专利名称：施陶丁格连接在用于显像和治疗的显像和治疗目的试剂盒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于医学显像和治疗中的新化合物、试剂盒和方法。本发明还涉及用于预靶向显像和/或治疗的新化合物和试剂盒，以及其制造方法和用途。
背景技术：
Bertozzi及合作者采用基于叠氮化物和膦间经典施陶丁格(Staudinger)反应(图1的反应路线1)的化学选择性连接研究了细胞表面糖基化[参见Kohn & Breinbauer(2004)Angew.Chem.Int.Ed.43，3106-3116]。
进一步改进称作无痕迹的施陶丁格连接(traceless Staudingerligation)，并示于图2中。使用施陶丁格连接，Bertozzi及合作者证实，N-叠氮基乙酰基甘露糖胺(ManNAz)经代谢转化成相应的唾液酸并混合进细胞表面复合糖中。在细胞表面上的叠氮基可与外源性膦试剂进行施陶丁格连接。对照实验证实，没有发生因内源性单硫醇(如谷胱甘肽)使叠氮基减少和因膦探针使细胞表面上的二硫化物减少。
这种技术(″代谢干扰″(metabolic interference))的用途包括通过在细胞上化学构建新糖基化模式构造细胞表面组分(探查糖基化功能)。这种反应也已被用于在细胞环境中设置标签。例如，通过非天然氨基酸将叠氮基加到蛋白中，并将这些蛋白靶向于细胞溶解产物内的共价修饰[Kiick等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99，19-24]。当在甲硫氨酸缺失的细菌培养物中表达该蛋白时，叠氮基高丙氨酸(azidohomoalanine)被大肠杆菌的甲硫氨酰基-t-RNA合成酶活化，并替代了甲硫氨酸。一种应用是用受施陶丁格连接活化的前荧光(pro-fluorescent)香豆素染料修饰蛋白，从而使得在细胞内运输的蛋白显像[Lemieux等人(2003)J.Am.Chem.Soc.125，4708-4709]。
施陶丁格连接已经成功地用于多种目的，如肽连接、内酰胺合成、生物结合物(bioconjugate)、细胞内标签、代谢细胞工程、和制造微阵列。施陶丁格连接已被表明可以在体内(大鼠)中进行，叠氮化物和膦衍生物被证明在体外和体内均无毒性[Prescher等人(2004)Nature 430，873-877]。用于分子显像的这种反应的普遍用途很大程度上仍未进行研究。
在医学显像形式中，已经成功使用造影剂(增强图像例如在不同器官或组织之间或在正常和异常组织之间的对比的材料)。与疾病相关的具体分子靶标的显像允许较早诊断和更好地控制疾病。因此，特别有益的是借助于活性靶标使造影剂优先分布在个别身体部位例如肿瘤细胞。通过使对比增强部分直接或间接地与靶标构造结合实现这种活性靶标。靶标构造与细胞表面结合或与靶标部位的其他表面结合，或被细胞吸收。
用在活的人和动物上的成功显像剂的重要标准在于，其表现出高的靶标吸收，同时表现出从非靶标组织和从血液中的快速清除(通过肾和/或肝胆系统)，从而在靶标和周围组织之间实现高对比。然而，这经常引起问题。例如，人体中显像研究表明，肿瘤部位的抗体最大浓度在24h内达到，但是在循环中标记的抗体降低到成功进行显像所需的足够低的水平之前需要几天。对于核探针而言这尤其是个挑战，因为它们通过衰变持续地产生信号。因此，必须在示踪剂的几个半衰期内达到相对于背景水平足够信号。对于MRI探针，在显像之前可以等待足够长的时间以使背景信号减小。此外，MRI途径中存在可活化探针或″智能探针″；它们仅当与靶标或酶相互作用时才产生信号(参见US专利6,770,261)。然而，对于用于MRI的足够的信号积聚而言，内源性受体密度经常过低。
在靶标组织中积聚较慢或不充足，从非靶标区域清除较慢和低造影剂浓度(特别是对于MRI)这些问题已经导致预寻靶方案(pre-targeting scheme)的应用。图3所示为典型预寻靶方案。在预寻靶步骤中，经由一级寻靶部分选择性识别一级靶标，如相关受体。为了允许在结合后检测，一级寻靶部分与还带有二级靶标的预寻靶平台(pre-targeting scaffold)连接。在第二寻靶步骤中，给予将与预寻靶平台上的二级靶标结合的二级寻靶部分。二级寻靶部分本身与携带有对比提供单元(contrast providing unit)的二级寻靶骨架结合。二级靶标/二级寻靶部分对的典型例子是生物素/链亲和素或抗原/抗体体系。
现有(预)靶向显像存在几个问题和缺点。主要问题在于寻靶仅依赖于天然/生物寻靶构造(即内源性受体、生物素/链亲和素)。这产生了多种缺点，尤其是在尺寸和其内源性性质方面。
通常在生物学(如抗体-抗原)中和特别是在预寻靶(生物素-链亲和素，寡核苷酸作为二级寻靶部分)中实施高度选择性相互作用的实体极大。由于尺寸原因，预寻靶构思迄今基本上限于血管体系内应用。因此，不能实现具有肽和小有机寻靶装置作为一级配体以及具有代谢显像和细胞内靶向显像的预寻靶，因为二级寻靶部分的尺寸排除了使用小的一级配体。大体积的二级寻靶部分影响预寻靶构造以及显像探针的性能(即转运、清除、靶标亲和性/相互作用)。此外，显像探针的对比提供单元也可能影响二级寻靶部分的性能(例如对于抗生物素蛋白，生物素结合物的亲和性损失)。
此外，预寻靶用的许多化合物被身体分解。生物素是内源性分子，其结合物可被血清酶生物素酰胺酶分解。当使用反义预寻靶时，寡核苷酸受RNAse和DNAse攻击。蛋白和肽也经历天然分解途径。
各配对之间的相互作用可被它们的非共价和动态性质进一步削弱。此外，内源性生物素与生物素结合物竞争与链亲和素结合。链亲和素可诱导免疫反应。最后，天然靶标如细胞表面受体存在的量并不总是足以在显像中产生对比。
预寻靶技术被证实对于抗体基显像极为有用，因为尽管其药物动力学经常对于显像应用太低，但其对抗原具有高选择性和特异性[Sung等人(1992)，Cancer Res.52，377-384；Juweid等人(1992)癌症Res.52，5144-5153]。尽管较小的寻靶构造如抗体片段、肽和有机分子具有更适合的药物动力学，但是它们也得益于预寻靶技术，因为这些构造仍具有寻靶和清除慢(即在致密组织中、或在细胞内显像中)或积聚不充足(低受体密度、生长慢或肿瘤小)的缺点。此外，在清除途径如肝胆或肾中的积聚也遮掩了相关组织。
显像领域中近期的发展方向是一般化的示踪剂，其中示踪化学没有较大变化，但是基础分子结构容易被修饰以使新分子靶标显像。对于新显像剂而言，这使研发时间/成本下降。预寻靶技术允许将该一般化用于对多种靶标，因为对比提供基团对于不同应用总是相同。因此，可以预期新分子显像能够很快得到FDA核准，因为仅有预寻靶基团需要FDA核准。
发明内容
本发明提供探针和前体，探针和前体的试剂盒，制造这种探针和前体的方法，和在医学显像和治疗中应用探针和前体的方法。
在最广泛方面，本发明涉及彼此相互作用形成稳定的共价生物正交键的两种成分。这些成分可用在医学显像和治疗中，更特别是在靶向和预靶向显像和治疗中。
根据本发明特定实施方案，通过施陶丁格连接得到所述共价生物正交键，本发明的每一种成分分别包括施陶丁格连接用的反应配偶子(reaction partner)，即膦和叠氮基。
本发明的第一方面涉及例如存在于试剂盒中的所述两种成分。本发明的试剂盒包括至少一个寻靶探针，其包括一级寻靶部分和二级靶标，和至少一个另外的探针，其是包括二级寻靶部分和标记的显像探针。可选择地，所述第二成分是包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针。根据本发明，所述寻靶探针或所述显像或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而另一个探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。
本发明特定实施方案涉及寻靶探针，其中一级寻靶部分与血管体系内或其外部的成分结合，或具体而言与胞间隙中的成分结合或与细胞内成分结合。
这里描述了本发明试剂盒中用的适宜的一级寻靶部分的特定实施方案，包括受体结合肽和抗体。本发明特定实施方案涉及应用小的寻靶部分如肽从而得到细胞渗透性寻靶探针的用途。
本发明的另一个方面涉及一种开发(developing)用于本发明中的寻靶探针的方法。本发明的这一方面的特定实施方案涉及通过组合化学制造用于靶向于受体的寻靶探针，其中在化合物库的合成中引入叠氮基。更特别地，本发明涉及一种研制对靶标具有优化的结合亲和性和对显像或治疗探针具有优化的反应的寻靶探针的方法，所述方法包括制备所述寻靶探针的寻靶部分的化合物库，其中在所述寻靶部分上的不同部位引入二级靶标，以及筛选这样得到的化合物库，以与靶标结合并与显像和/或治疗探针结合。因此，本发明还提供在相同或不同氨基酸处用至少一个叠氮基修饰的先导寻靶部分库。本发明还提供特异肽的衍生物或变体的库，其特征在于，所述衍生物在所述肽的氨基酸链中的不同氨基酸位置处被叠氮基修饰。
本发明另一个特定实施方案涉及一种上述寻靶探针和一个或多个显像探针和/或治疗探针的试剂盒以及其用途。除了作为本发明生物正交反应中的一个反应配偶子的二级寻靶部分之外，这种显像探针还应包括可检测标记，特别是传统显像系统中所用的造影剂，其选自MRI可显像剂，自旋标记，光学标记如发光、生物发光和化学发光标记，FRET型标记和Raman型标记，超声反应性试剂，X射线-响应剂，单光子发射计算机断层显像(single photon emissioncomputed tomography，SPECT)和正电子发射断层显像(PositronEmission Tomography，PET)用的放射性核素，它们的适合的例子对于本领域技术人员是已知的，并在本文中提供。
本发明特定实施方案涉及小尺寸有机PET和SPECT标记作为可检测标记的用途，其提供了细胞渗透性显像探针。
本发明另一个特定实施方案涉及包括″智能″或″响应性″MRI造影剂作为可检测标记的显像探针以及其在本发明的试剂盒和方法中的用途。更特别地，本发明涉及一种包括MRI显像剂和膦基团的显像探针，其可以在施陶丁格连接中与叠氮基反应，其中显像剂的金属原子通过含有膦基团的连接基团(link)与一个或者多个羧酸配位。
本发明另一个特定实施方案涉及一种上述寻靶探针和治疗探针的试剂盒，和其在靶向治疗中的用途。
本发明的显像探针可以任选地还包括治疗活性化合物，例如可以是药物或放射性同位素。可选择地，除了可检测标记之外，显像探针还可包括治疗活性化合物。
本发明的另一个方面提供特别适于医学显像的探针。因此，本发明提供一种包括二级寻靶部分和标记的显像探针，其中所述显像探针包括作为二级寻靶部分的至少一个叠氮基或至少一个膦基团，所述膦或叠氮基是适于施陶丁格连接用的反应配偶子，所述标记是适于使用经典技术包括MRI、X-射线、超声等显像的显像标记。
本发明的另一个方面涉及一种医学显像和/或治疗用的组合探针，其包括一级寻靶部分和可检测标记或药物活性化合物，其中寻靶部分通过酰胺键或三苯基膦氧化物部分与可检测标记连接。在本发明这一方面的特定实施方案中，所述一级寻靶部分是肽。
本发明还涉及一种体外制备包括一级寻靶部分和可检测标记或药物活性剂的组合的寻靶和显像或治疗探针的方法，所述方法包括如下步骤使包括膦的可检测标记与包括叠氮基的一级寻靶部分反应或使包括叠氮基的可检测标记与包括膦的一级寻靶部分反应。
本发明还涉及一种研制用于医学显像或治疗的、对靶标具有优化的结合亲和性和优化的显像或治疗功效的组合探针的方法，所述方法包括制备所述组合探针的寻靶部分的化合物库，其中在所述寻靶部分上的不同部位引入二级靶标，使所述库的化合物与标记或药物活性化合物连接，并筛选这样得到的化合物库，以与靶标结合和/或发挥治疗功效。这种方法特别适用于其中一级寻靶部分是肽或蛋白的组合探针。
在本发明的另一个方面中，在生物正交共价反应中相互作用的两种成分一方面是靶标代谢前体而另一方面是显像或治疗探针。
