专利名称：治疗子宫内膜异位症的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗子宫内膜异位症的药物，所述药物包括白细胞介素-5(下文简称为IL-5)拮抗剂作为活性成分。
背景技术：
治疗子宫内膜异位症的方法主要分为药物治疗和手术治疗。对于药物治疗，对症治疗例如镇痛药以及药丸和激素治疗例如给予药物治疗子宫内膜异位症也包括在内。手术治疗包括姑息性手术和根治性手术等(非专利文献1)。但是，在某些情况下这些手术治疗也还是不够的，因此到目前为止，尚未开发出完全治愈子宫内膜异位症的药物。
作为与人IL-5特异反应的抗体，已知有SB-240563(Smithkline-Beecham)、Sch-55700(CDP-835；Schering-Plough/Celltech)等。SB-240563显示出减少轻度哮喘患者周围血中嗜酸性粒细胞数目的活性(10thAnnual Meeting of the America Society for ClinicalPharmacology and Therapeutics，March，1999)。已知Sch-55700抑制过敏性疾病猿猴模型中预激引起的肺内嗜酸性粒细胞增加(非专利文献2)。
而且，作为与IL-5受体α链反应的抗体，已知有人源化抗体KM8399(专利文献1)。预期KM8399可以用作治疗过敏性疾病例如慢性支气管哮喘的药物。同样已知KM8399具有人IgG1亚型的Fc区，该区特异性地诱导人嗜酸性粒细胞的凋亡，凋亡是通过抗体依赖性细胞毒性活性诱导的(专利文献2)。
但是，上述与人IL-5特异性结合的抗体或与人IL-5受体特异性结合的抗体与子宫内膜异位症之间的关系还不知道。
非专利文献1Tsutomu Douchi等人，Selection of Treatment ofEndometriosis，Gynecologic Therapy，78，179-182(1999)非专利文献2Arzneimittel-Forschung，49，779(1999)专利文献1WO97/10354专利文献2WO01/60405
发明内容
因此需要一种用于治疗子宫内膜异位症的药物。
本发明涉及下列(1)到(13)(1)一种治疗子宫内膜异位症的药物，其包括白细胞介素-5拮抗剂作为活性成分。
(2)根据(1)所述的药物，其中白细胞介素-5拮抗剂是抑制白细胞介素-5与白细胞介素-5受体结合的抗体或其抗体片段。
(3)根据(2)所述的药物，其中抑制白细胞介素-5与白细胞介素-5受体结合的抗体是与白细胞介素-5结合的抗体。
(4)根据(3)所述的药物，其中白细胞介素-5是人白细胞介素-5。
(5)根据(2)所述的药物，其中抑制白细胞介素-5与白细胞介素-5受体结合的抗体是与白细胞介素-5受体结合的抗体。
(6)根据(5)所述的药物，其中白细胞介素-5受体是白细胞介素-5受体α链。
(7)根据(5)或(6)所述的药物，其中白细胞介素-5受体是人白细胞介素-5受体。
(8)根据(2)到(7)任意一项所述的药物，其中抗体是单克隆抗体。
(9)根据(8)所述的药物，其中单克隆抗体是基因重组抗体。
(10)根据(9)所述的药物，其中基因重组抗体是选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的基因重组抗体。
(11)根据(2)到(10)任意一项所述的药物，其中抗体片段是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚可变区(双特异抗体)、二硫化物稳定可变区(dsFv)以及包括CDR的肽的抗体片段。
(12)根据(1)到(11)任意一项所述的白细胞介素-5拮抗剂在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用。
(13)一种治疗子宫内膜异位症的方法，其包括给予(1)到(11)任意一项所述的白细胞介素-5拮抗剂。
本发明提供了一种包括白细胞介素-5拮抗剂作为活性成分的治疗子宫内膜异位症的药物。
图1显示了抗鼠IL-5受体抗体抑制子宫内膜异位症小鼠模型中的子宫内膜异位病变形成的活性。纵座标显示病变大小(mm2)。
图2显示了抗鼠IL-5抗体抑制子宫内膜异位症小鼠模型中的子宫内膜异位病变形成的活性。纵座标显示病变大小(mm2)。
具体实施例方式
本发明所使用的IL-5拮抗剂可以是任意拮抗剂，只要它能阻断IL-5与IL-5受体之间的信号转导和抑制IL-5的生物活性，并且它可以具有低分子量或者高分子量。例如，它包括抑制IL-5与IL-5受体结合的抗体或其抗体片段。
抑制IL-5与IL-5受体结合的抗体包括与IL-5结合并抑制IL-5与IL-5受体结合的抗体、与IL-5受体结合并抑制IL-5与IL-5受体结合的抗体等。对于IL-5受体，可包括IL-5受体α链、IL-5受体β链等。
本发明所使用的上述抗体或其抗体片段可以是任意一种多克隆抗体或者单克隆抗体，优选单克隆抗体。
单克隆抗体包括杂交瘤细胞产生的抗体、基因重组抗体等。
杂交瘤细胞是一种通过用抗原免疫非人哺乳动物得到的B细胞与骨髓瘤细胞之间进行细胞融合得到的细胞，它能产生具有所期望的抗原特异性的单克隆抗体。
