一种激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体公开了一种激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达的方法，包括以下步骤：1）在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的靶点识别模块，该靶点识别模块由TAL核酸识别单元组成；2）靶点识别模块编码序列的构建；3）通过酶切连接的方法，将步骤2）制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接，获得重组质粒；4）将重组质粒转化目的细胞并培养。本发明利用TALE技术在自体干细胞中激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的表达，为缺血性疾病的基因治疗提供了新的细胞来源，并能在组织工程和细胞治疗中发挥重要的作用。
【专利说明】—种激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达的方法。
【背景技术】
[0002]TALE (Transcription activator-effectors)技术是一种薪新的分子生物学工具。研究学者发现，来自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有着恒定的对应关系。利用TALE的序列模块，可组装成特异结合任何DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的(LiT,Huang S,Jiang W Z,et al.TAL nucleases (TALNs):hybrid proteins composed of TALeffectors and FokI DNAcleavage domain.Nucleic Acids Res.2011;39 (I):359-372.)。目前 TALE 技术主要有两种应用:I) TALEN (transcription activator-like (TAL)effector nucleases)的基因敲除；2) TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)的转录激活。TALEA的转录激活是将识别特异DNA序列的TALE与转录激活区域VP64 (VP64Activation Domain)融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA，将TALEA质粒转入细胞后，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与PolII结合，激活目标基因的转录，从而提高了内源目标基因的表达(Zhang F, Cong L, Lodato S, et al.Efficient construction ofsequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol.2011; 29 (2): 149-153.)。目前，TALEA已经成功运用到哺乳动物细胞中，Miller等利用人工设计的TALEA在人HEK293细胞中能够激活内源性NTF3基因的转录并使其表达水平增加了 20 倍(Miller JC, Tan S, Qiao G, et al.A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol.2011; 29 (2): 143-148.)。因为 TALE 技术无基因、细胞、物种限制，实验设计简单，毒性低、脱靶情况少等优点，TALE技术在酵母、动植物细胞的基因组定点修饰、遗传疾病的基因疗法及基因的功能研究等方面都有广阔的应用前景。[0003]骨髓间充质干细胞(MSC)是不同于造血干细胞(HSC)的另一类骨髓干细胞，具有分裂、增殖、分化形成多种间质细胞潜能(Pittenger MF, Mackay AM, BeckSc， et al.Muhilineage potential of adult human mesenehymal stem cell.science.1999:284(1):143-146.)。在骨髓中它是造血间质细胞的来源，通过胞体接触和分泌多种造血因子，如IL-6，6、粒系集落剌激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)等，为HSC的分裂、增殖、分化提供适合的微环境(Koc 0N，Gerson SL, Cooper BW, et aL Rapid hematopoietic recovery after coinfuse ofautologous-b10d stem cell and culture-expanded marrow mesenehymal stem celI inadvanced breast cancer patients receiving high—dose chemotherapy.J ClinicalOncology.2000; 18 (2):307-316.)。研究表明MSC体外支持造血干细胞(HSC)扩增，HSC联合移植可以体内促进其植入并重塑造血(Sylwia B, Danuta J, Marcin M.Mesenchymalstem cells: characteristics and clinical applications.Folia Histochemica etCytobiologica.2006;4(44):215-230.)，因此具有广阔的临床应用前景，而表达多种造血因子是MSC支持造血的分子基础。
[0004]粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor, GM-CSF)是一个具有多项潜能的造血生成因子，能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，对造血调控起着极其重要的作用(Parmiani G, Castelli C, Pilla L, etal.0pposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant incancer patients.Annals of Oncology.2007; 18:226 - 232.),因此过表达 GM-CSF 基因的MSC细胞较单独的MSC细胞可能提高造血干细胞的扩增能力，有望用于临床上各种缺血性疾病的治疗。
