专利名称：用于治疗真菌感染特别是曲霉病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于曲霉病治疗的由五亚基环蛋白(pentraxin)PTX3和抗真菌剂的组合组成的药物。
背景技术：
侵入性曲霉病(IA)是医院性肺炎和同种异体骨髓(BM)移植中死亡的主要原因，据估计感染率为8％-15％且相关死亡率为约90％(3，16，30，36，47)。尽管早期诊断和使用新的抗真菌剂治疗已经取得进展(6，31)，但是绝大多数AI病例仍然没有被诊断出来且没有得到治疗(16)。AI最重要的危险因素在过去是嗜中性白细胞减少症。然而，对于经历化疗和移植的患者的准备中取得的进展已使得嗜中性白细胞减少期显著缩短。许多研究已经证明了，曲霉病在骨髓移植之后伴随移植物抗宿主(GvH)疾病的发作而表现出来(30)。IA也可在非-嗜中性白细胞减少症患者中发生(17)证实了在先天性和适应性免疫效应物机理中的特异性缺陷在疾病发病中的重要性(13，20，22，32，39，43，44)。具体而言，近来已经评价了Th淋巴细胞在提供针对真菌的基本继发性防御中的作用(8-10，12，14，23，26)。由于IA在免疫活性个体中非常罕见，因此目标在于增强宿主免疫应答的疗法在这种感染的治疗方面提供了一种新的且有希望的途径。
先天免疫系统以复杂、多面的方式进化以保护肺组织免受感染。据信对肺组织的保护不仅包括对微生物增殖的预防性控制，而且还包括足以控制感染而不会诱导危险程度的肺泡渗出和浸润的平衡炎性反应的实现。肺泡内衬的分子成分作为感染中主要的免疫调节物近来已成为重要的注意焦点(28，29)。
五亚基环蛋白(PTX)是在由美洲鲎到人的进化过程中保守的蛋白超家族，其总体特征在于五聚结构(21)。PTX3是长五亚基环蛋白的原型，在于N-末端部分与五亚基环蛋白C-末端结构域偶联，后者是短PTX的同源物(7)。PTX3由多种类型的细胞分泌，特别是单核吞噬细胞、内皮细胞和树突细胞(DC)，在体外和体内应答初级炎性细胞因子(11，38，18)。该蛋白循环水平的增加已在各种不同的感染和炎症中检测到(37，19，34，41)。PTX3可结合多种选定的微生物因子(例如，烟曲霉分生孢子和铜绿假单胞菌)并激活免疫系统的多种效应物途径，从而对抗病原体的感染性(20)。对PTX3-缺陷型小鼠的分析证实了PTX3是一种模式识别受体(PRR)，其在对选定的病原体的抗性中发挥非-多余作用(20)。PTX3-缺陷型小鼠对烟曲霉的敏感性与I型适应性免疫反应的不成功组构相关，但由重组PTX3的外源施用所恢复(20)。
尽管近来抗真菌医药物质已经扩充(45)，但在抗曲霉病方面仍需要治疗性进展。
研究人员正在开始探究使用抗真菌剂和细胞因子的单一组合的新策略(46)。使用两性霉素B(一种首选药物)进行治疗受到与剂量有关的肾毒性的限制，其阻碍了接受BM移植的患者中的全剂量治疗(24)。已经开发了多种基于脂质的两性霉素B制剂，以降低与常规D-AmB(25)以及与L-AmB(2)有关的毒性。L-AmB毒性的药动学性能较之D-AmB更为有利，由此使全剂量治疗成为可能。虽然如此，失败率仍然是值得关注的问题(1)。公开的IA鼠模型，其中已经评价了抗真菌剂的功效，依赖由使用或未使用皮质类固醇的化疗诱导的嗜中性白细胞减少症，从而使小鼠不易感染。近来，对用于治疗IA的新抗真菌剂的开发有所增加，药物类别由新的治疗靶表征(45)，其引起对IA治疗的新的预期且增加了可能的新联合疗法的数目(45)。基于对其它感染性疾病的治疗(4)，联合疗法似乎是重要的治疗选择。
发明概述现在已经发现当与其它抗真菌剂组合时，五亚基环蛋白PTX3可发挥令人吃惊的协同作用，因而可制备特征在于亚适剂量抗真菌剂的药物。该特征显示在药物更大的易控性方面有益，因为它能够大大限制其各活性成分特征性的副作用。
