一种新型药物蛋白draco及其在防治猪蓝耳病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型药物蛋白DRACO及其在防治猪蓝耳病中的应用。本发明利用NCBI上猪相关序列，设计出既有活性又能够进入细胞的DRACO蛋白编码基因，然后在原核表达系统中表达并纯化出DRACO蛋白，在Marc-145细胞水平上通过qRT-PCR、Western-Blot、细胞上清TCID50检测及IFA等方法研究其对HP-PRRSV的抗病毒作用，并进一步阐述DRACO在病毒吸附和进入细胞两个过程中的抗病毒机制。本发明所述方法制得的DRACO对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物。
【专利说明】一种新型药物蛋白DRACO及其在防治猪蓝耳病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域。更具体地，涉及一种新型药物蛋白DRACO及其在防治猪蓝耳病中的应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse, PRRSV)引起。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus (LV)毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSV )。PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年龄段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。
[0003]PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5'和3'非编码区，中间为10个开放阅读框(openreading frame, ORF),其中 0RF2-7 分别翻译病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。
[0004]PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面:(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs) , PAMs是免疫细胞,破坏PAMs,从而破坏机体免疫系统,从而引起免疫抑制；(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；(3)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(4)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症；(5)混合感染，目前临床上混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌等与PRRSV的混合感染使PRRSV防控难上加难。
[0005]目前PRRSV防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点:(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；(2)不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；(3)产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；(4 )存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。
【发明内容】
[0006]本发明为了克服现有防控PRRSV病毒的疫苗存在的问题，研究寻找一种对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果的药物，能够更好地防治猪蓝耳病。
[0007]本发明的目的在于提供一种有活性且能够进入细胞的新型药物蛋白DRACO的编
码基因。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种有活性且能够进入细胞的新型药物蛋白DRACO。
[0009]本发明的又一目的是提供上述蛋白DRACO在制备抗病毒病药物中的应用。
[0010]优选地，所述的病毒是在转录和复制过程中能够产生长的dsRNA螺旋区的病毒。
[0011]更优选地，所述的病毒是PRRSV病毒。
[0012]上述DRACO基因序列为SEQ ID N0.1所示。DRACO氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示，DRACO蛋白由3部分组成:转导标签、dsRNA检测结构域及细胞凋亡诱导结构域。
[0013]转导标签为PTD且存在于蛋白N端，氨基酸序列为SEQ ID N0.3。dsRNA检测结构域氨基酸序列为DRACO蛋白氨基酸序列的第14位到第194位，如SEQ ID N0.6，细胞凋亡诱导结构域氨基酸序列为DRACO蛋白氨基酸序列的第195位到第291位，如SEQ ID N0.7。
[0014]一种原核表达载体，是由出发载体PET-28A的多克隆位点插入DRACO基因序列SEQID N0.1构建而成。
[0015]一种重组原核表达菌株，含有上述DRACO的编码基因序列。
[0016]DRACO抗病毒机制为:大部分病毒在转录和复制过程中都会产生长的dsRNA螺旋区，而未被感染的细胞不会产生，故被病毒感染的细胞能被DRACO检测到，启动细胞凋亡信号通路，从而使病毒感染的细胞凋亡，而正常细胞不受影响。
[0017]PRRSV病毒在转录和复制过程中会产生较长的dsRNA螺旋区，故本发明研究DRACO对PRRSV病毒的防治作用，并已在细胞水平证明DRACO对PRRSV有很好的抗病毒效果。
[0018]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
首先根据NCBI上猪的相关基因序列设计DRACO蛋白编码基因，然后利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化出DRACO蛋白 ，进而在细胞水平上研究DRACO对HP-PRRSV的抗病毒效果。具体实验设计如下:
