专利名称：医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医用生物材料的制备方法，特别涉及一种心外科手术用牛颈静脉带瓣管道的制备方法。
背景技术：
在许多心脏及大血管手术中，如法洛氏四联症、肺动脉闭锁、右心室双出口、永存动脉干、大血管转位合并肺动脉狭窄以及主动脉病变需行Ross手术者，往往需要应用带瓣管道重建右心室与肺动脉的连接。常用的材料有自体心包、同种异体主动脉带瓣管道、异种材料如猪主动脉及肺动脉带瓣管道、人工材料如Gore-Tex片、人工合成的带瓣管道等，但这些材料都存在一些局限性，如Gore-Tex片一般不能重建瓣膜结构；自体或牛心包缝制带瓣管道，瓣膜功能不理想；猪主动脉、肺动脉带瓣管道已应用于临床，但易钙化、衰败，使用期有限；由于右心系统压力低，血流速度慢，人工瓣特别是机械瓣置入后血栓栓塞并发症高；同种异体带瓣管道自Ross率先应用以来，已有40年历史并取得了良好的效果，但同种带瓣管道来源有限，且大小不易匹配，使其临床应用受到很大的限制。近年来，国外有将带瓣膜的牛颈静脉管道用于临床重建右心室流出道取得良好效果的报道，但作为异体生物材料由于在加工处理过程中的不足，一方面制作成本高，国内患者难于接受，另一方面置入人体后会产生排斥反应、钙化、衰老等，严重地影响了临床使用效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本较低，适于国产化的医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法，采用该方法所得的产品抗原性小，组织相容性好，抗钙化。具体技术方案如下医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法包括以下步骤(1).自屠宰场采集当场宰杀的2-4岁健康牦牛，清洁状况下取牛颈静脉全段，用大量自来水冲洗静脉腔内及外壁后，放置在盛有2～6℃生理盐水的容器中带回实验室；(2).即刻用手术刀、剪，去除血管鞘及多余肌肉、脂肪组织，然后用大量生理盐水冲洗，直到洗去杂质和血醒味；(3).浸泡于2～6℃Hank’s液内3～5小时，然后放入0.5～0.625％戊二醛溶液中在瓣膜关闭状态下固定45～55小时，温度22～27℃；(4).用蒸馏水冲洗，待上述浸泡溶液洗干净以后，浸泡于1％肝素盐水中20～30小时，22～25℃；(5).再用蒸馏水冲洗，洗去肝素盐水液后，再浸泡在0.5％戊二醛保存，送细菌及霉菌培养检测证实无菌，放入1℃～4℃冰箱仍用0.5％戊二醛保存备用。
所述医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法的优选方案是步骤(3)中Hank’s液内浸泡时间最好为4小时，戊二醛溶液中固定时间最好为48小时，温度为25℃。
所述医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法的优选方案是步骤(4)中在
1％肝素盐水中浸泡时间为24小时，温度为25℃。1％肝素盐水是每1毫升肝素加入到99毫升0.9％的生理盐水中配制而成的。采用该方法制得的产品可以经过常规的取样，进行细菌培养和霉菌培养，检测证实无菌后方可使用。
近年来，异种器官和组织移植已取得了巨大的成就，手术成功率已明显提高。但是，术后的免疫排斥反应仍然是移植失败的最主要原因，因而，消除、减少移植物的抗原性，从而有效控制排斥反应是移植成功与否的关键。
