多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白及其诊断和治疗用途的制作方法

专利名称：多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白及其诊断和治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明一般性涉及肠螺旋体病领域。具体而言，本发明涉及命名为Bpmp-72的多毛结肠短螺旋体(Brachyspira Pilosicoli)新72kDa外膜蛋白的氨基酸序列以及编码它的核苷酸序列。更具体而言，本发明涉及这些序列在动物物种(包括鸟类)和人中针对多毛结肠短螺旋体感染(肠螺旋体病)的预防(“接种疫苗”)和治疗方法的用途。本发明还涉及基于血清学和分子生物学诊断被多毛结肠短螺旋体定居的动物和人。最后，本发明涉及来自本申请中所述核苷酸和氨基酸序列的预防、治疗和诊断组合物。
背景技术：
肠螺旋体病(IS)(也称为结肠螺旋体病或螺旋体腹泻)是限制猪以及成年蛋鸡和肉种鸡产量的重要疾病。IS由大肠感染肠螺旋体多毛结肠短螺旋体(以前的蛇状螺旋体(Serpulina))引起。该螺旋体还感染大量其他动物物种，包括狗和人类。其相关疾病在猪中的了解和研究最多。
澳大利亚养猪业中感染的患病率并不明确，但在欧洲和斯堪地那维亚(Scandinavia)的研究显示30％或更多的猪群发生感染。相关疾病为具有间歇性腹泻的结肠炎/盲肠炎和生长率降低。该疾病在猪中的经济重要性尚不清楚，但可能很重要，因为尽管它比猪痢疾的病症轻，但是一般发病率要高得多。
多毛结肠短螺旋体还普遍感染成鸡。在澳大利亚最近的调查中，从43％的肉种鸡群和68％的蛋鸡群中回收到了肠螺旋体，多毛结肠短螺旋体是与这些菌群中44％的亚群相关的螺旋体。感染群排泄物的湿度平均比未感染群高14％。用从该研究中分离的多毛结肠短螺旋体实验性感染肉种鸡引起产蛋起始的显著延后和蛋产量的持续降低。除了蛋鸡以外，肉种鸡群中蛋产量的损失可对整个肉鸡业产生相当的破坏。这些问题的代价难以预计，但该工业在澳大利亚非常重要。鸡肉业生产零售价25亿美元的肉，而蛋业生产价值3.4亿美元的蛋。
多毛结肠短螺旋体作为狗和其他动物病原体的角色尚未完全证实，尽管其似乎能够取决于大量其他因素而在较大或较小的程度上影响健康。多毛结肠短螺旋体还感染大量发展中国家人口。在发达国家中，感染主要局限于无免疫应答的个体和同性恋男性中。它已被记录为老人和/或无免疫应答的个体中螺旋体血症的病因。多毛结肠短螺旋体对这些人群的致病影响的完整程度仍有争论。
很少尝试研发控制多毛结肠短螺旋体感染的方法。当猪舍中鉴定出IS问题时，例行用抗菌剂对动物进行治疗，尽管该疾病易于在撤除治疗后复发。然而，在鸡中对该疾病的了解并不深入，养鸡业尚未具体尝试控制感染。
在猪中控制IS的疫苗的用途仅有一项有记录的研究，且该自身菌苗没能提供保护(Hampson DJ，Robertson ID、La T，Oxberry SL和Pethick DW(2000)Influences of diet and vaccination on colonization of pigs by theintestinal spirochaete Brachyspira(Serpulina)pilosicoli.VeterinaryMicrobiology 7475-84)。尽管如此，由于螺旋体对大肠粘膜具有特异性的末端粘附，可能可以通过适当的疫苗所诱导的免疫来减弱或阻止定居。
本发明提供先前未鉴定过的新多毛结肠短螺旋体氨基酸序列及编码它的多核苷酸序列。
发明概述我们已鉴定了本文中称为多毛结肠短螺旋体膜蛋白72(Bpmp-72)的新氨基酸序列及其特别适于与肠道螺旋体病相关的诊断、预防和治疗目的的氨基酸片段。我们还鉴定了编码Bpmp-72氨基酸序列的多核苷酸序列。
因此，本发明提供Bpmp-72氨基酸序列，其含有SEQ ID NO2中所展示序列或与其基本同源的氨基酸序列或SEQ ID NO2氨基酸序列片段。在本发明的一个优选实施方案中提供了选自SEQ ID NO3至SEQ ID NO22的Bpmp-72氨基酸序列片段。
本发明还提供Bpmp-72多核苷酸序列(SEQ ID NO1)或其同源物。Bpmp-72多核苷酸序列优选选自(a)含有SEQ ID NO1中公开的多核苷酸序列或其片段的多核苷酸序列；(b)含有能与SEQ ID NO1中公开的多核苷酸序列或其片段选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸序列；(c)由于遗传密码与(a)或(b)中定义的序列简并的多核苷酸序列，或(d)与(a)、(b)或(c)的序列互补的多核苷酸序列。
还提供了可与本发明多核苷酸序列杂交的可检测标记的核苷酸序列，包括可与Bpmp-72多核苷酸序列的编码或非编码区杂交的核苷酸序列。本发明还提供如SEQ ID NO24和SEQ ID NO27至SEQ ID NO37中公开的用于扩增编码Bpmp-72的多毛结肠短螺旋体基因组DNA的寡核苷酸引物。
本发明提供的载体含有本发明的Bpmp-72多核苷酸序列。优选地，载体为克隆或表达载体。当载体为表达载体时，其优选含有与表达控制序列有效连接的Bpmp-72多核苷酸序列。
还提供了用本发明的多核苷酸序列或上文所述载体转化或转染的细胞。优选的细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或组织培养中的猪细胞。
本发明还提供制备Bpmp-72氨基酸序列的方法，所述方法包括(a)在提供表达Bpmp-72氨基酸序列的条件下培养如上文所述的细胞；和(b)回收表达的Bpmp-72氨基酸序列。该程序还可以伴随以下步骤(c)在Ni螯合柱上层析氨基酸序列；和(d)通过凝胶过滤纯化氨基酸序列。
本发明还提供对本发明的氨基酸序列具有特异性的标记和非标记的单克隆和多克隆抗体，以及产生本发明单克隆抗体的永生细胞系。本发明的抗体制备包括(a)将Bpmp-72氨基酸序列与载体蛋白缀合；(b)将步骤(a)的Bpmp-72氨基酸片段-载体蛋白缀合物与佐剂混合来免疫动物；和(c)从免疫的宿主动物获得Bpmp-72特异性抗体。
本发明还提供检测生物样品中短螺旋体(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)存在与否的方法，所述方法包括(a)在适当的杂交条件下使生物样品与含有本发明Bpmp-72多核苷酸序列的探针或引物接触；和(b)检测探针或引物与样品中核苷酸序列之间形成的任何双链体。
本发明提供测定样品中存在的Bpmp-72氨基酸序列的方法，包括(a)在允许形成反应复合物的条件下使怀疑含有Bpmp-72氨基酸序列的样品与特异性结合Bpmp-72氨基酸序列的抗体接触；和(b)检测反应复合物的形成，其中检出形成的反应复合物表示样品中存在Bpmp-72氨基酸序列。
本发明还提供检测生物样品中肠螺旋体病抗体的方法，其中包括(a)提供Bpmp-72氨基酸序列或其片段；(b)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品与所述氨基酸序列孵育；和(c)检测所述抗体-抗原复合物。
相应地提供了评估生物样品中Bpmp-72氨基酸序列水平的体外方法，包括(a)根据上文提到的方法检测生物样品中形成的反应复合物；和(b)评估形成的反应复合物的量，其量对应于生物样品中Bpmp-72氨基酸序列的水平。
另外，还提供了监控动物宿主中与短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)相关疾病的治疗方法的体外方法，所述方法包含如上文所述评估在不同时间点取自接受该治疗方法的动物宿主的一系列生物样品中Bpmp-72氨基酸序列的水平。
本发明还公开了本发明的多核苷酸序列以及可与编码本发明Bpmp-72氨基酸序列的多核苷酸杂交的反义核酸序列在生产调控与短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)相关疾病的药物中的用途。
另外，本发明提供药物或治疗组合物或试剂(包括但不仅限于预防、改善或治疗与包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体的短螺旋体物种相关的肠螺旋体病的疫苗)，其包含(a)至少一段本文所述的Bpmp-72氨基酸序列或至少一段本文所述的核苷酸序列或与上述序列之一特异性结合的抗体；和(b)一种或多种可药用载体和/或赋形剂。
本发明还提供本发明的多核苷酸、氨基酸序列和/或抗体在疗法中的用途。还提供治疗由肠螺旋体病表征的疾病的方法，其方法包括对需要治疗的动物施用有效剂量的本发明多核苷酸、氨基酸序列或抗体。另外，本发明提供预防性治疗动物以阻止肠螺旋体病或至少使其降到最低的方法，所述方法包括以下步骤对动物施用有效量的多核苷酸、多肽、抗体或含有一种或多种这些生物分子的药物组合物。
另外，本发明提供筛选能够通过与Bpmp-72核苷酸或氨基酸序列直接或间接相互作用来调控短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)生物活性的药物的方法。通过这些方法鉴定出的物质可以用于治疗肠螺旋体病的方法中。
本发明还提供用于筛选怀疑感染短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)的动物或确认动物已感染短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的试剂盒，所述试剂盒至少含有与使用说明书一起包装于适当容器内的与Bpmp-72多核苷酸序列的一部分互补的多核苷酸序列。在另一种形式中，本发明提供用于(a)筛选怀疑感染短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的宿主动物或(b)确认宿主动物已感染短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的试剂盒，所述试剂盒至少含有包装于适当容器内的Bpmp-72氨基酸序列或其片段或与上述序列结合的抗体及其使用说明书。
综述以下说明并参考以下的阐释性附图，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图简述

图1用多毛结肠短螺旋体外膜蛋白对吸收的超免疫猪血清(AHPS)进行Western印迹分析。泳道1，分子量标记物；泳道2，多毛结肠短螺旋体95/1000。箭头指示72kDa蛋白(Bpmp-72)。
图2用表达截短的多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白的大肠杆菌细胞对吸收的超免疫猪血清(AHPS)进行Western印迹分析。泳道1-分子量标记物；泳道2-AHP1；泳道3-AHP2；泳道4-AHP3；泳道5-AHP4；泳道6-AHP5；泳道7-AHP6；泳道8-多毛结肠短螺旋体95/1000外膜蛋白。箭头指示34kDa截短蛋白。
图3Bpmp-72的核苷酸序列。
图4克隆进pTrcHis大肠杆菌表达载体的Bpmp-72基因(图中标为Omp-72)的多个区域的载体图。pTrc-Bpmp-72(A；6081bp)、pTrc-Bpmp-72N(B；5518bp)和pTrc-bpmp-72C(C；5171bp)构建体分别表达全长Bpmp-72、Bpmp-72的N端部分和Bpmp-72的C端部分。所有载体构建自同一载体主链并仅在克隆进表达盒的Bpmp-72区存在差异。
图5天然Bpmp-72(图中标为Omp-72)和重组Bpmp-72C端部分(His6-Bpmp-72C)的Western印迹分析。泳道1-分子量标记物；泳道2-纯化的His6-Bpmp-72C；泳道3-来自多毛结肠短螺旋体95/1000的天然Bpmp-72C；泳道4-来自多毛结肠短螺旋体Csp1的天然Bpmp-72C，箭头指示天然和重组的Bpmp-72蛋白。
图6使用N-NTA层析纯化的不同批次的重组His6-Bpmp-72的SDS-PAGE分析。使用同一方法表达和纯化所有批次的重组蛋白。泳道1-分子量标记物；泳道2到9-纯化的His6-Bpmp-72C批次1-6。箭头指示重组的His6-Bpmp-72C蛋白。
图7用多毛结肠短螺旋体攻击前后未接种鸡针对重组His6-Bpmp-72C的全身抗体效价(ELISA)。使用纯化的His6-Bpmp-72C作为包被抗原用ELISA检测循环抗体。
图8用重组His6-Bpmp-72C接种鸡，并随后用多毛结肠短螺旋体攻击后的全身抗体效价(ELISA)。对所有禽肌内给予100μg蛋白质并之后通过口服1mg进行加强。用纯化的His6-Bpmp-72C作为包被抗原用ELISA检测循环抗体。
图9用重组His6-Bpmp-72C接种鸡，并随后用多毛结肠短螺旋体攻击后的全身抗体效价(ELISA)。对所有禽肌内给予1mg蛋白质并之后通过口服1mg进行加强。用纯化的His6-Bpmp-72C作为包被抗原用ELISA检测循环抗体。
图10取自肌内给予100μg重组His6-Bpmp-72C随后口服1mg蛋白质的鸡的混合血清的Western印迹分析。在每个采样时间混合取自三只鸡的血清。使用的抗原为攻击所使用多毛结肠短螺旋体菌株的全细胞提取物。泳道1-实验A1的接种鸡(阳性对照)；泳道2-4-为21-23号鸡；泳道5-7-为24-26号鸡；泳道8-10-为27-29号鸡；泳道11-13-为30-32号鸡；泳道14-16-为33-35号鸡。每个三份包括在接种前、攻击前和攻击后连续采样的血清。分子量标记物以kDa显示。箭头指示多毛结肠短螺旋体天然72kDa蛋白质。
图11取自肌内给予1mg重组His6-Bpmp-72C随后口服1mg蛋白质的鸡的混合血清的Western印迹分析。在每个采样时间混合取自三只鸡的血清。使用的抗原为攻击所使用多毛结肠短螺旋体菌株的全细胞提取物。泳道1-实验A1的接种鸡(阳性对照)；泳道2-4-为36-38号鸡；泳道5-7-为39-41号鸡；泳道8-10-为42-44号鸡；泳道11-13-为45-47号鸡；泳道14-16-为48-50号鸡。每个三份包括在接种前、攻击前和攻击后连续采样的血清。分子量标记物以kDa显示。箭头指示多毛结肠短螺旋体天然72kDa蛋白质(Bpmp-72)。
图12用重组His6-Bpmp-72C接种并随后用多毛结肠短螺旋体攻击后鸡的小肠和结肠粘膜抗体效价(ELISA)。1-19号禽未接种，21-35号禽肌内给予100μg蛋白质随后口服1mg蛋白质，36-50号禽肌内给予1mg蛋白质随后口服1mg。以纯化的His6-Bpmp-72C作为包被抗原用ELISA检测循环抗体。
图13用重组His6-Bpmp-72C接种并用多毛结肠短螺旋体攻击的鸡的粘膜抗体Western印迹分析。使用的抗原为攻击所使用多毛结肠短螺旋体菌株的全细胞提取物。泳道1-3-小肠抗体；泳道4-17-结肠抗体泳道1-为27号鸡；泳道2-为40号鸡；泳道3-为48号鸡；泳道4-5-为23-24号鸡；泳道6-为27号鸡；泳道7-9-为34-36号鸡；泳道10-13-为38-41号鸡；泳道14-15-为43-44号鸡；泳道16-为48号鸡；泳道17-为50号鸡；泳道18-实验A1中接种的鸡(阳性对照)。21-35号鸡肌内给予100μg蛋白质随后口服1mg蛋白质。36-50号鸡肌内给予1mg蛋白质随后口服1mg蛋白质。分子量标记物以kDa显示。箭头指示多毛结肠短螺旋体天然72kDa蛋白质(Bpmp-72)。
本发明详细的公开内容一般描述本领域技术人员会理解，本文所述的发明可以进行除具体描述以外的改变和修饰。应该理解，本发明包括所有这些改变和修饰。本发明还单独或共同包括说明书中涉及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物以及任意两种或更多步骤或特征的任意和全部组合。
本文所述的具体实施例仅用于示例目的，而非限制本发明的范围。如本文所述，功能性等价产物、组合物和方法明确包含于本发明的范围内。
本说明书中包括的包含核苷酸和氨基酸序列信息的序列标识号(SEQID NO)集中于本说明书的末尾，所述序列标识号使用PatentIn程序3.2版制订。在序列表中每一核苷酸和氨基酸序列通过数字指示<210>后的序列标识进行标识(如<210>1、<210>2等等)。每一核苷酸或氨基酸序列的长度、序列类型和来源生物分别通过数字<211>、<212>和<213>中提供的信息进行标示。说明书中指出的核苷酸和氨基酸序列通过数字指示区<400>之后的序列标识(如<400>1、<400>2等等)中提供的信息进行定义。