根据 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)查找获得的猪蛋白激酶 R (ProteinKinase R, PKR)(即dsRNA检测结构域)(序列号为AB104654.1)基因部分序列(如SEQ IDN0.4所不)和细胞凋亡蛋白酶激活因子I (apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1，序列号为AF013263.1)的基因部分序列(如SEQ ID N0.5所示)，N端加上转导肽序列PTD，设计得到DRACO蛋白编码基因，序列为SEQ ID N0.1所示。
[0019]将设计得到的DRACO序列送生工生物工程(上海)有限公司(http://sangon.com/)合成；将合成得到的DRACO蛋白编码基因克隆到原核表达载体pET_28A，构建得到原核表达载体pET-DRACO，然后在表达菌株BL21 (DE3)中IPTG诱导表达；最后经过纯化得到DRACO蛋白。
[0020]DRACO细胞毒性试验:AlamarBlue (购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作DRACO细胞毒性图。[0021]DRACO抗病毒试验:用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至细胞汇合度为60-70%，弃去培养液，PBS洗3次，分别加入含MOI=0.1和I (空斑形成单位PFU=0.7XTCID50,感染复数MOI=病毒数/细胞数)HP-PRRSV病毒的2%胎牛血清的DMEM培养液，37°C继续培养5h，PBS洗3遍，加入不同浓度的DRACO的2%胎牛血清的DMEM培养液，37°C培养36h，收集上清做TCID5tl检测；收集细胞做qRT_PCR(N基因定量引物见SEQ IDN0.8 和 SEQ ID N0.9)和 Western-Blot 检测。
[0022]DRACO 抗病毒间接免疫突光试验(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA):同上抗病毒试验方法，收集细胞，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS洗lOmin，10%Triton_100穿孔15min，PBS洗lOmin，然后用PBS稀释的1%BSA封闭30min，加入抗PRRSV病毒N蛋白的一抗，室温Ih,再加入抗鼠二抗作用lh, Hoechst染核5min, PBS洗IOmin,然后在突光显微镜下观察DRACO抗病毒效果。
[0023] DRACO抗病毒机制研究:(I )DRAC0是否通过影响HP-PRRSV吸附Marc-145细胞从而达到抗HP-PRRSV的目的的研究:首先，当Marc-145细胞在6孔板中汇合度为70%时，PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并加入浓度梯度的DRACO，4°C孵育2h，孵育完后，用PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培养箱中培养24h，收集细胞对N基因做qRT-PCR和Western-Blot检测；
(2) DRACO是否通过抑制HP-PRRSV进入Marc-145细胞来达到抗HP-PRRSV的目的的研究:首先，在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，孵育完后，用PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后加入浓度梯度的DRACO的营养液在5%C02、37°C培养箱中培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，收集细胞进行Western-Blot检测；
(3 )当PRRSV进入细胞4h和6h后，PG-1是否还有抗病毒作用的研究。首先，在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗
3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培养箱中培养4h和6h，PBS洗3次，分别将浓度为40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞进行 Western-Blot 检测。
[0024]统计学分析。以上所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用泣t 来分析。所有统计分析均采用以八％ 作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
[0025]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明首次设计得到一种新的防治猪蓝耳病的药物DRACO蛋白，最终设计并合成的DRACO具有活性且能够进入细胞发挥作用。
[0026]通过TCID5(1、qRT-PCR、IFA 及 Western-Blot 等多种方法证明了 DRACO 对 HP-PRRSV有很好的抗病毒作用，为研制抗猪蓝耳病的新型药物奠定了基础。
[0027]本发明对DRACO抗HP-PRRSV的机制进行了研究，包括病毒吸附细胞和进入细胞两个过程的研究。结果表明DRACO能够显著性地降低N基因和N蛋白表达水平，且随着DRACO浓度的升高，抑制效果更明显，且DRACO抗病毒作用主要发生在PRRSV进入细胞过程中，当PRRSV进入细胞4h和6h后，DRACO抗病毒效果不明显。【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为DRACO原核表达SDS-PAGE图。
[0029]图2为DRACO表达后纯化图。1:100mM咪唑缓冲液洗脱；2:300mM咪唑缓冲液第一次洗脱；3:300mM咪唑缓冲液第二次洗脱。
[0030]图3为DRACO细胞毒性试验结果统计图。
[0031]图4为DRACO抗病毒试验中，分别经不同浓度DRACO处理后的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞上清中的病毒滴度图。
[0032]图5为DRACO抗病毒试验中，经80mg/L DRACO作用36h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图。
[0033]图6为DRACO抗病毒试验中，经不同浓度DRACO处理36h后，N蛋白表达水平图。
[0034]图7为DRACO抗病毒间接免疫荧光试验检测DRACO抗病毒效果图；绿色为抗PRRSVN蛋白颜色，蓝色为Hoechst染细胞核颜色。
[0035]图8为DRACO抗病毒机制一病毒吸附细胞过程中，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图。