因此，本发明其中一个目的是五亚基环蛋白PTX3和抗真菌剂的组合，以及含有该组合的药物组合物和所述组合制备用于真菌感染特别是曲霉病的预防性或治疗性治疗的药物的用途。
发明详述五亚基环蛋白PTX 3及其多种治疗用途在以本申请人的名义提交的多项专利申请中描述。
国际专利申请WO 99/32516描述了该蛋白的序列及其在感染性、炎性或肿瘤性疾病中的用途。长五亚基环蛋白PTX3的其它用途在WO02/38169、WO 02/36151、WO 03/011326和WO 03/084561中描述。
在本发明的优选实施方案中，抗真菌剂是两性霉素B，更优选是已知以商标Fungizone(Bristol-Myers Squibb)出售的脱氧胆酸盐形式或已知以商标AmBisome(GILEAD)出售的脂质体制剂。
关于本发明工业实用性方面，长五亚基环蛋白PTX3和抗真菌剂将为药物组合物的形式，其中活性成分溶于和/或载于药学可接受的赋形剂和/或稀释剂中。
可用于长五亚基环蛋白PTX3的药物组合物的例子还有在WO99/32516中描述的那些。
本发明的组合可通过肠道或非肠道途径给药。
根据初级护理医师的判断，每日剂量取决于患者的体重、年龄和一般健康状况。
应指出，所述药物组合物包括缓释制剂的制备可使用药剂师和制药技术专家熟知的常规技术和设备来完成。
在本发明的特定实施方案中，真菌感染为侵入性曲霉病(IA)。
已在鼠骨髓移植模型中评价本发明的组合，该模型复制了在人相同状况中观察到的免疫缺陷。使小鼠经受不同的治疗方案并评价对IA的抗性及先天性和适应性免疫参数。结果显示PTX3诱导了对感染和再感染的总体抗性，它激活了I型保护反应并且当联合给药时显著增加了抗真菌剂的治疗功效。
现在通过实施例和附图详细例示本发明，其中
图1举例说明在患有侵入性曲霉病的小鼠中给予PTX3、AmBisome(L-AmB)或Fungizone(D-AmB)的作用。鼻内感染2×107个曲霉分生孢子之前一周，给经致死性辐射的C3H/HeJ小鼠输注BALB/c小鼠的耗尽T-细胞的BM细胞(2×106)。感染之前5天(之前)或之后(之后)或与感染同时(同时)，以所示剂量并经由所示途径，使用PTX3或聚烯治疗小鼠，在各情况下接下来5天重复给药。以存活百分率的形式评价对感染的抗性。通过将各器官灌洗液在沙氏葡萄糖培养基上连续平板接种而定量感染小鼠的肺、脑和肾中的真菌负荷，结果以从所示器官采集的样品中的菌落形成单位(CFU)(平均值±SE)表示，采样在于感染之前死亡的小鼠死亡时进行或在感染后6天进行。每组由6只动物组成。
*表示P＜0.05(经治疗的与未经治疗的小鼠相比)。
图2举例说明PTX3给药对于对曲霉菌再感染的抗性的作用。在BM移植后1周用2×107个曲霉分生孢子鼻内感染BM-移植小鼠，该小鼠按照图1说明中详细描述的而产生，并且在感染当天开始并接下来再持续5天，同时用PTX3以所示的剂量并经由所示的给药途径进行治疗。感染后2周，静脉内注射5×105个曲霉分生孢子，使存活的小鼠再感染。再感染后3天，评价肾中的真菌生长(CFU)。*表示P＜0.05(经治疗的与未经治疗的小鼠相比)。
图3显示PTX3可减轻患有侵入性曲霉病小鼠的肺病。从感染了曲霉分生孢子，且未治疗(A)或从感染当天开始并再持续5天用1mg/kgPTX3腹膜内治疗(B)的BM-移植小鼠的肺制备高碘酸席夫碱切片。众多曲霉菌丝(箭头)浸润肺实质，伴有广泛的实质破坏和支气管壁损害的强烈征象，并在没有治疗过的小鼠肺中观察到坏死和差的细胞募集(感染后3天)。PTX3-治疗过的小鼠呈现特征在于炎性细胞治愈性浸润的肺组织，且没有实质破坏或真菌生长的迹象(感染后6天)。A和B图放大100倍；插图放大400倍。