本文引用的所有出版物(包括专利、专利申请、杂志文章、实验室手册、书籍或其他文件)的完整公开内容在本文中引为参考文献。并不承认任何参考文献构成现有技术或本发明相关领域技术人员的普遍常识部分。
本文中使用的术语“衍生”和“来自”应理解为表示可以从特定来源中获得(尽管不必需直接从该来源获得)的具体事物。
在本说明书中，除非其上下文另有要求，术语“含有”应理解为指包含所述事物或事物组，但不排除其他事物或事物组。
本文中选择使用的术语的其他定义可见于本发明的详细描述中，并可应用于整篇申请中。除非另外定义，本文使用的所有其他科学和技术术语具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同含义。
发明详述本发明涉及鉴定Bpmp-72氨基酸序列，包括其变体和片段以及编码所述序列的多核苷酸序列。
通过筛选多毛结肠短螺旋体λ噬菌体基因组文库，从多毛结肠短螺旋体中分离Bpmp-72氨基酸序列。通过该筛选方法发现了六个克隆，命名为Ahp 1-6。这些克隆均产生表观分子量为34kDa的普通蛋白质，所有这些蛋白质均与吸收的超免疫的猪血清强烈反应。对一个克隆的测序鉴定出了具有29.4kDa编码容量的783个碱基对的局部开放读码框(ORF)。该局部ORF可能编码多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白的羧基端部分。
对Bpmp-72进行SWISS-PROT数据库同源性检索鉴定出该蛋白质与蚀疮溃疡密螺旋体(Treponema phagedenis)和苍白密螺旋体(Treponemapallidum)的密螺旋体膜蛋白B(TmpB)之间具有约5％的同源性(表1)。这些蛋白质与外膜相关，并可能作为孔蛋白或大分子的转运蛋白。用GenBank核苷酸数据库对Bpmp-72核苷酸序列进行比较未显示出与其他细菌基因的强同源性。
表1

对Bpmp-72多核苷酸序列的分析揭示了多毛结肠短螺旋体基因组DNA的1009个碱基对的插入物(图3)。插入DNA的序列分析显示了从碱基1到783的783个碱基对的潜在局部ORF，所述潜在局部ORF具有推定的ATG起始密码子和TAA终止密码子。对剩余基因的进一步克隆和测序表明Bpmp-72的编码序列大小为1692个核苷酸。在ATG起始密码子的上游鉴定出了潜在的Shine-Dalgarno核糖体结合位点(AGGAG)和推定的-10(TAATAT)及-35(TTGAAA)启动子区。编码72kDa外膜蛋白的基因序列命名为72kDa分子量的外膜蛋白(Bpmp-72)。
翻译的多肽由564个氨基酸(aa)残基组成，预测分子量为62.1kDa(图4)。推导出的大小与天然Bpmp-72蛋白的Western印迹中看到的存在显著差异。Bpmp-72的假想编码容量和天然Bpmp-72外膜蛋白之间分子量的差异原因可能是翻译后修饰，如酰化、甲基化、乙酰化、磷酸化和硫酸化。
氨基酸序列的分析显示在翻译多肽的C端存在与保守的赖氨酸基序(LysM)结构域同源的118个残基的区域。该结构域是广泛分布的蛋白质模块，最初在降解细菌细胞壁的酶中鉴定，尽管已经显示它也存在于许多其他细菌蛋白质中。LysM结构域是细菌细胞表面蛋白中最普遍的模块之一。具有LysM结构域的其他细菌蛋白质(如Staphlococci IgG结合蛋白和大肠杆菌亲密素)与细菌致病相关。
Bpmp-72氨基酸序列本发明提供的全长Bpmp-72氨基酸序列具有约564个氨基酸(aa)残基并编码多毛结肠短螺旋体外膜蛋白。推导出的蛋白质分子量为62,081Da。
本发明的Bpmp-72氨基酸序列包括具有本文公开的氨基酸序列(如SEQ ID NO2到22)的氨基酸序列。它们还包括用保守性氨基酸替代修饰的Bpmp-72氨基酸序列及其类似物、片段和衍生物。
在本发明的优选形式中提供了如本文所述的分离的Bpmp-72氨基酸序列。更希望以基本纯化的形式提供Bpmp-72氨基酸序列。
术语“分离的”用于描述已与天然状态中与其伴随的组分分开的Bpmp-72氨基酸序列。另外，当至少60％到75％的样品显示为单一Bpmp-72氨基酸序列时，Bpmp-72氨基酸序列为“基本纯化的”。基本纯化的Bpmp-72氨基酸序列一般含有Bpmp-72氨基酸序列样品的约60％到90％W/W，更通常约为95％，并优选高于99％的纯度。可以通过本领域已知的大量方法显示蛋白质的纯度或同质性，如对蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并在染胶后显示为单一的Bpmp-72氨基酸序列条带。对于某些目的，可以使用HPLC或本其应用领域熟知的其他方法提供更高的分辨率。
优选的本发明Bpmp-72氨基酸序列具有天然全长Bpmp-72氨基酸序列的一种或多种生物特性(如体内或体外或免疫特性)。由于非功能型Bpmp-72氨基酸序列可能是有用的(如作为Bpmp-72的拮抗剂)，因此它们也包括于本发明的范围内。可以通过如生物测定来检测类似物、片段或衍生物相对于野生型的生物特性。
可以合成(如使用熟知的固相或液相肽合成技术)制备Bpmp-72氨基酸序列，包括类似物、片段和衍生物。优选使用固相合成技术。另外，可以如下文所述使用熟知的基因工程技术制备本发明的Bpmp-72氨基酸序列。在另一实施方案中，可以从取自动物(包括猪、鸡、人和狗、马、牛、绵羊和鱼)的生物流体(例如但不仅限于血浆、排泄物、血清或尿液)中纯化Bpmp-72氨基酸序列。
Bpmp-72氨基酸序列类似物Bpmp-72氨基酸序列类似物包括具有其中一个或多个氨基酸用另一氨基酸进行替代的氨基酸序列的类似物，所述替代不显著改变分子的生物活性。
在本发明上下文中，类似物序列包括在至少20、50、100或200个氨基酸上与SEQ ID NO2中公开的序列在氨基酸水平具有至少60％、70％、80％或90％同源性、优选至少95％或98％同源性的Bpmp-72氨基酸序列。具体而言，一般应该考虑已知为蛋白质功能所必需的序列区域的同源性，而不是非必需的邻近序列的同源性。特别优选的本发明氨基酸序列含有与SEQ ID NO3到22中所示的一个或多个氨基酸序列具有高于60％或70％同源性、优选高于80％或90％同源性的连续序列。
尽管同源性可以考虑相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)，在本发明的上下文中，优选将同源性表达为序列同一性。在论及Bpmp-72氨基酸序列时，术语“基本同源”或“基本同一”指目的Bpmp-72氨基酸序列与完全天然存在的Bpmp-72氨基酸序列或其部分表现出至少约70％的同一性，一般为至少约80％的同一性并优选至少90％或95％的同一性。
在高度优选的本发明形式中，Bpmp-72氨基酸序列类似物与SEQ IDNO2中所公开的Bpmp-72氨基酸序列或SEQ ID NO3至SEQ ID NO22中所示的序列具有80％或更高的氨基酸序列同一性。本发明范围内的Bpmp-72氨基酸序列类似物的实例包括SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中(a)用谷氨酸替代了一个或多个天冬氨酸残基；(b)用亮氨酸替代了一个或多个异亮氨酸残基；(c)用丙氨酸替代了一个或多个甘氨酸或缬氨酸残基；(d)用组氨酸替代了一个或多个精氨酸残基；或(e)用色氨酸替代了一个或多个酪氨酸或苯丙氨酸残基。
筛选Bpmp-72类似物本领域公知筛选多肽类似物的多种筛选技术。有多种化学品文库可供使用。因此，本发明考虑筛选这些文库(如经多年研究后产生的合成化合物文库、天然化合物文库和组合文库，如下文所详细描述)以得到Bpmp-72氨基酸序列的类似物。在一个实施方案中，本发明考虑筛选这些文库以得到与Bpmp-72特异性抗体结合的类似物。
Bpmp-72氨基酸序列片段除了类似物以外，本发明还考虑Bpmp-72氨基酸序列的片段。Bpmp-72氨基酸序列片段是一段至少约5到7个连续氨基酸的氨基酸残基，常为至少约7到9个连续氨基酸，一般为至少9到13个连续氨基酸，且最优选至少约20到30或更多个连续氨基酸。优选的Bpmp-72氨基酸序列片段包括如SEQ ID NO3至SEQ ID NO22中所示的序列。
在高度优选的本发明形式中，片段表现Bpmp-72氨基酸序列的配体结合、免疫活性和/或其他生物活性特征。更优选的，片段具有与存在于天然Bpmp-72氨基酸序列上的一致的免疫表位。
本文使用的“表位”指多肽的抗原决定簇。表位可以含有表位特有的空间构象中的三个氨基酸。表位一般由至少5个氨基组成，更通常由至少8-10个氨基酸组成。测定这些氨基酸的空间构象的方法为本领域公知。
Bpmp-72氨基酸序列衍生物本发明提供“Bpmp-72氨基酸序列衍生物”，其包括一级结构基本同源但含有化学和/或生物化学修饰或非常见氨基酸的Bpmp-72氨基酸序列、其类似物或片段。这些修饰包括如本领域技术人员容易理解的乙酰化、羧基化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(如使用放射性核苷酸)和多种酶修饰。
在本发明的一种形式中，适于衍生的化学部分选自水溶性多聚体。所选择的多聚体应为水溶性的，以便其附着的蛋白质不会在水性环境(如生理环境)中沉淀。优选地，对于终产物制品的用于治疗用途时，多聚体是可药用的。本领域技术人员能够基于各种因素选择所需的多聚体，如多聚体/蛋白质缀合物是否用于治疗，以及用于治疗时的所需剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性和其他因素。对于本发明的蛋白质和肽，可以使用本文提供的方法确定这些因素。
水溶性多聚体可以选自如聚乙二醇、乙二醇/丙烯共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚丙烯氧/乙烯氧共聚物、聚氧乙烯多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛肟由于其在水中的稳定性而在制造业中具有优势。
在本发明的另一形式中，可以修饰氨基酸序列以产生在宿主动物中较长的半衰期，例如将一个或多个抗体片段(如Fc片段)与Bpmp-72氨基酸序列的氨基或羧基末端融合。
当Bpmp-72氨基酸序列将以标记的形式提供时，多种标记氨基酸序列的方法为本领域所熟知，包括放射性同位素(如32P)、与标记的反配体(antiligand)(如抗体)结合的配体、荧光团、化学发光剂、可作为标记的配体的结合对成员的酶和反配体。标记的选择取决于所需的灵敏度、稳定性需求和可用的设备。标记氨基酸序列的方法为本领域所熟知(参阅如Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)和Ausubel，F.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.《Current protocols in molecular biology》.Greene Publishing Assosiates/Wiley Intersciences，New York(2001))。
如果本发明的Bpmp-72氨基酸序列为可溶性的，其可以与固相支持物偶联，所述固相支持物如硝酸纤维素、尼龙、柱填充材料(如Sepharose珠)、磁珠、玻璃丝、塑料、金属、聚合物凝胶、细胞或其他基质。这些支持物可以为珠、孔、片或膜的形式。
本发明还提供含有Bpmp-72氨基酸序列和片段的融合多肽。因此Bpmp-72氨基酸序列可以是两个或多个Bpmp-72氨基酸序列之间或Bpmp-72氨基酸序列和相关蛋白质之间的融合物。类似的，可以构建表现衍生蛋白质的特性或活性组合的异源融合物。例如，配体结合或其他结构域在不同的融合多肽或片段之间“交换”。这些同源或异源融合多肽可以表现出如改变的结合强度或特异性。融合配偶体包括免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-内酰胺酶、α淀粉酶、醇脱氢酶和酵母α交配因子。
可以使用常规技术合成修饰的氨基酸序列，或其由修饰的多核苷酸序列编码并使用重组核酸方法产生。也可以使用常规技术制备修饰的多核苷酸序列。一般通过重组核酸方法或化学合成制备融合蛋白。
Bpmp-72多核苷酸根据本发明提供了分离或基本纯净的多核苷酸序列，所述序列编码Bpmp-72氨基酸序列或其类似物、片段或衍生物。优选的本发明Bpmp-72多核苷酸序列含有SEQ ID NO1中所列的序列或其片段。
“Bpmp-72多核苷酸序列”指单链形式或双螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胸苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA”分子)的磷酸酯多聚体形式。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。在讨论具体的双链DNA分子的结构时，本文中的序列描述按常规仅给出沿DNA非转录链(即具有与mRNA同源序列的链)5’到3’方向的序列。
“分离的”或“基本纯净的”Bpmp-72多核苷酸是与天然多毛结肠短螺旋体基因组序列天然共存的其他细胞组分基本分开的多核苷酸。该术语包括从其天然存在环境中取出的Bpmp-72多核苷酸序列，也包括重组或克隆的Bpmp-72多核苷酸序列分离物和化学合成的变体或异源系统生物合成的变体。
在一个实施方案中，本发明提供用于表达Bpmp-72氨基酸序列的Bpmp-72多核苷酸序列。更具体而言，Bpmp-72多核苷酸序列选自(a)SEQID NO1中公开的多核苷酸序列或其片段；(b)与(a)中定义的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列或其可杂交片段；和(c)编码表达由任何上述多核苷酸序列所编码的氨基酸序列的多核苷酸序列。
同源Bpmp-72多核苷酸序列本发明的Bpmp-72多核苷酸序列包括来自Bpmp-72多核苷酸序列或与Bpmp-72多核苷酸序列基本相似或与天然Bpmp-72多核苷酸序列或其部分具有显著同源性的序列。在与另一多核苷酸序列(或其互补序列)进行(带有适当的核苷酸插入或缺失的)最优比对时，如果在至少约60％的核苷酸碱基、通常至少约70％、更通常至少约80％、优选至少约90％并最优选至少约95％-98％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，则Bpmp-72多核苷酸序列与另一序列“基本同源”(或“基本相似”)。
另外，当Bpmp-72多核苷酸序列或其片段在选择性杂交条件下与另一Bpmp-72多核苷酸(或其互补链)杂交时，也存在基本同源性或同一性。可以在低、中或高严格条件下进行选择性杂交，但优选在高严格条件下进行。一般在至少约14个核苷酸的序列上至少约55％、优选至少约65％、更优选至少约75％并最优选至少约90％的同一性时发生选择性杂交。如所述的同源性比较的长度可以在更长的序列上进行，在某些实施方案中，可以在至少约9个核苷酸、通常至少约20个核苷酸、更通常至少24个核苷酸，一般至少约28个核苷酸、更一般至少约32个核苷酸且优选至少约36或更多核苷酸的序列上进行。
因此，本发明的核苷酸序列优选与本文序列表中所示序列具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％的同源性。更优选至少95％、更优选至少98％的同源性。可以按下文所述用于多肽的比较来进行核苷酸同源性比较。优选的序列比较程序为GCG Wisconsin Bestfit程序。
在本发明上下文中，同源序列包括与SEQ ID NO1中公开的核苷酸序列的至少20、50、100、200、300、500或819个核苷酸具有至少60％、70％、80％或90％同一性的核苷酸序列。具体而言，一般应该考虑编码已知为蛋白质功能所必需的连续氨基酸序列(而不是非必需邻近序列)的序列区域的同源性。
其他优选的本发明Bpmp-72多核苷酸序列包括与编码SEQ ID NO3至SEQ ID NO22中一个或多个氨基酸序列的核苷酸序列具有高于50％、60％或70％同源性、更优选高于80％、90％、95％或97％同源性的连续序列。
