专利名称：从生物材质去除病毒活性的方法
技术领域：
本发明是关于一种从生物材质去除病毒活性的方法，特别是关于一种利用高压流体从生物材质去除病毒活性的方法。
背景技术：
物质具有固相、液相、气相三种形态，当系统温度及压力达到某一特定点时，气-液两相密度趋于相同，两相合并为一均匀相。该特定点即为该物质的临界点，所对应的温度、压力和密度则分别为该纯物质的临界温度(Tc)、临界压力(Pc)和临界密度(ρc)。一旦超过此点，无论压力如何增加都无法使之液化，温度如何升高也无法使之返回气相，该物质即进入超临界状态，高于临界温度及临界压力的均匀相即为超临界流体。
超临界流体的物性均在气体与液体之间，具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，尤其是溶解能力可随温度、压力、极性而变化，同时兼具低粘度、低表面张力的特性，能够通过渗透进入微孔隙的物质，使得超临界流体非常适用于无水洗净、萃取、染整等用途。
超临界流体技术的应用领域相当广泛，多达数十种，最早的工业化应用为天然物的萃取，例如德国利用超临界二氧化碳萃取咖啡因及植物香精等；接下来扩展到染整、工业洗净等领域。未来随着技术发展及追求高品质、节能、环保的要求，它还能应用在纳米、化工、石化、制药、生物、半导体等其它产业。
二氧化碳由于其易于达到临界点，临界温度约摄氏31.1℃，与一般室温相近，临界压力则为72.9巴(bar)，本身无毒、无色、无臭、不具自燃性、不产生光化学反应、不破坏臭氧层、不产生烟雾。使用时，其溶解力随温度与压力条件而变，且易于回收再利用，加上易于取得、便宜又安全，因此很适合进行超临界流体的各项应用。
有鉴于二氧化碳本身是一种惰性(inert)的酸性气体，在槽体真空密闭空间，灌注二氧化碳进行洗净时，过程中二氧化碳会穿透细菌的细胞膜，此时其具有酸性气体的特质，会使得细胞死亡，因此二氧化碳本身就具有杀菌效果。然而，超临界二氧化碳杀死细菌及清洗效能到何种程度，还需要进一步检测；杀菌环境条件也仍有待研究，例如各菌种适应温度不同，有些必须在高温环境进行，有些则可能在低温进行即可；或是需加装其它设备，如紫外线设备等等。
再有一般常用的高温或高压灭菌方式，也不适用于对热不稳定的材料。因此，仍需要一种能够在较低温度条件下进行的灭菌方法。
发明内容
为克服上述现有技术的缺点，本发明的主要目的在于提供一种能够无毒地去除病毒活性的方法。
本发明的另一目的在于提供一种能够简单地去除病毒活性的方法。
本发明的又一目的在于提供一种能够在较低的温度条件下去除病毒活性的方法。
本发明的再一目的在于提供一种适用于对热不稳定材料进行灭菌以去除病毒活性的方法。
本发明的又一目的在于提供一种适用于对敏感蛋白质材料进行灭菌以去除病毒活性的方法。
为达上述及其它目的，本发明提供一种从生物材质去除病毒活性的方法包括下列步骤(a)在雷诺数小于或等于2000的非湍流条件下，将高压流体导入含有待处理物的容器进行灭菌，该待处理物是可能带有病毒且具有生物活性的物质；以及(b)从该待处理物移除该高压流体，使该可能存在于待处理物的病毒失去活性。
本发明的方法可使用超临界二氧化碳或液态二氧化碳作为高压流体去除可能存在于医疗物品或材料的病毒活性，不需额外添加具有毒性或可能致癌的添加剂进行灭菌，由于超临界二氧化碳及液态二氧化碳具有无色、无毒、无味、不易燃、具有化学惰性、价格便宜、以及易制成高浓度液体等特点，因此得以免除后续移除有毒物质的步骤，同时具有简化制程与降低成本的优点。另一方面，由于二氧化碳的临界温度接近室温且临界压力不高，相较于一般的高温、高压灭菌方式，本发明的方法可以在较低的温度条件下进行灭菌，去除冠状病毒、猪生殖与呼吸综合症病毒、日本脑炎病毒、以及假性狂犬病病毒等病毒的活性，特别适合用于对热不稳定的材料以及敏感的蛋白质材料进行灭菌。
具体实施例方式
以下通过具体实例说明本发明的实施方式。
一般而言，所谓的“临界流体(critical fluid)”是指温度与压力分别为临界温度或超过临界压力以及临界压力或超过临界压力，处于临界状态的流体。另一方面，所谓的“近临界流体(near critical fluid)”是指温度与压力分别为临界温度或接近临界温度以及临界压力或接近临界压力。在本说明书中，“高压流体”一词包括超临界流体以及液态流体，“超临界流体(supercritical fluid，SCF)”一词包括温度与压力分别为临界温度、接近临界温度或超过临界温度，以及临界压力、接近临界压力或超过临界压力的临界、近临界及超临界流体。同样地，本说明书中，所谓的“超临界二氧化碳”包括温度与压力分别为临界温度(31.1℃)、接近临界温度或超过临界温度，以及临界压力(72.9bar)、接近临界压力或超过临界压力的临界、近临界及超临界二氧化碳。
在本说明书中，所谓的“待处理物”包括可能带有冠状病毒、猪生殖与呼吸综合症病毒、日本脑炎病毒或假性狂犬病病毒等病毒且具有生物活性的物质，实例包括但不限于生物材料，例如蛋白质、核酸、生物活性分子、血小板、血液因子等。
本发明的从生物材质去除病毒活性的方法，是在雷诺数小于或等于2000的非湍流条件下，先将高压流体导入含有待处理物的容器进行灭菌；接着，从该待处理物移除该高压流体，使该可能存在于待处理物的病毒失去活性，或同时移除可能存在的病毒。
一般而言，雷诺数(Reynold number，Re)是判断流体流动形态的指标。雷诺数小于2,100则称为层流(laminar flow)，即当流体流动时，各质点间互相平行，互不干扰；雷诺数大于4,000则称为湍流(turbulentflow)，即流体除了向前流动外，并碎成许多漩涡，与侧边的流体混合；雷诺数界介于2,100至4,000则称为过渡流(transition flow)，即从层流过渡至湍流的中间状态，流体行为不稳定，时而层流时而湍流。雷诺数的定义如下式(I)所示Re=Du‾ρμ---(I)]]>其中，D表示管内直径，单位为米；u表示平均速度，单位为米/秒；ρ表示密度，单位为公斤/立方米；以及μ表示粘度，单位为公斤/米·秒。