图4显示PTX3加速患有侵入性曲霉病小鼠中的细胞恢复。使按照图1说明中详细描述产生的BM-移植小鼠鼻内感染2×107个曲霉分生孢子，从感染当天起并再持续5天使用1mg/kg PTX3腹膜内给药而治疗(+)或不进行治疗(-)。数字表示感染后3或6天肺(A)和脾(B)中阳性细胞的百分比，其通过FACS分析而报告。
图5显示PTX3诱导Th1细胞的功能性恢复。使按照图1说明中详细描述产生的BM-移植小鼠鼻内感染2×107个曲霉分生孢子，并在感染之前(斜线柱条)和从感染当天开始并再持续3天(带点的柱条)，使用1mg/kg PTX3腹膜内给药治疗。在感染后3天，通过对支气管肺泡灌洗液进行特异性ELISA分析而测定IL-12 p70和IL-10水平(A)，产生细胞因子的CD4+T脾细胞数是通过ELISPOT分析计数的(B)且CD4+脾细胞上细胞因子的基因表达通过实时-PCR测定。线条表示标准误差。*P＜0.05，感染与没有感染的小鼠相比；**P＜0.05，PTX3-治疗过的与没有治疗过的小鼠相比。未感染的小鼠(白色柱条)；感染过的小鼠(黑色柱条)。
图6显示PTX3增加AmBisome(L-AmB)和Fungizone(D-AmB)的治疗功效。使按照图1说明中详细描述产生的BM-移植小鼠鼻内感染2×107个曲霉分生孢子，并在感染之前(之前)或之后(之后)，单独或联合使用各单一药物进行腹膜内治疗。剂量为感染之前或之后分别为0.04和0.2mg/kg PTX3；1mg/kg AmBisome和2mg/kg Fungizone。对感染的抗性以存活百分率和来自肺的CFU评价，后者在感染前死亡的小鼠死亡时进行或在感染后6天进行。*P＜0.05，治疗过的与没有治疗过的小鼠相比；**P＜0.001，PTX3+L-AmB的联合治疗与单独的各单一治疗相比；***P＜0.05，PTX3+D-AmB的联合治疗与单独的D-AmB相比。
图7显示在用聚烯治疗的小鼠中，PTX3降低TNF-α产生并增加Th1∶Th2细胞因子比。使按照图1说明中详细描述产生的BM-移植小鼠鼻内感染2×107个曲霉分生孢子，并在感染之后，单独或联合使用各单一药物进行腹膜内治疗。剂量是如图6说明中详细描述的。测定感染后3天支气管肺泡灌洗液中的TNF-γ水平(pg/ml)(A)和抗原-激活的脾细胞的培养上清液中的IFN-γ和IL-4水平(pg/ml)(B)，后者在于感染前死亡的小鼠死亡时进行，或在感染后6天时进行。线条表示标准误差。(-，没有治疗过的小鼠)。*P＜0.05治疗过的与没有治疗过的小鼠相比；**P＜0.05，PTX3+Fungizone(D-AmB)的联合治疗与单独的D-AmB相比；***P＜0.05，PTX3+AmBisome(L-AmB)的联合治疗与单独的各单一治疗相比。
材料和方法动物.雌性BALB/c和C3H/HeJ小鼠，8-10周龄，由Charles RiverBreeding Laboratories(Calco，Italy)提供。该小鼠在特定的无污染的条件下喂养。将BM-移植小鼠圈养在小的无菌笼子中(每个笼子5只动物)并喂以无菌饲料和水。与动物和它们的护理有关的所有过程均按照国家和国际法规和标准进行。所有体内研究均按照国家准则和Committee for the Care and Use of Animals of the University ofPerugia的那些指南进行。