[0005]本研究选择人GM-CSF基因和人骨髓间充质干细胞(MSC)作为靶基因和靶细胞，利用TALE技术在MSC中激活GM-CSF基因的表达，有可能为造血研究和缺血性疾病治疗提供新的途径。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用TALE技术在人自体干细胞中激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因表达的方法。本发明选用人GM-CSF基因和人自体骨髓间充质干细胞(MSC)作为靶基因和靶细胞，利用TALE技术在MSC细胞中激活GM-CSF基因的表达，为基因治疗提供新了一种新的细胞来源，并将在组织工程和细胞治疗中发挥重要作用。
[0007]本发明首先公开了一种利用TALE技术在目的细胞中激活GM-CSF基因表达的方法，其步骤如下:
[0008]I)在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块；
[0009]2)靶点识别模块编码序列的构建:构建编码步骤I)所述靶点识别模块的双链DNA ；
[0010]3)通过酶切连接的方法，将步骤2)制备的所述靶点识别模块编码序列与含有转录因子激活区域VP64(VP64Activation Domain)编码序列的骨架载体连接，获得重组质粒;
[0011]4)重组质粒转染目的细胞，及目的细胞的培养。
[0012]较优的，步骤I)所述TALE靶点序列为GM-CSF基因启动子上游15~20个连续的喊基。
[0013]更优的，步骤I)所述TALE靶点序列为GM-CSF基因启动子上游16个连续的碱基。
[0014]最优的，步骤I)所述TALE靶点序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]较优的，步骤I)所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为NN-NN-HD-N1-NG-HD-HD-N1-N1-HD-N1-NN-HD-HD-NN-NG。
[0016]更进一步的，步骤I)所述靶点识别模块的氨基酸组成如SEQ ID NO:19所示。
[0017]靶点识别模块N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI 的氨基酸序列组成如SEQ ID NO:19所示。
[0018]本发明的靶点识别模块由N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元组成。所述TAL核酸识别单元为重复的34个恒定氨基酸序列，其中12、13位的双连氨基酸与A、T、G、C四种碱基有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，NN识别G，HD识别C。因此，本发明靶点识别模块中的N1、NG、NN、HD不指代具体的双氨基酸，而是代表特异性识别A、T、G、C四种碱基的TAL核酸识别单元；根据TALE靶点序列的碱基组成，获得由对应TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块。
[0019]通过TALE技术，能够组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白(靶点识别模块)，从而达到靶向操作内源性基因的目的。
[0020]N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元各自对应一个能够编码该识别单元的单体，所述单体为双链DNA。对照靶点识别模块的组成，对编码不同TAL核酸识别单元的单体进行串联组装，即可获得能够编码该靶点识别模块的双链DNA (靶点识别模块编码序列)。所述串联组装方式可以为在首尾相邻的单体之间设有相同的粘性末端，具体可通过在单体序列内TAL核酸识别单元编码序列两侧插入对应的酶切位点，通过多步酶切、连接的方法获得，或采用同序异尾限制性内切酶一步酶切法获得。 [0021]较优的，步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
[0022]A.构建单体库:所述单体库包括分别针对N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第I位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；
[0023]B.按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，通过酶切、连接的方法获得靶点识别模块编码序列。
[0024]本发明的连接末端是位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的双链DNA序列，连接末端含有酶切位点序列(包括限制性内切酶识别序列和/或限制性内切酶剪切序列)，可以经限制性内切酶酶切获得特定的粘性末端。当某一单体下游的连接序列与另一单体的上游连接序列酶切后获得互补粘性末端的时候，该两个单体能够连接并且连接顺序是一定的，因此可以通过特定连接末端序列的设计，将多个单体按照特定顺序进行连接。
[0025]更优的，步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
[0026]a按照所述靶点识别模块的组成，将靶点识别模块由N端开始向C端方向，顺次按
照每η个TAL核酸识别单元一组的方式分组，构成个次模块；
[0027]b构建单体库:所述单体库包括分别针对N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第I位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；每一次库中的M个单体从排序第I的单体开始，顺次以每η个单体作为一个分组，共获得fM/?l个分组，并且同一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的；四个次库之间，排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同；
[0028]c按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体,按照每η个单体一组的方式连接,构成IMwj个编码对应次模块的η联单体，然后再将Uftij个η联单体连接，或者将Uftij个η联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他单体连接，获得靶点识别模块编码序列；其中，M为靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目，η为整数,并且η的取值范围为2~6。