为了证实该方法处理的产品抗原性小，进行了下述试验材料和方法一、材料1.实验动物选取健康新西兰大白兔15只，雌雄不拘，体重2.0～2.5千克，购自重庆医科大学动物实验中心。
2.新鲜牛颈静脉带瓣管道的制备自屠宰场采集当场宰杀的2-4岁牦牛的颈静脉，生理盐水浸泡、冲洗后，剥除多余肌肉和脂肪组织，用1∶1000的新洁尔灭溶液浸泡灭菌2小时，再用抗菌素溶液(每100ml生理盐水加入青霉素80万单位，庆大霉素8万单位)浸泡灭菌20小时，送细菌及霉菌培养检测证实无菌，4℃冰箱保存备用。
3.新鲜牛颈静脉带瓣管道组织匀浆的制备取适量上述新鲜牛颈静脉带瓣管道，4℃冰生理盐水充分漂洗，搅拌器充分捣碎搅匀，匀浆2000转/分离心10分钟，过滤取得蛋白上清液，加入1∶2000NaN3防腐，送细菌及霉菌培养检测证实无菌，4℃冰箱保存备用。
4.戊二醛鞣制牛颈静脉带瓣管道的制备取适量上述新鲜牛颈静脉带瓣管道，4℃冰生理盐水充分漂洗后，浸泡于4℃Hank’s液内4小时清除可溶性蛋白，然后放入0.625％戊二醛溶液中固定48小时，温度25℃；蒸馏水冲洗，将其浸入1％肝素盐水中24小时，25℃；蒸馏水冲洗，0.5％戊二醛保存，送细菌及霉菌培养检测证实无菌，放入4℃冰箱仍用0.5％戊二醛保存备用。
5.戊二醛鞣制牛颈静脉带瓣管道组织匀浆的制备取适量上述戊二醛鞣制牛颈静脉带瓣管道组织，4℃冰生理盐水充分漂洗，搅拌器充分捣碎搅匀，匀浆2000转/分离心10分钟，过滤取得蛋白上清液，加入1∶2000NaN3防腐，送细菌及霉菌培养检测证实无菌，4℃冰箱保存备用。
二.方法 以15只新西兰大白兔建立动物模型，随机分为三组，A组以戊二醛鞣制牛颈静脉带瓣管道组织匀浆实验兔腹腔注射及戊二醛鞣制牛颈静脉带瓣管道组织块实验兔背部皮下埋藏。B组以无菌新鲜牛颈静脉带瓣管道组织匀浆实验兔腹腔注射及无菌新鲜牛颈静脉带瓣管道组织块实验兔背部皮下埋藏。C组以生理盐水实验兔腹腔注射及生理盐水实验兔背部皮下注射。实验动物于实验前1天、致敏实验后1天、致敏实验后1周、攻击实验后1天、攻击实验后1周、攻击实验后2周分别抽取静脉血(非抗凝)，用速率散射比浊法测量血清特异性IgG、IgM抗体浓度；用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNF-α、IL-6、IL-8细胞因子水平。全部实验动物于实验后30天取背部皮下埋藏物及周围组织作病理学检查及免疫细胞化学检查。所得结果用SAS8.02统计软件进行重复测定的方差分析，结果用F值、P值表示，P＜0.01时认为差异有显著性。
结果 三组实验动物于实验前各测量值均无显著性差异。于实验后12天B组特异性IgG、IgM抗体及细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8浓度均明显升高，而A组各种测量值实验后仍无明显升高，C组实验前后各测量值几乎无变化，B组与A、C组间比较，其差异有显著性；A组与C组比较，各测量值之变化差异无显著性。
背部皮下埋藏物及周围组织病理检查B组未经戊二醛处理的组织块由于抗原性未被消除，引起局部组织明显的变态性炎性反应，植入物周围有较多的淋巴细胞、巨噬细胞及浆细胞浸润，提示有明显的炎症反应发生，免疫组织化学检测证实局部有IgG、IgM、C3沉着，移植物亦有变硬、挛缩及吸收；而A组与C组则镜检没有明显的淋巴细胞、巨噬细胞及浆细胞浸润，免疫组织化学检测证实局部没有明显的IgG、IgM、C3沉着，移植物亦没有变硬、挛缩及吸收。
结论 作为一种异种生物材料，新鲜牛颈静脉带瓣管道具有抗原性，本发明制备方法经戊二醛鞣制处理的牛颈静脉带瓣管道其抗原性几乎完全消失，从而避免了异种移植免疫排斥反应的发生。