因此，在特定实施方案中，本发明提供一种靶向医学显像或治疗用的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个靶标代谢前体和至少一个另外的探针，所述靶标代谢前体包括二级靶标，所述另外的探针选自包括二级寻靶部分和标记的显像探针或包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针，其中所述靶标代谢底物或所述显像或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而所述显像或治疗探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。
本发明这一方面的特定实施方案涉及上述试剂盒，其中靶标代谢前体包括至少一个叠氮基，和其中显像或治疗探针包括至少一个膦基团。
本发明另一个特定实施方案涉及包括选自糖、氨基酸、核碱(nucleobases)和胆碱的代谢前体的试剂盒。
本发明另一个特定实施方案涉及包括代谢前体和显像探针特别是包括可检测标记的显像探针的试剂盒，所述可检测标记是传统显像系统中所用的造影剂。这种可检测标记可以是但不限于选自如下的标记MRI可显像剂、自旋标记、光学标记、超声反应性试剂、X射线反应性试剂、放射性核素、和FRET型染料。
在本发明特定实施方案中使用了报道探针。这种报道探针可以是酶特别是非细胞内源性而是通过基因治疗或感染外来物质而引入的酶的底物。提及细胞或组织中基因时所述的非内源性用于表明基因不是在该细胞或组织中天然存在和/或表达的。可选择地，这种报道探针是通过受体或泵引入细胞中的分子，所述受体或者泵可以是内源性的或通过基因治疗或感染外来物质而引入细胞中的。可选择地，所述报道探针是与细胞或组织环境内的某些(变化着的)条件反应的分子。
因此，本发明提供用于医学显像和治疗的探针和试剂盒。此外，本发明涉及使用本发明两种成分的显像方法和治疗方法。根据特定实施方案，本发明提供用于靶向和预靶向显像和治疗的探针和试剂盒。因此，本发明涉及利用作为生物正交反应如施陶丁格连接中的配对成分的至少两种成分使细胞、组织、器官、外来成分显像的方法。所述两种成分一方面是寻靶探针、靶标代谢前体或报道探针，另一方面是显像探针。此外，本发明涉及利用作为生物正交反应如施陶丁格连接中的配对成分的至少两种成分来预防或治疗、靶向于细胞、组织、器官、外来成分的方法。所述两种成分一方面是寻靶探针、靶标代谢前体或报道探针，另一方面是治疗探针。本发明还涉及制造本发明的显像和治疗中所用的工具的方法。
图1表明反应路线1中的施陶丁格反应和反应路线2中的施陶丁格连接。
图2表明反应路线3无痕迹的施陶丁格连接。
图3表明预寻靶构思的一般方案。
图4表明显像探针的反应，显像探针包括膦基团和″智能″MRI造影剂和存在于与靶标结合的寻靶探针上的叠氮基，由此实现信号强度。
图5表明怎样将标记或治疗化合物的结合部位包括在用于识别针对特定靶标的新先导的组合库的设计中。
图6提供在基因治疗中的报道基因如编码青霉素酰胺酶的基因的显像。
图7提供显像探针的一般合成路线，其中显像剂通过胺或羧酸与叠氮部分或膦部分连接。
具体实施例方式
下面结合特定实施方案并结合某些
本发明，但本发明不限于此，而是由权利要求限定。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制其范围。所示的附图仅是示意性的和非限制性的。在附图中，为说明目的，一些元件尺寸被夸大，而没有按比例绘制。在说明书和权利要求书中使用的术语″包括″不排除其他元件或步骤。当指代单数名词时，如果使用不定冠词或定冠词例如″a″或″an″，″the″，则也包括该名词的复数，除非另有具体说明。
此外，应注意到，在说明书和权利要求书中使用的术语″包括″不应被解释为限制到其后所列的手段；其不排除其他元件或步骤。因此，表达″一种装置，其包括部件A和B″的范围不应被限制为仅由部件A和B构成的装置。这是指，该装置与本发明相关的部件仅是A和B。
本发明对现有(预)靶向显像的上述限制提供一种解决方案，使用共价连接，特别是生物相容的共价连接而不是生物基相互作用，例如施陶丁格连接，这是一种选择性化学和生物正交反应，[Saxon &Bertozzi(2000)Science 287，2007-2010；Saxon等人(2002)J.Am.Chem.Soc.124，14893-14902]。
使用在两个分子之间的生物相容的、但不是自然发生的直接共价反应解决了不同应用中基于共价反应的识别机理所遇到的缺点。更具体而言，其在预寻靶中表现出多种特别有益的优点，并且是分子显像中强大的新工具。
本发明的实施方案提供一种化学反应，其中参与的两个官能团比在现有预寻靶组合中的生物配对物(counterpart)更小。在本发明的方法中，使用的两个参与官能团，例如叠氮基和膦，等于在许多生物过程如抗体-抗原结合中发生的非共价识别事件的极大的选择性。根据本发明的一个方面，选择具有经细微调节的反应性的两个参与官能团，从而避免了与共存官能团的干扰。根据本发明另一方面，选择的非生物的反应性配对成分在生理条件下形成稳定的加成物，并且仅彼此识别而忽视它们的细胞/生理环境，即它们是生物正交的。生物环境所施加的选择性需求排除了对大多数其他常规反应的使用。施陶丁格连接对于在细胞环境中进行的本发明方法是优选的反应。对于本发明的方法和化合物，可以使用非无痕迹的和无痕迹的施陶丁格连接。
使用本发明的方法和化合物，由于尺寸小，显像探针可以例如通过肾从身体快速排出，并可提供所需的高肿瘤积聚以及相对低的非靶向积聚。在核医学显像中，预寻靶的构思是有利的，因为可以在不使用放射性同位素情况下进行耗时的预寻靶步骤，同时可以使用与包括二级寻靶部分的小的叠氮化物或膦偶联的放射性同位素更快速地进行二级寻靶步骤。后者允许使用短寿命的放射性核素，其优点在于例如最小化对患者的放射剂量并允许使用PET即正电子发射断层显像剂代替SPECT即单光子发射计算机断层显像剂。在超声显像中，常规造影剂基于气泡，并具有受限的造影剂寿命。根据本发明的预寻靶构思可以克服受限的造影剂寿命问题，使得使用通用造影剂成为可能。此外，本发明特别适用于多模显像(multimodalimaging)，任选地使用不同的显像剂来使相同的靶标可视化。
根据本发明的另一个方面，预寻靶方法与多齿配体体系如树枝状聚合物、聚合物、或脂质体组合使用，从而可以在靶标部位实现信号放大，例如MRI信号。
在分子显像中使用施陶丁格连接使得所有类型和尺寸的寻靶构造均可进行预寻靶。这使得细胞内和代谢显像可得益于可通过预寻靶积聚得到的高靶标积聚和低背景。同样，预靶向信号放大方案，例如聚叠氮基和/或聚膦树枝状聚合物或脂质体，可用于较小和更多的不同寻靶装置。因为反应配偶子是非生物的和生物正交的，因此以施陶丁格连接进行预寻靶不受内源性竞争和代谢/分解的妨碍，并提供稳定的共价键。借助于在例如肿瘤细胞中比正常细胞中更高的流量选择靶向代谢途径和相应的叠氮基-代谢物衍生物，在靶标细胞的表面上建立高密度人工叠氮基受体或其他化学把手(chemicalhandle)，从而避免了使用有时是低水平的内源性细胞表面受体。
最后，施陶丁格连接的正交性质使其成为在预寻靶方案的一般化中，或在各种寻靶装置和/或具有各种官能团的显像剂的结合化学中成为优先选择的反应。
本发明提出施陶丁格连接作为生物相容的并可用于人或动物体中的共价连接体系的例子的新颖应用。其被认为是生物正交的。本申请中所指的″施陶丁格连接″指施陶丁格反应的改进。在″施陶丁格反应″中，在膦和叠氮化物之间发生反应生成氮叶立德(aza-ylide)(图1，反应路线1)。在水存在下，该中间体自发地水解生成伯胺和相应的膦氧化物。膦和叠氮化物在水中于室温下高产率地迅速相互反应。
在施陶丁格连接中，施陶丁格反应被改进以防止氮叶立德中间体水解。为此，设计了带有亲电阱(electrophylic trap)例如甲基酯的膦，在水解进行之前，其可以使不稳定的亲核氮叶立德中间体进行分子内重排形成稳定的加成物。因此，通过使这种修饰和生物结合的三芳基膦与叠氮化物结合物反应进行施陶丁格连接，其后分子内环化得到酰胺键和膦氧化物。这种连接被称作″非无痕迹的″施陶丁格连接(图1，反应路线2)，因为连接产物含有附加的三苯基膦氧化物残基。在图1中，例示了施陶丁格反应。所述的芳基是优选的例子，但可选择地，这些基团可以被任何烷基或环烷基替代。
在图1的反应路线2中，R为a)在寻靶探针情况下是一级寻靶部分，b)在显像探针的情况下是可检测标记，或c)在治疗探针的情况下是治疗化合物。R′为a)在寻靶探针情况下是一级寻靶部分，b)在显像探针的情况下是可检测标记，或c)在治疗探针的情况下是治疗化合物。在反应路线1和2中，R′与一个芳基连接。应该理解，R′也可以与膦分子的任何其他适合部分连接。
然而，″无痕迹的″施陶丁格连接后来发展成从叠氮化物和膦试剂产生简单酰胺键(图2)。这种反应利用带有可转移的酰基的膦。在中间体氮叶立德重排和水解之后与叠氮化物的反应生成酰胺连接的产物和释放的膦氧化物。在图2中，芳基是优选的例子，其可以被任何烷基或环烷基替代。在图2中，″X″代表杂原子如氧或硫。R′为a)在寻靶探针情况下是一级寻靶部分，b)在显像探针的情况下是可检测标记，或c)在治疗探针的情况下是治疗化合物。在″无痕迹的″施陶丁格连接中，R′与亲电阱连接。R为a)在寻靶探针情况下是一级寻靶部分，b)在显像探针的情况下是可检测标记，或c)在治疗探针的情况下是治疗化合物。使用″非无痕迹的″和″无痕迹的″施陶丁格连接都在本发明的范围中。
本发明中使用的″一级靶标″涉及要通过显像检测的靶标。例如，一级靶标可以是有机体、组织或细胞中存在的任何分子。用于显像的靶标包括细胞表面靶标，例如受体，糖蛋白；结构蛋白，例如淀粉斑；细胞内靶标，例如高尔基体的表面，线粒体的表面，RNA，DNA，酶，细胞信号途径成分；和/或外来体，例如病原体如病毒，细菌，真菌，酵母菌或其部分。一级靶标的例子包括化合物，如其存在或表达水平与某些组织或细胞类型相关的蛋白，或其表达水平在某些紊乱中上调或下调的蛋白。根据本发明特定实施方案，一级靶标是蛋白如受体。可选择地，一级靶标可以是在疾病例如传染病或癌症中上调的代谢途径，如DNA合成，蛋白合成，膜合成和糖类吸收。在患有疾病的组织，上述标记可以与健康组织相区别，并提供独特的早期检测、特异诊断和治疗尤其是靶向治疗的可能性。
本文中应用″寻靶探针″指能与一级靶标结合的探针。寻靶探针包括″一级寻靶部分″和″二级靶标″。
本发明中使用的″一级寻靶部分″涉及能与一级靶标结合的寻靶探针部分。一级寻靶部分的特定例子是能与受体结合的肽或蛋白。一级寻靶部分的其他例子是能与细胞化合物反应的抗体或其片段。抗体可被培养成非蛋白质的化合物以及培养成蛋白或肽。其他一级寻靶部分可以由适体，寡肽，寡核苷酸，寡糖，以及拟肽和有机药物化合物构成。一级寻靶部分的结合优选具有高特异性，高亲和性，且与一级靶标的结合在体内优选是稳定的。
本发明中使用的″二级靶标″涉及寻靶探针的能提供共价连接例如在下述显像或治疗探针的二级寻靶部分上存在的施陶丁格连接的反应配偶子的部分。在具体实施方案中，二级靶标将是一个或多个叠氮基。然而，在其他特定实施方案中，可以预期其中二级靶标是一个或多个膦基团的应用。
本文中″靶标代谢前体″指包括共价连接例如施陶丁格连接的反应配偶子的代谢途径的底物，即作为二级靶标，根据本发明其与下述显像或治疗探针的二级寻靶部分反应。所述代谢途径可以是每个细胞中存在的途径(如DNA合成、蛋白合成和膜合成)，并可在例如癌症或炎症/感染中被上调。可选择地，所述代谢途径可以对特定细胞类型例如癌细胞具有特异性。
″显像探针″包括″二级寻靶部分″和可检测标记，例如对比提供单元。
″二级寻靶部分″涉及显像探针的包括共价连接例如施陶丁格连接的反应配偶子的部分，其与一级寻靶探针上的二级靶标反应。在特定实施方案中，二级寻靶部分将包括一个或多个膦基团。
