度的悬浮液(即高浓度)。每日登记耗水量，根据平均耗水量计算剂量。登记体重，3次/周。
结果该药的耐受良好，所有动物均未观察到副作用或行为改变。24、27和30天以后处死动物。24天以后，对照小鼠仅1/7具有大的或团状转移，在20-30mg/kg治疗组发现相同的比例。较高浓度组未发现大的或融合性转移。在随后的尸检中发现第27和30天对照和硫利达嗪处理组之间的显著差异对照B16接种小鼠的平均肺重量为583.4和487.6mg，而硫利达嗪(Thio)组的平均肺重量为258.0、209.4、338.8和329.6mg。发现6/11对照动物以及0/21Thio处理小鼠中融合性转移。也发现Thio处理动物中较小、较少的转移。在实验期间，5/18的对照以及2/36的Thio处理小鼠发生自然死亡。在健康对照、B16对照以及硫利达嗪处理的小鼠之间，没有发现体重差异。肺重量的结果如图11所示，以及饮用水中给予硫利达嗪(40-50mg/kg)的小鼠的存活。
口服给予小鼠硫利达嗪(20-40mg/kg/天)，抑制肿瘤(B16黑色素瘤)生长、转移传播并提高存活率。
该药(经口服给药)的耐受良好，未观察到副作用。
实施例12经口服途径联合给予硫利达嗪和阿霉素的体内研究使用5-7周龄的雌性黑色C57小鼠。小鼠接种黑色素瘤B16细胞并随机分组(7-8/笼)。将动物分为三组1.对照，B16细胞无治疗；2.给予一次阿霉素4mg/kg i.p处理(3天后)。
3.利用阿霉素(4mg/kg)和硫利达嗪25-35mg/kg/天(经由饮用水)处理。
结果对照和硫利达嗪+阿霉素组的所有动物均存活。接种7和14天以后，阿霉素组中2/7动物死亡。21天以后处死动物，解剖肺称重，计算转移数。B16对照的肺重量为770+/-95mg，阿霉素为538+/-137mg，而联合组为381+/-95mg。联合组显示非融合性肺的动物数最多，为5/7，阿霉素为2/7，而B16对照组为0/7。
以下图12和表2分别显示不同小鼠的肺重量和转移状态。
表2阿霉素和硫利达嗪联合治疗对肺转移的作用
这些结果证明，联合使用硫利达嗪和阿霉素可防止转移扩散，并提高阿霉素对存活和肿瘤生长的作用。
实施例13精神药物对增殖性皮肤病的作用A.体外对细胞存活的作用材料与方法利用三种永生的人角化细胞系为增殖性疾病模型HaCat(自发永生化、非致瘤性人皮肤角化细胞系)、HaCat 15(良性、致瘤性)以及HaCat II-4RT(恶性、致瘤性)。如Bachmeier BE等人所述维持细胞(Bachmeier BE等人，Biol.Chem 381(5-6)509-516(2000))。利用不同种类的精神药物处理细胞，例如酚噻嗪(例如硫利达嗪、奋乃静)、三环神经安定药(例如氯氮平)、三环抗忧郁药(例如氯米帕明、丙米嗪、多塞平)、二环抗抑郁药(例如帕罗西汀)、一环抗抑都药(例如氟西汀)。按5-100μM浓度给予药物，给药后24小时，利用中性红染色测定细胞存活。按等摩尔浓度与两种常用抗癌剂(阿霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU))比较，评价药物针对细胞系存活的效力。
结果不同药物显示诱导对三种不同角化细胞系的显著剂量依赖性抑制活性(图13A和13B)。如这些图形所示，硫利达嗪(酚噻嗪)、氯米帕明(三环抗忧郁药)、帕罗西汀(一环抗抑郁药)和氟西汀(二环抗抑郁药)显示有效降低细胞存活，即抑制各种细胞系的细胞增殖。
还评价了HaCat II-4RT恶性致瘤细胞系对不同药物的敏感性，显示其敏感性高于非恶性(I5)细胞或非致瘤性HaCat细胞，后者显示其非敏感性与I5细胞系类似。表3和图14A、图14B概括了不同药物对三种角化细胞系活性的IC50值。
表3
如表3所示9-100μM的活性药物获得的IC50值，认为更具活性药物的IC50值为10-30μM。