BM-移植模型.来自BALB/c供体小鼠的骨髓(BM)细胞是使用大豆凝集素通过差别凝集制备的。将耗尽T-淋巴细胞的细胞(通过FACS分析测量，污染T细胞少于1％)以≥4×106个/mL的浓度静脉内(i.v.)注射在暴露于9Gy致死剂量的受体C3H/HeJ小鼠中(33)。不进行BM移植的情况下，小鼠在14天内死亡。根据先前研究(33)，超过95％的小鼠存活下来，如通过脾细胞中供体类型的I类MHC的表达所检测到的，所述存活小鼠显示稳定供体的造血嵌合状态。
微生物，培养条件和感染.烟曲霉菌株由在Institute forInfectious Diseases of the University of Perugia的一例肺曲霉病致死病例提供(13)。对于感染，通过吸入乙醚使小鼠轻度麻醉，然后滴注2×107个分生孢子/20μL盐水溶液的混悬液，使用具有无菌一次性管尖的微量吸管经由鼻孔缓慢释放。该过程重复连续3天。对于再感染，对经首次鼻内(i.n.)感染仍存活的小鼠i.v.接种5×105个曲霉分生孢子。感染小鼠的肺、脑和肾中的真菌负荷通过在沙氏葡萄糖培养基上连续平板接种而定量，且结果(平均值±SE)以从所示器官采集的样品中的菌落形成单位(CFU)表示。对于选定的实验，真菌生长还可通过壳多糖分析而评价(10)。对于组织学分析，摘除肺并立即固定在福尔马林中。将包埋在石蜡中的组织切片(3-4μm)使用高碘酸席夫碱操作染色(13，20)。
治疗PTX3(SIGMA-Tau，Pomezia，Rome，Italy)是通过免疫亲和色谱从转染PTX3的CHO细胞的培养上清液纯化的，并监测是否缺乏内毒素(20)。将PTX3、两性霉素B脱氧胆酸盐(D-AmB，Fungizone，Bristol-Myers Squibb，Sermoneta，Italy)和脂质体两性霉素B(L-AmB，AmBisome，GILEAD，Milan，Italy)在无菌盐水溶液(PTX3)或5％葡萄糖-水溶液中稀释至所需浓度。治疗是按照下列方案进行的腹膜内(i.p.)或鼻内(i.n.)(仅PTX3)给予不同剂量的PTX3、两性霉素B或AmBisome，单独或联合，在曲霉菌感染之前进行5天(预防性治疗)，与感染同时进行和感染后进行5天，或在最后一次注射分生孢子后进行5天(治疗性治疗)。在i.n.给药的情况下，分开给予PTX3和分生孢子。对照动物仅接受稀释剂或无菌盐水溶液。
流式细胞计量术.各种细胞类型的表型使用针对所示抗原的鼠抗体和来源于PharMingen(San Diego，Ca)的与FITC缀合的大鼠抗小鼠抗体来评价。在进行免疫化学鉴定之前，通过将细胞与5％正常血清温育而使FcR饱和。组织型抗体用作对照。分析通过FACScan(BectonDickinson，Mountain View，Ca)进行。所得数据以阳性细胞百分比的形式评价。直方图代表4个独立实验中的1个。
通过实时RT-PCR定量细胞因子的转录物.按照制造商的说明，用Sensiscript逆转录酶(QIAGEN)逆转录总RNA(5μg，使用RNeasy MiniKit(QIAGEN S.p.A.，Milan，Italy)从CD4+T脾细胞提取)。进行PCR的引物从Applied Biosystems(FosterCity，Ca)获得。使样品经过95℃15秒，然后60℃ 1分钟的40次扩增循环，其使用ABI PRISM 7000Sequence Detection System(Applied Biosystems)进行。按照制造商(Applied Biosystems)的说明，进行真核18S rRNA管家基因的PCR扩增，以便使样品标准化。包括使用水进行的对照是为了确保特异性。通过对扩增图的分析，检验了所有数据的完整性。将使用RNA 18S标准化的数据以所检验细胞因子的相对mRNA(ΔΔCt)表示，并与首次用于实验的小鼠的数据(10)进行比较。