本文中″可检测标记″涉及显像探针的例如当存在于细胞、组织或有机体中时允许检测所述探针的部分。本发明中可预期的一类可检测标记是对比提供剂。本发明中可预期并在本文中公开了不同类型的可检测标记。
本文中″治疗探针″指包括二级寻靶部分和药物活性化合物例如但不限于治疗化合物的探针。本文提供了药物活性化合物的例子。治疗探针任选地还包括可检测标记。
本文中″组合探针″，即″组合的寻靶和显像探针″或″组合的寻靶和治疗探针″或″组合的寻靶和显像和治疗探针″指通过使寻靶探针的二级靶标例如叠氮基或膦分别与显像探针的二级寻靶部分例如膦或叠氮基结合形成的化合物。该结合可以是体外的。因此，这种组合探针包括一级寻靶部分和可检测标记。
本文中术语″分离的″指存在于身体之外或细胞或细胞部分例如细胞溶解产物之外的化合物。在本发明中，就属于分离的探针或组合探针例如一级寻靶探针、显像探针或治疗探针或其组合的特定特征而言，这指存在于人或动物体、组织或细胞之外的探针。不是指在将所述结合物的构成成分连续加到所述身体组织或细胞之后在身体、组织或细胞内形成的结合物。
在第一方面中，本发明涉及一种使用能在共价连接例如施陶丁格连接中反应的化合物预寻靶的方法。
预寻靶的总体构思就显像而言绘于图3中。相关标记存在于例如某些疾病组织的细胞表面上。这种标记称作″一级靶标″。在第一预寻靶步骤中，寻靶探针通过一级寻靶部分与一级靶标结合。寻靶探针也带有二级靶标，这将允许与显像探针特异地结合。任选地，一旦寻靶探针到达一级靶标，并与其结合，例如耗时24小时，那么如果自然清除不足，可以使用清除剂从组织或有机体除去过量的寻靶探针。在第二温育步骤中，例如1-6小时，提供了用于所述显像方式的可检测标记的显像探针通过其二级寻靶基团与(预)-结合的寻靶探针结合。
在预寻靶策略中使用施陶丁格连接的优点在于，膦和叠氮化物都是非生物的，并且基本上对细胞和所有其他区域如血清等之中或表面上的生物分子没有反应性。因此，本发明的化合物和方法可用于活细胞、组织或有机体中。此外，叠氮基较小，可以在没有明显改变生物学尺寸的情况下引入生物样品或活有机体中。使用施陶丁格连接，有可能使用小的反应配偶子例如叠氮化物和膦，使大尺寸的一级寻靶部分例如抗体与标记或其他分子结合。更有利的是，使用(匹配的)小反应配偶子例如叠氮化物和膦，相对较小的一级寻靶部分例如肽可以与标记或其他分子结合。二级靶标和二级寻靶部分对寻靶探针和显像探针的尺寸和性能没有大的影响，从而允许小的寻靶部分可用于(预)寻靶方案。因此，与采用抗体-链亲和素的现有预寻靶不同，本发明可靶向于其他组织，即探针的目标不限于血管体系和细胞间隙。
根据一个实施方案，本发明用于靶向显像。根据该实施方案，通过特异性结合寻靶探针的一级寻靶部分和并使用可检测标记检测这种结合来实现特定一级靶标的显像。
根据本发明，一级靶标可以选自人或动物体内或病原体或寄生虫上任何适合的靶标，例如选自细胞如细胞膜和细胞壁，受体如细胞膜受体，细胞内结构如高尔基体或线粒体、酶、受体、DNA、RNA、病毒或病毒颗粒、抗体、蛋白、碳水化合物、单糖、多糖、细胞因子、激素、甾类、促生长素抑制素受体、单胺氧化酶、蕈毒碱受体、心肌交感神经系统、例如在白细胞上的白三烯受体、尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)、叶酸盐受体、凋亡标记、(抗)血管生成标记、胃泌激素受体、多巴胺能系统、血清素系统、GABAergic系统、肾上腺素能系统、胆碱能系统、阿片受体、GPIIb/IIIa受体和其他血栓相关的受体、纤维蛋白、降钙素受体、促吞噬素受体、整合素受体、VEGF/EGF受体、基质金属蛋白酶(MMP)、P/E/L-选择素受体、LDL受体、P-糖蛋白、神经降压肽受体、神经肽受体、物质P受体、NK受体、CCK受体、σ受体、白介素受体、单纯疱疹病毒酪氨酸激酶，人酪氨酸激酶。
为允许对上列一级靶标的特异性寻靶，寻靶探针的一级寻靶部分可以包括化合物，包括但不限于抗体、抗体片段、例如Fab2、Fab、scFV、聚合物(通过EPR作用而靶向于肿瘤)、蛋白、肽例如奥曲肽和衍生物、VIP、MSH、LHRH、趋化肽、蛙皮素、弹性蛋白、肽模拟物、碳水化合物、单糖、多糖、病毒、药物、化疗剂、受体激动剂和拮抗剂、细胞因子、激素、甾类。本发明中可预期的有机化合物的例子是或衍生于雌激素例如雌二醇、雄激素、孕激素、皮质甾类、紫杉醇、依托泊苷、多柔比星、氨甲蝶呤、叶酸、和胆固醇。
根据本发明特定实施方案，一级靶标是受体，适合的一级寻靶部分包括但不限于这种受体的配体或仍与受体结合的配体的部分，例如在受体结合蛋白配体情况下的受体结合肽。
蛋白性质的一级寻靶部分的其他例子包括干扰素，例如α，β，和γ干扰素，白介素，和蛋白生长因子，如肿瘤生长因子，例如α，β肿瘤生长因子，血小板衍生的生长因子(PDGF)，uPAR靶向蛋白，脱脂载脂蛋白，LDL，膜联蛋白V，内皮抑素，和血管生成抑制素(angiostatin)。
一级寻靶部分的可选择例子包括例如与一级靶标互补的DNA，RNA，PNA和LNA。
根据本发明特定实施方案，使用可以与细胞内一级靶标结合的小的亲脂性一级寻靶部分。
根据本发明另一个特定实施方案，选择一级靶标和一级寻靶部分，使得对组织或疾病的靶向具有特异性或增强，所述组织或疾病如癌症，炎症，感染，心血管疾病，例如血栓，动脉粥样硬化损伤，缺氧性部位(hypoxic site)，例如中风，肿瘤，心血管紊乱，脑紊乱，凋亡，血管生成，器官，和报道基因/酶。通过选择具有组织-，细胞-或疾病-特异性表达的一级靶标可以实现这一点。例如，膜叶酸受体介导叶酸盐和其类似物如氨甲蝶呤的细胞内积聚。表达于正常组织中受限，但是受体在各种肿瘤细胞类型中过表达。
根据一个实施方案，寻靶探针和显像探针可以是多聚化合物，包括多个一级和/或二级靶标和/或二级寻靶部分。这些多聚化合物可以是聚合物，树枝状聚合物，脂质体，聚合物颗粒，或其他聚合构造。对于放大检测信号特别有益的是具有一个以上二级靶标的寻靶探针，其允许结合几个显像探针。
根据本发明特定实施方案，本发明的化合物和方法用于显像，特别是医学显像。为识别一级靶标，使用包括一个或多个可检测标记的显像探针。显像探针的可检测标记的特定例子是传统显像系统中所用的造影剂，如MRI可显像剂、自旋标记、光学标记、超声反应性试剂、X射线反应性试剂、放射性核素、(生物)发光和FRET型染料。本发明中可预期的示例性可检测标记包括但不限于荧光分子，例如自身荧光分子，与试剂等接触时发荧光的分子，放射性标记；生物素，例如，通过生物素和抗生物素蛋白的反应检测；荧光标签，包括顺磁性金属的MRI用的显像剂，显像试剂，例如，记载在美国专利4,741,900和5,326,856中的那些)等。
用于显像的放射性核素可以是例如选自如下的同位素3H、11C、13N、15O、18F、51Cr、52Fe、52mMn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80mBr、82mBr、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113mIn、114mIn、117mSn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193mPt、195mPt、201Tl、203Pb。在某些应用中，也可以使用例如用于治疗的其他元素和同位素来显像。
MRI-可显像剂可以是顺磁离子或超顺磁颗粒。顺磁离子可以是选自如下的元素Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。本发明特定实施方案涉及使用后面更详细说明的″智能″或″响应性″MRI造影剂。
超声反应性试剂可以包括微泡，其外壳由磷脂，和/或(生物可降解的)聚合物，和/或人血清白蛋白构成。微泡可以用氟化气体或液体填充。
X射线反应性试剂包括但不限于碘、钡、硫酸钡、泛影葡胺(gastrografin)或可以包括用碘化合物和/或硫酸钡填充的泡囊、脂质体或聚合物胶囊。
此外，本发明中可预期的可检测标记还包括可通过抗体结合检测例如通过结合可检测标记的抗体或通过夹心型分析(sandwich-type analysis)检测结合的抗体结构的肽或多肽。
在一个实施方案中，可检测标记是小尺寸有机PET和SPECT标记，如18F、11C或133I。由于尺寸小，有机PET或SPECT标记，例如18F、11C或123I，理想地适用于监控细胞内事件，因为它们通常对寻靶装置的性能特别是其膜转运没有大影响。同样，叠氮部分较小，并可用作蛋白、mRNA、信号途径等的细胞内显像的标记。包括PET标记和三苯基膦作为二级寻靶部分的显像探针是亲脂性的，并能被动地扩散进出细胞，直到找到其结合配对成分。此外，两种成分都不排除穿过血脑屏障并因此允许在大脑中的区域显像。
根据另一个实施方案，本发明的化合物和方法用于靶向治疗。这通过使用包括二级寻靶部分和一种或多种药物活性剂(即药物或放疗用的放射性同位素)的治疗探针来实现。靶向药物输送中用的适合的药物是本领域已知的。任选地，治疗探针还包括可检测标记，如一种或多种显像剂。用于治疗的放射性核素可以是选自如下的同位素24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、225Ac。
现有已知的多种治疗化合物已经含有叠氮基，因此代表可用于能够与寻靶探针组合使用的治疗探针而用于靶向治疗以改进其功效。例如使用预寻靶策略，光动力癌症治疗用的叠氮基-染料结合物(参见WO 03/003806)可更有效地靶向于疾病组织。
在本发明的另一个实施方案中，通过选择性地将本发明的二级靶标加到靶标细胞或组织中可代替使用寻靶探针。使用细胞途径中涉及的分子如代谢前体分子可实现这一点，其包括二级靶标，例如叠氮基反应配偶子，可通过细胞的代谢加到生物分子中。细胞途径中设计的分子也称作构造块。按此方式靶向于的代谢途径可以是所有细胞细胞共同的途径，如DNA合成、蛋白合成和膜合成。任选地，这些是在疾病如癌症或炎症/感染中上调的代谢途径。可选择地，作为靶标的代谢途径对于特定类型的细胞或组织具有特异性。本发明中使用的靶标代谢前体包括代谢前体分子，例如但不限于氨基酸和核酸、氨基糖、脂质、脂肪酸和胆碱。这些化合物如氨基酸的显像可以反映氨基酸吸收和/或蛋白合成中的差异。各种糖可用于标记碳水化合物结构。脂肪酸可用于标记例如细胞膜中的脂质。
此外，许多代谢前体的类似物在本领域中是已知的，用于在本发明中其可提供特别的优点。可以用叠氮基或膦标记的代谢途径和相应代谢前体非限制性地列举于下文。其中一些临时积聚在细胞中，而其他的加到生物大分子中。
胸苷磷酸化酶是催化胸苷水解成胸腺嘧啶和去氧核醣-1-磷酸酯的酶。据报道胸苷磷酸化酶的高水平表达与结肠直肠，头或颈，膀胱，和子宫癌症中的存活下降相关，也与肿瘤的血管生成活性相关。由于酶也催化逆反应(即，胸腺嘧啶转化成胸苷)，所以其可用作细胞内捕集胸腺嘧啶治疗类似物的手段，如卡培他滨，其可转化成氟尿嘧啶。
增殖-靶向显像剂优选对恶性肿瘤具有高特异性，并可用于区分良性或低级肿瘤与高级损伤，检测低级肿瘤中的高级转化，或设计诊断性活组织检查、外科切除、或放疗的优化途径。FDG和甲硫氨酸也适用于该目的。大多数研究集中于被结合到复制的DNA链中的DNA类似物，如胸苷或溴脱氧尿苷(BrdU)。溴-2′-氟-2′-脱氧尿苷(BFU)是更耐降解并具有高结合速率的类似物。通过使用西眯替丁抑制物质的肾清除可以提高短的血浆半衰期。其他适合的核苷类似物包括1′-氟-5-(C-甲基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶(FMAU)，脱氧尿苷；和5-碘-1-(2-氟-2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖)-尿嘧啶(FIAU)。