基因重组抗体的例子包括人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。
人嵌合抗体指包括非人动物抗体的VH和VL以及人抗体的CH和CL的抗体。对于人嵌合抗体的CH，可以使用任意的CH，只要它属于人免疫球蛋白(下文称作hIg)，优选其中的hIgG型。也可以使用属于hIgG型的任意亚型hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。对于人嵌合抗体的CL，可以使用任意CL，只要它属于hIg并且可以使用任意的κ型或者λ型。
非人类动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。
人源化抗体是其中非人类动物抗体的VH和VL的CDR被移植到人抗体的VH和VL的适当位置的抗体，也被称作人CDR移植抗体。
本发明的人源化抗体如下进行制备设计和构建编码V区的cDNA，其中非人类动物抗体的VH和VL的CDR被连接到任意人抗体的VH和VL的框架结构(下文称为FR(s))上，并将它们分别插入到用于具有编码人抗体的CH和CL的cDNA的动物细胞的表达载体中，从而构建人源化抗体表达载体，然后将该表达载体导入到动物细胞内以表达人源化抗体。
对于人源化抗体的CH，可以使用任意CH，只要它属于hIg，但是，优选属于hIgG型的抗体，并且还可以使用属于hIgG型的任意亚型例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。进一步，对于人源化抗体的CL，可以使用任意CL，只要它属于hIg，并且可以使用属于κ型或者λ型的抗体。
尽管人抗体原先是在人体内自然存在的抗体，但是它也包括从人抗体噬菌体文库中获得的抗体，以及从通过基因工程、细胞工程和发育工程技术的新进展而制备的产生人抗体的转基因动物中获得的抗体。对于存在于人体内的抗体，例如，通过分离人周围血淋巴细胞，通过用EB病毒或类似物感染使其永生化，然后将其克隆以获得能产生抗体的淋巴细胞，培养由此获得的这些淋巴细胞，从培养上清液中纯化这些抗体。人抗体噬菌体文库是其中通过将由人B细胞制备而成的抗体编码基因插入到噬菌体基因内从而使抗体片段例如Fab和scFv在噬菌体表面上表达的一种文库。在其表面上具有所需要的抗原结合活性的表达抗体片段的噬菌体可以通过使用与固定抗原的底物的结合活性来作为指标从文库中收集。通过基因工程技术，抗体片段可以进一步转变成包括两条全长H链和两条全长L链的人抗体分子。产生人抗体的转基因动物是指其中人抗体基因整合到其细胞中的动物。例如，产生人抗体的转基因小鼠可以通过将人抗体基因导入小鼠ES细胞中，然后将该ES细胞移植到小鼠的早期胚胎并发育而获得。对于从产生人抗体的转基因动物制备人抗体的方法，可以通过培养由通常在非人类动物上进行的杂交瘤制备方法获得的产生人抗体的杂交瘤细胞，在培养上清液中形成和积累人抗体。
优选用于本发明中的抗体或者抗体片段包括由杂交瘤细胞ATCCHB10959(日本公开的未经审查的专利申请第2000-210097号)制备的单克隆抗体，该抗体与IL-5结合并抑制IL-5与IL-5受体的结合；由杂交瘤细胞KM1259(FERM BP-5134，WO97/10354)和杂交瘤细胞KM1486(FERM BP-5651，WO97/10354)等制备的单克隆抗体，它与IL-5受体α链结合并抑制IL-5与IL-5受体的结合；以及由杂交瘤细胞BION-1(ATCC HB-12525，WO00/09561)制备的单克隆抗体，该抗体特异性结合IL-5受体β链并抑制IL-5与IL-5受体的结合；以及这些抗体的抗体片段。
与人IL-5受体结合并抑制IL-5与IL-5受体结合的人嵌合抗体的具体实例包括抗人IL-5R α链嵌合抗体，其包括包括SEQ ID NO1、2和3分别所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO4、5和6分别所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3；具有包括SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的抗体的VH和/或包括SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的抗体的VL的抗人IL-5α链嵌合抗体；具有包括SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的抗体的VH和包括hIgG1亚型氨基酸序列的人抗体的CH以及包括SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的抗体的VL和包括κ型氨基酸序列的人抗体的CL的抗人IL-5R α链嵌合抗体。实例包括KM1399(WO97/10354)等。