细胞因子的分析和″斑点酶联免疫吸附″(ELISPOT)分析.支气管肺泡灌洗液和用热激活的曲霉菌(9，10)刺激的脾细胞培养物上清液中的细胞因子水平是用ELISA Kit(R&D Systems，Inc.SpaceImport-Export srl，Milan Italy)测定的。分析的检测限(pg/ml)为对IL-12 p70＜16，对TNF-α＜32，对IFN-γ＜10且对IL-4和IL-10＜3。对产生细胞因子的CD4+T细胞计数时，对纯化的CD4+T脾细胞使用ELISPOT分析(9，10)。结果以每105个细胞中产生细胞因子的细胞平均数(±SE)表示，其中使用连续细胞稀释物的平行测定计算。
统计学分析.对数-秩检验用于分析Kaplan-Meier存活曲线的成对数据。Student′s t-检验或方差分析(ANOVA)和Bonferroni检验用于确定器官清除率和体外分析中差异的统计学显著性，正如
中所示。显著性被定义为P＜0.05。体内组由4-6只动物组成。除非另有说明，所报告的数据从3-5次实验汇总。
结果正如先前所证实的，PTX3的外源给药恢复了患有IA的PTX3-缺陷型小鼠的抗真菌抗性(20)。为了评价PTX3是否可能在以其它方式易感的小鼠中具有益作用，我们使用了BM-移植小鼠，它对IA的显著敏感性已得到很好证明(15)。在感染之前、同时或之后，鼻内或腹膜内给予不同剂量的PTX3而使小鼠经受治疗。剂量是基于初步实验而选择的，该初步实验表明PTX3水平(0.5mg/kg/i.n.剂量)在支气管肺泡灌洗液中较高，持续至少24小时(从2-24小时为70-25ng/ml)且它们高于在IA小鼠中感染后1天观察到的水平(2-15ng/ml)(20和未公开的数据)。然后记录存活参数及肺和脑中的真菌负荷并通过与在使用不同剂量AmBisome或Fungizone治疗的小鼠中获得的那些数据相比较而进行分析。结果表明预防性给予PTX3(图1A)在任何测定剂量下诱导对IA的总体抗性，如绝大多数(85-95％)治疗过的小鼠存活增加(≥60天)及肺和脑中真菌负荷显著降低而揭示的，特别是在接受最高剂量(1mg/kg)的小鼠中。在感染同时接受PTX3的小鼠中获得了相似的结果(图1B)。在该给药期间检测到了剂量-依赖性作用，其中在0.04mg/kg剂量下，PTX3的保护性功效丧失。感染后给予PTX3仅在较高剂量下增加小鼠存活，虽然在两种剂量下，它均显著降低肺中的真菌负荷，且在更高剂量下显著降低脑中的真菌负荷(图1C)。在两种给药途径之间没有观察到差异。在使用5mg/kg AmBisome治疗的小鼠中观察到类似的结果，其中当在感染之前或之后治疗时，所有小鼠经感染均存活下来(图1D)。Fungizone没有提供相同水平的保护，仅在感染后给予最高耐受剂量(4mg/kg)时，观察到存活增加以及真菌负荷降低(图1E)。此外，我们评价了使用PTX3治疗之后，治愈小鼠对曲霉菌再感染的敏感性，并发现使用PTX3治疗还显著增加对再感染的抗性，这是通过再感染小鼠肾中的真菌生长减少而揭示的(图2)。PTX3还改善了肺病理学。感染小鼠的肺切片显示存在许多浸润了肺实质的曲霉菌菌丝，并有严重损害支气管壁的征象及坏死和差的炎性细胞募集(图3A)。在使用PTX3治疗的小鼠中没有观察到这些特征，其肺特征在于多核及单核的炎性细胞的愈合性浸润，没有真菌生长或支气管壁破坏的迹象(图3B)。这些数据为PTX3在BM移植状况中的治疗性功效提供了证据，在所述状况中抗真菌剂通常显示活性降低(16，31)。