[0036]图9为DRACO抗病毒机制一病毒吸附细胞过程中，N蛋白Western-Blot检测图。
[0037]图10为DRACO抗病毒机制一病毒进入细胞过程中，N蛋白Western-Blot检测图。
[0038]图11为DRACO抗病毒机制一病毒进入细胞4h后，N蛋白Western-Blot检测图。
[0039]图12为DRACO抗病毒机制一病毒进入细胞6h后，N蛋白Western-Blot检测图。
【具体实施方式】
[0040]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试验方法、试剂以及设备为本【技术领域】常规方法、试剂和设备。
[0041]实施例1 DRACO基因设计合成与表达分析
1、DRACO基因设计合成:根据NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)查找获得的猪蛋白激酶R (Protein Kinase R, PKR)(序列号为AB104654.1)基因部分序列(如SEQ IDN0.4所不)和细胞凋亡蛋白酶激活因子I (apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1，序列号为AF013263.1)的基因部分序列(如SEQ ID N0.5所示)，N端加上转导肽序列PTD，PTD氨基酸序列为SEQ ID N0.3所示，设计得到DRACO蛋白编码基因，序列为SEQ IDN0.1所示。该基因编码的DRACO蛋白氨基酸序列为SEQ ID N0.2。将设计得到的DRACO序列送生工生物工程(上海)有限公司(http://sangon.com/)合成。
[0042]2、构建DRACO基因重组原核表达菌株:将上述合成得到的DRACO基因克隆到原核表达载体PET-28A，构建得到原核表达载体pET-DRACO，其插入酶切位点为Kpn I和HindIII;然后将原核表达载体pET-DRACO转化菌株BL21 (DE3)感受态细胞，Kan+抗性筛选、鉴定、测序，阳性重组表达菌株甘油保存于-80° C冰箱。
[0043]3、重组表达菌株的诱导表达:吸取上述甘油保种的重组大肠杆菌50 μ L，加入装有5mL Kan+抗性的LB液体培养基的细菌培养瓶，37° C振荡培养过夜，分别吸取上述复苏的菌液50 μ L，加入两个装有200mlLKan+抗性的LB液体培养基的细菌培养瓶，37° C摇床培养4h，至OD6tltl达到0.6~1.0时，一瓶加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L (5 μ I)诱导表达，另一瓶不加，做好标记，继续培养3h后,8000rpm离心2min收集菌体。
[0044]4、DRACO可溶性分析:用500 μ ILPBS悬浮菌体，选择合适的浮漂，置于冰水中，清洗3次，选取合适的探头(探头置于液面下，防止产生泡沫)，调节工作时间IOmin ;调节破碎5S，停止5S ;选择功率30% (150 W)，破碎完成后于4° C 12000rpm离心15~20min，收集上清液，沉淀用300 μ ILPBS悬浮，于-80° C保存。
[0045] 5、DRACO蛋白SDS-PAGE鉴定:取上清液和悬浮的沉淀40 μ L，加入10 μ L的
5X loading buffer,沸水中煮IOmin,进行SDS-PAGE分析,分析DRACO表达蛋白的可溶性。见附图1，图中I为未加IPTG诱导表达，2为IPTG诱导表达，M为预染蛋白分子Marker。
[0046]实施例2 DRACO蛋白的纯化
利用His-tag过柱纯化DRACO蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(购自Thermo Scientific公司，货号:23227)测定DRACO蛋白浓度。
[0047]1.准备好蛋白样品，憐酸盐缓冲液、Binding buffer、Washing buffer、Elutionbuffer、20%乙醇、蒸馏水，在铁架台上装好N1-NTA层析柱。
[0048]2.用注射器加入柱体积(5mL) 4倍的ddH20清洗N1-NTA层析柱，平衡层析柱，用柱体4倍体积的Binding buffer,平衡柱子,Binding buffer起了粘附作用，目的是为了接下来的，过滤含Hi s标签的蛋白粘附在N1-NTA树脂，将含Hi s标签的过滤好的蛋白，用相同的方法，加到装有N1-NTA树脂的层析柱。
[0049]3.用柱体积的4倍的Washing buffer,用相同的方法注入到装有N1-NTA树脂的层析柱去除一些弱结合和非特异性结合的目的蛋白，用柱体积4倍的Elution buffer，用相同的方法注入N1-NTA层析柱从镍柱上洗脱下带有His标签的目的蛋白，用1.5mlLEP管分装，每管lmL，-80° C保存。
[0050]4.用柱体积4倍的含300mM咪唑的磷酸盐缓冲液，注入N1-NTA层析柱，除去所有杂蛋白，清洗层析柱，用柱体积的4倍的ddH20，清洗装有N1-NTA树脂的层析柱，保存层析柱，用柱体积的4倍的20%乙醇清洗N1-NTA层析柱后，4° C保存。纯化得到的DRACO蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图2。
[0051]实施例3 DRACO细胞毒性试验
AlamarBlue (购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂,在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60_70%，弃去培养液，加入含DRACO倍比稀释的营养液作用36h，设定PBS对照组，然后加入10% (V/V)比例AlamarBlue继续培养3h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作DRACO细胞毒性图。见附图3，以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的DRACO处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下DRACO相对细胞活性，由图3可知，当DRACO浓度为80mg/L时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100%，此浓度即为后面试验的最大浓度。
[0052]实施例4 DRACO抗病毒试验
