专利名称：溶组织类阿米巴在治疗恶性实体瘤中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶组织类阿米巴的应用，具体地说是溶组织类阿米巴在治疗恶性实体瘤中的应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的常见疾病之一，仅次于心血管疾病，且其发病呈逐年上升的趋势。目前，肿瘤的临床治疗方案较多采用以手术为主的综合治疗，包括化疗、物理疗法(放射、超声、热疗、低温技术等)、生物治疗、中医中药治疗，但均不理想。手术治疗癌症病人损伤大，易转移，放、化疗易杀伤病人的正常组织与破坏病人免疫系统，使病人抵抗力降低，而且病人的治疗费用高、疗效差、副作用大。因此，开拓新的恶性肿瘤的生物治疗研究领域是当今医学界的重要研究课题。
溶组织阿米巴(Entamoeba histolytica)是一种寄生在人类结肠中的寄生虫，属于肉足鞭毛门(Phylum Sarcomastigophora)的叶足纲(Class lobasea)。目前尚未有关于应用溶组织类阿米巴治疗恶性实体瘤的报道。
发明内容
本发明的目的是将溶组织阿米巴应用于治疗恶性实体瘤。
本发明的技术方案如下一种溶组织阿米巴的用途，它是用于治疗恶性实体瘤。即将具毒力的溶组织阿米巴滋养体，注入经B超、CT、核磁扫描等定位后的肿瘤中心部位，作为生物刀定位切除恶性实体瘤，以治疗恶性实体瘤。其剂量为每个肿瘤中心部位一次性注入阿米巴滋养体5-10ml。
溶组织类阿米巴在治疗恶性实体瘤中的应用，是将溶组织类阿米巴制成接种管(2-20ml/管)。
经人体或动物实验结果表明，溶组织阿米巴(Entamoeba histolytica)中引起侵入性阿米巴病的虫株(Entamoeba histolytica Schaudinn)可吸附、溶解、吞噬组织，同样也可以吸附、溶解、吞噬恶性实体瘤组织，发挥作用的因子为①半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集260kDa-介导吸附恶性实体瘤组织细胞。
②阿米巴穿孔素(amoeba pores)-在恶性实体瘤组织细胞形成孔状破坏，使细胞膜通透性改变，细胞萎缩。
③半胱氨酸蛋白酶—溶解恶性实体瘤组织细胞。
④阿米巴对宿主中性粒细胞有化学趋附性。粒细胞被滋养体触溶后出释出有毒氧化物而加剧恶性实体瘤组织破坏。
⑤滋养体表膜的植物凝血素(lectin)使恶性实体瘤组织血液凝集、止血、血栓形成；一方面瘤组织血液供应减少，瘤组织细胞饥饿死亡。另一方面瘤组织细胞通过血液扩散受到限制。
⑥例宿主感染溶组织类阿米巴后可激发体液及细胞免疫应答。恶性实体瘤组织淋巴细胞聚集，分泌各种IgG、IgM、IgA和IgE抗体及含丰富γ-干扰素、TNF、IL等细胞因子，进而活化巨噬细胞和中性粒细胞，使增强吞噬力，产生超氧化物，杀伤瘤组织，并在实体瘤组织周围形成一个免疫包围圈，使瘤组织细胞直接浸润扩散受到限制。
动物实验结果还表明，溶组织类阿米巴经过以上机制使恶性实体瘤变成阿米巴脓疡，完成了对恶性实体瘤的生物切除后，再采取各种阿米巴脓肿的治疗方法(引流，局部与全身抗阿米巴药物治疗等)治愈溶组织阿米巴脓疡，最后即达到应用溶组织类阿米巴作为一种生物刀定位切除恶性实体瘤的目的。因此，应用溶组织类阿米巴治疗恶性实体瘤不仅解决了手术治疗癌症病人损伤大，易转移，放、化疗损害病人正常组织与免疫系统使病人抵抗力降低及其他生物疗法效果不理想的严重缺陷，而且治疗费用低，疗效好，副作用低，开辟了癌症治疗的新途径。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述。
(四)具体实施例实施例1裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20(LCI-D35)的建立与阿米巴生物切除治疗(1)致病性溶组织类阿米巴的培养主要用Robinson”s培养基，不仅可以培养溶组织类阿米巴，也可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用6-7ml或更小的螺旋有盖培养管。
1.1组成成分(1)盐水琼脂斜面溶解15g琼脂粉和7-8g化钠于1000ml蒸馏水中，分装在小试管中高压灭菌(121℃，15min)，当琼脂冷却至75℃左右倾放使其形成斜面。
(2)红霉素将0.5g实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中，加入20ml70％乙醇溶解，4℃放置2h以上，而后加灭菌水至50ml。
(3)米粉梗米粉经高压消毒或180℃干燥灭菌。
(4)配制50mol邻苯二甲酸氢钾，PH6.3，高压灭菌。
(5)血清56℃，30min灭活，甚至未灭活的牛或马血清均可使用。
(6)R溶液贮存液NaCL 50g、(NH4)2SO410g、柠檬酸.2H2O 20g、MgSO47H2O 0.5g、KH2PO45g、乳酸(90％纯度)4ml，加水至950ml，调节PH至7.0，最终调节容量至1000ml，分装高压灭菌，制备成贮存工作液。使用时将100ml贮存液加入850ml双蒸水，调节PH7.0分装高压灭菌。
(7)BR溶液25ml R工作液与1个克隆的大肠杆菌，37℃振摇培养24-48小时。