与人IL-5受体α链结合并抑制IL-5与IL-5受体结合的人源化抗体的实例包括这样的抗体其包括SEQ ID NO24、25和26分别所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO27、28和29分别所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3；更优选这样的抗体其包括SEQ ID NO18、19和20分别所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO21、22和23分别所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3；仍然更优选这样的抗体其包括SEQ ID NO1、2和3分别所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO4、5和6分别所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3，以及这些抗体的抗体片段。
在上述的人源化抗体组合物中，优选包括抗体VH的人源化抗体组合物(其中SEQ ID NO9所示的氨基酸序列或者至少一个选自SEQID NOo9所示的氨基酸序列中位点40的丙氨酸(Ala)、位点46的谷氨酸(Glu)、位点67的精氨酸(Arg)、位点72的丙氨酸(Ala)、位点74的苏氨酸(Thr)、位点79的丙氨酸(Ala)、位点95的酪氨酸(Tyr)和位点97的丙氨酸(Ala)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代)，以及包括抗体VL的人源化抗体(其中SEQ ID NO10所示的氨基酸序列或者至少一个选自SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中位点7的丝氨酸(Ser)、位点8的脯氨酸(Pro)、位点22的苏氨酸(Thr)、位点37的谷氨酰胺(Gln)、位点38的谷氨酰胺(Gln)、位点44的脯氨酸(Pro)、位点45的赖氨酸(Lys)、位点71的苯丙氨酸(Phe)、位点77的丝氨酸(Ser)、位点87的酪氨酸(Tyr)和位点98的苯丙氨酸(Phe)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代)；更优选包括抗体VH和抗体VL的人源化抗体，在抗体的VH中，至少一个选自SEQ ID NO9所示的氨基酸序列中位点40的丙氨酸(Ala)、位点46的谷氨酸(Glu)、位点67的精氨酸(Arg)、位点72的丙氨酸(Ala)、位点74的苏氨酸(Thr)、位点79的丙氨酸(Ala)、位点95的酪氨酸(Tyr)和位点97的丙氨酸(Ala)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代，在抗体的VL中，至少一个选自SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中位点7的丝氨酸(Ser)、位点8的脯氨酸(Pro)、位点22的苏氨酸(Thr)、位点37的谷氨酰胺(Gln)、位点38的谷氨酰胺(Gln)、位点44的脯氨酸(Pro)、位点45的赖氨酸(Lys)、位点71的苯丙氨酸(Phe)、位点77的丝氨酸(Ser)、位点87的酪氨酸(Tyr)和位点98的苯丙氨酸(Phe)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代。
实例包括人源化抗体，其包括其中抗体的VH分别由SEQ ID NO9、11、12和13所示，或者其中至少一个选自SEQ ID NO9所表示的氨基酸序列中位点40的丙氨酸(Ala)、位点46的谷氨酸(Glu)、位点67的精氨酸(Arg)、位点72的丙氨酸(Ala)、位点74的苏氨酸(Thr)、位点79的丙氨酸(Ala)、位点95的酪氨酸(Tyr)和位点97的丙氨酸(Ala)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代的氨基酸序列，和/或其中抗体的VL分别由SEQ ID NO10、14、15、16和17所示的氨基酸序列；或者其中至少一个选自SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中位点7的丝氨酸(Ser)、位点8的脯氨酸(Pro)、位点22的苏氨酸(Thr)、位点37的谷氨酰胺(Gln)、位点38的谷氨酰胺(Gln)、位点44的脯氨酸(Pro)、位点45的赖氨酸(Lys)、位点71的苯丙氨酸(Phe)、位点77的丝氨酸(Ser)、位点87的酪氨酸(Tyr)和位点98的苯丙氨酸(Phe)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代的氨基酸的氨基酸序列。更具体的是包括其中VH为SEQ ID NO13所示和VL为SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的人源化抗体，例如，KM8399(WO97/10354)、KM7399(WO97/10354)等也包括在内。
进一步，与IL-5结合并抑制IL-5与IL-5受体结合的人化抗体包括美泊利单抗(mepolizumab)[SB-240563，GlaxoSmithKline制造]、reslizumab[Sch-55700，Schering-Plough/Celltech制造]等。