本发明特定实施方案涉及使用报道探针，即由于涉及细胞过程中而允许使过程或细胞类型可视化的分子。这种探针可以利用细胞的内源性机制，例如提供了底物的内源性酶。可选择地，这种探针通过被称作报道基因的外来基因起作用。报道基因产物可以是使报道探针转化成选择性地在细胞内被捕集的代谢物的酶。可选择地，报道基因可以编码受体或转运子或泵，从而使探针积聚进细胞中。
氟胸苷是被胸苷激酶-1(TK1)磷酸化的胸苷类似物，TK1可用作报道基因，造成细胞捕集。在细胞培养中，吸收与TK1活性和细胞增殖相关。
根据本发明另一个实施方案，报道探针是响应于细胞或组织中特定环境的分子。组织缺氧是脑血管疾病，缺血性心脏疾病，外周血管疾病，和炎性关节炎致病的重要因素。其也是恶性实体肿瘤生长的一般特征，其与肿瘤的进攻性具有正性关系，与对化疗或放疗的响应可能性具有负性关系。近期工作表明，在这些情况的每一个中都存在对缺氧响应的共同途径。2-硝基咪唑化合物被还原并被捕集在缺氧性细胞中，因此在缺血性心肌和肿瘤中可用作氧张力的传感器。例子包括氟米索硝唑，氟赤式硝基咪唑，硝基咪唑-阿拉伯糖苷，乙烯基米索硝唑，RP-170(1-[2-羟基-1-(羟基甲基)-乙氧基]甲基-2-硝基咪唑)和SR 4554(N-(2-羟基-3，3，3-三氟丙基)-2-(2-硝基-1-咪唑基)乙酰胺)。HL91是具有肿瘤吸收的非硝基咪唑化合物。另一种适合的化合物是二乙酰基-双(N4-甲基缩氨基硫脲)-铜(II)(ATSM)。
任选地，寻靶探针或代谢前体或构造块或报道探针已经包括可检测标记。优选地，这种标记不同于可使用施陶丁格连接在下一步中引入的标记。两种显像标记的组合对于更好的靶向定位，人工清除，非相关(清除)途径的描述具有潜在优点。
根据本发明，一方面寻靶探针或靶标代谢前体分子或另一方面显像探针或治疗探针可以包括膦或叠氮基，分别作为二级靶标或二级寻靶部分，从而允许通过施陶丁格连接结合这些探针。
根据本发明的实施方案，膦可由以下通式结构代表Y-Z-PR2R3其中Z选自用R1取代的烷基，环烷基和芳基，优选用R1取代的芳基，其中R1优选在芳环上相对于PR2R3的邻位；和其中R1是用以捕集例如稳定氮叶立德基团的亲电子基团，包括但不限于羧酸，酯，例如烷基酯如低级烷基酯，例如1～4个碳原子的烷基酯，苄基酯，芳基酯，取代的芳基酯，醛，酰胺，例如烷基酰胺如低级烷基酰胺，例如1～4个碳原子的烷基酰胺，芳基酰胺，烷基卤，如低级烷基卤，例如1～4个碳原子的烷基卤，硫代酯，磺酰基酯，烷基酮，如低级烷基酮，例如1～4个碳原子的烷基酮，芳基酮，取代的芳基酮，卤代磺酰基，腈，硝基等；R2和R3通常是芳基，包括取代的芳基，或环烷基，例如，环己基，其中R2和R3可以相同或不同，优选相同；和Y对应于如下之一a)在寻靶探针情况下是一级寻靶部分，b)在显像探针的情况下是可检测标记，或c)在治疗探针的情况下是治疗化合物。Y可以在氢处与膦连接或在芳基Z任何位置例如对位、间位、邻位处与另一种反应性基团连接；示例性反应基团包括但不限于羧基，胺，例如烷基胺，如例如包括1～4个碳原子的低级烷基胺，芳基胺，酯，例如烷基酯如例如包括1～4个碳原子的低级烷基酯，苄基酯，芳基酯，取代的芳基酯，硫代酯，磺酰卤，醇，硫醇，琥珀酰亚胺酯，异硫代氰酸酯，碘代乙酰胺，马来酰亚胺，肼，等。可选择地，Y可以通过连接基与膦成分连接。在图1和2中，Y由R′代表。
Y可以与Z连接或与膦的任何其他适合部分连接。
可选择地，寻靶或显像探针上存在的膦的结构被修饰成包括可离去的连接基，其通式如下Y-X1-R4-PR2R3
其中X1是亲电体，优选用作可离去的连接基的羰基或硫代羰基；和通常在X1和R4之间存在杂原子，如氧或硫。
R4是亲电体的连接基，可以是烷基或取代或未取代的芳基；和Y，R2和R3如上所述。
在′无痕迹的′施陶丁格连接中这种膦基团将与叠氮基反应。在无痕迹的施陶丁格连接中，Y与亲电阱连接。
R4-PR2R3的例子公开在美国申请2003/0199084中。该申请中也公开了几种制备膦衍生物的合成方法，因此引入该申请作为参考。
包括叠氮基并适用于本发明中的分子以及制备适用于本发明中的包括叠氮基的分子的方法在本领域中是已知的。
图7提供了制备显像探针的合成路线的一般方案，其中包括胺或羧酸的显像剂与膦或叠氮部分连接。相似的合成路线适于分别从适当的带有胺或羧基的寻靶部分、药物化合物或代谢前体制备寻靶探针、治疗探针、或靶标代谢前体。
根据本发明另一个实施方案，治疗探针与显像探针组合使用。在此实施方案中，直接给予包括治疗化合物和二级寻靶部分的治疗探针，例如没有寻靶探针，并且二级寻靶部分用于以显像探针检测。因此，根据此实施方案，实际上用作二级靶标的治疗探针的二级寻靶部分和显像探针的二级寻靶部分是施陶丁格连接中的配对。此实施方案用在例如AZT(叠氮基胸苷)治疗设计和监控中。AZT(1)是一种抗-逆转录酶病毒药物，是第一种被核准用于治疗HIV的抗病毒治疗。在糖部分上也安装有叠氮基。叠氮基可用作把手来结合标记的施陶丁格膦探针，从而允许在患者中AZT显像。
本发明的包括叠氮基或膦的寻靶、显像和治疗探针是生物相容的，并可以与目前医学显像或治疗中所用的常规分子相同或相似的方式给予。此外，可检测标记对于本领域技术人员是已知的，并且需要常规方法和设备。
根据本发明特定实施方案，所述的化合物和方法在体内用于动物或人体中组织或细胞类型的显像或检测。可选择地，它们同样可在体外用于检测活组织检查或其他身体样品，或者检测在手术后除去的组织。
如本文中所述，根据特定实施方案，本发明相继提供了寻靶探针和显像或治疗探针，从而使寻靶探针可与其一级靶标结合，并且任选地在提供标记或治疗化合物之前除去过量的寻靶探针。这样确保在图像中具有较高的信噪比和/或较高治疗功效，这通常称作′预寻靶′或′两步′寻靶。本发明的化合物允许两步寻靶方法，其中克服了通常与二级靶标和二级寻靶部分相关的问题(向靶标扩散和从有机体清除过长，显像化合物衰变)(确保在两步之间的识别和结合)。此外，这种′两步′寻靶允许开发出可与所需的′寻靶探针′组合使用的′通用′显像探针。
根据另一个实施方案，本发明的方法和化合物用于靶向信号放大和/或多价态安装。这里，寻靶探针的一级寻靶部分与含有多个三苯基膦部分的树枝状聚合物，聚合物或脂质体结合。在寻靶探针通过其一级寻靶部分与受体结合之后，注射包括与一种或多种MRI造影剂例如Gd螯合物或超声报道物(ultrasound reporter)例如微泡结合的叠氮基的显像探针。这里，所述造影剂或微泡包括二级寻靶部分。随后的施陶丁格连接使MRI造影剂在靶标组织处具有高浓度。此外，靶标部位的多价态将增强与叠氮基报道结合物(显像探针)反应的动力学，从而提供MRI造影剂或微泡于靶标处的有效积聚。
可选择地，叠氮基也可以包括在上述寻靶探针中，并且三苯基膦与显像探针中的报道物结合。
根据另一个方面，所使用的本发明的方法和化合物没有一级寻靶部分，但通过细胞的代谢将二级靶标结合进待结合进生物分子中的前体分子内。以此方式，可靶向于一般代谢途径。上述膦或叠氮化物与例如糖，氨基酸或核苷酸连接，然后给予至细胞或有机体，并通过正常代谢被结合进生物分子中和/或在细胞中被捕集。现有技术中记载了结合进活有机体，真核培养的细胞或重组蛋白表达体系(细菌，酵母，高级真核细胞)的例子[Lemieux等人2003，上述文献，Hang等人(2003)Proc Natl.Acad Sci.USA 100，14846-14851；Wang等人(2003)Bioconjugate Chem.14，697-701]。
在本发明这一方面的特定实施方案中，靶向于在疾病如感染/炎症或癌症中上调的代谢途径。在疾病状态中被上调的成分包括例如DNA，蛋白，膜合成和糖摄取。用于靶向于这些途径的适合的构造块包括叠氮基-标记的氨基酸，糖，核碱和胆碱和乙酸酯。这些叠氮基标记的构造块在功能上与现有使用的代谢示踪剂[11C]-甲硫氨酸，[18F]-氟去氧葡萄糖(FDG)，去氧-[18F]-氟胸苷(FLT)，[11C]-乙酸酯和[11C]-胆碱类似。高代谢或增殖的细胞对这些构造块具有较高吸收。叠氮基-衍生物可以进入这些途径，并在细胞中和/或其上积聚。在充分积聚并清除自由构造块之后，显像探针例如包括放射性标记和(细胞渗透性)施陶丁格膦作为二级寻靶部分的探针被输入以结合积聚的叠氮基代谢物。与正常FDG-型显像相比的优点在于，在结合放射性成分之前有足够时间允许寻靶探针高度积聚，因此提高了信噪比。可选择地，可靶向于对疾病有特异性的代谢途径和/或代谢物。
本发明的另一个方面涉及″智能″或响应性MRJ造影剂在基于无痕迹的施陶丁格连接的靶向显像中的应用。
根据本发明的这一方面，包括膦基团和低松驰并因此低信号强度的″智能″MRI造影剂的显像探针，在与寻靶探针上的叠氮基反应时实现了信号强度。包括膦基团例如作为二级寻靶部分的这种″智能″MRI显像探针具有如下通式结构(2) 其中M是顺磁性金属离子，选自Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl；A、B、C和D是单键或双键；X1、X2、和X3是-OH、-COO-、-CH2OH-、CH2COO-、C(O)N-；R1-R10是氢、烷基、芳基、磷部分，和其中Y是二级寻靶部分，更特别是取代的三苯基膦如(CH2)2-COO-C6H4N(CH2COOH)2-P-(C6H5)2或允许在取代的膦和顺磁性金属之间有一个或多个配位的另一种取代的三苯基膦。
这方面的实施方案示于图4中。使包括叠氮基作为二级靶标的寻靶探针与其靶标(2)结合。随后，给予由Gd-DOTA三苯基膦结合物(1)构成的显像探针。在此结合物中，两个突出的羧酸阻断了两个在Gd螯合配位化合物内球中的水配位位置，从而使该构造具有低的松弛性。这在MRI中产生低信号强度。当寻靶探针的叠氮基与显像探针的三苯基膦部分反应时，无痕迹的连接除去了所带的羧酸，同时使活化的MRI探针与靶标(3)结合。因此，结合事件为水提供了两个可用的配位位置，这样使结合时的信号增强。这允许标记在组织内MRI显像，因为成分1和2在胞间隙内快速扩散。
本发明的另一个方面涉及提供用于显像和治疗中的组合的寻靶和显像或治疗探针。因此，根据这一方面，在给予至细胞、组织或有机体之前，允许寻靶探针的二级靶标和显像探针或治疗探针的二级寻靶部分在体外反应。当使用施陶丁格连接特别是无痕迹的施陶丁格连接连接本发明的寻靶探针和显像或治疗探针时，尺寸几乎没有任何增大，这是化学反应本身典型的特征。因此，组合的寻靶探针和显像探针能够足够小，以允许向靶标快速扩散和从身体快速清除。因此，预期施陶丁格连接是正交的，并是使显像剂与寻靶构造结合的一般途径。通常，所有上述一级寻靶部分和可检测标记的组合可以在体外制备并用于这种应用中。应该理解，对于体内优化使用而言，一级寻靶部分和标记的组合尺寸应允许向一级靶标的扩散足够快并从身体快速清除。
根据本发明上述方面的特定实施方案，组合的寻靶和显像/治疗探针包括与其他蛋白如受体相互作用的肽作为一级寻靶部分。
根据本发明上述方面的另一个特定实施方案，可检测标记选自有机PET标记的辅基，PET、SPECT或MRI用的金属配位化合物，超声显像用的微泡，和含有碘或钡的分子或泡囊。
制造本发明的组合的寻靶和显像或治疗探针的重要优点在于，施陶丁格连接的各试剂(即，包括二级靶标的寻靶探针和包括二级寻靶部分的显像或治疗探针)是稳定的，且它们之间的反应在水中进行。
因此，可以制备并单独保存包括悬挂的(pendent)叠氮部分的显像探针和包括三苯基膦衍生物的寻靶探针，或反之亦可，并预先作为制备的一部分加以组合或者就在终端使用者使用之前组合。该反应快速，产率高，并且组合产物不需要费力纯化。
因此，本发明也预期组合的寻靶和显像或治疗探针，或包括一个或多个用于与一个或多个显像或治疗探针组合的寻靶探针的试剂盒。根据一个特定实施方案，两种成分在体外反应，例如就在显像过程之前反应，并照此使用组合的探针。根据一个实施方案，组合探针的特征在于，因膦和叠氮基在无痕迹的施陶丁格连接中反应因此存在酰胺键。使用非无痕迹的连接，包括一级寻靶部分和可检测标记的组合探针将包括膦氧化物。例如，一级寻靶部分和可检测标记可以与三苯基膦的苯基上的取代基结合。特别预期用于核显像剂的施陶丁格试剂盒应用。