本发明的方法是在雷诺数小于或等于2000的非湍流条件下，将高压流体导入含有待处理物的容器进行灭菌，适用于液态或固态的待处理物。由于该高压流体是以雷诺数小于或等于2000的非湍流条件下导入，因此可确定病毒的去活是因流体达到超临界而不是由流体的湍流导致的。就该高压流体的导入比例而言，以每克待处理物计，该高压流体的导入比例优选是100至500克范围；更优者，以每克待处理物计，该高压流体的导入比例是300克，但并非局限于此。
在本发明的方法中，以超临界二氧化碳作为高压流体为例，该超临界二氧化碳的压力是以60至240巴(bar)的范围较佳，以100至200巴(bar)的范围更佳，以150至190巴(bar)的范围又更佳，以160巴(bar)为最佳；该超临界二氧化碳的温度是以40至80℃的范围较佳，以40至60℃的范围更佳，以40至50℃的范围又更佳，但并非局限于此。再者，根据实际导入的超临界二氧化碳的温度而定，灭菌时间是以2小时或2小时以内的时间进行，较佳是1小时以内；然而，熟习该项技术者可视需要，根据待处理物的特性加以调整。除了二氧化碳外，本发明的方法中使用的高压流体也可以是水、丙烷、氙气、笑气、氢气或氯气。
在本发明的一具体实例中，可进一步在该高压流体中加入辅溶剂进行流体助溶。该辅助溶剂的实例包括机溶剂，例如丙酮、己烷、二氧杂环己烷、苯、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇1)、乙腈、二甲基甲酰胺、环己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、吡啶、乙醚、硝基甲烷及苯甲醚；以及生物制剂，例如过氧化物(如，过乙酸、过氧化氢)、醛类(如，甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛)、卤素试剂(如，碘)、Sterilox、乙醇、酸及碱等。该辅溶剂的添加时间与添加量是熟习该项技术者视需要加以决定，并无特别限制。
本发明的方法不但可以去除病毒的活性，更能够从待处理物移除可能存在的病毒。另一方面，本发明的方法也可用于使酵素或与病毒有关的生物物质去活性，进而借由抑制蛋白脢的途径达到抑制病毒散播及繁殖的目的。
实施例1至17以及对照例1至4材料使用ST细胞株(来源ATCC CRL-1746)-第114代，冠状病毒属的传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)台湾野外分离株(TFI)进行测试。
实施方法取病毒效价TCID50为108/ml的TGEV解冻后，加入等量含8％(W/V，无菌蒸馏水配制)的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，待明胶凝固后，密封保存于4℃备用。
接着，在雷诺数为2000的非湍流条件下，根据表1记载的处理条件导入超临界二氧化碳，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。
然后，回收样品，进行离心，取上清液，以96孔盘ST细胞株进行TCID50检定，重复进行六次，并依细胞是否受到病毒感染与否的细胞病变(CPE，cytopathic effects)有无，决定病毒是否存活，再以Reed-Muench法计算样品中病毒的效价。
最后，重复进行上述实验步骤以获得实施例1至17以及对照例1至4的TCID50值，测定病毒含量，纪录病毒效价，根据下列公式计算几何平均数GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>表1
病毒效价测定极限100.69/0.1ml
*重复六次测定CPE的有无，并以Reed-Muench法计算所得的数据实施例18至32以及对照例5至9材料使用MARC-104细胞株，猪生殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV MD006 strain)进行测试。
实施方法取病毒效价TCID50为107.5/ml的PRRSV解冻后，加入等量含8％(W/V，无菌蒸馏水配制)的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，待明胶凝固后，密封保存于4℃备用。
接着，在雷诺数为2000的非湍流条件下，根据表2记载的处理条件导入超临界二氧化碳，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。
然后，回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘MARC-104细胞株进行TCID50检定，重复进行六次，并依CPE的有无，决定病毒是否存活，再以Reed-Muench法计算样品中病毒的效价。
最后，重复进行上述实验步骤获得实施例18至32以及对照例5至9的TCID50值，测定病毒含量，纪录病毒效价，根据下列公式计算几何平均数GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>表2
病毒效价测定极限101/0.1ml*重复六次测定CPE的有无，并以Reed-Muench法计算所得的数据实施例33至47以及对照例10至14材料使用Vero细胞株，日本脑炎病毒(Japan encephalitis virus，JEV)AT疫苗株进行测试。