在HaCat和HaCat I5细胞中，测试阿霉素和5-FU与硫利达嗪相比的反应性(分别为图15A和15B)，两种细胞系对硫利达嗪的反应敏感性相似，但是抗5-FU，只有HaCat(非致瘤性)细胞对阿霉素和硫利达嗪的反应具有相同的等摩尔IC50水平。
B.对DNA片段化的作用根据Vindelov等人的方法(Vindelov，L.L.等人，Cytometry.5323-327(1983))，利用荧光活化细胞分选仪(FACScan，Bectonand Dickenson，CA)，通过碘化丙啶染色细胞的流式细胞术分析，测定DNA片段化。在25和50μM硫利达嗪处理的HaCat和HaCat I5细胞(每个样品500,000和1,000000个细胞)中进行研究。
HaCat细胞显示基本片段化比率为29％，但利用硫利达嗪处理以后，片段化的比率分别提高到82.8％(25μM)和89.3％(50μM)的水平。
I5细胞系的基本凋亡仅为10.23％，接触硫利达嗪以后，凋亡分别增加到74.5％(25μM)和76.6％(50μM)(参见图16)。
这些结果提示，硫利达嗪对增殖性皮肤细胞存活力的抑制作用由凋亡机制的标志-DNA片段化增强介导。
C.局部给予硫利达嗪乳膏对银屑病患者的作用三名患有银屑病、但没有任何精神病的受试者，利用包含硫利达嗪的乳膏治疗银屑病。在蒸馏水中(1.5ml)溶解硫利达嗪(3mg)，制备硫利达嗪乳膏。然后将该混合物加入标准(aqueosum)eucerinum制剂(30g)中，彻底混合，直至获得均质的乳膏。
受试者1一名18岁男性患者，自4岁起患有局部性银屑病，结垢(scaling)和红斑主要位于肘和膝(但其它方面健康，并且没有精神紊乱或症状)。该受试者对局部性类固醇的反应差。几个月不经任何治疗以后，该受试者皮肤的银屑病区域每天两次施用乳膏。
甚至在治疗几天以后，皮肤的结垢和红斑显著减少，该受试者每日用乳膏如上所述不断治疗，皮肤的状况持续一年改善。另外，该治疗有效减少了局部损害的大小。
停止治疗(14天)以后，观察到银屑病的损害显著恶化，恢复治疗后再次消失。
受试者2一名60岁的健康男性受试者，背部和手掌患有局部银屑病(但其它方面健康，并且没有精神紊乱或症状)，每日利用硫利达嗪乳膏治疗两次。治疗四个月以后，观察到结垢和红斑减少。停止治疗导致银屑病症状复发。
两名受试者均未观察到治疗副作用。
权利要求
1.治疗增殖性疾病的方法，其包含给予有此需要的受试者治疗有效量的至少一种活性成分，该活性成分为选自三环神经安定药和抗精神病药、二环抗抑郁药和一环抗抑郁药的环状精神药物，条件是，该三环神经安定药和抗精神病药不是酚噻嗪或噻吨，并且若该活性成分是一环抗抑郁药，则该增殖性疾病不是前列腺癌。
2.权利要求1的方法，其中所述的三环神经安定药和抗精神病药是二苯并噻平、二苯并氮、二苯并硫氮、二苯并二氮或二苯并氧氮的衍生物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述的三环神经安定药和抗精神病药是氯氮平或氯噻平。
4.权利要求1的方法，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
5.权利要求1的方法，其中所述的一环抗抑郁药是苯丙胺的衍生物。
6.权利要求5的方法，其中所述的一环抗抑郁药是选自托莫西汀、尼索西汀和氟西汀的苯氧基-3-丙胺衍生物。
7.权利要求6的方法，其中所述的一环抗抑郁药是氟西汀。
8.权利要求1的方法，其中所述的增殖性疾病是癌。
9.权利要求8的方法，其中所述癌选自神经母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多药耐药性(MDR)癌、肺癌、乳腺癌以及与突变的p53基因有关的癌。
10.权利要求9的方法，其中所述的治疗包含与细胞毒药物联合给予所述的活性成分。
11.权利要求10的方法，其中所述细胞毒药物是阿霉素。