1.在含10%胎牛血清的DMEM培养基的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以MOI=0.1和I接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37 °C继续培养5h。[0053]2.PBS洗3遍，将浓度为80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，每孔加400 μ L Trizol，提RNA,做qRT-PCR检测。结果见图5，结果表明在转录水平上，DRACO可显著性地降低N基因表达水平。
[0054]3.同上以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37°C继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，并设PBS对照组，收集ImL上清做TCID5tl检测，结果见图4，结果表明DRACO可显著性地减少细胞上清中的病毒产量，抑制病毒释放到细胞上清中。另外弃去剩余培养液，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测，结果见图6，结果表明在蛋白翻译水平上，DRACO可明显的降低N蛋白表达水平。
[0055]4.在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37°C继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS 洗 lOmin，10%Triton_100 穿孔 15min，PBS 洗 lOmin，然后用 PBS 稀释 1%BSA 封闭 30min，抗PRRSV N蛋白一抗室温lh，抗鼠二抗作用lh，Hoechst染核5min，PBS洗lOmin，IFA检测。结果见图7，由图7可知，DRACO浓度为40、60、80mg/L时，PRRSV病毒N蛋白荧光值明显低于PBS对照组，表明PRRSV病毒N蛋白几乎没有在细胞中表达，即说明DRACO抗病毒效果明显，且当DRACO浓度为80mg/L时,抗病毒效果最明显。
[0056]实施例5 DRACO抗病毒机制研究:HP_PRRSV吸附抑制试验
1.在Marc-145细胞汇合度7 0%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入浓度为40、60、80mg/L DRACO，4°C孵育2h。
[0057]2.PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培养箱中继续培养24h，弃去培养液，PBS洗3次，收集细胞，每孔加400 μ L Trizol,提RNA，对N基因做qRT-PCR检测，见图8 ;裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测，见图9，结果表明DRACO能够显著性地降低N基因和N蛋白表达水平，且随着DRACO浓度的升高，抑制效果更明显，说明在HP-PRRSV吸附细胞过程中，DRACO有抗病毒效果。
[0058]实施例6 DRACO抗病毒机制研究:HP_PRRSV进入抑制试验
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h。
[0059]2、PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后分别加入浓度为40、60、80mg/L DRAC0，在 5%C02、37°C培养箱中培养 6h。
[0060]3、PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞进行Western-Blot检测，见图10，结果表明在HP-PRRSV进入细胞过程中，DRACO有很好的抗病毒效果，甚至浓度为40mg/L时，都检测不到N蛋白表达水平，说明DRACO抗病毒作用主要发生在PRRSV进入细胞过程中。
[0061]4、当PRRSV进入细胞4h和6h后，PG-1是否还有抗病毒作用。首先，在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗
3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培养箱中培养4h和6h，PBS洗3次，分别将浓度为40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞Western-Blot检测，见附图11 (4h)和12 (6h)，结果表明，当HP-PRRSV在37°C进入细胞4h和6h后再用不同浓度DRACO处理，DRACO抗病毒效果不明显，只有当DRACO浓度为80mg/L时,才有抗病 毒效果,说明在病毒进入细胞后，DRACO抗病毒效果不明显。
【权利要求】
1.一种新型药物蛋白DRACO的编码基因，其特征在于，DRACO基因序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种新型药物蛋白DRAC0，其特征在于，DRACO的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根据权利要求2所述新型药物蛋白DRAC0，其特征在于，该蛋白由3部分组成:转导标签、dsRNA检测结构域及细胞凋亡诱导结构域，其中转导标签为PTD且存在于蛋白N端，PTD氨基酸序列为SEQ ID N0.3。
4.根据权利要求3所述新型药物蛋白DRAC0，其特征在于，所述的dsRNA检测结构域氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，细胞凋亡诱导结构域氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
5.一种重组原核表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点插入权利要求1所述SEQ ID N0.1基因序列。
6.一种重组原核表达菌株，其特征在于含有权利要求1所述DRACO的编码基因序列。
7.权利要求1所述DRACO的编码基因在制备抗病毒病药物中的应用。
8.权利要求2所述新型药物蛋白DRACO在制备抗病毒病药物中的应用。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述的病毒是在转录和复制过程中能够产生长的dsRNA螺旋区的病毒。
10.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于， 所述的病毒是PRRSV病毒。
【文档编号】A61P31/14GK103571863SQ201310469225
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】刘小红, 郭春和, 莫德林, 陈瑶生, 高进涛 申请人:中山大学