在患有I A的小鼠中，对感染的抗性与产生IFN-γ的Th1细胞的激活有关(12，13)。为了评价在患有IA的BM-移植小鼠中PTX3是否激活Th1细胞反应性，我们通过FACS分析评价了细胞恢复、局部细胞因子产生和效应物吞噬细胞的抗真菌活性。对血液白细胞的定量评价表明在使用PTX3治疗之后，循环嗜中性白细胞的绝对数量显著增加(没有显示数据)。然而，由于血液中嗜中性白细胞的水平不能使我们预测对曲霉病的敏感性(5)，因此对肺和脾细胞进行了细胞荧光分析。在使用PTX3治疗的小鼠肺中，CD4+细胞、CD8+细胞和Gr-1+嗜中性白细胞的数量显著增加(图4A)。在脾中还观察到嗜中性白细胞和CD4+T细胞(部分地)的恢复。使用或没有使用PTX3治疗的肺或脾F4-80+细胞的数量没有发现差异(图4B)。恢复的细胞和淋巴细胞证实是有功能活性的，这是通过肺匀浆中促炎(IL-12)和抗炎(IL-10)细胞因子的产生和CD4+Th1(IFN-γ)及Th2(IL-4)的频率所表明的。图5A显示使用PTX3治疗大大增加IL-12产生(约4倍)；然而，IL-10的产生仅为一半(与没有治疗过的对照相比)，这一结果表明PTX3对感染部位的炎性过程发挥精细的控制作用。此外，PTX3治疗增加脾中CD4+Th1细胞的频率，并减少产生IL-4的细胞的频率(图5B)，这一发现是利用定量PCR通过评价细胞因子的mRNA表达水平加以证实的。图5C显示使用PTX3进行的预防性和治疗性治疗均显著增加IFN-γ表达并减少IL-4表达。在评价效应物吞噬细胞的抗真菌活性水平时，发现PTX3-治疗过的小鼠中的效应物吞噬细胞杀死分生孢子的活性高于没有治疗过的小鼠(没有显示数据)。因为体外研究已经排除了PTX3对真菌的任何直接杀死活性(没有显示数据)，因此这些数据证明了PTX3作为一种新的药物，对先天性和适应性抗真菌免疫具有显著的免疫调节活性。
所有上述发现促使我们评价PTX3的免疫调节活性是否可用于增加AmBisome或Fungizone的治疗功效，因为已知这些药物可与抗真菌的效应物吞噬细胞协同起作用(40)。为了该目的，BM移植小鼠接受亚适剂量的单独或与聚烯一起的PTX3，在所述亚适剂量下两种药物均未达到最大治疗作用。在感染之前或之后给予联合或单一的治疗。监测小鼠的存活、真菌生长和细胞因子的产生。发现单独给予各单一药物显著降低肺中真菌生长，但它不能显著改变小鼠的存活，除了在感染之前单独给予PTX3外。然而，使用PTX3和AmBisome的联合疗法，无论在感染之前还是之后，均治愈小鼠感染，这是通过存活增加(＞60天)和真菌生长减少而判断的。当在感染之后给药时，与单独的Fungizone给药相比，PTX3和Fungizone的联合给药显著增加对真菌感染的抗性(图6)。对肺匀浆和培养的抗原-刺激的脾细胞上清液中的细胞因子的分析证实，与在使用单独的药物进行治疗的小鼠中观察到的水平相比，PTX3大大降低接受Fungizone的小鼠肺中TNF-α的产生；作为对AmBisome的反应的TNF-α产生的水平低于使用Fungizone治疗所诱导的水平，且不能通过与PTX3联合治疗而改变(图7A)。各单一治疗之后，与没有治疗过的小鼠相比，脾细胞产生IFN-γ显著增加，且在使用PTX3和AmBisome治疗的小鼠中进一步增加；相反，使用PTX3和/或AmBisome治疗，和使用PTX3与Fungizone联合治疗时，两者均大大减少IL-4的产生，尽管程度较低(图7B)。因此，在减轻肺炎性反应和促进Th1抗真菌反应性方面，PTX3似乎与AmBisome协同发挥作用，并超过与Fungizone的协同作用。
本发明的PTX3在患病最轻的IA小鼠中诱导治愈性反应。鉴于当预防性给药时PTX3是有效的且它不显示对真菌细胞的直接活性，似乎该有益作用取决于它激活Th1-依赖性保护抗性的能力。