[0029]本发明中M为向上取整的符号，所述『Md为取比[Μ/η]大的最小整数 U为向下取整的符号,所述IMwj为取比LM/;j小的最大整数。
[0030]本发明步骤a是指:由于靶点识别模块由M个TAL核酸识别单元组成，因此从靶点识别模块N端的第一个TAL核酸识别单元开始向靶点识别模块的C端，按照每η个TAL核酸识别单元一组的方式，依次将靶点识别模块分为『M/lll个次模块，Π为向上取整的符号，当Μ/η能够整除时，所述靶点识别模块分为个次模块，并且每个次模块内含有η个TAL核酸识别单元；当Μ/η不能整除时，所述靶点识别模块分为个次模块，前-1个次模块的每个次模块内含有η个TAL核酸识别单元,余下的第『Mnl个次模块内包括
I# -11X j个TAL核酸识别单 元，并且Μ-?χ?—Ii的取值大于等于I，小于η。
[0031]步骤b中，由于每一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，但与该分组内其他单体酶切后的粘性末端是非互补的，因此能够将每一个分组内的多个单体片段按照其排次顺次的连接到一起。又由于每一次库中的单体，按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，因此属于不同分组，但在次库中排序相邻的两个单体酶切后可以通过互补的粘性连接，将不同分组内的片段连接到一起。最后，由于四个次库之间，排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同，才可以保证按照模板识别序列的组成，从不同次库中选择对应TAL核酸识别单元的单体，与任意来源的前一单体连接。
[0032]步骤c为按照所述靶点识别模块的组成，从前述的单体库中选择对应的单体，通过酶切连接的方法获得多个2联单体、3联单体、4联单体、5联单体或6联单体。当Μ/η能够整除时，从单体库中依次选择对应的单体，获得?ΑΛ/j个编码对应次模块的η联单体，然后再将J个η联单体连接；当Μ/η不能整除时，先从单体库中选出η的倍个单体，分别连接获得lA#/?j个η联单体后，将lM/?j个η联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他不足η个的单体连接，或者将剩余的不足η个的单体连成寡聚单体，与其他的η联单体连接，获得靶点识别模块编码序列。
[0033]最优的，每一所述分组内η个单体顺次排列，同一次库的每一分组内排次第2至第η-l的任一单体，与同一次库的其他分组内排次第2至第η-l的任一单体，排次相同的单体的序列完全相同。即每一分组含有η个单体，η个单体在分组内顺次排列，分别位于分组的第I至第η位，例如在编码NN这一 TAL核酸识别单元的次库中，每一个分组内排次第2的单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，TAL核酸识别单元编码序列相同；同理，同一次库不同分组间，排次第3、第4……第η-1位的单体，排次相同的单体的序列也相同。
[0034]同一次库内设有序列相同的单体，并将序列相同的单体放入不同分组的目的是为了减少实验所需要设计的粘性末端的数目，由于同一分组内的单体先彼此连接，因此不同分组内的单体即使能够酶切获得相同的粘性末端，也不会影响整个靶点识别模块编码序列的连接。
[0035]最优的，每一所述分组内，排次第I单体的上游连接序列的5’端外侧与排次最后一位单体的下游连接序列的3’端外侧还分别各设有一成环序列，同一分组内的两个成环序列酶切后，获得互补的粘性末端。
[0036]本发明所述成环序列是位于单体上/下游连接序列外侧的双链DNA序列，成环序列内含有酶切位点序列(包括限制性内切酶识别序列和/或限制性内切酶剪切序列)，可以经限制性内切酶酶切获得互补的粘性末端；由于成环序列分别位于每一分组内排次第I的单体的5’端及排次第η位单体的3’端，因此，当该分组的η个单体连成η联单体后，可以将该η联单体进行酶切，环化，获得一个环状双链DAN。
[0037]进一步的，所述次库中的单体是通过PCR的方法，从含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增获得。
[0038]更进一步的，所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI，M 为 16，η 取 4，用于从含有 N1、NG、NN 或 HD 任一TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增单体片段的PCR方法的引物序列为SEQ ID NO:3、
4；SEQ ID NO:5,6 ；SEQ ID NO:7、8 ;SEQ IDNO:9、10 ;SEQ ID NO:11,4 ；SEQ ID NO:9U2 ；SEQ ID NO:13,4 ；SEQ ID NO:9U4 ；SEQ ID N0:15、4;SEQ ID N0:9、16。
[0039]如下表所示，每一个次库中M个单体按照一定的次序顺次排列，因此每个单体在
所属的次库中都有各自的排次，如I位、2位......M位。当n=4时，单体库的组成如下表所
示。其中，1) 1-1-N1-2和4’ -N1-5-1 ’表示同一分组内，排序第I的单体上游连接序列的5’端与排序第4位单体的下游连接序列的3’端还分别设有一个成环序列，同一分组内的两个成环序列酶切后，获得互补的粘性末端，使η联单体环化为一双链环状DAN。2)每一分组内前一单体下游 连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的，保证分组内的单体按排次顺次连接。3)同一次库中，顺次排列的单体之间，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，保证不同分组内排次相邻的单体能够彼此连接，获得靶点识别模块编码序列。4)四个次库之间，排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同，保证来源于不同次库的单体，能够通过互补的粘性末端彼此之间连接。
[0040] M 为 16，η 取 4 时
【权利要求】