Bpmp-72多核苷酸序列片段本发明的Bpmp-72多核苷酸序列片段优选长度至少为15个核苷酸，更优选长度至少为20、30、40、50、100或200个核苷酸。一般而言，多核苷酸序列的长度越短，得到选择性杂交所需的同源性越高。因此，当本发明的多核苷酸序列由少于30个核苷酸组成时，与本文的序列表中公开的多核苷酸序列相比，优选同一性百分比高于75％，优选高于90％或95％。相反，当本发明的多核苷酸序列由例如多于50或100个核苷酸组成时，与本文的序列表中公开的多核苷酸序列相比的同一性百分比可以较低，如高于50％，优选高于60％或75％。
Bpmp-72探针序列本发明范围内还考虑来自Bpmp-72多核苷酸序列的探针序列，所述探针序列可以从本文公开的特定序列中便利地制备。探针可以是任何适当的长度，所述探针跨越Bpmp-72多核苷酸序列的全部或部分并能够与该序列特异性杂交。
同源性程度越高，就可以使用越严格的杂交条件。因此，在一个实施方案中，优选设计探针以使用低严格杂交条件鉴定同源Bpmp-72多核苷酸序列。在另一实施方案中，设计探针以使用中严格杂交条件。更优选使用高严格杂交条件。如本文实验所示的，Bpmp-72探针序列与SEQ ID NO1中所述的多核苷酸序列在中严格条件下杂交，更优选地，在高严格条件下杂交。
本领域技术人员会认识到，除了本领域技术人员容易认识到的碱基组成、互补链长度和杂交核酸之间错配的核苷酸碱基数目以外，杂交条件的严格性还被如盐浓度、温度或有机溶剂等多种条件影响。严格温度条件一般包括高于30℃的温度，一般高于37℃并优选高于45℃。严格盐条件通常低于1000mM，一般低于500mM并优选低于200mM。然而，参数的组合远比任何单个参数的值重要。严格杂交条件的实例为65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M乙酸钠，pH7.0)。
优选地，探针序列具有来自SEQ ID NO1的至少约8个连续核苷酸的核苷酸序列，或优选至少约15个连续核苷酸，或更优选至少约25个核苷酸，且可以具有至少约40个核苷酸的长度。特别优选地，检测Bpmp-72多核苷酸序列的寡核苷酸探针包括SEQ ID NO3至SEQ ID NO18及实施例中所公开的寡核苷酸序列。
本发明的探针可以包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸附着于标记或报告分子，并可通过标准方法用于分离序列类似的其他多核苷酸序列。制备和标记探针的技术参阅如上文的Sambrook等，(1989)或上文的Ausubel等，(2001)。
含有本发明的合成寡核苷酸或其他多核苷酸序列的探针还可以来自天然存在或重组的单链或双链多核苷酸，或进行化学合成。可以通过切口平移、Klenow补平反应或本领域已知的其他方法标记探针。
Bpmp-72引物序列本发明还提供Bpmp-72引物序列。为得到最高的扩增效率，扩增反应中使用的引物优选为单链，但也可以为双链。若为双链，可以在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离链。引物的长度应在存在聚合反应诱导剂时可有效起始Bpmp-72延伸产物的合成。引物的准确长度取决于许多因素，包括温度、缓冲液和核苷酸组成。
寡核苷酸引物一般含有12-20个或更多核苷酸(尽管也可含有更少的核苷酸)。优选地，引物选自SEQ ID NO3至SEQ ID NO18中所述序列。
可以使用任何合适的方法制备寡核苷酸引物，如常规磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化实施方案。在一个这样的自动化实施方案中，使用二乙基亚磷酰胺作为起始物质并如Beaucage等(1981)Tetrahedron Letters，221859-1862所述进行合成。U.S.专利No.4,458,066中描述了在改良的固体支持物上合成寡核苷酸的一种方法。
反义核酸和核酶本发明还扩展到制备可用于在翻译水平干扰Bpmp-72氨基酸序列表达的反义核苷酸和核酶。该方法使用反义核酸和核酶通过用反义核酸屏蔽mRNA或用核酶切割mRNA来阻断特定mRNA的翻译。
反义核酸为与特定分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(参阅Weintraub，(1990)Sci.Am.，26240-46；Marcus-Sekura，(1988)Anal.Biochem.，172289-295)。在细胞中，它们与mRNA杂交形成双链分子。细胞不翻译这种双链形式的mRNA复合物。因此，反义核酸干扰mRNA表达成蛋白质。由于易于合成并且在将其引入转染细胞时较少出现问题，约15个核苷酸的寡聚体并与AUG起始密码子杂交的分子特别高效。已经使用反义方法体外抑制许多基因的表达(Hambor等，(1988)J.Exp.Med.，1681237-1245)。
核酶为具有以某种程度上与DNA限制性内切酶类似的方式特异性切割其他单链RNA分子的能力的RNA分子。核酶发现于某些mRNA具有切除其自身内含子的能力的观察中。通过修饰这些RNA的核苷酸序列，研究者已经能够设计识别RNA分子中特定核苷酸序列并对其切割的分子(Cech，(1988)J.Am.Med.Assoc.，2603030-3034)。由于它们是序列特异性的，因此只能抑制具有特定序列的mRNA。
研究者已经鉴定出两种类型的核酶，四膜虫型和“锤头”型。四膜虫型核酶识别四碱基序列，而“锤头”型识别十一到十八个碱基序列。识别序列越长，越有可能只在靶mRNA种类中出现。因此，就失活特定的mRNA种类而言，锤头型核酶优于四膜虫型核酶，且十八碱基识别序列优先于较短的识别序列。
因此本文所述的Bpmp-72多核苷酸序列可以用于制备针对的Bpmp-72反义分子和切割Bpmp-72氨基酸序列的mRNA的核酶，从而抑制Bpmp-72多核苷酸序列的表达。
Bpmp-72多核苷酸序列的分离可使用任何多毛结肠短螺旋体样品(纯化的或非纯化的形式)作为分离Bpmp-72多核苷酸序列的起点。这些样品优选通过例如Maniatis等在《Molecular CloningA Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor，N.Y.，280-281页，(1982)所述的多种技术提取自动物样品(例如血液、组织材料或粪便等)。
如果提取的样品未被纯化，在分离Bpmp-72多核苷酸序列前可将其用大量有效打开样品细胞或细菌细胞膜的试剂处理以暴露和/或分离核酸的链。
当多毛结肠短螺旋体的基因组材料释放后，有许多方法可扩增和/或分离Bpmp-72多核苷酸序列。这些方法的详细描述可得自上文的Sambrook等，(1989)或上文的Ausubel等(2001)。
PCR可能是可用于最初扩增Bpmp-72多核苷酸序列的更常规的方法之一，并优选在本发明中使用。特异的待扩增的Bpmp-72多核苷酸序列可为较大分子的一个片段或可最初以分离的分子存在(从而特异序列构成了整个核酸)。待扩增的序列不必要最初以纯化的形式存在；其可为复杂混合物的较小级分，例如包含在整个多毛结肠短螺旋体DNA中的。
根据PCR方法，与引物一起或单独向合成混合物中添加足量的脱氧核糖核苷酸三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，在约1到10分钟(优选1到4分钟)内将产生的溶液加热至大约90℃-100℃。加热期后，优选为引物杂交而冷却溶液。向冷却的混合物中添加合适的用于影响引物延伸反应的试剂(文中称为“聚合剂”)，且允许反应在本领域已知的条件下进行。聚合剂还可与其他热稳定的试剂一起添加。该合成(或扩增)反应可在室温到室温之上(该温度下聚合剂不再作用)反应。因此，例如如果使用DNA聚合酶作为聚合剂，温度通常不大于40℃。最适宜反应发生在室温。
在上述杂交条件下，新合成的Bpmp-72链及其互补核酸链会形成双链分子，且该杂合体用于该方法的后续步骤。
变性、退火和延伸产物合成可根据需要重复以扩增目的Bpmp-72多核苷酸序列至检测需要的程度。产生的特异的Bpmp-72多核苷酸序列的数量会以指数形式累积。这些扩增反应更详细描述于《PCR.A PracticalApproach》，ILR Press，M.J.McPherson，P.Quirke和G.R.Taylor编，1992。
Bpmp-72多核苷酸扩增产物可通过Southern印迹分析(不使用放射性探针的)。在该方法中，例如包含非常低水平的Bpmp-72多核苷酸序列核酸序列的DNA少量样品被扩增并通过Southern印迹技术分析或类似的使用斑点印迹分析。高水平的扩增信号促进了非放射性探针或标签的使用。另外，如本文所述，用于检测扩增产物的探针可直接或间接地可检测性标记。
通过本发明方法扩增的序列在溶液中或结合在固体支持物上后，可通过通常用于检测特异DNA序列的方法如PCR、寡聚体限制性酶切(Saiki等(1985)，Bio/Technology，31008-1012)、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner等(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80278)、寡核苷酸连接测定(OLAS)(Landgren等(1988)，Science，2411007)等进一步评估、检测、克隆、测序等。
另外的扩增方法已被描述并也可用于本发明。这类其它的扩增体系包括但不仅限于自动维持的序列复制和基于核酸序列的扩增(使用反转录和T7RNA聚合酶并掺入两个引物以靶向其循环方案)。另外，Bpmp-72多核苷酸序列可通过连接激活的转录或连接酶链式反应或修复链反应核酸扩增技术来扩增。
Bpmp-72多核苷酸构建体及载体根据另一实施方案，本发明提供用于制备Bpmp-72氨基酸序列的方法，包括步骤(a)在使得Bpmp-72氨基酸序列表达的条件下培养本文所述细胞；(b)回收表达的Bpmp-72序列。该方法还可伴有步骤(c)使用本领域已知的任何适当方法层析氨基酸序列；和/或(d)将氨基酸序列进行蛋白质纯化。
为了产生能够表达Bpmp-72氨基酸序列的细胞，优选将本发明的多核苷酸序列整合进重组载体，然后将其引入宿主原核或真核细胞。
本发明提供的载体通常将包含编码需要的氨基酸序列的Bpmp-72多核苷酸序列，并优选转录和翻译起始调节序列与氨基酸编码序列有效连接。这类表达载体的实例描述于上文的Sambrook等(1989)或上文的Ausubel等(2001)。许多有用的载体为本领域已知并可获得自如Stratagene、NewEngland Biolabs、Promega Biotech和其他的厂商。
表达载体还可包括例如复制起点或自主复制序列以及表达调控序列、启动子、增强子和必须的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点、转录终止子序列和mRNA稳定序列。适当时也可包含来自相同或相关种类的分泌多肽的分泌信号，其允许蛋白质跨越和/或嵌入细胞膜，并因此获得其功能拓扑学，或从细胞分泌。这些载体可通过本领域熟知并在例如上文的Sambrook等(1989)或上文的Ausubel等(2001)中讨论的标准重组技术制备。
选择能够在宿主细胞中发挥功能的适当启动子和其他必须的载体序列，且适当时可包括与外膜脂蛋白基因天然相关的那些。
如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子之类的启动子可用于原核宿主。有用的酵母启动子包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(如烯醇酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶、负责利用麦芽糖和半乳糖的酶)的启动子区及其他启动子区。适合用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于Hitzeman等，EP 73,675A。适合的非天然哺乳动物启动子可包括来自SV40的早期或晚期启动子，或来自鼠莫洛尼白血病病毒、鸟肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳头瘤病毒或多瘤的启动子。另外，该构建体可与可扩增的基因(例如DHFR)连接，从而可产生多拷贝的该基因。适当的增强子和其他表达调控序列。
当这些表达载体可自主复制时，它们还可通过本领域熟知的方法插入宿主细胞的基因组而复制。
表达和克隆载体可能会包含选择性标记，编码该载体转化的宿主细胞存活或生长必须的蛋白质的基因。该基因的存在确保了只有表达插入物的宿主细胞生长。通常的选择基因编码a)给予对抗生素或其他毒性物质例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤等的抗性；b)补充营养缺陷的不足，或c)提供不能得自复合培养基的关键营养物(例如编码用于细菌的D-丙氨酸消旋酶的基因)的蛋白质。适当的选择性标记的选择将依赖于宿主细胞，适用于不同宿主细胞的适当标记为本领域熟知。
包含Bpmp-72多核苷酸序列的载体可体外转录，且产生的RNA通过熟知的方法(例如通过注射)引入宿主细胞，或载体可通过本领域熟知的方法直接引入宿主细胞，这些方法根据细胞宿主的类型变化，包括电穿孔法、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染、微粒轰击、脂质转染、侵染(其中载体为侵染剂，如逆转录病毒基因组)和其他方法。Bpmp-72多核苷酸序列引入宿主细胞可通过任何本领域已知的方法完成，这些方法尤其包括上述的。
本发明还提供用Bpmp-72多核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。优选的宿主细胞包括酵母、丝状真菌、植物细胞、昆虫、两栖动物、鸟类、细菌、哺乳动物细胞和组织培养的人细胞。用作说明的是，这些宿主细胞选自大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10和Sf9细胞。
可通过在合适的原核或真核宿主细胞中的载体或其他表达载体中表达Bpmp-72多核苷酸序列或其部分而制备大量本发明的Bpmp-72多核苷酸序列。最常用的原核宿主为大肠杆菌菌株，尽管也可使用其他的原核细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或假单胞菌。常用的哺乳动物宿主细胞系实例为VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和WI38、BHK、COS细胞系，尽管技术人员将明白其他的细胞系可是合适的。
还提供了含有通过同源重组事件体外修饰的Bpmp-72多核苷酸序列的哺乳动物细胞，以使得Bpmp-72氨基酸序列更高表达，所述同源重组事件由在Bpmp-72氨基酸序列编码序列中插入与之功能近似的表达调节序列组成。
Bpmp-72氨基酸序列的抗体根据本发明，可使用重组或化学合成产生的Bpmp-72氨基酸序列和片段或其其他衍生物或类似物(包括融合蛋白)作为免疫原，以产生识别Bpmp-72氨基酸序列的抗体。这些抗体包括但不仅限于多克隆、单克隆、嵌合体、单链、Fab片段和Fab表达文库。
当能够与免疫系统的抗原识别分子(例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异相互作用时，分子是“抗原性的”。抗原性氨基酸序列包含至少5个，并优选至少大约10个氨基酸。分子的抗原部分可以是对抗体或T细胞受体识别免疫显性的部分，或可以是通过将抗原性部分与用于免疫的载体分子缀合而产生针对该分子的抗体的部分。
“抗体”为任何免疫球蛋白，包括抗体及其与特异表位结合的片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体(所述最后者更详细描述于U.S.专利No.4,816,397和4,816,567)，以及抗体的抗原结合部分，包括Fab、F(ab′)2和F(v)(包括单链抗体)。因此，“抗体分子”是指完整的免疫球蛋白分子和包含抗体结合位点的免疫球蛋白分子免疫活性部分。“抗体结合位点”为由轻链和重链可变区和特异结合抗原的高变区组成的抗体分子的结构部分。
示范的抗体分子为完整的免疫球蛋白分子，基本上完整的免疫球蛋白分子和包含互补位的免疫球蛋白分子部分，包括本领域已知的部分，如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)，这些部分在文中所述治疗方法中优选使用。