12.权利要求1的方法，其包含肠胃外给予所述的活性成分。
13.权利要求12的方法，其中所述的肠胃外给药包括静脉内、皮下、肌内、髓内或直接注射。
14.权利要求1的方法，其包含口服给予所述的活性成分。
15.使增殖性细胞对细胞毒药物敏感的方法，其包含将适量的所述的细胞毒药物与致敏量的至少一种精神药物联合给予有此需要的受试者，条件是，所述的精神药物不是吩噻嗪或噻吨。
16.权利要求15的方法，其中所述的精神药物为环状神经安定药和抗精神病药或环状抗抑郁药。
17.权利要求16的方法，其中所述的环状神经安定药和抗精神病药是选自氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪的三环化合物。
18.权利要求17的方法，其中所述的环状抗抑郁药是选自氯氮平和氯噻平三环化合物。
19.权利要求16的方法，其中所述的环状抗抑郁药是帕罗西汀。
20.权利要求15的方法，其中所述的细胞毒药物是阿霉素。
21.使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的方法，其包含将一定量的所述的细胞类药物与致敏量的至少一种精神药物联合给予有此需要的受试者。
22.使MDR癌细胞对阿霉素敏感的方法，其包含将一定量的阿霉素与致敏量的至少一种选自氯氮平、氯米帕明、氟西汀和帕罗西汀的精神药物联合给予有此需要的受试者。
23.使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的方法，其包含将一定量的所述的细胞毒药物与致敏量硫利达嗪联合给予有此需要的受试者。
24.权利要求15、21-23中任一项的方法，其包含肠胃外给予所述的活性成分。
25.权利要求24的方法，其中所述的肠胃外给药包括静脉内、皮下、肌内、髓内或直接注射。
26.利要求15、21-23中任一项的方法，其包含口服给予所述的活性成分。
27.治疗与精神病症状无关的增殖性皮肤病的方法，其包含给予有此需要的受试者治疗有效量的至少一种精神药物。
28.权利要求27的方法，其中所述的增殖性皮肤病选自银屑病、过度角化症和基底细胞癌。
29.权利要求27的方法，其中精神药物是酚噻嗪。
30.权利要求29的方法，其中所述的酚噻嗪选自硫利达嗪、奋乃静和氟奋乃静。
31.权利要求27的方法，其中所述的精神药物是三环抗抑郁药。
32.权利要求31的方法，其中所述的三环抗抑郁药选自氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪。
33.权利要求27的方法，其中所述的精神药物是二环抗抑郁药。
34.权利要求33的方法，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
35.权利要求26的方法，其中所述的精神药物是一环抗抑郁药。
36.权利要求35的方法，其中所述的一环抗抑郁药是氟西汀。
37.权利要求27的方法，其中所述的活性成分局部应用于疾病皮肤细胞。
38.权利要求27的方法，其中该活性成分局部应用于病变的皮肤细胞。
39.治疗增殖性疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种活性成分和药学可接受的载体，所述的活性成分为选自三环神经安定药和抗精神病药、二环抗抑郁药和一环抗抑郁药的环状精神药物，条件是，所述的三环神经安定药和抗精神病药不是酚噻嗪或噻吨，若该活性成分是一环抗抑郁药，则该增殖性疾病不是前列腺癌。
40.权利要求39的组合物，其中所述的三环神经安定药和抗精神病药是二苯并噻平、二苯并氮、二苯并硫氮、二苯并二氮或二苯并氧氮的衍生物。
41.权利要求39或40的组合物，其中所述的三环神经安定药和抗精神病药是氯氮平或氯噻平。