实施方法取病毒效价TCID50为107.1/ml的JEV解冻后，加入等量含8％(W/V，无菌蒸馏水配制)的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，待明胶凝固后，密封保存于4℃备用。
接着，在雷诺数为2000的非湍流条件下，根据表3记载的处理条件导入超临界二氧化碳，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。
然后，回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘Vero细胞株进行TCID50检定，重复进行六次，并依细胞CPE的有无，决定病毒是否存活，再以Reed-Muench法计算样品中病毒的效价。
最后，重复进行上述实验步骤以获得实施例33至47以及对照例10至14的TCID50值，测定病毒含量，纪录病毒效价，根据下列公式计算几何平均数GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>
表3
病毒效价测定极限101/0.1ml*重复六次测定CPE的有无，并以Reed-Muench法计算所得的数据实施例48至62以及对照例15至19材料使用RK细胞株，假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)台湾野外分离株进行测试。
实施方法取病毒效价TCID50为106.3/ml的PRV解冻后，加入等量含8％(W/V，无菌蒸馏水配制)的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，待明胶凝固后，密封保存于4℃备用。
接着，在雷诺数为2000的非湍流条件下，根据表4记载的处理条件导入超临界二氧化碳，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。
然后，回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘RK细胞株进行TCID50检定，重复进行六次，并依细胞CPE的有无，决定病毒是否存活，再运用Reed-Muench法计算样品中病毒的效价。
最后，重复进行上述实验步骤以获得实施例48至62以及对照例15至19的TCID50值，测定病毒含量，纪录病毒效价，根据下列公式计算几何平均数GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>表4
病毒效价测定极限101/0.1ml*重复六次测定CPE的有无，并以Reed-Muench法计算所得的数据实施例63至77以及对照例20至24超临界二氧化碳对于具有生物活性蛋白质的作用材料使用MARC-104细胞株，猪生殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV MD006 strain)，以及抗猪传染性胃肠炎病毒中和抗体抗血清等，进行测试。
实施方法取病毒效价TCID50为107.5/ml的PRRSV解冻后(20ml)，加入等量含8％(W/V，无菌蒸馏水配制)的明胶(gelatin)(20ml)，再加入1ml抗猪传染性胃肠炎病毒中和抗体抗血清混和均匀后，平均分装至玻璃小瓶，待明胶凝固后，密封保存于4℃备用。
接着，在雷诺数为2000的非湍流条件下，根据表5记载的处理条件导入超临界二氧化碳，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。
然后，回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘MARC-104细胞株进行PRRSV的TCID50检定，重复进行六次，依细胞CPE的有无，决定病毒是否存活，再以Reed-Muench法计算样品中病毒的效价。
最后，以TGEV中和抗体检定方法依照OIE规范进行，先将试样取100μl以两倍连续稀释(2-1至2-12)后，加入等量100μl病毒效价为100TCID50的TGEV作用一小时后，再将混和液转移至已经生长成为平面的细胞株。五天之后判定中和抗体效价。
表5
病毒效价测定极限101/0.1ml*重复六次测定CPE的有无，并以Reed-Muench法计算所得的数据实施例78至92以及对照例25至29材料使用RK细胞株，假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)台湾野外分离株，以及抗猪传染性胃肠炎病毒中和抗体抗血清等，进行测试。
实施方法取病毒效价TCID50为108/ml的PRV解冻后(20ml)，加入等量含8％(W/V，无菌蒸馏水配制)的明胶(gelatin)(20ml)，再加入1ml抗猪传染性胃肠炎病毒中和抗体抗血清混和均匀后，平均分装至玻璃小瓶，待明胶凝固后，密封保存于4℃备用。
继而，在雷诺数为2000的非湍流条件下，根据表6记载的处理条件导入超临界二氧化碳，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。
然后，回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘RK细胞株进行PRV TCID50检定，重复进行六次，依细胞CPE的有无，决定病毒是否存活，再运用Reed-Muench法计算样品中病毒的效价。
最后，以TGEV检定方法依照OIE规范进行，先将试样以两倍连续稀释(2-1至2-12)后，加入等量的100 TCID50TGEV作用一小时后，再将混和液转移至已经生长成为平面的细胞株。五天之后判定效价。
表6