PTX3可激活针对致病感染性的至少两个效应物途径，即，经典补体激活途径，在Clq结合中(35)，和通过与一种或多种尚未鉴定的细胞受体相互作用而促进吞噬作用(20)。驻留单核细胞对分生孢子的内化可能有助于限制真菌的感染性并使肺中的髓样细胞和淋巴样细胞恢复。然而，PTX3还可通过应答曲霉分生孢子时IL-12的产生和共同刺激分子的表达而激活DC(20)。因此，通过Toll-样受体(TLR)家族成员(18)，在DC中PTX3产生的迅速开始暗示了PTX3在先天抗性的扩增和定向适应性免疫中的直接作用。
在使用PTX3治疗的感染小鼠的肺中，IL-12的产生增加且IL-10的产生减少，这一结果表示炎性反应。然而，使用PTX3治疗没有增加TNF-α的产生，表明PTX3象许多胶原凝集素一样可对促炎和抗炎刺激之间的平衡发挥精细调节剂的作用(42，48)。
根据本发明，在BM移植感染模型中评价了AmBisome和Fungizone的治疗功效，该模型与BM移植受体中见到的深度免疫病理相似，其中对侵入性真菌感染的敏感性在原因上与保护性Th反应的发生与否有关(15，33)。我们发现在BM移植后的IA小鼠中，AmBisome显示出与Fungizone相比更优的活性。使用5mg/kg AmBisome进行每日预防性和治疗性治疗均治愈小鼠的感染并减少肺中真菌负荷。使用D-AmB，我们仅在感染后给予最高耐受剂量(例如，4mg/kg)时，观察到对感染的抗性稍稍增加。
已经假定D-AmB的毒性(包括发热和战栗)是由先天免疫细胞通过TLR-依赖性机理产生促炎细胞因子所致(43)。表达TKR2、CD14和MyD88衔接蛋白的鼠巨噬细胞和人细胞系应答D-AmB，释放促炎细胞因子，包括TNF-α。这里，我们发现与使用L-AmB治疗的小鼠相比，在使用D-AmB治疗的小鼠中，TNF-α产生更高。然而，与PTX3联合治疗大大降低使用Fungizone治疗所诱导的TNF-α的产生，而它同时增加该药物的治疗功效，正如在感染后使用PTX3和D-AmB组合治疗的小鼠存活增加和真菌负荷降低所示的那样。与使用各单一治疗所观察到的相比，与PTX3联合治疗还在不影响TNF-α产生水平的情况下，增加亚适剂量AmBisome的功效。因此，PTX3与抗真菌剂共同给药的活性可能取决于超出降低TNF-α产生的一种作用。在这一点上，已知抗真菌化疗的功效取决于宿主的免疫反应性(32)且不同的两性霉素B制剂与效应物吞噬细胞联合针对烟曲霉发挥附加的抗真菌活性(40)。还报告了PTX3可增加效应物吞噬细胞针对曲霉分生孢子的吞噬作用和杀伤活性(20)。
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权利要求
1.五亚基环蛋白PTX3与抗真菌剂的组合。
2.根据权利要求1所述的组合，其中所述抗真菌剂为两性霉素B。
3.根据权利要求2所述的组合，其中所述两性霉素B为脱氧胆酸盐形式或脂质体制剂。
4.由权利要求1-3任何一项所述的组合组成的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，含有亚适剂量抗真菌剂。
6.权利要求1-3任何一项所述的组合在制备用于真菌感染的预防性或治疗性治疗的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物含有亚适剂量的抗真菌剂。
8.根据权利要求6和7所述的用途，其中所述真菌感染为肺曲霉病。
全文摘要
本发明描述了用于治疗真菌感染且特别是由烟曲霉引起的感染的五亚基环蛋白PTX3与抗真菌剂的组合。
文档编号A61P31/10GK1950104SQ200580014654
公开日2007年4月18日 申请日期2005年4月28日 优先权日2004年5月7日
发明者G·萨尔瓦托利, P·卡尔米纳蒂, L·罗曼尼 申请人:希格马托制药工业公司