42.权利要求39的组合物，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
43.权利要求39的组合物，其中所述的一环抗抑郁药是苯丙胺衍生物。
44.权利要求43的组合物，其中所述的一环抗抑郁药是选自托莫西汀、尼索西汀和氟西汀的苯氧基-3-丙胺衍生物。
45.权利要求44的组合物，其中所述的一环抗抑郁药是氟西汀。
46.权利要求39的组合物，其中所述的增殖性疾病是癌。
47.权利要求46的组合物，其中所述的癌选自神经母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多药耐药性(MDR)癌、肺癌、乳腺癌以及与突变的p53基因有关的癌。
48.权利要求39的组合物，其包含细胞毒药物。
49.权利要求48的组合物，其中所述的细胞毒药物是阿霉素。
50.权利要求39的组合物，其为适合肠胃外给药的剂型。
51.权利要求50的组合物，其为适合静脉内、皮下、肌内、髓内或直接注射的剂量。
52.权利要求39的组合物，其为适合口服给药的剂型。
53.使增殖性细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物，其包含一定量的所述细胞毒药物、致敏量的精神药物以及药学可接受的载体，附带条件是，所述的精神药物不是吩噻嗪或噻吨。
54.权利要求53的组合物，其中所述的精神药物为环状神经安定药和抗精神病药或环状抗抑郁药。
55.权利要求54的组合物，其中所述的环状神经安定药和抗精神病药是选自氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪的三环化合物。
56.权利要求55的组合物，其中所述的环状药物是选自氯氮平和氯噻平三环化合物。
57.权利要求53的组合物，其中所述的环状抗抑郁药是帕罗西汀。
58.权利要求53的组合物，其中所述的细胞毒药物是阿霉素。
59.使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物，其包含一定量的所述细胞毒药物连同致敏量的至少一种精神药物。
60.使MDR癌细胞对阿霉素敏感的药物组合物，其包含一定量的阿霉素以及致敏量的至少一种选自氯氮平、氯米帕明、氟西汀和帕罗西汀的精神药物。
61.使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物，其包含一定量的所述的细胞毒药物、致敏有效量的硫利达嗪以及药学可接受的载体。
62.权利要求53或60-61中任一项的组合物，其中所述的药学可接受的载体适于肠胃外给药。
63.权利要求62的组合物，其为适合静脉内、皮下、肌内、髓内或直接注射的剂型。
64.权利要求53或60-61中任一项的组合物，其为适合口服给药的剂型。
65.治疗与精神病症状无关的增殖性皮肤病的药物组合物，其包含治疗有效量的精神药物以及药学可接受的载体。
66.权利要求65的组合物，其中所述的增殖性皮肤病选自银屑病、过度角化症和基底细胞癌。
67.权利要求65的组合物，其中精神药物是酚噻嗪。
68.权利要求67的组合物，其中所述的酚噻嗪选自硫利达嗪、奋乃静和氟奋乃静。
69.权利要求65的组合物，其中所述的精神药物是三环抗抑郁药。
70.权利要求69的组合物，其中所述的三环抗抑郁药选自氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪。
71.权利要求65的组合物，其中所述的精神药物是二环抗抑郁药。
72.权利要求71的组合物，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
73.权利要求65的组合物，其中所述的精神药物是一环抗抑郁药。
74.权利要求73的组合物，其中所述的一环抗抑郁药是氟西汀。
75.权利要求65的组合物，其中所述的药学可接受的载体适合于在过度增殖的皮肤上局部应用该组合物。