在另一个方面中，本发明涉及包括根据本发明的显像探针的药物组合物。
本发明还涉及一种制备显像用的诊断组合物的方法，其包括使用根据本发明的显像探针。
本发明的另一个方面涉及使用组合肽合成制备用于本发明中的适合的寻靶探针。在肽的情况下，用叠氮基或三苯基膦基团标记可能扰乱受体亲和性能。因此，在标记寻靶部分之后，可能需要额外的耗时的优化过程以确保寻靶探针具有所需的药理性能和受体亲和性。根据本发明的这一方面，叠氮基或三苯基膦包括在用于识别特定靶标的新先导的组合库的设计中。通过这种方法产生的先导不需要额外的改进，而是可以直接用作本发明的寻靶探针。根据特定实施方案，带有叠氮残基的氨基酸构造块(5)(图5)在肽库(6)的组合制备过程中在肽链任何所需位置加入。筛选肽-叠氮化物探针，以优化受体结合亲和性。因此，优化的肽叠氮探针可被识别用于预寻靶。
本发明的另一个方面涉及施陶丁格连接在制备对应于此处所述的组合探针靶向显像或治疗剂中的应用。
通常，通过用标记如放射性同位素、金属螯合物或有机荧光团标记已知的寻靶基团如受体-结合部分，例如生物活性肽或有机药物类结构研制靶向显像剂。经常通过螯合物基团例如SPECT剂或对于卤素标记的芳香辅基来结合核同位素。相似地，通过使已知的寻靶基团与治疗化合物连接开发靶向治疗化合物。这些加入的标记基团或治疗化合物可以明显改变寻靶部分的性能和受体亲和性，从而得到次优化的靶向显像剂或治疗剂。因此，对于各标记的寻靶部分而言，结合物需要额外的耗时的对药理性能和靶标亲和性优化的过程。根据本发明，施陶丁格连接可用于促进这种靶向显像或治疗剂的开发。在用作寻靶部分的肽合成中包括在不同位置选择性结合的叠氮基或三苯基膦。这种优化可用于基于已知的肽部分开发靶向探针或治疗剂，即在已知肽序列的不同位置结合叠氮基或三苯基膦。可选择地，这可例如通过在组合库的设计中加入针对特定靶标的新先导而应用于开发新的寻靶部分。然后使用施陶丁格连接，使组合库与所需的标记或治疗剂结合，并对优化的靶标结合亲和性和标记/治疗功效进行筛选。
任选地，将与冷同位素例如非放射性F，I等连接的施陶丁格膦与所有的叠氮-官能化的库成员偶联，以研究结合亲和性。然后通过使叠氮-肽与相应的热同位素标记的施陶丁格膦偶联得到″热″类似物。
通过这种方法产生的先导不需要额外的修饰，而是在使标记或治疗化合物与提供的结合部位结合之后，即可直接用作显像和/或治疗剂。
根据特定实施方案，在肽库(6)的组合制备过程中，在肽链任何所需位置加入带有叠氮残基的氨基酸构造块(5)(图5)。然后，鉴定出具有优化的受体结合亲和性的肽-叠氮化物-标记或肽-叠氮化物-治疗剂结合物，以分别用于靶向显像或靶向治疗。这样得到的组合库可以包括预先鉴定出的其中在不同位置引入带有叠氮残基的氨基酸构造块的先导分子的阵列，通过筛选鉴定出标记/治疗剂与先导结合至其靶标的相互作用最小的分子。
本发明的探针和试剂盒可用于医学显像和治疗，特别是′靶向′显像和治疗。术语′靶向′涉及显像标记或药物活性化合物在被给予至患者后与靶标分子发生特异性相互作用或并入其中。根据本发明通过使用包括寻靶部分的寻靶探针或使用靶标代谢底物可以实现这一点。可选择地，通过提供组合的寻靶和显像或治疗探针(即给予本发明的两种成分作为组合探针)实现这一点。该靶标分子对于特定类型的细胞或组织可以是特异性的，或对于身体中的所有细胞或组织可以是共有的。本发明的特定方面涉及′预寻靶′显像或治疗。这方面需要单独使用本发明的两种成分，并涉及将给予患者包括寻靶部分或由于是特定反应的底物而确保了寻靶的成分和给予患者确保显像或治疗效果的成分的时间分开。给予两种成分之间的时间可以变化，范围从约10分钟至几小时或甚至几天。
本发明的探针可以通过不同途径给予，包括静脉注射，口服给予，直肠给予和吸入。适用于这些不同给予类型的制剂对于本领域技术人员是已知的。
根据本发明的包括药物组合物的治疗探针或显像探针可以与药物学可接受的载体一起给予。用于此处的适宜的药物载体涉及适于医学或兽医用的载体，没有毒性且不是在其他方面不可接受的。这种载体在本领域是公知的，包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、和其组合。制剂应适于给予模式。
实施例实施例1神经内分泌肿瘤的预靶向显像包括促生长素抑制素受体-结合肽的寻靶探针；例如代表根据图3的一级寻靶部分，与例如作为二级靶标的叠氮基连接，被注射进受试者。在寻靶探针与例如在神经内分泌肿瘤上高浓度存在的一级靶标如促生长素抑制素受体结合，并清除未结合的寻靶探针之后，用作二级寻靶部分的包括18F-标记的显像探针，即与施陶丁格膦基团连接的放射性物质被注射进受试者，例如动物或人中；在那里与固定的叠氮基结合。因此，通过提供对比的放射性同位素可以使神经内分泌肿瘤的存在可视化。可选择地，显像探针的二级寻靶部分含有叠氮基，而三苯基膦是寻靶探针中的二级靶标。膦-(3)或叠氮基-标记的(4)氨基酸可以并入受体-结合肽中以制备寻靶探针。
实施例2用于治疗方案的乳房肿瘤组织的预靶向显像将由叠氮基-雌激素衍生物构成的寻靶探针给予至乳腺癌患者。在雌激素受体结合之后，注射与99mTc螯合物结合的施陶丁格膦基团作为显像探针，并结合、可视化固定的叠氮基。用叠氮基官能化的几种乳腺癌-靶向构造是已知的。然而，它们均未用于基于施陶丁格连接的显像方法中。
实施例3骨肿瘤组织的显像将二膦酸酯与施陶丁格膦基团的结合物作为寻靶探针给予至骨癌症患者。在积聚至骨之后，将用悬挂的叠氮基官能化的99mTc螯合物注射进患者中作为显像探针。可选择地，在骨癌症治疗中，由螯合物-叠氮基结合物构成的显像探针还携带治疗核素。可选择地，在寻靶探针中，二膦酸酯与叠氮基连接(5)，并且在显像探针中，二级寻靶基团是与标记(Tc螯合物)连接的膦基团。
实施例4脑组织的预靶向显像将叠氮基-莨菪烷衍生物作为寻靶探针注射进患有例如帕金森(Parkinson)疾病的受试者中。在多巴胺能系统中靶向结合之后，将18F-标记的施陶丁格膦探针作为显像探针注射，并与固定的叠氮基结合。
实施例5缺氧性组织的预靶向显像将例如下图(6)、(7)的叠氮基官能化的硝基咪唑衍生物用作探针使缺氧显像。在缺氧性细胞中，硝基部分被还原成自由基，然后在与细胞内大分子反应时被捕集。随后，注射亲脂性18F-标记的施陶丁格膦基团例如作为显像探针，以结合积聚的叠氮基。
实施例6预寻靶信号放大和/或多价态安装将一级寻靶部分与含有多个三苯基膦部分的树枝状聚合物或聚合物结合。在使一级寻靶部分与其一级靶标例如受体结合之后，注射与一种或多种MRI造影剂例如Gd螯合物或与超声报道剂例如微泡结合的叠氮基作为显像探针。随后的施陶丁格连接使MRI造影剂在靶标部位处具有高浓度。此外，靶标部位的多价态将增强与叠氮基报道结合物反应的动力学，从而提供MRI造影剂或微泡在靶标处的有效积聚。可选择地，寻靶探针包括在树枝状聚合物中的叠氮基，并且三苯基膦与显像探针中的标记结合。
实施例7使用无痕迹的施陶丁格连接的″智能″或响应性MRI造影剂的预寻靶。
该实施例示于图4中。使包括叠氮基的寻靶探针结合其靶标(2)。随后，给予显像探针Gd-DOTA三苯基膦结合物(1)。两个羧酸阻断了两个水在Gd螯合配位化合物内球中的配位位置，从而使该构造具有低松弛，并因此在构造的MRI中产生低信号强度。当叠氮基与三苯基膦部分反应时，无痕迹的施陶丁格连接除去悬挂的羧酸，同时使活化的MRI探针与靶标(3)结合。因此，结合事件为水提供了两个可利用的配位位置，这样使信号经结合增强。此外，这种构思允许标记在组织内MRI显像，因为成分1和2在胞间隙内快速扩散。
实施例8在基因治疗中使报道基因显像在这种应用中，使用了其中表达治疗基团并表达酶HSV 1-TK的报道基因的运载体。这种酶经代谢在细胞中捕集尿嘧啶类似物和无环鸟甙类似物。在此实施方案中，尿嘧啶和无环鸟甙类似物被叠氮部分官能化。这些分子经代谢被捕集在组织中，报道基因于此表达(因此也表达治疗基因)。随后，注射18F-标记的施陶丁格膦探针，以结合积聚的包括叠氮基的尿嘧啶和无环鸟甙类似物。
实施例9在基因治疗中使报道基因显像。
该实施例示于图6中。报道酶活化细胞内输送的叠氮基前体，该前体反过来与施陶丁格膦探针结合。掩蔽的叠氮基-衍生物4包括与叠氮部分(B)结合的跨膜寻靶肽(A)。叠氮部分被作为先前由Gopin等人公开[(2003)Angew.Chem.Int.Ed.，42，327-332]的酶-敏感性触发装置(C)的一部分的酯基团保护。报道基因对应于酶青霉素酰胺酶，其裂解(C)中的苄基酰胺部分。生成的伯胺重排成亚甲基环己二烯亚胺，并释放出叠氮基-酯。自发的脱羧作用产生活性叠氮基，然后该活性叠氮基可捕集标记的施陶丁格膦探针。
实施例10施陶丁格连接在固定嵌入脂质体表面中的Gd-Dotam配位化合物的应用。
通过在磷脂双分子层中插入硬脂酰基残基，可以用具有悬挂的硬脂酰基脂质残基的配位化合物8覆盖脂质体的表面。接下来，通过多官能团施陶丁格膦探针9(三肽)使悬挂的叠氮基分子间交联。与脂质中的未交联的Gd配位化合物相比，交联的Gd配位化合物的旋转显著下降，从而增强了在MRI中的松驰性。
实施例11合成三苯基膦-DOTA显像/治疗探针26，28和29。
实验下述化合物的合成由Eindhoven，The Netherlands的SyMO-Chem承担并实施。
仪器在Bruker 400MHz光谱仪，Varian Gemini 300MHz光谱仪，和Varian Mercury 200MHz光谱仪上记录NMR谱。在PerkinElmer 1600 FT-IR上测量红外光谱。在Perseptive Biosystems VoyagerDE-Pro MALDI-TOF质谱仪上得到MALDI-TOF谱(加速电压20kV；栅电压74.0％，导线电压0.030％，延迟200ms，低质量门900amu)。通过将聚合物的THF溶液(20μl，c＝1mg/ml)加到α-氰基-4-羟基肉桂酸的THF溶液(10μl，c＝20mg/ml)中，然后充分混合，从而制备了MALDI-TOF样品。将该混合物(0.3μl)置于样品板上，并蒸发溶剂。在使用之前用分子筛干燥溶剂。吸湿性化合物保存在含有P2O5的干燥器中。所有反应都在氩气中进行。
使用以下缩略语DCM＝二氯甲烷，DMF＝二甲基甲酰胺，DIPEA＝二异丙基乙基胺，TFA＝三氟乙酸，HBTU＝O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸脲盐，DCC＝N，N′-二环己基碳二亚胺。
膦-构造块 a).1)HCl，NaNO2/H2O；2)KI/H2Ob).HPPh2，Pd(OAc)2，Et3N(4eq)，CH3CN，80℃，3dc).Boc2O，对于13用二噁烷，对于15用DCM，20℃
d).HBTU，DIPEA，DMF，RT，2he).TFA，DCM，20℃，4h氨基酸10由Aldrich市售，作为二胺14。根据Saxon等人US2003199084制备碘化物11，改进该专利中报道的关于膦12的制备方法以提高产率。
化合物12向火焰干燥的烧瓶中加入乙腈(30mL)，三乙胺(5.32g；52.3mmol)，化合物11(3.06g；10.0mmol)和醋酸钯(42mg；0.2mmol)。混合物真空脱气。在氩气中搅拌，通过注射器将二苯基膦(2.16g；11.6mmol)加到烧瓶中。得到的溶液在80℃下加热3d，然后冷却至rt并浓缩。残渣溶解在DCM(175mL)中，用H2O(175mL)和1M盐酸(2×50mL)洗涤，并浓缩。粗产物溶解在热MeOH(100mL)中并冷却到4℃。过滤提供金黄色固体产物(2.87g；78％)，mp＝206℃。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ10.8(br.s，1H)，8.07(d，2H，J＝1)，7.67(d，1H，J＝3.4)，7.37-7.25(m，10H)，3.75(s，3H)ppm。13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ170.58，166.68，141.46(d，J＝29.5)，138.90(d，J＝19.1)，136.89(d，10.0)，135.56，133.83(d，J＝10.0)，131.90，130.56，129.70，129.02，128.65(d，J＝7.1)，52.35ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ4.04ppm。FT-IR(ATR)ν2952，2846，2536，1726，1686，1434，1262，1244，1106，1057，743cm-1。