病毒效价测定极限101/0.1ml*重复六次测定CPE的有无，并以Reed-Muench法计算所得的数据利用超临界二氧化碳作为高压流体去除病毒活性时，在160bar的条件下，以40℃或以上温度处理30分钟以上即可达到理想的灭菌效果。就冠状病毒而言，以40℃处理60分钟或以50℃处理30分钟，可达更优异的灭菌效果。由上述结果可知，将TGEV中和抗体加入病毒中共同进行处理后，中和抗体的效价并未产生大的差异，显示具有生物活性的中和抗体，不因此处理而失去效价。因此，本发明的方法特别适合在较低的温度条件下，针对具有生物活性以及蛋白质等对热不稳定的材料进行病毒不活化处理作业。
本发明也可借由其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在不悖离权利要求所界定范围内进行各种修饰与变更。
权利要求
1.一种从生物材质去除病毒活性的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(a)在雷诺数小于或等于2000的非湍流条件下，将高压流体导入含有待处理物的容器进行灭菌，该待处理物是指可能带有病毒且具有生物活性的物质；以及(b)从该待处理物移除该高压流体，使该可能存在于待处理物的病毒失去活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该高压流体是选自二氧化碳、水、丙烷、氙气、笑气、氢气以及氯气所构成的群组的其中一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该高压流体是超临界二氧化碳。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该高压流体是液态二氧化碳。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以每克待处理物计，该超临界二氧化碳的导入比例是100至500克的范围。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以每克待处理物计，该超临界二氧化碳的导入比例是300克。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的压力是60至240巴的范围。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的压力是100至200巴的范围。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的压力是150至190巴的范围。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的压力是160巴。
11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的温度是40至80℃的范围。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的温度是40至60℃的范围。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的温度是40至50℃的范围内。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该步骤(a)还包括进一步将辅溶剂加入该高压流体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该辅溶剂是有机溶剂。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该有机溶剂是选自由丙酮、己烷、二氧杂环己烷、苯、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、环己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、吡啶、乙醚、硝基甲烷及苯甲醚所构成的群组的其中一种。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该辅溶剂是生物制剂。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该生物制剂是选自由过乙酸、过氧化氢、甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛、碘及乙醇所构成的群组的其中一种。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该病毒包括冠状病毒、猪生殖与呼吸综合症病毒、日本脑炎病毒及假性狂犬病病毒。
全文摘要
本发明提供一种从生物材质去除病毒活性的方法，其包括下列步骤(a)在雷诺数小于或等于2000的非湍流条件下，将高压流体导入含有待处理物的容器进行病毒不活化处理，该待处理物是指可能带有病毒且具有生物活性的物质；以及(b)从该待处理物移除该高压流体，使该可能存在于待处理物的病毒失去活性；由于本发明的方法使用无毒性的高压流体即能够使可能存在于医疗物品或材料的病毒去活性，因此不需额外添加具有毒性或可能致癌的添加剂；另一方面，本发明的方法可以在较低的温度条件下进行病毒不活化处理作业，特别适合用于对具有生物活性以及蛋白质等对热不稳定的材料进行不活化处理。
文档编号A61L2/20GK1837359SQ20051005695
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月24日 优先权日2005年3月24日
发明者邱永和, 林国靖, 陈毓婷, 林瑞岳, 陈启铭, 张梦扬 申请人:南纬实业股份有限公司