76.选自三环神经安定药和抗精神病药、二环抗抑郁药以及一环抗抑郁药的环状精神药物的用途，用于制备治疗增殖性疾病的药物组合物，条件是，该三环神经安定药和抗精神病药不是酚噻嗪或噻吨，若所述的活性成分是一环抗抑郁药，则所述的增殖性疾病不是前列腺癌。
77.权利要求76的用途，其中所述的三环神经安定药和抗精神病药是二苯并噻平、二苯并氮、二苯并硫氮、二苯并二氮或二苯并氧氮的衍生物。
78.权利要求76或77的用途，其中所述的三环神经安定药和抗精神病药是氯氮平或氯噻平。
79.权利要求76的用途，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
80.权利要求76的用途，其中所述的一环抗抑郁药是苯丙胺衍生物。
81.权利要求80的用途，其中所述的一环抗抑郁药是选自托莫西汀、尼索西汀和氟西汀的苯氧基-3-丙胺衍生物。
82.权利要求81的用途，其中所述的一环抗抑郁药是氟西汀。
83.权利要求76的用途，用于制备治疗癌的药物组合物。
84.权利要求83的方法，其中所述的癌选自神经母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多药耐药性(MDR)癌、肺癌、乳腺癌以及与突变的p53基因有关的癌。
85.精神药物的用途，用于制备使增殖性细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物，条件是，该精神药物不是酚噻嗪或噻吨。
86.权利要求85的方法，其中所述的精神药物为环状神经安定药和抗精神病药或环状抗抑郁药。
87.权利要求86的用途，其中所述的环状神经安定药和抗精神病药是三环化合物。
88.权利要求87的用途，其中所述的三环化合物是氯氮平、氯米帕明。
89.权利要求86的用途，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
90.权利要求85的用途，其中所述的细胞毒药物是阿霉素。
91.精神药物的用途，用于制备使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物。
92.精神药物的用途，用于制备使MDR癌细胞对阿霉素敏感的药物组合物，其中所述的精神药物选自氯氮平、氯米帕明、氟西汀和帕罗西汀。
93.硫利达嗪的用途，用于制备使MDR癌细胞对细胞毒药物敏感的药物组合物。
94.精神药物的用途，用于制备治疗与精神病症状无关的增殖性疾病的药物组合物。
95.权利要求94的用途，其中所述的增殖性皮肤病选自银屑病、过度角化症和基底细胞癌。
96.权利要求94的用途，其中所述的精神药物是酚噻嗪。
97.权利要求96的用途，其中所述的酚噻嗪选自硫利达嗪、奋乃静和氟奋乃静。
98.权利要求94的用途，其中所述的精神药物是三环抗抑郁药。
99.权利要求98的用途，其中所述的三环抗抑郁药选自氯米帕明、阿米替林、多塞平和丙米嗪。
100.权利要求99的用途，其中所述的精神药物是二环抗抑郁药。
101.权利要求100的用途，其中所述的二环抗抑郁药是帕罗西汀。
102.权利要求101的用途，其中所述的精神药物是一环抗抑郁药。
103.权利要求102的用途，其中所述的一环抗抑郁药是氟西汀。
全文摘要
本发明涉及通过给予有此需要的受试者治疗有效量的至少一种精神药物，而治疗细胞过度增殖相关疾病的方法。本发明发现精神药物有效抗击的特定增殖性疾病为肿瘤，包括多药耐药性肿瘤以及皮肤细胞过度增殖相关疾病，例如银屑病和过度角化症。
文档编号A61P43/00GK1501797SQ01821739
公开日2004年6月2日 申请日期2001年11月29日 优先权日2000年11月29日
发明者I·吉尔-阿德, A·魏茨曼, I 吉尔-阿德, 穆 申请人:特拉维夫大学拉莫特有限公司