抗体分子的Fab和F(ab′)2部分分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本上完整的抗体分子通过熟知方法的蛋白水解反应制备。见例如Theofilopolous等人的U.S.专利No.4,342,566。Fab′抗体分子部分也是众所周知的，并且是通过用巯基乙醇还原F(ab′)2部分中连接两个重链部分的二硫键，然后用例如碘乙酰胺的试剂烷基化产生的蛋白质硫醇而产生。本文优选包含完整抗体分子的抗体。
短语“单克隆抗体”是指只有一种能与特定抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体。单克隆抗体因而通常显示对与其免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。因此单克隆抗体可包含具有多种各自对不同抗原免疫专一的抗体结合位点的抗体分子(例如双重特异性抗体)。
术语“佐剂”是指增强对抗原免疫应答的化合物或混合物。佐剂可作为缓慢释放抗原的组织储藏所作用，并还可作为非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活剂作用[Hood等《Immunology》中384页，第二版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，California(1984)]。通常，没有佐剂时抗原单独的原初攻击不能引起体液或细胞的免疫反应。佐剂包括但不仅限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物胶(如氢氧化铝)、表面活性物质，如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油或碳氢化合物乳剂、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。优选佐剂为可药用的。
本领域已知的多种方法可用于产生Bpmp-72氨基酸序列或其片段、衍生物或类似物的多克隆抗体。产生抗体时，可通过注射Bpmp-72氨基酸序列或其衍生物(例如片段或融合蛋白质)免疫多种宿主动物，包括但不仅限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案中，Bpmp-72氨基酸序列或其片段可与免疫原性载体缀合，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔槭血蓝蛋白(KLH)。可使用多种佐剂增强免疫应答，基于宿主种类包括但不仅限于弗氏(完全和不完全)、矿物胶(如氢氧化铝)、表面活性物质，如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基酚和可能有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。
为了制备直接针对Bpmp-72氨基酸序列或其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体，可使用任何提供的用于从培养的连续细胞系中产生抗体分子的技术。这些技术包括但不仅限于最初由Kohler等(1975)Nature，256495-497发展的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术[Kozbor等(1983)《Immunology Today》，472]和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等(1985)在《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》中，77-96页，Alan R.Liss，Inc.]。永生化的、产抗体的细胞系可通过融合之外的技术产生，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染。见例如U.S.专利No.4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632和4,493,890。
在另一本发明的实施方案中，可使用最近的技术从无菌动物中产生单克隆抗体。根据本发明，可使用鸡或猪抗体并可使用鸡或猪杂交瘤或通过用EBV病毒体外转化B细胞而获得。事实上，根据本发明，可使用发展用于通过剪接来自小鼠特异性针对Bpmp-72氨基酸序列的抗体分子的基因和来自有适当生物学活性的抗体分子的基因而产生“嵌合抗体”的技术[Morrison等(1984)J.Bacteriol.，159-870；Neuberger等(1984)Nature，312604-608；Takeda等，(1985)Nature，314452-454]；这些抗体在本发明的范围内。因为与异体的抗体相比该抗体自身更少可能引起免疫应答，特别是过敏反应，这些嵌合抗体优选用于治疗肠疾病或紊乱(下述)。
根据本发明，用于产生单链抗体的技术(U.S.专利4,946,778)可适用于产生Bpmp-72氨基酸序列特异的单链抗体。本发明的另一实施方案使用构建Fab表达文库的技术(Huse等，(1989)Science，2461275-1281)以允许快速和简单鉴定具有需要的对Bpmp-72氨基酸序列或其衍生物或类似物特异性的单克隆Fab片段。
包含抗体分子独特型的抗体片段可通过已知技术产生。例如，这些片段包括但不仅限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段；可通过还原F(ab′)2片段二硫键产生的Fab′片段和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。
制备抗体时，可通过本领域已知技术筛选所需抗体，例如放射免疫测定、ELISA、“夹层”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标签)、Western印迹、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标签检测抗体结合。在另一实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合检测第一抗体。在另一实施方案中，标记第二抗体。本领域已知许多用于免疫测定的检测方法并包含在本发明范围内。例如，为了选择识别Bpmp-72氨基酸序列的特异表位的抗体，可测定产生的杂交瘤以找到结合包含该表位的Bpmp-72氨基酸序列片段的产物。为了选择对来自具体种类动物的Bpmp-72氨基酸序列特异的抗体，可基于与该种动物细胞表达的或分离自该种动物细胞的Bpmp-72氨基酸序列的阳性结合进行选择。
诊断根据另一实施方案，本发明提供使用Bpmp-72氨基酸序列和/或来自于其的抗体和/或Bpmp-72多核苷酸序列检测短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)的存在的诊断和预后方法。
通常使用得自动物(如鸡或猪)的生物样品实施诊断和预后方法。“样品”指取自动物的怀疑含有短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)多核苷酸或多肽的组织或流体样品，包括但不仅限于如血浆、血清、粪便样品、组织和体外细胞培养物组分的样品。
基于多肽/抗体的诊断本发明提供检测样品中Bpmp-72氨基酸序列的存在的方法，包括(a)在允许形成含有抗体和Bpmp-72氨基酸序列的反应复合物的条件下使怀疑含有Bpmp-72氨基酸序列的样品(优选与固体支持物结合)与特异性结合Bpmp-72氨基酸序列的抗体接触；和(b)检测样品中形成的含有抗体和Bpmp-72氨基酸序列的反应复合物，其中检出形成反应复合物表示样品中存在Bpmp-72氨基酸序列。
优选地，本方法中使用的抗体来自亲和纯化的多克隆抗体，并更优选单克隆抗体。另外，本文中使用的抗体分子优选为Fab、Fab’、F(ab’)2或F(v)部分的形式或完整抗体分子的形式。
特别优选的基于以上方法检测短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的方法包括酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、免疫放射测定和免疫酶测定，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹层方法。
特别有用的三种这样的方法方便利用了标记可检测标记的Bpmp-72氨基酸序列(或其片段)、标记可检测标记的Ab1抗体或标记可检测标记的Ab2抗体。可以用以下等式概括这些方法，其中星号表示该部分是标记的，“AA”代表Bpmp-72氨基酸序列A.AA*+Ab1＝AA*Ab1B.AA+Ab*1＝AA Ab1*C.AA+Ab1+Ab2*＝Ab1AA Ab2*本领域技术人员熟悉这些方法及其应用，因此可以在本发明范围内使用这些方法。“竞争性”方法(方法A)描述于U.S.专利No.3654090和3850752。方法B代表熟知的竞争性测定技术。方法C(“夹层”方法)描述于U.S.专利No.RE31006和4016043。还已知其他方法，如“双抗体”或“DASP”方法。
在每种情况下，Bpmp-72氨基酸序列与一个或多个抗体或结合配偶体形成复合物，并用可检测标记对复合物的一个成员进行标记。可以通过适用于检测标记的方法测定形成复合物这一事实，并在需要时检测其数量。
从上文中可以看出，Ab2的特征性质是其与Ab1反应。这是因为在哺乳动物物种中产生的Ab1在另一物种中作为抗原用于产生抗体Ab2。例如，可以用兔抗体作为抗原在山羊中产生Ab2。从而Ab2为山羊中产生的抗兔抗体。就本说明书和权利要求书而言，Ab1指第一抗体，Ab2指第二抗体或抗Ab1抗体。
这些研究中最普遍使用的标记为放射性元素、酶、在暴露于紫外光时发光的化学品等等。
大量的荧光材料是已知的并可作为标记使用。它们包括如荧光素、罗丹明和金胺。具体的检测材料为在山羊中制备并通过异硫氰酸酯与荧光素缀合的抗兔抗体。
也可以用放射性元素或酶标记氨基酸序列或其结合配偶体。可以用目前可用的任何技术流程检测放射性标记。优选的同位素可以选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
可以类似的使用酶标记，并用目前使用的任何色度法、分光光度法、荧光分光光度法、电流法或气体定量技术进行检测。通过与桥接分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应将酶与选择的颗粒缀合。许多可用于这些方法的酶是已知并可利用的。优选的酶为过氧化物酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶，以及碱性磷酸酶。参考U.S.专利No.3654090、3850752和4016043作为公开了其他标记材料和方法的实例。
本发明还提供检测生物样品中肠螺旋体病抗体的方法，包括(a)提供Bpmp-72氨基酸序列或其片段；(b)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品与所述氨基酸序列孵育；和(c)检测是否形成了含有所述氨基酸序列的抗体-抗原复合物。
在本发明的另一实施方案中提供了评估生物样品中Bpmp-72抗体水平的体外方法，包括(a)根据上文提到的方法检测生物样品中形成的反应复合物；和(b)评估形成的反应复合物的量，其中复合物的量对应于生物样品中Bpmp-72抗体的水平。
另外还提供了筛选动物宿主中与短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)相关疾病的治疗方法的体外方法，包括如上文所述评估一系列生物样品中Bpmp-72氨基酸序列的水平，所述生物样品在不同时间点取自接受该治疗方法的动物宿主。
基于核酸的诊断本发明还提供检测生物样品中短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)存在与否的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适当的杂交条件下使生物样品与含有本发明Bpmp-72多核苷酸序列的探针或引物接触；和(b)检测探针或引物和样品中的核酸形成的任何双链体。
根据本发明的实施方案，可以使用已知技术直接扩增来自生物样品的Bpmp-72多核苷酸序列并随后检测Bpmp-72多核苷酸序列的存在来检测短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)。
在本发明的一种形式中，通过PCR扩增靶核酸序列并使用上文提到的任何具体方法进行检测。检测Bpmp-72多核苷酸序列的存在的其他有用的诊断技术包括但不仅限于1)等位基因特异性PCR；2)单链形成测定；3)变性梯度凝胶电泳；4)核糖核酸酶保护测定；5)使用识别核苷酸错配的蛋白质，如大肠杆菌mutS蛋白；6)等位基因特异性寡核苷酸；和7)荧光原位杂交。
除了上述方法以外，还可以使用常规探针技术检测Bpmp-72多核苷酸序列。当用探针检测Bpmp-72多核苷酸序列的存在时，需要时可以处理待分析的生物样品(如血液或血清)以提取核酸。可以用多种方法制备样品多核苷酸序列以便于检测靶序列，如变性、限制性消化、电泳或斑点印迹。通常样品多核苷酸序列的靶区域必须至少部分是单链的，以便与探针的寻靶序列形成杂交体。如果序列是天然单链的，则不需要变性。然而，如果序列是双链的，序列很可能需要变性。可以通过本领域已知的多种方法进行变性。
在促进探针中的靶序列和样品中假定的Bpmp-72多核苷酸序列形成稳定杂交体的条件下孵育样品多核苷酸序列和探针。优选地，使用高严格条件以防止假阳性。
如果进行检测的话，通常使用标记的探针检测得到的杂交体。另外，探针可以是未标记的，但是可以通过与标记的配体直接或间接的特异性结合进行检测。合适的标记及标记探针和配体的方法为本领域已知，包括如可以通过已知技术(如切口平移、随机引物或激酶)掺入的放射性标记、生物素、荧光基团、化学发光基团(如二氧杂环丁烷，特别是触发的二氧杂环丁烷)、酶、抗体等等。该基本方案的变化为本领域公知，包括便于从外来材料中分离待检测的杂交体和/或增强来自标记部分的信号的变化。
在本发明的范围内还考虑在本发明的核酸探针测定法中使用能够检测Bpmp-72多核苷酸序列的核酸探针的混合物。因此，在检测细胞样品中Bpmp-72多核苷酸序列的存在的实例中，使用了多于一种的与Bpmp-72多核苷酸序列互补的探针，不同探针的数目具体可以是2、3或5种不同的核酸探针序列。
核酸阵列——“DNA芯片”技术还可以将(优选为探针形式的)Bpmp-72多核苷酸序列固定于固相支持物来检测短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)。或者Bpmp-72多核苷酸序列可以形成DNA分子文库的一部分，所述文库可用于同时检测来自短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的大量不同基因。在本发明的另一种形式中，可以将Bpmp-72多核苷酸序列与其他(如来自其他细菌或病毒的)多核苷酸序列固定于固体支持物上，其中以允许鉴定结合于固体支持物上的短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)和/或任何其他多核苷酸序列的存在的方式进行固定。
本领域中已经描述了产生DNA分子文库的技术。通常多数现有技术描述使用如掩蔽技术在固体基质的多个离散位置建立多种序列变换来合成单链核酸分子文库。U.S.专利No.5873832描述了基于极大规模集成技术产生固定于硅基质的DNA阵列的改进方法。具体而言，U.S.专利No.5873832描述了称为“贴片(tilling)”的策略，在可用于产生本发明的固化DNA文库的基质空间的特定位置合成特定的探针组。U.S.专利No.5873832还提供可以使用的早期技术的参考。因此可以在基质表面原位合成多核苷酸序列探针。