1.一种激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达的方法，其特征在于，为利用TALE技术在目的细胞中激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的表达，包括以下步骤: 1)在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别该TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块； 2)靶点识别模块编码序列的构建:构建编码步骤I)所述靶点识别模块的双链DNA； 3)通过酶切连接的方法，将步骤2)制备的所述靶点识别模块编码序列与含有转录因子激活区域VP64编码序列的骨架载体连接，获得重组质粒； 4)重组质粒转染目的细胞，及目的细胞的培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述TALE靶点序列为GM-CSF基因启动子上游15~20个连续的碱基。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤I)所述TALE靶点序列如SEQID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为 NN-NN-HD-N1-NG-HD-HD-N1-N1-HD-N1-NN-HD-HD-NN-NG。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤I)所述靶点识别模块的氨基酸组成如SEQID NO:19 所示。
6.如权利要求1-5任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下: A.构建单体库:所述单体库包括分别针对N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第I位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补； B.按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，通过酶切、连接的方法获得靶点识别模块编码序列。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下: a.按照所述靶点识别模块的组成，将靶点识别模块由N端开始向C端方向，顺次按照每η个TAL核酸识别单元一组的方式分组，构成『朦/7〗个次模块； b.构建单体库:所述单体库包括分别针对N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第I位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；每一次库中的M个单体从排序第I的单体开始，顺次以每η个单体 作为一个分组，共获得个分组，并且同一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的；四个次库之间，排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同； c.按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，按照每η个单体一组的方式连接，构成LJ///7j个编码对应次模块的η联单体，然后再将I朦/?j个η联单体连接，或者将个η联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他单体连接，获得靶点识别模块编码序列；其中，M为靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目，η为整数,并且η的取值范围为2~6。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分组内η个单体顺次排列，同一次库的每一分组内排次第2至第η-1的任一单体，与同一次库的其他分组内排次第2至第η-1的任一单体，排次相同的单体的序列完全相同。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分组内，排次第I单体的上游连接序列的5’端外侧与排次最后一位单体的下游连接序列的3’端外侧还分别各设有一成环序列，同一分组内的两个成环序列酶切后，获得互补的粘性末端。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述次库中的单体是通过PCR的方法，从含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增获得。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为 N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI，M 为 16，η 取 4，用于从含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸识别单元编码序列的质粒中扩增单体片段的PCR方法的引物序列为 SEQ ID NO:3、4 ；SEQ ID NO:5、6 ；SEQ ID NO:7、8 ；SEQ IDNO:9、10 ；SEQ ID NO:11、4 ；SEQ ID NO:9、12 ；SEQ ID NO:13、4 ；SEQ ID NO:9、14 ；SEQ ID NO:15、4 ；SEQ ID NO:9、16。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述骨架载体中含有转录因子激活区域VP64的编码序列，所述重组质粒表达靶点识别模块-转录因子激活区域VP64融合蛋白。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述目的细胞为人自体干细胞。
14.一种高效表达促粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的人自体骨髓间充质干细胞，为以人自体骨髓间充质干细胞为目的细胞，采用权利要求1-13任一权利要求所述方法制备获得。
15.权利要求1-13任一权利要求所述激活粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因表达的方法、权利要求14所述高效表达促粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的人自体骨髓间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病的试剂中的应用。
【文档编号】A61K35/28GK103966247SQ201310047948
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2013年2月6日
【发明者】朱向莹, 许可, 翁仕强, 曹跃琼, 金杨晟 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司