本发明所述的制备方法经戊二醛复合鞣制的牛颈静脉带瓣管道去除了大量的可溶性蛋白、粘多糖和糖蛋白，浆膜层间的间质细胞已基本脱落，仅剩间质细胞下层，外结缔组织层中成丛状的脂肪细胞全部丢失；纤维层中胶原纤维及弹力纤维结构完整，排列整齐，呈不同方向的网状排列，胶原纤维无溶解和断裂现象，胶原蛋白分子间形成了牢固的交联机构，从而掩盖和封闭了蛋白分子中的活性基，使其失去抗原性。而且管道的组织断裂强度及组织稳定性增加，尽管管道壁稍变硬、变厚，但仍富有弹性，固定后瓣叶无卷曲、变形，仍菲薄透明。戊二醛结合肝素对牛颈静脉带瓣管道进行处理，由于填充了内在胶原蛋白的空间，封闭了潜在钙化点，改变电性，使宿主血浆钙不能渗透到生物材料中，从而起到防钙化的作用。
经过这些处理之后，所得到的牛颈静脉带瓣管道具有抗原性小，组织相容性好，抗钙化的优点，与此同时，本发明所用的材料丰富简便，经济，降低了生产成本。
具体实施例制备本发明所述的牛颈静脉带瓣管道依次按以下步骤进行(1).自屠宰场采集当场宰杀的2岁健康牦牛，清洁状况下取牛颈静脉全段，用大量自来水冲洗静脉腔内及外壁后，放置在盛有4℃生理盐水的容器中带回实验室；(2).即刻用手术刀、剪，去除血管鞘及多余肌肉、脂肪组织，然后用大量生理盐水冲洗；(3).浸泡于4℃Hank’s液内4小时，然后放入0.625％戊二醛溶液中在瓣膜关闭状态下固定48小时，温度25℃；
(4).蒸馏水冲洗后，浸泡于1％肝素盐水中24小时，温度25℃；(5).蒸馏水冲洗，0.5％戊二醛保存，送细菌及霉菌培养检测证实无菌，放入4℃冰箱仍用0.5％戊二醛保存备用。
权利要求
1.一种医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法依次按以下步骤进行(1).自屠宰场采集当场宰杀的2-4岁健康牦牛，清洁状况下取牛颈静脉全段，用大量自来水冲洗静脉腔内及外壁后，放置在盛有2～6℃生理盐水的容器中带回实验室；(2).即刻用手术刀、剪，去除血管鞘及多余肌肉、脂肪组织，然后用大量生理盐水冲洗，直到洗去杂质和血醒味；(3).浸泡于2～6℃Hank’s液内3～5小时，然后放入浓度为0.5～0.65％戊二醛溶液中在瓣膜关闭状态下固定45～55小时，温度22～27℃；(4).用蒸馏水冲洗，待上述浸泡溶液洗干净以后，浸泡于浓度为1％肝素盐水中20～30小时，温度22～25℃；(5).再用蒸馏水冲洗，洗去肝素盐水液后，再浸泡在0.5％戊二醛中保存，送细菌及霉菌培养检测证实无菌后，放入1℃～4℃冰箱保存备用。
2.如权利要求1所述的医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法步骤(3)中Hank’s液内浸泡时间为4小时，戊二醛溶液中固定时间为48小时，温度为25℃。
3.如权利要求1所述的医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法步骤(4)中在1％肝素盐水中浸泡时间为24小时，温度为25℃。
全文摘要
本发明提供了一种医用牛颈静脉带瓣管道的制备方法，该方法采用戊二醛复合鞣制再结合肝素进行处理，使所得产品具有抗原性小，组织相容性好，抗钙化的优点，与此同时，本发明所用的材料丰富简便，经济，降低了生产成本。
文档编号A61L27/38GK1961971SQ200510057378
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者何德沛, 杨庆军, 申林, 赵树林 申请人:重庆市中山医院