另外，可以脱离固体基质合成单链分子，并将每一预制的序列应用于固体基质的离散位置。例如，可以使用装备了pin或pizo电子装置的自动装置直接将多核苷酸序列印在基质上。
文库序列通常固定于固体基质上或固体基质的离散部分。基质可以是疏松的(以在基质内进行固定)或基本非疏松的，在这种情况下文库序列一般固定于基质的表面。固体基质可以由多肽可直接或间接结合的材料制成。合适的固体基质的实例包括平板玻璃、硅晶片(silicon wafer)、云母、陶瓷和有机多聚体如塑料(包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯)。还可以使用半透膜，如广泛使用的硝酸纤维素或尼龙膜。可以将半透膜包埋在坚硬的固体(如玻璃)表面。可以任选地用金属(如金、铂或其他过渡金属)层覆盖表面。合适的固体基质的具体实例为市售的BiaCoreTM芯片(Pharmacia Biosensers)。
优选的，固体基质通常为具有硬或半硬表面的材料。在优选的实施方案中，基质的至少一个表面应基本是平的，尽管在一些实施方案中可能需要以如隆起的区域或蚀刻槽将不同多聚体的合成区物理上分开。还优选固体基质适于一般从50到100μm的离散区中的DNA序列高密度应用，给定10000到40000点/cm-2的密度。
固体基质可便利地分成切片。这可通过如光刻等技术或应用疏水墨如基于特氟隆(telflon)的墨(Cel-line，USA)实现。
文库中每一不同成员定位的离散位置可以是任何方便的形状，如环形、矩形、椭圆形、楔形等等。
可以通过共价或非共价方法将多核苷酸序列附着于基质。多核苷酸序列可以通过文库序列结合的分子层附着于基质。例如，可以用生物素标记多核苷酸序列并用抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素包被基质。使用生物素化的多核苷酸序列的一个便利的特征是与固体基质的偶联效率容易测定。由于多核苷酸序列可能与一些固体基质不充分结合，所以提供固体基质(如玻璃)和核苷酸序列之间的化学界面经常是必要的。合适的化学界面的实例包括乙二醇。另一实例是使用包被聚赖氨酸的玻璃，然后使用标准程序化学修饰聚赖氨酸以便引入亲和配体。使用偶联剂将分子附着于固体基质表面的其他方法为本领域公知，参阅如WO98/49557。
可以通过多种方法测定互补多核苷酸序列与固化的核酸文库的结合，如所结合多核苷酸序列光学特性的变化(即通过使用溴化乙啶)或通过使用标记的核酸如用荧光基团标记的多肽。无需使用标记的其他检测技术包括光学技术如光声学(optoacoustics)、反射剂测量法、椭圆对称法和表面等离子共振(参阅WO97/49989)。
因此，本发明提供其上固定了至少一种本发明的多核苷酸(优选两种或多种本发明的不同序列)的固体基质。在优选的实施方案中固体基质另外含有来自非Bpmp-72多核苷酸序列的基因的多核苷酸序列。
治疗用途本发明还可用于预防剂和治疗剂，所述预防剂和治疗剂用于刺激动物(如鸡和猪)中体液和细胞介导的应答，从而提供对短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)定居的保护。短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的天然感染诱导针对Bpmp-72的循环抗体效价。因此，Bpmp-72氨基酸序列或其部分可能形成全身或口服给药的预防剂或治疗剂的基础，以提供对肠螺旋体病的保护。
因此，在本发明的一个实施方案中提供了以治疗有效剂量与可药用载体、稀释剂或赋形剂混合的Bpmp-72氨基酸序列或其片段或与所述氨基酸序列结合的抗体或本文描述的多核苷酸序列。
本文使用的术语“治疗有效剂量”指足以使动物宿主的活性、功能和应答的临床显著缺乏减少至少约15％、优选至少50％、更优选至少90％并最优选完全阻止的量。另外，治疗有效剂量足以在动物宿主中引起临床显著症状的改善。
术语“可药用”指分子实体和缀合物是生理耐受的，并且在施用于动物时一般不产生过敏或类似的不良反应如心嘈等。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这些药物载体可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。优选使用水或盐溶液和葡萄糖水和甘油溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体描述于Martin《Remington’sPharmaceutical Sciences》，第十八版，Mack Publishing Co.，Easton，PA，(1990)。
在本发明的另一种形式中提供了药物组合物，所述药物组合物与可药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体一起含有治疗有效剂量的Bpmp-72氨基酸序列或其类似物、片段或衍生物或抗体。这些组合物包含多种缓冲容量、pH和离子强度的稀释剂(如Tris-盐酸、乙酸、磷酸)和添加剂，如洗涤剂和增溶剂(如吐温80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠)、防腐剂(如thimersol、苯甲醇)和填充物质(如半乳糖、甘露醇)。材料可掺入多聚体化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸)的粉粒制剂中或装入脂质体中。这些组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放的速率和体内清除的速率。参阅如本文中引入作为参考文献的Martin《Remington’s Pharmaceutical Sciences》，第十八版，(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712页。组合物可以液体形式或干粉形式(如冻干的形式)制备。
给药应该理解，可以以本领域已知的任何方法施用本发明提供的组合物。优选地，通过注射、经口或经肺或鼻途径施用待施用的药物组合物。更优选通过静脉、动脉、腹膜内、肌内或皮下给药途径递送得到的氨基酸序列或抗体。另外，可以通过鼻或口腔给药施用得到的(通常为配制的)Bpmp-72氨基酸序列或抗体。
基于多核苷酸的疗法本发明还提出本发明的多核苷酸序列以及可与编码本发明Bpmp-72氨基酸序列的多核苷酸序列杂交的反义和核酶多核苷酸序列用于生产调控多毛结肠短螺旋体相关疾病的药剂的用途。
编码治疗方法中使用的反义构建体或核酶的多核苷酸序列需要以裸核酸构建体形式直接施用。可通过若干已知的转染技术(如包括使用转染剂)增强细菌对裸核酸构建体的摄取。这些转染剂的实例包括阳离子试剂(如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂质体(如lipofectamTM和transfectamTM)。一般将核酸构建体与转染剂混合产生组合物。
另外反义构建体或核酶可以与可药用载体或稀释剂组合产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，如磷酸缓冲盐水。可以将组合物配制来用于胃肠外、肌内、静脉、皮下、口腔或皮肤施用。
由于熟练的从业者能够容易地对任何具体动物和疾病决定最优给药途径和任何剂量，因此所描述的给药途径仅作为指导。
药物筛选测定本发明还提供适于鉴定与Bpmp-72氨基酸序列结合的物质的测定法。另外，还提供了适于鉴定干扰Bpmp-72氨基酸序列的物质的测定法。还提供了测试候选物质功效的测定法，此候选物质在全细胞实验中于完整细胞上进行的初级体外测定中被鉴定。
鉴定与Bpmp-72氨基酸序列结合的物质的一种测定法类型涉及将固定于固体支持物上的Bpmp-72氨基酸序列与候选物质接触，并测定Bpmp-72氨基酸序列与候选物质是否和/或以何种程度互相结合。另外，可以固定候选物质而不固定Bpmp-72氨基酸序列。
在优选的测定方法中，Bpmp-72氨基酸序列固定于珠(如琼脂糖珠)上。为达到该目的，一般在细菌、酵母或高等真核细胞系中将组分表达为GST融合蛋白并使用谷胱甘肽-琼脂糖珠从粗细胞提取物中纯化GST-融合蛋白。然后测定候选物质与固定的Bpmp-72氨基酸序列的结合。这种类型的测定法在本领域中称为GST pulldown测定法。同样，可以固定候选物质而不固定Bpmp-72氨基酸序列。
还可以使用固定一种组分(如Ni-NTA琼脂糖和六组氨酸标签组分)的不同的亲和纯化系统进行这种类型的测定法。
可以通过多种本领域熟知的方法测定Bpmp-72氨基酸序列与候选物质的结合。例如，可以(用如放射性标记、表位标签或酶-抗体缀合物)标记非固定的组分。另外，可以通过免疫检测技术测定结合。例如，可以对反应混合物进行Western印迹并用检测非固定组分的抗体检测印迹。还可以使用ELISA技术。
通常以1到1000nmol/ml的终浓度加入候选物质，更优选1到100nmol/ml。对于抗体的情况，一般使用从100到500μg/ml的终浓度，更优选从200到300μg/ml。
因此，本发明提供筛选药物的方法，所述方法包括使该试剂与Bpmp-72氨基酸序列或其片段接触，并通过本领域熟知的方法测定(i)试剂和Bpmp-72氨基酸序列或片段的复合物的存在，或(ii)Bpmp-72氨基酸序列或其片段和配体之间的复合物的存在。在这种竞争性结合测定法中，通常标记Bpmp-72氨基酸序列或片段。将游离的Bpmp-72氨基酸序列或片段与蛋白质蛋白质复合物中存在的Bpmp-72氨基酸序列或片段中分开，游离(非复合物)的标记量是对测试试剂与Bpmp-72氨基酸序列的结合或其对Bpmp-72氨基酸序列配体结合干扰的测量。
药物筛选的另一种技术提供高通量筛选对Bpmp-72氨基酸序列具有合适的结合亲和力的化合物，并描述于1984年9月13日出版的Geysen，PCT公布申请WO 84/03564。简言之，在固体基质(如塑料针或其他表面)上合成大量不同的小肽测试化合物。使肽测试化合物与Bpmp-72氨基酸序列反应并洗涤。通过本领域熟知的方法检测结合的Bpmp-72氨基酸序列。
本发明还考虑使用竞争性药物筛选测定法，其中能够特异性结合Bpmp-72氨基酸序列的抗体与测试化合物竞争结合Bpmp-72氨基酸序列或其片段。可以以这种方式使用抗体检测分享一个或多个Bpmp-72氨基酸序列的抗原决定簇的任何肽的存在。
试剂盒本发明还提供筛选怀疑感染短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的动物或确认动物感染了短螺旋体物种(如多毛结肠短螺旋体)的试剂盒，所述试剂盒至少包含与Bpmp-72多核苷酸序列的一部分互补的多核苷酸序列，其包装于合适的容器中并带有使用说明书。
在本发明的另一实施方案中，可以制备适于专业人员使用的试剂盒以在怀疑感染的动物中测定短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)是否存在或定量测量短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)感染。根据上文讨论的测试技术，取决于所选择方法(如“竞争性”、“夹层”、“DASP”等等)，一类这种试剂盒至少含有标记的Bpmp-72氨基酸序列或其结合配偶体(如其特异性抗体)和说明书。试剂盒还可以含有辅助试剂，如缓冲液、稳定剂等。
因此，可以制备试剂盒用于证明短螺旋体物种(包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体)的存在，所述试剂盒包含(a)预决定量的至少一种标记的免疫化学反应性组分，所述组分通过将本发明Bpmp-72氨基酸序列或其特异性结合配偶体直接或间接附着于可检测标记得到；(b)其他试剂；和(c)所述试剂盒的使用说明书。
更具体而言，诊断试剂测试盒可以包含(a)已知量的上文所述的Bpmp-72氨基酸序列(或结合配偶体)，一般与固相结合形成免疫吸附剂或者与适当的标签结合，或者存在多种这样的终产物等；(b)(必要时存在)其他试剂；和(c)所述试剂盒的使用说明书。
在另一种变化中，可以制备所述试剂盒并用于上文所提到的目的，所述试剂盒根据预确定的方案(如“竞争性”、“夹层”、“双抗体”等等)操作，并含有(a)通过将Bpmp-72氨基酸序列与可检测标记偶联得到的标记组分；
(b)一种或多种额外的免疫化学试剂，其中至少一种试剂为配体或固定的配体，配体选自(i)能与标记组分(a)结合的配体(ii)能与标记组分(a)的结合配偶体结合的配体；(iii)能与至少一种待测组分结合的配体；(iv)能与至少一种待测组分的至少一种结合配偶体结合的配体；和(c)实施检测和/或测定Bpmp-72氨基酸序列与其特异性结合配偶体之间的免疫化学反应中一种或多种组分的操作的说明书。
实施本发明的最佳模式在以下的非限制性实施例中更详细的描述了本发明的其他特征。然而应当理解，该详细描述仅包含示例本发明的目的。不应以任何方式理解为限制如上文公开的本发明的宽泛描述。
在以下实施例中未明确描述的分子克隆、免疫和蛋白质化学方法报道于文献中，并为本领域技术人员公知。描述本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术的一般教材包括如Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)、Glover编，《DNA CloningA Practical Approach》，I和II卷，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.(1985)和F.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.《Current protocols in molecularbiology》.Greene Publishing Associates/Wiley I ntersciences，New York(2001)。
实施例1编码多毛结肠短螺旋体72kDa外包膜蛋白的基因的鉴定和表征方法产生用于筛选的多克隆抗体(AHPS)
将取自用多毛结肠短螺旋体菌株1648超免疫的猪的血清(1.0ml)加入含有1012个猪痢疾短螺旋体B78T、Brachyspira intemedia PWS/AT、良性短螺旋体(Brachyspira innocens)B256T、Brachyspira murdochii 56-150T、Brachyspira aalborgi 513T和大肠杆菌JM109细胞的细胞悬液(9.0ml)中。将浆体在4℃连续首尾(end-to-end)混合孵育过夜。通过在4℃以5000×g离心20分钟取下吸收到细胞上的抗体。取出上清液并用于重悬含有1012个猪痢疾短螺旋体B78T、Brachyspira intemedia PWS/AT、良性短螺旋体B256T、Brachyspira murdochii 56-150T、Brachyspira aalborgi 513T和大肠杆菌JM109细胞的混合细胞沉淀。将浆体在4℃连续首尾混合孵育过夜。通过在4℃以5000×g离心20分钟再次移出吸收到细胞上的抗体。将吸收过程再重复两次。终吸收后，将吸收的超免疫猪血清(AHPS)分成(50μl的)等分式样并保存于-80℃。
筛选基因组文库通过将局部限制性酶切的高分子量DNA(2-3kb)连接进λ噬菌体臂并使用Gigapack II提取物(Stratagene)包装噬菌体颗粒，产生多毛结肠短螺旋体P43/6/78基因组文库。在大肠杆菌中扩增得到的噬菌体文库并使用标准plaque-lift方法用稀释的AHPS免疫筛选。在的三轮免疫筛选后将4个克隆(命名为AHP1-4)切割进质粒中。
在大肠杆菌中表达编码72kDa外包膜蛋白(Bpmp-72)的基因将容纳了重组质粒的大肠杆菌克隆划线到添加了卡那霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上并在37℃孵育过夜。将单克隆接种到添加了卡那霉素(50mg/l)、PMSF(1mM)和IPTG(1mM)的LB液体培养基(10ml)。在37℃将液体培养基培养物振荡孵育12小时。将每一培养物的等分式样(1.0ml)以2500×g离心15分钟并洗涤三次。将洗涤过的细胞沉淀重悬于PBS(100μl)中准备用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹。