N-单(叔丁氧基羰基)-乙二胺(13)二-叔丁基-二碳酸酯(40.77g；0.187mol)溶解在二噁烷(200mL)中，滴加到乙二胺(89.82g；1.49mol)的二噁烷(500mL)溶液中。30分钟后，将悬浮液蒸发至干，加入H2O(500mL)。过滤掉白色固体，水层用DCM(3×250mL)萃取。合并有机层，用Na2SO4干燥，并浓缩。得到无色液体产物(23.75g；79％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.32(br.s，1H)，3.17(q，2H，J＝6.0)，2.80(t，2H，J＝6.0)，1.45(s，9H)，1.30(s，2H)ppm。13C-NMR(75MHz，CDCl3)δ156.09，78.84，43.19，41.65，28.20ppm。FT-IR(ATR)ν3363，2975，2932，1689，1518，1364，1249，1166，873cm-1。
化合物15市售二胺14(10.7g；72.2mmol)溶解在DCM(400mL)中，溶液在油浴中加热到40-45℃，保持在氩气中。分三次加入二-叔丁基-二碳酸酯(总共15.9g；72.8mmol)，溶液在40-45℃下氩气中搅拌过夜。溶液冷却，真空浓缩，粗产物用硅胶柱色谱使用氯仿/MeOH/异丙胺＝20/2/1纯化，分离油状产物(7.8g；44％)。1H NMR(CDCl3)δ＝5.2(bs，1H)，3.5-3.35(8H)，3.2(q，2H)，2.75(t，2H)，1.35(s，9H)，1.25(b，2H)。13C NMR(CDCl3)δ＝155.7(C＝O)，78.5(CCH3)，73.2和69.9(CH2O)，41.5和40.0(CH2N)，28.1(CCH3)。
化合物16HBTU(3.64g；9.61mmol)溶解在无水DMF(40mL)中，加入DIPEA(2.48g；19.22mmol)和羧酸12(3.50g；9.61mmol)。混合物在氩气中rt下搅拌10分钟，然后加入胺13(1.69g；10.57mmol)的DMF(4mL)溶液。混合物搅拌2h，然后用乙醚稀释(500mL)，用饱和NaHCO3(3×400mL)和0.1M HCl(400mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，浓缩，得到黄色固体(4.59g；94％)。1H-NMR(300MHZ，CDCl3)δ8.07(dd，1H，J＝3.3，7.8)，7.75(dd，1H，J＝1.8，8.1)，7.38-7.27(m，11H)，6.93(br.s，1H)，4.85(br.s，1H)，3.75(s，3H)，3.44(q，2H，J＝6.0)，3.31(q，2H，J＝6.0)，1.42(s，9H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.88ppm。FT-IR(ATR)ν3343，2974，1716，1708，1687，1637，1535，1435，1274，1255，1184，1165，1116，743，695cm-1。
化合物17Boc-保护的胺16(4.59g；9.06mmol)溶解在DCM(20mL)和TFA(20mL)中，在rt下搅拌4h。浓缩混合物，在DCM(100mL)中再溶解，用饱和Na2CO3(200mL)洗涤。水层用DCM(50mL)反萃取，合并有机层，用Na2SO4干燥，蒸发至干，得到黄色泡沫(3.51g；97％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.08(dd，1H，J＝3.6，7.8)，7.81(dd，1H，J＝1.6，8.2)，7.37-7.23(m，11H)，6.57(br.s，1H)，3.72(s，3H)，3.33(q，2H，J＝5.6)，2.79(t，2H，J＝5.9)，1.14(br.s，2H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.87ppm。FT-IR(ATR)ν3301，2949，1717，1641，1537，1433，1271，1251，1114，742，695cm-1。
化合物18HBTU(2.08g；5.49mmol)溶解在无水DMF(25mL)中，加入DIPEA(1.42g；5.49mmol)和羧酸12(2.00g；5.49mmol)。混合物在氩气中rt下搅拌10分钟，然后加入胺15(1.50g；6.04mmol)的DMF(2mL)溶液。混合物搅拌2h，然后用乙醚稀释(300mL)，用饱和NaHCO3(3×200mL)和0.1M HCl(200mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，浓缩，得到黄色泡沫(2.90g；89％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.08(1H)，7.79(1H)，7.33-7.27(11H)，6.41(1H)，4.94(1H)，3.74(3H)，3.59-3.51(10H)，3.30(2H)，1.43(9H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.82ppm。FT-IR(ATR)ν3334，2896，1714，1648，1525，1271，1249，1166，1112，744，696cm-1。
化合物19Boc-保护的胺18(2.90g；4.88mmol)溶解在DCM(15mL)和TFA(15mL)中，在rt下搅拌2h。浓缩混合物，在DCM(50mL)中再溶解，用饱和Na2CO3(40mL)洗涤。水层用DCM(50mL)反萃取，合并有机层，用Na2SO4干燥，蒸发至干，得到黄色泡沫(2.27g；94％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.07(dd，1H)，7.81(dd，1H)，7.37-7.26(m，11H)，6.74(br.s，1H)，3.74(s，3H)，3.59-3.46(m，10H)，2.81(t，2H)，1.68(s，2H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.82ppm。FT-IR(ATR)ν3302，2866，1717，1648，1536，1433，1271，1251，1113，744，696cm-1。
DOTA-构造块 a).Boc2O，Et3N，CHCl3，0℃b).溴乙酸苄酯，DIPEA，乙腈，65℃，18hc).TFA，DCM，20℃，4hd).溴乙酸叔丁酯，K2CO3，乙腈，20℃，4he).H2，Pd/C，MeOH，H2O，20℃，18h20的合成报道在例如E.Kimura，J.Am.Chem.Soc，1997，119，3068-3076中。化合物21报道在以下日本专利(日本语)中。Miyake，Muneharu；Kusama，Tadashi；Masuko，Takashi。作为NMDA受体抑制剂的新颖的含氮环状化合物的制备，PCT国际申请(2004)，57pp。化合物22-24报道在A.Heppeler等人，Chem.EwJ.1999，5，7，1974-1981中。
化合物20使用JACS，1997，119，3068-3076中报道的方法得到这种化合物。使用己烷-乙酸乙酯混合物作为洗脱剂通过硅胶柱色谱分离产物。
1H NMR(CDCl3)δ＝3.6(b，4H，CH2N)，3.35(b，1H，NH)，3.25(b，8H，CH2N)，2.8(b，4H，CH2N)，1.4(s，9H，CH3)，1.4(s，18H，CH3)。13C NMR(CDCl3)δ＝156-155(多信号C＝O)，79.8-79.1(多信号C-CH3)，51.5-48.5和46.5-44.5(多信号CH2-N)，28.6(CH3)，28.4(CH3)。MALDI-TOF-MS[M+H]+＝473，[M+Na]+＝495，[M+K]+＝511。
化合物21三-Boc保护的化合物20(15.2g；32.2mmol)溶解在20mL乙腈中，其后加入在乙腈(10mL)中的二异丙基乙基胺(19mL)和溴乙酸苄酯(7.9g；34.5mmol)。溶液加热到60-65℃，氩气中搅拌过夜。通过蒸发溶剂浓缩混合物，在DCM中溶解，用1M NaOH洗涤溶液。有机层用Na2SO4干燥，然后蒸发溶剂，并与甲苯一起蒸发。使用己烷/乙酸乙酯＝1/1作为洗脱剂通过硅胶柱色谱分离出纯产物。产率约90％。1H NMR(CDCl3)δ＝7.4(m，5H，Ph-H)，5.15(s，2H，CH2Ph)，3.6(s，2H，CH2C(O))，3.6-3.2(不同的b，12H，CH2N)，2.9(b，4H，CH2N)，1.45(s，9H，CH3)，1.4(s，18H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝170.3(C＝O酯)，156-155(多信号C＝O氨基甲酸酯)，135.5和128.6-128.2(苯环碳)，79.5-79.2(多信号C-CH3)，66.2(CH2-O)，55.0，53.5，51.2，49.9和47.4-46.9(CH2-N)，28.6(CH3)，28.4(CH3)ppm。
化合物22三-Boc保护的单乙酸苄酯环烯21(5.4g；8.7mmol)溶解在甲苯(50mL)中，蒸发溶剂除去如果存在的痕量水。产物溶解在新蒸馏的DCM(35mL)和TFA(35mL)的混合物中，在氮气中搅拌约3小时。蒸发溶剂(低于30℃)，在TFA(30mL)中再次溶解，再搅拌2小时，然后蒸发挥发物(低于30℃)。用甲苯抽提剩余的盐两次，尽可能多地除去TFA以得到产物22，经分离用于下一步中。1H NMR(CDCl3)δ＝7.4(m，5H，Ph-H)，5.1(s，2H，CH2Ph)，3.5(s，2H，CH2C(O))，3.05(b，4H，CH2N)，3.0(b，4H，CH2N)，2.9(b，4H，CH2N)，2.8(b，4H，CH2N)ppm。
化合物23混合粗产物22，乙腈(50mL)和碳酸钾(10.6g；7.67mmol)，剧烈磁力搅拌15分钟，得到细悬浮液。然后，滴加溴乙酸叔丁酯(6.8g；34.9mmol)的乙腈(20mL)溶液。搅拌4～5小时后，真空浓缩混浊的混合物。残渣转移至含有氯仿(200mL)和水(200mL)的分液漏斗。分离氯仿层，用盐水洗涤。过滤，蒸发氯仿，得到液体(约12g)，使用硅胶柱色谱纯化，首先用DCM洗脱除去杂质如溴乙酸叔丁酯，然后用DCM/EtOH＝600/30洗脱以收集白色固体产物(5.35g，93％)。TLCRf＝0.23(DCM/EtOH＝8/1)，在10％KI水溶液中用I2显色。1H NMR(CDCl3)δ＝7.4-7.3(m，5H，Ph-H)，5.10(s，2H，CH2Ph)，3.6-2.0(宽，24H，烯环N-CH2和CH2COOR)，1.45(s，9H，C(CHs)3)，1.40(s，18H，C(CH3)3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝173.5，172.9和172.8(C＝O)，135.0，128.6，128.5和128.3(苯环)，81.9(C(CH3)3)，66.8(CH2O)，55.8，55.7和54.9(CH2-C(O))，52.3和48.7(两个极宽的，CH2N)，27.8(C(CH3)3)ppm。FT-IR(cm-1)ν＝2977-2830(w)，1724(vs，C＝O酯)，1368(vs)，1227(vs)，1157(vs)，1105(vs)cm-1。MALDI-TOF-MS[M+H]+＝663Da和[M+Na]+＝685Da。