(8)BRS溶液在上述BR溶液中加入等量血清，继续培养24-48小时即可。
1.2、操作步骤
在含琼脂斜面的培养试管中加入10mg米粉，120μl红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液4∶1混合液，加入少量(约50mg)粪便，混匀，37℃培养24小时后，移去培养上清液，加适量入4∶1混合液并加入60μl红霉素和米粉。37℃继续培养小48时后，取米粉与粪便混合物一滴，以碘液染色或直接观察有无滋养体；若未发现虫体再加入米粉，再培养24小时观察。若虫体阳性可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养，即为转种。取培养后72h，溶组织阿米巴约3.0×10虫体/10ml置于具塞15ml管中，120g离心5min，弃上清，用无菌生理盐水反复冲洗3-5次，用无菌生理盐水配成10×106虫体/10ml/管，封盖，置0-4℃运输，接种前用37℃水浴温孵30分钟后即可接种使用。
(2)人肝癌转移模型LCI-D20(LCI-D35)的建立与阿米巴生物切除治疗。
2.1对数期生长的HCCLM3癌细胞HCCLM3(细胞株由复旦大学肝癌研究所提供)。培养液丢弃，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，用胰酶消化，从培养瓶中洗脱，制成单细胞悬液。调整浓度至每0.2ml 5×106个/细胞，接种于裸小鼠(由中国科学院上海药物所实验动物部提供)右肩胛皮下。待肿瘤长到约1cm时，处死裸鼠，取肿瘤组织，除去表面纤维、血管。用PBS液洗后放入有DMEM培养液的培养皿中，切成1.0mm3组织块。用3％的硫酸戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸小鼠(40mg/kg)。取左肋下切口约1.5cm，分层切开腹壁进入腹腔，暴露肝左叶。在其表面做0.3cm切口，压迫止血，将瘤组织块植入肝内，8字形缝合肝脏，将肝脏送回腹腔，全层缝合腹壁。
2.2动物分组所有动物于原位接种瘤块后第10天，梭形切除原手术疤痕及切口周围皮肤、皮下组织、肌肉，进腹后仔细暴露移植瘤，将移植瘤成功的小鼠分成两组，每组10只，溶组织阿米巴生物治疗组，将具毒力的溶组织内阿米巴滋养体105～106/ml 0.1ml/只注入肝脏接种瘤生长部位中心区，对照组注入0.1ml/只无阿米巴的阿米巴培养液，7天形成肝脏阿米巴脓疡(可用B超进行观察)。当肝脏阿米巴脓疡生长至肝脏接种瘤体一倍大时开始实施抗阿米巴药物治疗，腹腔注射左氧氟沙星250mg/kg，/d，连续给药3W，B超进行观察肝脏阿米巴脓疡愈合情况确定治疗时间，对照组腹腔注射生理盐水。观察比较两组动物的生存时间，实验结束时，取肝肿块部位组织进行称重、病理切片及比较对照统计学T检验分析。结果见表1表1溶组织阿米巴定向接种对裸鼠人肝癌(LCI-D35)转移模型的影响
●与生理盐水组比较P＜0.01实施例2.应用溶组织阿米巴作为生物刀定位切除肝恶性实体瘤的临床试验临床确诊的原发性局限性肝癌患者，经B超、CT、核磁扫描等定位后，将具毒力的溶组织内阿米巴滋养体105～106/ml 5-10ml/注入肝脏肿瘤中心部位，经2-3W后形成肝癌部位肝阿米巴脓疡(可用B超进行观察)待肝阿米巴脓疡范围超过原肝脏肿瘤1CM时，经检测血中肝癌标志物(AFP)含量正常时，可认为肝肿瘤已被生物切除，开始通过局部引流与局部注射抗阿米巴药物，同时配合全身抗阿米巴、抗菌治疗及其它支持营养疗法，治愈阿米巴肝脓疡，最后达到恶性肿瘤临床或完全治愈的目的。
实施例3.应用溶组织类阿米巴作为生物刀定位切除肺恶性实体瘤的临床试验临床确诊的原发性局限性肺癌患者，经B超、CT、核磁扫描等定位后，将具毒力的溶组织内阿米巴滋养体105～106/ml 5-10ml/注入肺肿瘤中心部位，经2-3W后形成肺癌部位肺阿米巴脓疡(可用X光进行观察)待肺阿米巴脓疡范围超过原肝脏肿瘤1CM时(可用X光、CT、核磁进行检查)，可认为肝肿瘤已被生物切除，开始通过局部引流与局部注射抗阿米巴药物，同时配合全身抗阿米巴、抗菌治疗及其它支持营养疗法，治愈阿米巴肺脓疡，最后达到恶性肿瘤临床或完全治愈的目的。
实施例4.溶组织类阿米巴作为生物刀定位切除还可以应用于乳腺癌、肠癌、恶性脑瘤、等局灶性恶性肿瘤的治疗，与实施例2、3类同。
权利要求
1.溶组织类阿米巴在治疗恶性实体瘤中的应用。
全文摘要
溶组织类阿米巴在治疗恶性实体瘤中的应用，是将具有毒力的溶组织类阿米巴滋养体应用于治疗恶性实体瘤，即应用溶组织类阿米巴作为生物刀定位切除恶性实体瘤，解决了手术治疗癌症病人损伤大，易转移，放、化疗损伤病人的正常组织与免疫系统，其他生物疗法效果不理想的严重缺陷，而且治疗费用低，治疗效果好，副作用低。
文档编号A61P35/00GK1947793SQ20051002186
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月10日 优先权日2005年10月10日
发明者徐庆, 罗伟生, 程训佳, 李勇文, 戴之凯, 梁荣感, 李利亚, 简洁, 韦京辰, 黄春松, 龚受基, 梁成钦 申请人:桂林医学院