Bpmp-72蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的SDS-PAGE分析涉及使用不连续Tris-甘氨酸缓冲液系统的电泳分离。将蛋白质样品的等分式样(30μl)与10μl 4×样品处理缓冲液(250mM Tris-盐酸(pH 6.0)、8％(v/v)SDS、200mM DTT、40％(v/v)甘油和0.04％(v/v)溴酚蓝)混合。在将样品(10μl)装入凝胶的孔中之前将样品煮5分钟。凝胶包含积层胶(125mM Tris-盐酸ph 6.8、4％(w/v)的丙烯酰胺、0.15％(w/v)的双丙烯酰胺和0.1％(w/v)的SDS)和分离胶(375mMTris-盐酸ph 8.8、12％(w/v)的丙烯酰胺、0.31％(w/v)的双丙烯酰胺和0.1％(w/v)的SDS)。通过加入0.1％(v/v)TEMED和0.05％(w/v)的新制备的硫酸铵溶液使胶聚合并倒入双板槽(Bio-Rad)中。室温(RT)下以150V电泳样品直至溴酚蓝染料前端到达凝胶底部。将预染分子量标准与样品平行电泳以估计分子量。电泳后，立即将胶电转移到硝酸纤维素膜上用于Western印迹。
Western印迹分析使用Towbin转移缓冲系统将分开的蛋白质从SDS-PAGE凝胶电泳转移到硝酸纤维素膜。电泳后，将凝胶在转移缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、20％(v/v)甲醇，pH 8.3)中平衡15分钟。使用mini-Protean转移印迹设备(Bio-Rad)将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。按照生产商的说明书装配凝胶固定器后，在4℃以30V转移过夜。在室温下用含有5％(w/v)的脱脂乳粉的10ml Tris缓冲盐溶液(TBS)封闭含有分离蛋白质的新转移硝酸纤维素膜1小时。用TBS(0.1％(v/v)吐温20(TBST))洗涤膜后，在室温下将膜与10mL 5000倍稀释的山羊抗猪IgG(全分子)-HRP孵育1小时。用10mL DAB底物溶液(0.5mg/ml 3，3’-二氨基联苯、0.003％过氧化氢、TBS)使膜显色。用蒸馏水洗涤膜终止显色反应。使膜干燥并扫描用于展示。
测序多毛结肠短螺旋体插入片段选择AHP1质粒用于使用ABI 373A DNA测序仪(PE AppliedBiosystems)直接测序多毛结肠短螺旋体基因组插入片段。按照生产商的说明书使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中纯化噬菌粒。使用与插入物末端任一侧的载体区退火的市售T3和T7寡核苷酸得到起始插入序列。基于上游插入序列的3’-OH设计剩余的寡核苷酸(表2)。“TA”表示使用该寡核苷酸的PCR的优化退火温度。
表2

以等分式样(10μl)的噬菌粒(300ng)、引物(4pmol)和ABI PRISMTMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE AppliedBiosystems)进行每一个测序反应。循环条件包括96℃2分钟的变性步骤，随后是96℃变性10秒、于引物解链温度(表2)退火5秒和60℃引物延伸4分钟的25个循环。用含有120mM乙酸钠(pH 4.6)的95％乙醇沉淀除去残余的染料终止子，并真空干燥。使用ABI 373A DNA测序仪分析测序产物。
完成Bpmp-72序列将基因组DNA片段克隆进测序载体用HinDIII将来自多毛结肠短螺旋体的纯化的染色体DNA完全消化。简言之，在37℃分别将染色体DNA(2μg)和pTrcHis质粒(1μg)(Invitrogen)在含有20U的HinDIII(New England Biolabs)的1×HinDIII缓冲液中孵育过夜。按照生产商的说明书使用UltraClean PCR Clean-up试剂盒(MoBio Laboratories)纯化限制性产物。在14℃下将线性化pTrcHis载体(100ng)的等分式样与限制性多毛结肠短螺旋体基因组DNA(100ng)在含有1U T4DNA连接酶(Promega)的30mM Tris-盐酸(pH 7.8)、10mM MgCl2、10mMDTT和1mM ATP中孵育16小时。该连接反应的产物命名为pTrc-PIL。还包括了作为载体重新环化阴性对照的不含基因组DNA的同一连接反应。以总体积20μl进行所有的连接反应。
聚合酶链式反应(PCR)扩增连接的DNA使用的引物为与pTrcHis HinDIII克隆位点侧翼的互补序列退火的pTrcHis-F(5′-CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3′)(SEQ ID NO26)和与多毛结肠短螺旋体局部ORF 5’端互补序列退火的AHP-Rev(5′-TCGCTTGCAGTTTGAGGAGTG-3′)(SEQ ID NO27)。使用TaqDNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以50μl总体积通过PCR扩增连接的DNA。扩增混合物由1×PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2)、0.5U Taq DNA聚合酶、0.05U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每种dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM引物对(pTrcHis-F、AHP-Rev)和pTrc-PIL(2μl)组成。循环条件包括94℃5分钟的起始模板变性步骤和随后的94℃变性30秒、55℃退火15秒和68℃引物延伸4分钟的30个循环。在1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸、1mM EDTA)中将PCR产物置于1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光观察。
测序Bpmp-72的ORF延伸按照生产商的说明书使用UltraClean PCR Clean-up试剂盒纯化pTrc-PIL的PCR扩增产物。使用pTrcHis-F和AHP-Rev重复测序PCR产物。以由PCR产物(50ng)、引物(2pmol)和ABI PRISMTMDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE Applied Biosystems)组成的10μl体积进行每一个测序反应。循环条件包括96℃2分钟的变性步骤和随后的96℃变性10秒、55℃引物退火5秒和60℃引物延伸4分钟的25个循环。用含有120mM乙酸钠(pH 4.6)的95％乙醇沉淀除去残余的染料终止子，并真空干燥。使用ABI 373A DNA测序仪分析测序产物。用SeqEdv1.0.3和Vector NTI第6版编辑、汇编和比较测序结果。
测序剩余的Bpmp-72ORF
如上文重复pTrc-PIL的PCR扩增。使用的引物为pTrcHis-F和AHP-Rev2(5’-TGGATTTTGAAGCTATTGCTC-3’)(SEQ ID NO28)。SEQ ID NO28与延伸的Bpmp-72 ORF 5’端的互补序列退火。使用pTrcHis-F和AHP-Rev2引物如前述进行Bpmp-72 ORF剩余位置区域的测序。使用ABI 373A DNA测序仪分析测序产物。用SeqEd v1.0.3和VectorNTI第6版编辑、汇编和比较测序结果。
分析假想的Bpmp-72 ORF使用SeqEd v1.0.3(PE Applied Biosystems)编辑和汇编测序结果。使用Vector NTI第6版(InforMax)和University of Wisconsin GeneticsComputer Group程序分析核苷酸序列。用推定的假想开放读码框(ORF)在国家生物信息中心(NCBI)可供使用的所有数据库搜索同源性。
聚合酶链式反应(PCR)分析短螺旋体属中的Bpmp-72设计并优化了与Bpmp-72 ORF的913bp和1692bp区退火的两种引物用于PCR检测来自82种短螺旋体基因组DNA的编码72kDa外膜蛋白的基因48株猪痢疾短螺旋体、18株多毛结肠短螺旋体、12株B.intermedia、8株B.murdochii、4株良性短螺旋体、2株“犬短螺旋体”、1株Brachyspiraalvinipulli和1株B.aalborgi。使用的引物为与多毛结肠短螺旋体ORF侧翼互补序列退火的AHP-F4(5’-CAAGTAATAGCTAAAGGTGATG-3’)(SEQ ID NO29)和AHP-R783(5′-TTACTGTTGTGCTTGAGTAGTG-3′)(EQ ID NO30)。使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以50μl总体积通过PCR扩增基因。扩增混合物由1×PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2)、0.5U Taq DNA聚合酶、0.05U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每种dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM引物对(AHP-F4、AHP-R783)和2.5μl纯化的染色体模板DNA组成。循环条件包括94℃5分钟的起始模板变性步骤和随后的94℃变性30秒、55℃退火15秒和68℃引物延伸2分钟的30个循环。在1×TAE缓冲液(40mMTris-乙酸、1mM EDTA)中将PCR产物置于1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光观察。
测序其他多毛结肠短螺旋体菌株中存在的Bpmp-72来自多毛结肠短螺旋体菌株的Bpmp-72的PCR设计并优化了用于PCR扩增Bpmp-72以获得测序模板的两种引物与Bpmp-72ORF上游98碱基对退火的AHP-98F(CGTTTAGCTGAACTTGAAGCTATG-3′)(SEQ ID NO31)和与ORF下游178碱基对退火的AHP-1890R(5′-GTAATGCTCTGTCTTAATCAT-3′)(SEQ ID NO32)。使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以50μl总体积通过PCR扩增基因。扩增混合物由1×PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2)、0.5U Taq DNA聚合酶、0.05U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每种dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM引物对(AHP-L1、AHP-R1)和2.5μl纯化的染色体模板DNA组成。循环条件包括94℃5分钟的起始模板变性步骤和随后的94℃变性30秒、55℃退火15秒和68℃引物延伸4分钟的30个循环。在1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸、1mM EDTA)中将PCR产物置于1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光观察。
测序来自多毛结肠短螺旋体菌株的Bpmp-72按照生产商的说明书使用UltraClean PCR Clean-up试剂盒纯化来自六株多毛结肠短螺旋体菌株的PCR产物。使用AHP-98F、AHP+1890R和AHP+1012R(5’-TATCGCTTGCAGTTTGAGGAG-3’)(SEQ ID NO33)重复测序PCR产物。以由PCR产物(50ng)、引物(2pmol)和ABI PRISMTMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE AppliedBiosystems)组成的10μl体积进行每一个测序反应。循环条件包括96℃2分钟的变性步骤和随后的96℃变性10秒、55℃引物退火5秒和60℃引物延伸4分钟的25个循环。用含有120mM乙酸钠(pH 4.6)的95％乙醇沉淀从测序产物中除去残余的染料终止子，并真空干燥。使用ABI 373A DNA测序仪分析测序产物。用SeqEd v1.0.3、Vector NTI第6版和ClustalX编辑、汇编和比较测序结果。
结果在大肠杆菌中分离和表征编码72kDa外膜蛋白的重组噬菌粒如上文所述用短螺旋体属(除了多毛结肠短螺旋体以外的)全细胞和大肠杆菌全细胞吸收来自用多毛结肠短螺旋体菌苗超免疫的猪的血清。吸收血清(AHPS)针对多毛结肠短螺旋体外包膜提取物的Western印迹显示AHP主要与表观分子量72kDa的蛋白质反应(图1)。筛选多毛结肠短螺旋体λZAP基因组文库产生六株克隆，命名为AHP1-6。这些克隆都产生表观分子量34kDa的普通蛋白质，所述蛋白质均与AHPS强烈反应(图2)。对一个克隆测序鉴定出了编码容量29.4kDa的783碱基对局部ORF。认为该局部ORF编码多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白的羧基端。
开放读码框的序列分析基序和保守结构域使用表2列出的引物对AHP1质粒测序显示多毛结肠短螺旋体基因组DNA的1009碱基对的插入片段。插入DNA的序列分析显示了从碱基1到783的带有推定的ATG起始密码子和TAA终止密码子的783碱基对的可能的局部ORF(图3)。进一步对剩余基因进行克隆和测序显示Bpmp-72的编码序列大小为1692个核苷酸。在ATG起始密码子上游鉴定了可能的Shine-Dalgarno核糖体结合位点(AGGAG)和推定的-10(AGGAG)和-35(TTGAAA)启动子区。编码72kDa外膜蛋白的基因序列命名为72kDa分子量的外膜蛋白(Bpmp-72)。
翻译多肽由564个氨基酸(aa)残基组成，预测分子量为62.1kDa。推导出的大小与天然Bpmp-72蛋白的Western印迹中看到的存在显著差异。Bpmp-72的假想编码容量和天然Bpmp-72外膜蛋白之间分子量的差异原因可能是翻译后修饰，如酰化、甲基化、乙酰化、磷酸化和硫酸化。氨基酸序列的分析显示在翻译多肽的C端存在与保守的赖氨酸基序(LysM)结构域同源的118个残基的区域。该结构域是广泛分布的蛋白质模块，最初在降解细菌细胞壁的酶中鉴定，尽管已经显示它也存在于许多其他细菌蛋白中。LysM结构域是细菌表面蛋白中最普遍的模块之一。具有LysM结构域的其他细菌蛋白如Staphlococci IgG结合蛋白和大肠杆菌亲密素与细菌致病相关。
测序短螺旋体物种中存在的Bpmp-72基因使用Bpmp-72特异性PCR扩增了来自48株猪痢疾短螺旋体、18株多毛结肠短螺旋体、12株B.intermedia、8株B.murdochii、4株良性短螺旋体、2株“犬短螺旋体”、1株Brachyspira alvinipulli和1株B.aalborgi的基因组DNA。Bpmp-72基因存在于所有的多毛结肠短螺旋体中，但不存在于任何猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.murdochii、良性短螺旋体、“犬短螺旋体”、Brachyspira alvinipulli或B.aalborgi中。选择6株多毛结肠短螺旋体用于测序存在的Bpmp-72基因。表3和表4概括了多毛结肠短螺旋体菌株Bpmp-72基因之间的同源性水平。
6种多毛结肠短螺旋体菌株的Bpmp-72基因在核苷酸水平显示出99.8％-100％的同源性(表3)。所有菌株具有翻译成564个氨基酸的蛋白质的1692bp基因。多毛结肠短螺旋体不同菌株之间高水平的同源性提示Bpmp-72可能是在物种中高度保守的基因座。
表3

六种多毛结肠短螺旋体菌株的Bpmp-72基因在氨基酸水平显示99.3-100％的同源性。所有菌株具有翻译成564个氨基酸的蛋白质的1692个碱基对的基因。多毛结肠短螺旋体不同菌株之间高水平的同源性提示Bpmp-72可能是在物种中高度保守的基因座。