化合物24苄基酯23(5.3g；7.99mmol)溶解在甲醇(100mL)和去矿物水(50mL)中，溶液转移至厚壁Parr氢化反应容器中。氮气鼓泡通过溶液，加入Pd/C 10％催化剂(305mg)。混合物在70psi氢气过压力下摇动4小时。过滤混合物，真空浓缩滤液。与乙腈(40mL)一起蒸发除去残余水。进一步干燥产物，并保存在真空干燥器中的P2O5上，得到泡沫状浅黄色固体(4.33g；95％)。产物极具吸湿性。1H NMR(CDCl3)δ＝3.7-3.2，3.2-2.6和2.6-2.0(所有三个均极宽并重叠，CH2N)，1.41(s，18H，(CH3)3)，1.39(s，9H，C(CH3)3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝174.2和172.3(C＝O)，82.1和81.9(C(CH3)3)，55.9，55.7和55.3(CH2-C(O))，53.5-50.5和50.5-47.0(两个极宽的，CH2N)，27.9和27.7(C(CH3)3)ppm。FT-IR(cm-1)v＝2976(w，CH-伸缩振动)，2824(w；CH-伸缩振动)，1725(vs，C＝O，伸缩振动酯和酸)cm-1。MALDI-TOF-MS[M+H]+＝573Da和[M+Na]+＝595Da。
膦-DOTA探针26的组装f).HBTU，DIPEA，DMF，20℃，2hg).TFA，DCM，20℃化合物25HBTU(0.664g；1.75mmol)溶解在无水DMF(7mL)中，加入DIPEA(0.45g；3.50mmol)和羧酸24(1.00g；1.75mmol)。混合物在氩气中rt下搅拌10分钟，然后加入胺17(0.85g；2.10mmol)。混合物搅拌2h，然后用乙醚稀释(200mL)，用饱和NaHCO3(3×100mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，并浓缩。粗产物用硅胶柱色谱纯化，CHCl3作为初始洗脱剂，然后用CHCl3中的4％MeOH溶液作为洗脱剂。得到黄色泡沫产物(900mg；55％)。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ8.06(dd，1H)，7.86(dd，1H)，7.53(dd，1H)，7.32(m，10H)，7.02(br.t，1H)，6.62(br.t，1H)，3.73(s，3H)，3.6-2.0(br.m，28H)，1.46(s，9H)，1.40(s，18H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.97ppm。FT-IR(ATR)ν3426，2978，2826，1724，1677，1524，1369，1228，1159，1107，837，734cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+961.4Da；[M+Na]+983.4Da。
化合物26三-tBu-保护的25溶解在DCM(6mL)和TFA(6mL)中，在rt下搅拌1h。浓缩混合物，再次溶解在DCM(6mL)和TFA(6mL)中，再搅拌2h。浓缩混合物，与CHCl3一起蒸发2次，然后在真空中充分干燥。产物溶解在H2O(30ml)中，冻干，得到蓬松黄色粉末(541mg，94％)。1H-NMR(200MHZ，MeOD)δ8.05(dd，1H，J＝3.6，8.2)，7.84(dd，1H，J＝1.6，8.2)，7.51(dd，1H，J＝3.6，1.6)，7.37-7.23(m，10H)，4.1-3.7(br.s，8H)，3.67(s，3H)，3.6-3.1(br.m，20H)ppm。31P-NMR(80MHz，MeOD)δ34.34(小，膦氧化物)，-3.80(大，产物)，-15.20(t，HPO2F2，J＝953)ppm。FT-IR(ATR)ν3301，3073，2856，2541，1717，1667，1539，1435，1292，1188，1131，720，698cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+793.3Da。
PS杂质二氟磷酸(HPO2F2)源于六氟磷酸根阴离子(PF6-)，在与HBTU的偶联反应之后部分地留在样品中。在酸性条件下，该阴离子转化成二氟磷酸。(Kolditz，L.Z.Anorg.Chem.1957，293，155-167)。
膦-DOTA探针28的组装
f).HBTU，DIPEA，DMF，20℃，2hg).TFA，DCM，20℃化合物27HBTU(1.32g；3.49mmol)溶解在无水DMF(15mL)中，加入DIPEA(0.90g；6.98mmol)和羧酸24(2.00g；3.49mmol)。混合物在氩气中rt下搅拌10分钟，然后加入胺19(1.90g；3.84mmol)的DMF(5mL)溶液。混合物搅拌2h，浓缩，在DCM(100mL)中再次溶解，然后用饱和NaHCO3(3×50mL)，H2O(3×50mL)，和1M NaOH(50mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，并浓缩。粗产物用硅胶柱色谱纯化，CHCl3作为初始洗脱剂，然后用CHCl3中的5％MeOH溶液作为洗脱剂。得到黄色泡沫产物(1.21g；33％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.05(dd，1H)，7.81(dd，1H)，7.41-7.27(m，11H)，6.52(br.m，2H)，3.74(s，3H)，3.60(m，10H)，3.39(t，2H)，3.3-2.0(br.m，24H)，1.45(s，27H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.82ppm。FT-IR(ATR)ν3424，2976，2827，1724，1674，1536，1369，1228，1161，1106，838，749cm-1。LC-MSm/z[M+H]+计算值1049.2Da，观测值1049.5Da。
化合物28三-tBu-保护的27溶解在DCM(7mL)和TFA(5mL)中，在rt下搅拌1h。浓缩混合物，再次溶解在DCM(7mL)和TFA(5mL)中，再搅拌2h。浓缩混合物，与CHCl3一起蒸发2次，然后在真空中充分干燥。产物溶解在H2O(30ml)中，冻干，得到蓬松黄色粉末(1.16g，96％)。1H-NMR(200MHz，MeOD)δ8.04(dd，1H，J＝3.7，8.1)，7.79(dd，1H，J＝1.7，8.1)，7.45(dd，1H，J＝3.7，1.7)，7.4-7.2(m，10H)，4.05-3.7(br.m，8H)，3.68(s，3H)，3.6-3.1(br.m，28H)ppm。31P-NMR(80MHz，MeOD)δ33.82(小，膦氧化物)，-3.91(大，产物)，-15.19(t，HPO2F2，J＝953)ppm。FT-IR(ATR)ν3287，3074，2872，2546，1718，1651，1547，1435，1292，1189，1130，745，720，698cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+881.4Da。
合成探针28与Eu的配位化合物(29) h)EuCl3·6H2O，NH4OAc，H2O，20℃，2hEu3+-配位化合物29化合物28(100mg；0.114mmol)和乙酸铵(87.9mg；1.14mmol)溶解在脱气的超纯H2O(60mL)中。加入EuCl3·6H2O(37.4mg；0.102mmol)，略微混浊的混合物在Ar中rt下搅拌2h。然后，过滤，冻干，得到黄色固体配位化合物(123mg)。1H-NMR(200MHz，H2O)δ7.8-7.0(br.m)，3.6-2.4(br.m)ppm。31P-NMR(80MHz，D2O)δ37.02(小，膦氧化物)，-5.30(大，产物)，-15.01(t，HPO2F2，J＝962)ppm。FT-IR(ATR)ν3050，1664，1590，1403，1292，1128，721cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+1031.1Da。
实施例12用于合成叠氮基-官能化的寻靶探针的水溶性的叠氮化物与活性酯(34)。
实验参见实施例11。
化合物30叔BuOK(12.0g；107mol)分次加到搅拌的二乙二醇(27.0g；0.254mol)和叔丁醇(110mL)的混合物中。溶液保持在氩气中，在温水浴(约40℃)中搅拌以溶解钾盐。90分钟后将溶液冷却到15℃，5分钟内加入溴乙酸叔丁酯(26.8g；0.137mol)。形成沉淀(KBr)，混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，混合物溶解在水中，用乙醚/戊烷萃取水层以除去杂质。用DCM(3次)萃取收集产物。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。粗产物使用己烷/二甲氧基乙烷梯度混合物用硅胶柱色谱纯化。得到无色油状产物(产率25％)。TLC(硅胶，己烷/二甲氧基乙烷1/1)Rf＝0.30。1H NMR(CDCl3)δ＝3.95(s，2H，CH2C(O))，3.7-3.6(6H)，3.55(t，2H)，2.75(t，1H，OH)，1.4(s，9H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝169.5(C＝O)，81.5(CCH3)，72.5，70.7，70.2和68.8(CH2O)，61.5(CH2OH)，27.9(CH3)ppm。
化合物31对甲苯磺酰氯(11.9g；62.4mmol)分次加到醇30(11.7g；52.9mmol)和无水吡啶(30mL)的搅拌和冷却下的混合物中。溶液在氩气中在4℃下搅拌过夜，出现沉淀(吡啶盐氯化物)。将冰水加到混合物中，然后搅拌5分钟，水解过量的对甲苯磺酰氯。用乙醚萃取水层(3次)，合并有机层，用冷HCl溶液和冷水洗涤，然后用Na2SO4干燥醚。蒸发溶剂，得到油状产物(16g，80％)。1H NMR(CDCl3)δ＝7.8(m，2H，Ar-H)和7.3(m，2H，Ar-H)，4.1(t，2H)，3.95(s，2H，CH2C(O))，3.7-3.5(6H)，2.4(s，3H，Ar-CH3)1.4(s，9H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝169.5(C＝O)，144.7，132.9，129.7和127.9(苯环碳)，81.5(CCH3)，70.6，70.5，69.1，68.9和68.6(CH2O)，28.0(CH3)，21.5(Ar-CH3)ppm。