在构建上述抗体或者抗体片段的氨基酸序列中，其中的一个或者多个氨基酸残基被删除、增加、取代或者插入并且活性与上述的抗体或者抗体片段基本相当的抗体或者抗体片段包括在本发明所使用的抗体之内。
要被删除、插入、取代或者增加的氨基酸数目可以是一个或者多个，该数目没有特别的限制，但其是一个能通过已知的技术例如位点定向诱变而被删除、取代或者增加的数目，该技术在Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版；Current Protocols in Molecular Biology；Nucleic Acids Research，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Research，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中有所描述。例如，它可以是1到数十，优选1到20，更优选1到10，进一步优选1到5。
在上述的抗体的氨基酸序列中删除、取代、插入或者增加一个或者多个氨基酸是指一个或者多个氨基酸被删除、取代、插入或者增加到氨基酸序列中的一个或者多个任意的位置上。删除、取代、插入或者增加可以在同一个氨基酸序列中同时进行。同样，被取代、插入或者增加的氨基酸残基可以是天然的或者人工的。天然的氨基酸残基包括L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
在下文中，显示了能互相取代的氨基酸残基的优选实例。在同一组内的氨基酸残基可以相互取代。
A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、t-丁基甘氨酸、丙氨酸环己酯；B组天门冬氨酸、谷氨酸、异天门冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天门冬酰胺、谷氨酰胺D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E组脯氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、同型丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明所使用的抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双特异抗体、dsFv以及包括CDR的肽等。
Fab是分子量约为50,000并且具有抗原结合活性的抗体片段，其中在用蛋白酶、木瓜蛋白酶(在H链的位点224切断氨基酸残基)处理IgG型抗体分子而得到的片段中，其H链的N末端约一半和L链的全长通过二硫键连接在一起。
本发明所使用的Fab可以通过用蛋白酶、木瓜蛋白酶处理抗体而制成。可供选择的是，编码抗体Fab的DNA被插入到原核生物的表达载体或者真核生物的表达载体，然后将载体导入原核生物或者真核生物来诱发表达。
F(ab’)2是分子量约为100,000并具有抗原结合活性的抗体片段，其中在用蛋白酶、木瓜蛋白酶处理IgG型抗体分子而得到的片段中，其抗原结合活性比经由铰链区的二硫键连接的Fab稍大。
本发明所使用的F(ab’)2可以通过用蛋白酶、木瓜蛋白酶处理抗体而制成。可供选择的，它可以经由硫醚键或者二硫键来连接下述Fab’而制成。
Fab’是分子量约为50000并具有抗原结合活性的抗体片段，其中上述的F(ab’)2铰链区的二硫键被劈开。
本发明所使用的Fab’可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理F(ab’)2而制成。可供选择的，编码抗体Fab’片段的DNA被插入到原核生物的表达载体或者真核生物的表达载体，然后将载体导入原核生物或者真核生物来诱发表达。
scFv是具有抗原结合活性的抗体片段并且是VH-P-VL或者VL-P-VH多肽，其中一个VH和一个VL使用适当的肽连接子(下文称为P)连接在一起。
本发明所使用的scFv可以这样的方式制备，获得编码抗体VH和VL的cDNA，构建编码scFV的DNA，将该DNA插入到原核生物的表达载体或者真核生物的表达载体，然后将该表达载体导入原核生物或者真核生物来诱发表达。
双特异抗体是其中scFv被二聚化的抗体片段并且具有二价抗原结合活性的抗体片段。二价抗原结合活性可以是相同的或者其中之一可以用作不同的抗原结合活性。
本发明所使用的双特异抗体可以以这样的方式制备，获得编码抗体VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA从而使连接子的氨基酸序列的长度不超过8个残基，将该DNA插入到原核生物的表达载体或者真核生物的表达载体，然后将该表达载体导入原核生物或者真核生物来诱发表达。
dsFV是其中VH和VL每个中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经半胱氨酸残基之间的二硫键连接在一起的抗体片段。用半胱氨酸取代的氨基酸残基根据Reiter等人所示的方法，基于抗体的三维结构的估计进行选择(Protein Engineering，7，697-704(1994))。