表4

实施例2克隆、表达和纯化重组多毛结肠短螺旋体72kDa外包膜蛋白(Bpmp-72)方法质粒提取从甘油储藏库中将带有pTrcHis质粒(Invitrogen)的大肠杆菌JM109克隆划线到添加了氨苄青霉素(100mg/l)的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，并在37℃孵育16小时。将单克隆接种到添加了氨苄青霉素(100mg/l)的LB液体培养基(10ml)中并将液体培养基在37℃振荡孵育12小时。将过夜培养物整体以5000×g离心10分钟，并按照生产商的说明书使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)提取细胞中含有的质粒。使用Dynaquant DNA荧光计(Hoefer)定量纯化的质粒，并用TE缓冲液将DNA浓度调整到100μg/ml。纯化的pTrcHis质粒保存于-20℃。
载体制备以在100mM Tris-盐酸(pH 7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mMDTT和100μl/mlBSA中含有5U EcoR1(New England Biolabs)和5U Xho1(New England Biolabs)的100μl总体积在37℃将纯化的pTrcHis质粒(1μg)消化过夜。通过在1×TAE缓冲液中的1％(w/v)的琼脂糖凝胶中以90V电泳消化反应物(2μl)1小时来确认限制性载体。用溴化乙啶(1μg/ml)溶液使电泳的DNA染色并用紫外(UV)光观察。
按照生产商的说明书使用UltraClean PCR Clean-up试剂盒(Mo BioLaboratories)提取线性化的pTrcHis载体。使用荧光计定量纯化的线性化载体，并用TE缓冲液将DNA浓度调整到50μg/ml。纯化的限制性载体保存于-20℃。
插入片段制备引物设计设计了三对引物以扩增Bpmp-72基因的不同部分。表5显示了引物序列和克隆的所得基因部分。所有引物包含末端限制性酶切位点，以使得到的扩增子可以以粘性末端连接进线性化的pTrcHis载体中。正向引物的设计使得末端Xho1限制性酶切位点与pTrcHis的表达盒在框内。反向引物的设计使得在连接进pTrcHis载体的EcoR1克隆位点之后不产生过早的翻译终止密码子。用Amplify 1.2(威斯康辛大学)测试引物，且理论扩增子序列插入了pTrcHis载体中的正确位置。使用Vector NTI第6版(InforMax)进行嵌合pTrcHis表达盒的推导翻译，以确认Bpmp-72插入片段插入正确的读码框。
表5

Bpmp-72插入片段的扩增使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以100μl总体积通过PCR扩增Bpmp-72插入片段。简言之，扩增混合物由1×PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2)、1U Taq DNA聚合酶、0.1U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每种dNTP(Amersham PharmaciaBiotech)、0.5μM适当的引物对(AHP-F1-Xho1/AHP-R783-EcoR1、AHP-F1-Xho1/AHP-R223-EcoR1或AHP-F4-Xho1/AHP-R783-EcoR1)和2.5μl染色体模板DNA组成。通过将10μl冰冻多毛结肠短螺旋体菌株95/1000(从猪中分离的澳大利亚西部菌株)重悬于200μl TE并煮1分钟来制备染色体DNA。煮过的细胞以20000×g离心5分钟并收集上清液用作PCR模板。循环条件包括94℃5分钟的起始模板变性步骤和随后的94℃变性30秒、50℃退火15秒和68℃引物延伸2分钟的30个循环。在1×TAE缓冲液中将PCR产物置于1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光观察。
确认存在正确大小的PCR产物之后，如前述用UltraClean PCRClean-up试剂盒纯化PCR反应物。
Bpmp-72插入片段的限制性内切酶消化以在100mM Tris-盐酸(pH 7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mMDTT和100μl/mlBSA中含有1U EcoR1和1U Xho1的100μl总体积在37℃将纯化的PCR产物(50μg)消化过夜。使用UltraClean PCR Clean-up试剂盒纯化消化的插入片段DNA。用TE缓冲液从提纯柱上洗脱纯化的消化插入片段DNA，用荧光计定量，并用TE缓冲液稀释将DNA浓度调整到20μg/ml。纯化的限制性插入片段立即用于载体连接。
将Bpmp-72插入片段连接进pTrcHis载体以总体积20μl进行所有的连接反应。在14℃下将Xho1/EcoR1线性化的pTrcHis载体(100ng)与Xho1/EcoR1限制性Bpmp-72插入片段(20ng)在含有1U T4DNA连接酶(Promega)的30mM Tris-盐酸(pH 7.8)、10mMMgCl2、10mM DTT和1mM ATP中孵育16小时。还包括了作为载体重新环化阴性对照的不含Bpmp-72插入片段的同一连接反应。
将pTrc-Bpmp-72连接体转化进大肠杆菌细胞在冰上融化-80℃保存的感受态大肠杆菌BL21 StarTM(DE3)pLysOne Shot(Invitrogen)细胞，然后将细胞(50μl)转移进用冰预冷的含有5μl过夜连接产物反应物的(等价于25ng pTrcHis载体)1.5ml微离心管中。在凳子上轻轻敲打管的底部混合，并置于冰上30分钟。然后通过将管在42℃水浴中放置45秒随后放回冰上2分钟热激细胞。在37℃下使转化细胞在LB液体培养基(1ml)中轻柔混合复苏1小时。2500×g、5分钟收获复苏的细胞并将细胞重悬于新鲜LB液体培养基(50μl)中。用无菌玻璃棒将重悬细胞整体(50μl)均匀涂到添加了氨苄青霉素(100mg/l)的LB琼脂平板上。平板在37℃孵育16小时。
通过PCR检测大肠杆菌中的pTrc-Bpmp-72插入片段将每种构建体的12个单转化体菌落划线到含有氨苄青霉素(100mg/l)新鲜LB琼脂平板上并在37℃孵育16小时。在TE缓冲液(50μl)中重悬每一转化事件的单菌落并煮1分钟。使用煮过的细胞的等分式样(2μl)作为PCR模板。扩增混合物由1×PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2)、1U TaqDNA聚合酶、0.2mM每种dNT、0.5μM pTrcHis-F引物(SEQ ID NO6)和0.5μM pTrcHis-R引物(5’-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3’)(SEQ ID NO38)组成。循环条件包括94℃5分钟的起始模板变性步骤和随后的94℃变性30秒、60℃退火15秒和72℃引物延伸30秒的30个循环。在1×TAE缓冲液中将PCR产物置于1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光观察。
通过直接序列分析证实pTrc-Bpmp-72读码框将产生正确大小PCR产物的每一构建体的两个转化体接种到含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB液体培养基(10ml)中并在37℃振荡孵育12小时。以5000×g离心全部过夜培养物10分钟，并如前述用QIAgen SpinMiniprep试剂盒提取细胞中含有的质粒。纯化的质粒用荧光计定量。
用pTrcHis-F和pTrcHis-R引物对纯化的两种质粒进行自动化直接测序。以由质粒DNA(200ng)、引物(2pmol)和ABI PRISMTMDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE Applied Biosystems)组成的10μl体积进行每一个测序反应。循环条件包括96℃2分钟的变性步骤和随后25个循环的96℃变性10秒、60℃4分钟的组合的引物退火和延伸步骤。用含有120mM乙酸钠(pH 4.6)的95％乙醇沉淀除去残余的染料终止子并真空干燥。使用每一引物对质粒重复测序。使用ABI 373A DNA测序仪(PE Applied Biosystems)分析测序产物。成功连接的质粒命名为pTrc-Bpmp-72(全蛋白)、pTrc-Bpmp-72N(N端部分)和pTrc-Bpmp-72C(C端部分)。
大规模表达重组His6-Bpmp-72C选择大规模产生重组34kDa的Bpmp-72C端部分并进而用作疫苗。将大肠杆菌BL21中的pTrc-Bpmp-72C单菌落接种到250ml锥形瓶中含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB液体培养基(50ml)中，并在37℃孵育16小时。将含有添加了氨苄青霉素(100mg/l)的LB液体培养基(1L)的2L锥形瓶与过夜培养物(10ml)在37℃孵育，直至细胞在600nm处的吸光度为0.5(约3-4个小时)。然后通过加入终浓度1mM的IPTG来诱导培养物，并将细胞放回37℃振荡。诱导5小时后，将培养物转移到250ml离心瓶中，并使瓶在4℃以5000×g离心20分钟。弃去上清液并用10ml Ni-NTA变性裂解缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-盐酸、8M尿素，pH 8.0)重悬沉淀。将重悬细胞保存在-20℃。
大规模纯化重组重组His6-Bpmp-72C将-20℃保存的细胞悬液取出并在冰上融化。然后在冰上30秒超声破碎细胞3次，每轮超生之间冰上孵育1分钟。在4℃以20000×g离心10分钟使裂解液澄清，并将上清液转移到含有1ml柱床体积Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)的15ml柱上。在4℃翻滚(end-over-end)混合使重组His6标签蛋白与树脂结合1小时。用30ml Ni-NTA变性洗脱缓冲液(100mMNaH2PO4、10mM Tris-盐酸、8M尿素，pH 4.5)洗脱之前，先用50ml Ni-NTA变性洗涤缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-盐酸、8M尿素，pH 6.3)洗涤树脂。收集三个10ml的级分并保存于4℃。用4×样品处理缓冲液(10μl)处理每一洗脱液的等分式样(30μl)并煮5分钟。样品进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝G250(Sigma)染色。将染色胶在蒸馏水中平衡1小时并在两个纤维素片中室温干燥过夜。
透析和冻干纯化的重组His6-Bpmp-72C合并洗脱的蛋白质并转移进分子量截留(MWCO)为35000Da的含水透析管(Spectrum)中。取合并洗脱液的等分式样(200μl)并根据生产商的说明书用Biorad Protein Assay(Biorad)定量。4℃下使蛋白质对2l蒸馏水搅拌透析。以12小时的间隔将透析缓冲液更换8次。将透析过的蛋白从透析袋中转移进50ml离心管(40ml最大容积)中并将管置于-80℃。将管放进MAXI冻干机(Heto)中冻干至干燥。用PBS将冻干的蛋白质再水化至5mg/ml并保存于-20℃。
结果重组pTrc-Bpmp-72载体的结构表6显示在大肠杆菌中表达Bpmp-72不同部分的构建体。表5中显示用于产生克隆的插入序列的引物对。引物扩增确定的Bpmp-72部分，导致表达完整的Bpmp-72、其N端部分或C端部分。将多种插入序列克隆进pTrcHis表达载体产生大小分别为6081、5518和5171bp的重组载体pTrc-Bpmp-72、pTrc-Bpmp-72N和pTrc-Bpmp-72C。pTrcHis构建体的核苷酸序列证实所有构建体的表达盒在正确的框内。PtrcHis表达载体的预测翻译表明重组pHis6-Bpmp-72蛋白(66.3kDa)、pHis6-Bpmp-72N蛋白(46.9kDa)和pHis6-Bpmp-72C蛋白(34.6kDa)与天然Bpmp-72脂蛋白(62.1kDa)的推定氨基酸序列一致。PtrcHis构建体的完整质粒图显示于图4。
表6

表达和纯化重组Bpmp-72C大规模表达选定的含有pTrc-Bpmp-72C的重组克隆以产生足够的重组蛋白用于接种。重组Bpmp-72C蛋白和六组氨酸(4kDa)融合产生表观分子量34kDa的主要蛋白(图5)。λ噬菌体基因组文库的最初筛选中使用的AHPS与天然Bpmp-72和重组His6-Bpmp-72C均发生反应(图5)。
通过变性条件下的亲和层析成功纯化了His6-Bpmp-72重组抗原。六个重复批次大规模纯化的His6-Bpmp-72C的SDS-PAGE显示重组抗原纯度超过90％且蛋白质表达是一致的(图6)。使用该表达程序可以稳定的得到2mg/L的重组蛋白产量。在透析和冻干后成功产生了稳定的重组His6-Bpmp-72C抗原。
实施例3用多毛结肠短螺旋体72kDa外包膜蛋白的重组羧基端部分接种鸡方法用多毛结肠短螺旋体72kDa蛋白的重组34kDa羧基端部分全身和经口免疫两个15只鸡的组，然后用多毛结肠短螺旋体攻击以检测接种是否能防止多毛结肠短螺旋体定居。使用了第三组未接种的15只鸡作为对照。全部45只禽置于一个房间中单独的笼子中。三个组的命名为i)A组未接受接种；ii)B组与佐剂一起肌内接受重组蛋白(100μg)，3周后经嗉囊管接受1mg蛋白质。
iii)C组与佐剂一起肌内接受1mg重组蛋白，3周后经嗉囊管接受1mg蛋白质。
在第二次接种后两周用多毛结肠短螺旋体的鸡菌株(Csp1)经口攻击所有的禽。
鸡和免疫方案用等体积的弗氏不完全佐剂乳化Bpmp-72的重组34kDa C端部分(His6-Bpmp-72C)，并注射进B和C每一组的15只小母鸡(ISA Brown产蛋小母鸡每只鸡约为18周龄，体重1.5kg)的胸肌中。B组中的每只鸡接受1ml总体积中的100μg蛋白质，C组中的每只鸡接受1ml总体积中的1mg蛋白质。A组中的鸡不接受接种。第一次接种三周后，B和C组的所有鸡接受直接进入嗉囊的2ml磷酸缓冲液中的1mg蛋白质。A组的鸡不接受接种。经口接种后两周，对全部禽直接进入嗉囊给予2ml指数对数期(～109细胞/ml)的多毛结肠短螺旋体。在连续的三天中重复攻击。将禽关在各自的笼子中。
在第一次接种前、仅临第二次接种前、第一天攻击前和五周后通过从翅脉采血获得血清。在ELISA中测试血清针对接种抗原的抗体，还在针对多毛结肠短螺旋体细胞提取物的Western印迹中进行测试。每周取所有鸡的排泄物三次并培养。用颈脱位法在实验性感染五周后将鸡杀死。
在死后收集小肠和结肠碎屑并通过ELISA和Western印迹分析测试特异性免疫球蛋白的含量。
螺旋体培养将从排泄物中取到的样品划线到含有5％(v/v)去纤维绵羊血、大观霉素(400μg/ml)、粘菌素(25μg/ml)和万古霉素(25μg/ml)的Trypticase Soy琼脂平板上。在通风环境中将这些平板在37℃孵育7天。基于弱β溶血作用和显微镜形态学将短螺旋体鉴定为多毛结肠短螺旋体。传代培养分离物的亚群并使用物种特异性PCR确定为多毛结肠短螺旋体。
(血清)ELISA用100μl碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中纯化的His6-Bpmp-72C(1μg/ml)包被微孔滴定板的孔并在4℃孵育过夜。在室温下用150μl PBS-BSA(1％w/v)混合封闭平板1小时然后用150μl PBST(0.05％v/v)洗涤三次。
将鸡血清200倍稀释于100μl PBST-BSA(0.1％w/v)中并在室温下混合孵育2小时。在加入以80,000倍稀释于PBST中的100μl山羊抗鸡IgG(完整分子)-HRP之前，(如上文)洗涤平板。室温孵育1小时后，洗涤平板并加入100μl TMB底物。在室温下显色10分钟，然后加入50μl 1M硫酸终止显色。在450nm处读出每一孔的光密度。