化合物32将对甲苯磺酸酯31(15g；40.0mmol)加到NaN3(3.20g；49.2mmol)的二甲基亚砜(90mL)溶液中。混合物搅拌2d，同时保持在氩气中。加入水，用醚萃取(3次)，合并有机层，用水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，得到油状产物(9.9g；100％)。1H NMR(CDCl3)δ＝3.95(s，2H，CH2C(O))，3.7-3.6(6H)，3.4(t，2H，CH2N3)，1.4(s，9H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝169.5(C＝O)，81.5(CCH3)，70.7，70.6，69.9和69.0(CH2O)，50.6(CH2N3)，28.0(CH3)ppm。
化合物33将叠氮化物32(9.9g；40.0mmol)加到水(10mL)，MeOH(50mL)和NaOH(2.05g；51.3mmol)的搅拌溶液中，得到的混浊混合物在室温下搅拌过夜。在加入一些HCl-溶液降低pH为约7后，蒸发甲醇。加入水，使用DCM分几次萃取产物。合并有机层，用少量水洗涤，然后用Na2SO4干燥。浓缩溶液，得到接近无色的油状产物(7.3g；95％)。1H NMR(CDCl3)δ＝10.0(b，1H，COOH)，4.2(s，2H，CH2C(O))，3.8-3.6(6H)，3.4(t，2H，CH2N3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝174.5(C＝O)，71.1，70.4，70.0和68.3(CH2O)，50.5(CH2N3)ppm。
化合物34将酸33(310mg；1.64mmol)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠(316mg；1.46mmol)，DCC(640mg；3.11mmol)和3mL无水DMF混合，得到的悬浮液在水浴中于50℃超声处理1小时，然后在室温下搅拌3天。混合物在4℃下保持几小时，然后用玻璃过滤器过滤，并用少量无水DMF和乙腈洗涤。将无水乙酸乙酯(30mL)和醚(200mL)加到透明滤液中，得到乳状悬浮液。离心，得到白色粉末，向其中加入醚；再次离心悬浮液。真空干燥粉末。产率200mg(35％)。
小心保持化合物干燥，因为其略具吸湿性，并会水解回到起始化合物！
权利要求
1.一种用于靶向医学显像或治疗的试剂盒，其包括至少一个寻靶探针，其包括一级寻靶部分和二级靶标；和至少一个另外的探针，其选自包括二级寻靶部分和标记的显像探针；或包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针，其特征在于，所述寻靶探针或所述显像或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而另一个探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述寻靶探针包括所述至少一个叠氮基，而所述显像或治疗探针包括所述至少一个膦基团。
3.如权利要求1～2中任一项所述的试剂盒，其中所述一级寻靶部分与血管体系内的成分结合。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述一级寻靶部分与受体结合。
5.如权利要求1～4中任一项所述的试剂盒，其中所述一级寻靶部分与细胞内成分结合。
6.如权利要求1～5中任一项所述的试剂盒，其中所述一级寻靶部分是抗体。
7.如权利要求1～6中任一项所述的试剂盒，其中所述一级寻靶部分是细胞渗透性的。
8.如权利要求1～7中任一项所述的试剂盒，其包括显像探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述显像探针包括可检测标记，其是传统显像系统中所用的造影剂，选自MRI可显像剂、自旋标记、光学标记、超声反应性试剂、X射线反应性试剂、放射性核素、和FRET型染料。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述可检测标记选自(生物)发光或荧光分子或标签、放射性标记、生物素、顺磁或超顺磁显像试剂。
11.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述标记包括选自如下的放射性核素3H、11C、13N、15O、18F、51Cr、52Fe、52mMn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80mBr、82mBr、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113mIn、114mIn、117mSn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193mPt、195mPt、201Tl、203Pb。
12.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述标记包括选自如下的顺磁离子Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。
13.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述标记是小尺寸有机PET(正电子发射断层显像)或SPECT标记。
14.如权利要求8～13中任一项所述的试剂盒，其中所述显像探针还包括药物活性化合物。
15.如权利要求1～4中任一项所述的试剂盒，其包括治疗探针。
16.一种包括二级寻靶部分和标记的显像探针，其特征在于，所述显像探针包括作为二级靶标的至少一个叠氮基或至少一个膦基团，所述膦或所述叠氮基是适于施陶丁格连接用的反应配偶子，而所述标记是显像标记。
17.如权利要求16所述的显像探针，其中所述标记选自金属颗粒，有机PET或SPECT标记的辅基，光学标记，PET、SPECT或MRI用的金属配位化合物，微泡，或含有碘或钡的分子或泡囊。
18.药物组合物，其包括如权利要求16所述的显像探针。
19.制备显像用的诊断组合物的方法，包括使用如权利要求16所述的显像探针。
20.包括一级寻靶部分和二级靶标的寻靶探针作为靶向医学显像中的工具的用途，其特征在于，所述寻靶探针包括作为所述二级靶标的至少一个叠氮基或至少一个膦基团，所述膦或所述叠氮基是适于施陶丁格连接用的反应配偶子。
21.包括一级寻靶部分和二级靶标的寻靶探针在制造医学显像用的工具中的用途，其特征在于，所述寻靶探针包括作为所述二级靶标的至少一个叠氮基或至少一个膦基团，所述膦或所述叠氮基是适于施陶丁格连接用的反应配偶子。
22.一种包括MRI显像剂以及在施陶丁格连接中可以与叠氮基反应的膦基团的显像探针，其特征在于，所述显像剂的金属原子通过含有膦基团的连接基团与一个或者多个羧酸配位。
23.一种显像探针，其包括PET或SPECT标记和三苯基膦作为二级寻靶部分。
24.如权利要求22所述的显像探针，其具有通式结构(6) 其中M是顺磁性金属离子，选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II)、Yt(III)、Cr(III)、Eu(III)、Yb(III)和Dy(III)；A、B、C和D是单键或双键；X1、X2、和X3是-OH、-COO-、-CH2OH-、CH2COO-；R1-R10是氢、烷基、芳基、磷部分，以及Y是取代的三苯基膦如(CH2)2-COO-C6H4N(CH2COOH)2-P-(C6H5)2或允许在取代的膦和顺磁性金属之间有一个或多个配位的另一种取代的三苯基膦。
25.如权利要求24所述的显像探针，其中所述顺磁性金属是Gd。
26.如权利要求24或25所述的化合物，其由式(1)所代表
27.一种医学显像用的组合探针，其包括一级寻靶部分和可检测标记，其特征在于，所述寻靶部分通过酰胺键或三苯基膦氧化物部分与所述可检测标记连接。
28.如权利要求27所述的组合探针，其中所述可检测标记是选自如下的显像剂金属颗粒，有机PET或SPECT标记的辅基，光学标记，PET、SPECT或MRI用的金属配位化合物，微泡，以及含有碘或钡的分子或泡囊。
29.一种体外制备包括一级寻靶部分和可检测标记或药物活性剂的组合的寻靶和显像或治疗探针的方法，所述方法包括如下步骤使包括膦的可检测标记与包括叠氮基的一级寻靶部分反应或使包括叠氮基的可检测标记与包括膦的一级寻靶部分反应。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述显像剂选自有机PET或SPECT标记的辅基，光学标记，PET、SPECT或MRI用的金属配位化合物，微泡，和含有碘或钡的分子或泡囊。
31.一种开发对靶标具有优化的结合亲和性以及对显像或治疗探针具有优化的反应的寻靶探针的方法，所述方法包括a)制备所述寻靶探针的寻靶部分的化合物库，其中在所述寻靶部分上的不同部位引入二级靶标，和b)筛选这样得到的化合物库，以与靶标结合并与显像探针和/或治疗探针结合。
32.一种特异肽的衍生物的库，其特征在于，所述衍生物在所述肽的肽链中的不同氨基酸位置处被叠氮基修饰。
33.如权利要求32的库用于测定含有叠氮基的肽和/或包括叠氮基的肽和包括膦的显像或治疗探针的反应产物对一级靶标的结合性能的用途。
34.一种靶向医学显像或治疗用的试剂盒，其包括至少一个靶标代谢前体，其包括二级靶标；和至少一个另外的探针，其选自包括二级寻靶部分和标记的显像探针；或包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针，其特征在于，所述靶标代谢底物或所述显像或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而另一个探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述靶标代谢前体包括至少一个叠氮基，而所述显像或治疗探针包括至少一个膦基团。
36.如权利要求34或35所述的试剂盒，其中所述代谢前体选自糖、氨基酸、核碱、和胆碱。
37.一种靶向医学显像或治疗用的试剂盒，其包括至少一个报道探针，其包括二级靶标；和至少一个另外的探针，其选自包括二级寻靶部分和标记的显像探针；或包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针，其特征在于，所述报道探针或所述显像探针或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而另一个探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。
38.如权利要求34～37中任一项所述的试剂盒，其包括显像探针。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述显像探针包括可检测标记，其是传统显像系统中所用的造影剂，选自MRI可显像剂、自旋标记、光学标记、超声反应性试剂、X射线反应性试剂、放射性核素、和FRET型染料。
全文摘要
提供共价连接如施陶丁格连接的选择性化学和生物正交反应在靶向分子显像和治疗中的用途，更具体而言，其有益的应用是预靶向显像或治疗。现有预靶向显像的问题在于其仅依赖于天然/生物寻靶构造(即生物素/链亲和素)。与其内源性性质相关的对尺寸的考虑因素和限制因素严重限制了其应用数量。本发明公开了如何使用非生物的、在生理条件下通过小或不可检测到的结合来形成稳定的加成物的生物正交反应能够克服这些局限。
文档编号A61K51/02GK101068577SQ200580034471
公开日2007年11月7日 申请日期2005年10月4日 优先权日2004年10月7日
发明者马克·S·罗比亚尔, 霍尔格·克吕埃 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司