(粘膜)ELISA从小肠和结肠的15cm2切片中取得碎屑。将碎屑重悬于含有1％(w/v)的BSA、2mM PMSF、1mM EDTA和0.2％(w/v)的叠氮钠的1ml PBS中。将悬液彻底混合并以20000×g离心10分钟。取出上清液，用PBST稀释2倍并取100μl用于ELISA。该ELISA按照血清ELISA进行。
Western印迹分析将超声处理并澄清了的多毛结肠短螺旋体悬液等分式样(50mg)上样到7cm预制的孔中，电泳经过12.5％(w/v)的SDS-PAGE凝胶，并电转移到硝酸纤维素膜上。用TBS-脱脂乳(5％w/v)封闭膜并将膜装配到多探针仪(Biorad)中。孔与100μl稀释的混合鸡血清(200倍)或粘膜上清液(2倍)在室温下孵育2小时。用TBST(0.1％v/v)将孔洗涤三次，然后与100μl山羊抗鸡IgG(全分子)-HRP(10000倍)在室温下孵育1小时。从仪器中取出膜并用TBST洗涤三次。在10ml DAB溶液(5mg/ml、0.0003％(v/v)过氧化氢、TBS)中显色，当显色充分时用自来水洗涤膜。使膜干燥并扫描用于展示。
结果对接种的血清学应答鸡的全身血清学(ELISA)应答显示于图7-9。对照禽(A组)没有循环抗体，且在实验性感染后也没有产生(图7)。实验性感染后循环抗体加强的缺乏也可见于多数(但不是全部)接种的禽中(图8和图9)。用100μg蛋白质接种的禽(B组)中有6只显示适度的初次应答，而其他禽对疫苗显示弱的应答(图8)。相反，在11只接种1mg蛋白质的禽(C组)中可见良好的初次全身应答，而该组中剩余的4只禽对接种仅显示中度应答。除3只以外的所有禽在经口放大后都显示提高的应答(图9)。
接种鸡对多毛结肠短螺旋体提取物的Western印迹分析显示于图10和图11。每一组中显示了各取自3只禽的5组血清。Western印迹显示了这些应答对天然72kDa蛋白(尽管接种使用34kDa亚基)的特异性，并显示C组禽(1mg)具有较B组禽(100μg)更强的应答这一趋势。
鸡对接种和攻击(死后采样)的粘膜ELISA应答显示于图12。尽管被感染，对照禽不显示任何局部反应。仅有1只来自100μg接种组(B组)的禽(27号)在小肠和结肠都显示良好的局部抗体反应。该组中4只其他的禽(23、24、34和35号)在结肠显示中度局部反应。来自1mg接种组(C组)的两只禽(40和48号)在小肠显示良好的局部反应，而6只禽(36、38、40、41、43和50号)在结肠显示良好的局部反应。
图13显示具有较高抗体效价的禽粘膜提取物的Western印迹分析。所有禽的局部抗体应答都针对天然72kDa蛋白。这些结果表明嗉囊的经口接种(和随后的实验性攻击)能够沿胃肠道向下诱导局部反应。然而，经口接种在结肠(和小肠)中成功诱导可检测的局部反应是矛盾的(inconsistent)。
针对多毛结肠短螺旋体定居的保护表7显示三组禽中培养排泄物以获得多毛结肠短螺旋体的概括结果。三个组中个体禽的结果分别展示于表8-10。传代培养的全部分离物通过靶向16S rRNA基因的物种特异性PCR确定为多毛结肠短螺旋体。
表7


截至感染后(pi)9天，与两个接种组中的7％和0％相比，对照组产生80％定居率(表6)。随后，对照组中的定居率下降了，尽管在30天的时间段中保持了45％的平均率。相反，两个接种组中的定居率都趋向于随时间增加，B组在感染后30天出现最大的60％定居率，而C组在感染后25天出现最大的40％定居率。三个组在感染后30天的定居率相似。尽管如此，在整个时间段中对照组的定居率明显高于两个接种组。
表8显示非接种鸡在多毛结肠短螺旋体经口攻击后的个体定居结果。通过培养排泄物样品确定定居。(-)符号代表培养物阴性而(+)代表培养物阳性。表9显示接种鸡(100μg肌内+1mg经口)在多毛结肠短螺旋体经口攻击后的个体定居结果。通过培养排泄物样品确定定居。(-)符号代表培养物阴性而(+)代表培养物阳性。表10显示接种鸡(1mg肌内+1mg经口)在多毛结肠短螺旋体经口攻击后的个体定居结果。通过培养排泄物样品确定定居。(-)符号代表培养物阴性而(+)代表培养物阳性。
全部15只对照禽均发生定居，在实验时期的第3和6次采样之间(在11个可能的采样天数中平均为4.53)得到阳性样本。
B组结果显示14只禽在某些点发生定居，第1和第3次采样之间为阳性(平均采样天数为1.87)。在C组中，14只禽在某些点发生定居，第1和第5次采样之间为阳性(平均采样天数为1.6)。这些结果强调接种禽中感染总量小于对照禽，两种疫苗方案对于防止定居产生相似的结果。
当比较个体禽对定居的全身或结肠抗体应答时，没有得到一致的结果。对照禽对感染很少产生局部或全身抗体应答。考虑到B组中具有大于2天的定居的4只禽(21、24、29和30号)，它们的抗体效价不低于该组中定居时间较短的其他禽。未发生定居的禽(26号)具有与该组中其他相似的抗体效价。相反，在C组中，具有大于2天的定居的3只禽(37、46和49号)确实具有弱的结肠抗体应答。在这些禽中，37号禽具有良好的全身抗体应答，而46和49号禽则不然。未发生定居的禽(40号)具有中度全身抗体应答，但具有良好的结肠应答。在该接种组中，具有在较短定居的禽中发现较高的结肠抗体效价的趋势。
总体而言，该实验提供了该接种方案可诱导针对Bpmp-72的特异性循环和结肠抗体效价的证据。就这方面而言，肌内接种1mg蛋白质给出比使用100μg更好的应答。两种接种流程都明显推迟了多毛结肠短螺旋体定居，还降低了总体持续时间和定居的禽数(特别是与感染9天后对照组感染的高峰相比)。如果对照组中保持高定居率，还可以进一步加大该差异。这些结果提供了坚实的基础，以提示Bpmp-72可能发展为防止发生多毛结肠短螺旋体定居的鸡以及其他动物物种(包括猪、狗和人)的有效手段。

表8

表9

表10
序列表<110>莫道什大学<120>Bpmp-72新的核苷酸和氨基酸序列及它们的诊断和治疗用途<130>110427<160>38<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>1750<212>DNA<213>多毛结肠短螺旋体<400>1atgagtactt taataaagaa aatcgtagct tatatagctt taatctcttt tagttttagc 60gtattacctg ctcaaactta tgatgatgcg gctagaatta ctggagaagc tgagacttta 120caaaatgacg gagaatacca aaagtcttat gataaatctc aagaggcttc tgactctata 180gataaaacta ctgtatcatt attttataga ttaatgaact taagaatagc taaagcaaaa 240aatgatgcaa ataagactat taatgaaata gaacaattag gtgcttctac tgataatgaa 300tttaaaacaa aatatcaaga agctctaaaa ttctttgaag aaggaaataa tagtattact 360aacttacctc cagaaccgca aactcctcct acagatgaag agtttactgc ttcttcaaac 420acattcacta cagtatataa ttctttcaac aatgctttac aatctgctaa cagtgtaaaa 480gaaggttatc ttaatagaga aagagcaata gcttcaaaat ccattaatga tgctagaaac 540aaatataaag cagaattagg caagagtgta aaagcaggcg atgctaatga tagaaatatt 600aatggtgctt taactagagc tgatgaagca cttagcaatg acaattttgc aagcgttcag 660cagaatgtat ctactgcatt agctggtata aataaagcta tagcagatgc taaggcgaaa 720gctgaggcag aagctaaagc aaaagctgct gctgaagcta aggcaagagc tgaagcagag 780gctaaagcga aagcagaagc tgctgctaaa gcaaaagctg aagcagaggc taaagcgaaa 840gcagatgcaa tagcaaaagc taaaaaagac atagaagatg cacaaaataa atataataat 900ttagttaatg atcaagtaat agctaaaggt gatgataatg ataaaaacgt atcaaaactt 960ttaactgatg ctaataatgc tttacaaaac actcctcaaa ctgcaagcga taaagcttta1020gaagcttcta aaactatgga taatatatta aacactgcta atcaattgaa aaaagaagaa1080gctgttaaaa atctagagca attaaaggca agaagagaca gacttataag cgaaggttat1140ttaactaaag acagcgaaga agaacaaaag ttatctcaaa ctattaaaga agctgaagat1200
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<212>DNA<213>AHP+1890R<400>32gtaatgctct gtcttaatca t21<210>33<211>21<212>DNA<213>AHP+1012R<400>33tatcgcttgc agtttgagga g21<210>34<211>34<212>DNA<213>AHP-F1-Xho1<400>34agactcgaga gtactttaat aaagaaaatc gtag 34<210>35<211>31<212>DNA<213>AHP-R783-EcoR1<400>35gttgaattct tactgttgtg cttgagtagt g 31<210>36<211>31<212>DNA<213>AHP-R223-EcoR1<400>36taagaattcc ttataagtct gtctcttctt g 31<210>37<211>31<212>DNA<213>AHP-F4-Xho1<400>37ctactcgagc aagtaatagc taaaggtgat g 31<210>38<211>23<212>DNA<213>pTrcHis-R<400>38tgcctggcag ttccctactc tcg 2权利要求
1.分离的多肽，其包含(i)选自SEQ ID NO2至SEQ ID NO22的氨基酸序列；(ii)与来自(i)的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；(iii)与来自(i)的氨基酸序列至少80％一致的氨基酸序列；或(iv)任何(i)到(iii)的片段，其具有SEQ ID NO2所编码多肽的生物活性。
2.分离的多核苷酸，其包含(i)编码根据权利要求1的多肽的核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列；(iii)符合(i)或(ii)中所定义序列的简并形式的核苷酸序列；(iv)能与(i)到(iii)中的序列选择性杂交的核苷酸序列；(v)与(i)到(iv)中任何序列互补的核苷酸序列；(vi)适合作为引物或探针使用的(v)中序列的片段。
3.制备根据权利要求1的多肽的方法，所述方法包括以下步骤(i)在提供多肽表达的条件下培养含有与启动子有效连接的根据权利要求2(i)到(iv)的多核苷酸的细胞；和(ii)回收表达的多肽。
4.权利要求3的方法，其中使用层析回收多肽。
5.权利要求4的方法，其中层析包括使用Ni-螯合柱和/或凝胶过滤。
6.载体，其含有根据权利要求2的核苷酸序列的。
7.宿主细胞，其转化或转染了根据权利要求6的载体。
8.抗体，其特异于根据权利要求1的氨基酸序列。
9.权利要求8的抗体，其还含有可检测标记。
10.制备抗体的方法，所述方法包括步骤(i)将根据权利要求1的多肽与载体蛋白缀合；(ii)对动物施用(i)的缀合物和佐剂；并(iii)从动物中分离得到的抗体。
11.从样品中筛选短螺旋体物种的方法，其中短螺旋体物种包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体，所述方法包括以下步骤(i)在适当的杂交条件下使样品与根据权利要求2(vi)的多核苷酸接触；和(ii)检测多核苷酸和样品中核苷酸序列之间形成的任何双链体。
12.根据权利要求11的方法，其中多核苷酸选自SEQ ID NO24和SEQ ID NO27至37。
13.筛选样品中根据权利要求1的多肽的方法，所述方法包括(i)在允许形成反应复合物的条件下使样品与根据权利要求8的抗体接触；和(ii)检测反应复合物。
14.筛选样品中根据权利要求8的抗体的方法，所述方法包括(i)在允许形成反应复合物的条件下使样品与根据权利要求1的多肽接触；和(ii)检测反应复合物。
15.筛选样品中短螺旋体物种的试剂盒，其中短螺旋体物种包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体，所述试剂盒含有(i)根据权利要求2(vi)的多核苷酸；和(ii)检测该多核苷酸和样品中核苷酸序列之间形成的任何双链体的手段。
16.筛选样品中根据权利要求1的多肽的试剂盒，所述试剂盒含有(i)根据权利要求8的抗体；(ii)检测含有该抗体的反应复合物的手段。
17.筛选样品中根据权利要求8的抗体的试剂盒，所述试剂盒含有(i)根据权利要求1的多肽；(ii)检测含有该多肽的反应复合物的手段。
18.治疗动物中与短螺旋体物种相关的疾病的方法，其中短螺旋体物种包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体，所述方法包括对动物施用有效剂量的选自以下的组合物(i)含有根据权利要求2(i)到(iv)的多核苷酸序列的组合物，所述多核苷酸序列采取适于引起表达该多核苷酸所编码多肽的形式；(ii)根据权利要求1的多肽；或(iii)与佐剂共存的(i)或(ii)。
19.治疗动物中与短螺旋体物种相关的疾病的方法，其中短螺旋体物种包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体，所述方法包括对动物施用有效剂量的含有根据权利要求2(v)的多核苷酸的组合物。
20.根据权利要求18或19的治疗疾病的方法，其中疾病为肠螺旋体病。
21.使动物对与短螺旋体物种相关的疾病免疫的方法，其中短螺旋体物种包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体，所述方法包括施用致免疫剂量的选自以下的组合物(i)含有根据权利要求2(i)到(iv)的多核苷酸序列的组合物，所述多核苷酸序列采取适于引起表达该多核苷酸所编码多肽的形式；(ii)根据权利要求1的多肽；或(iii)与佐剂共存的(i)或(ii)。
22.根据权利要求21的方法，其中疾病为肠螺旋体病。
23.根据权利要求18到22中任一项的方法，其中动物选自猪、鸡、狗、马、牛、绵羊、鱼和人。
24.含有载体和(i)根据权利要求1的多肽；(ii)根据权利要求2的多核苷酸；或(iii)根据权利要求8的抗体的组合物。
25.用于筛选的试剂盒，所述试剂盒至少含有与Bpmp-72编码多核苷酸序列的一部分互补的多核苷酸序列、合适的容器及其使用说明书。
26.根据权利要求2的多核苷酸或根据权利要求2的多肽的用途，用于制造治疗或预防与短螺旋体物种相关的疾病的药物，其中短螺旋体物种包括但不仅限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛结肠短螺旋体。
全文摘要
本发明涉及多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白(Bpmp－72)及其氨基酸和核苷酸序列。本发明还涉及这些序列在多毛结肠短螺旋体感染(肠螺旋体病)的预防(接种)和治疗中的用途。
文档编号A61P1/12GK1898385SQ200480038092
公开日2007年1月17日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月19日
发明者D·J·汉普森, T·拉 申请人:莫道什大学, 诺瓦提斯公司