本发明所使用的dsFv可以以这样的方式制备，获得编码抗体VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物的表达载体或者真核生物的表达载体，然后将该表达载体导入原核生物或者真核生物来诱发表达。
包括CDR的肽通过包括VH或VL的CDR的至少一个区域来构建。包括多个CDR的肽可以直接连接或经由适当的肽连接子来连接。本发明中所使用的包括CDR的肽可以这样的方式制备，构建编码VH和VL的DNA，将该DNA插入到原核生物的表达载体或者真核生物的表达载体，然后将该表达载体导入原核生物或者真核生物来诱发表达。包括CDR的肽还可以通过化学合成方法，例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)和tBoc法(叔丁基氧基羰基法)来制备。
下面描述制备本发明所使用的抗体或者抗体片段的方法及其活性的评价1.单克隆抗体的制备(1)抗原的制备包括编码多肽的cDNA的表达载体作为抗原被导入大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、动物细胞等内并在其中表达，从而获得重组蛋白，所得的蛋白质可以用作抗原。可选的是，具有抗原多肽的部分氨基酸序列的合成多肽也可以用作抗原。
对于抗原的部分肽，选择约5到30个残基的部分蛋白质序列。为了获得识别处于具有未变性的自然结构状态的蛋白质的抗体，鉴于三维结构，必须选择存在于蛋白质表面的部分氨基酸序列作为抗原肽。分析蛋白质的三维结构的方法的实例包括这样的方法，该方法用市售的分析蛋白质序列的软件如Genetyx Mac等预测高度亲水的部分序列。鉴于三维结构有许多低亲水区域存在于蛋白质的内部的情况以及还有许多高亲水区域存在于蛋白质表面的情况。另外，有许多蛋白质的N-末端和C-末端存在于蛋白质的表面的情况。
为了与蛋白质交联，将半胱氨酸加入到部分肽的末端。当蛋白质的内在序列被选作部分肽时，如果需要的话，该肽的N-末端和C-末端分别被乙酰化和酰胺化。部分肽可以通过普通的液相或者固相肽合成方法、将其适当组合而成的方法或者其改良的方法(The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1(1979)；Vol.2(1980)；Vol.3，(1981)，Academic Press；Fundamentals and Experiments for Peptide Synthesis，Maruzen(1985)；Development of Drugs，Second Series，Vol.14，PeptideSynthesis，Hirokawa Shoten(1991)；International Journal of Protein &Protein Research，35，161-214(1990))而合成。也可能使用自动化肽合成仪。用肽合成仪来合成肽可以在市售的肽合成仪如Shimadzu制造的肽合成仪、Applied Biosystems，Inc.(下文称为ABI)制造的肽合成仪、Advanced ChemTech Inc.(下文称为ACT)制造的肽合成仪上，使用侧链被适当保护的Nα-Fmoc-氨基酸或Nα-Boc氨基酸，根据各自的合成程序来进行。
用作原料的受保护的氨基酸和载体树脂可从ABI、Shimadzu、Kokusan Kagaku、Nova Biochem、Watanabe Kagaku、ACT、PeptideLaboratory等获得。用作起始原料的受保护的氨基酸、受保护的有机酸和受保护的有机胺可以通过已报道的合成方法或其改良方法(ThePeptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1(1979)；Vol.2(1980)；Vol.3，(1981)，Academic Press；Fundamentals and Experiments for PeptideSynthesis，Maruzen(1985)；Development of Drugs，Second Series，Vol.14，Peptide Synthesis，Hirokawa Shoten(1991)；International Journal ofProtein & Protein Research，35，161-214(1990))来合成。
(2)动物的免疫和抗体生成细胞的制备对于用于免疫的动物，可以使用任何动物只要它能制备杂交瘤细胞，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔。使用小鼠和大鼠的实施例将阐述如下。
将3到20周龄的小鼠或大鼠用上述1(1)制备的抗原免疫并从动物的脾脏、淋巴结和周围血中收集抗体生成细胞。免疫是通过将抗原与适当的佐剂一起经皮下、静脉内或腹腔内给予动物数次而进行的。佐剂的实例包括完全福氏佐剂或者氢氧化铝凝胶、百日咳疫苗等。与载体蛋白如牛血清蛋白(下文称为BSA)或者钥孔血兰素(下文称为KLH)制备共轭物，得到的共轭物可用作免疫原。给予每种抗原后的3到7天，从免疫的动物的眼底静脉丛或者尾静脉采血，通过ELISA等方法来证实抗原的反应性，当小鼠或者大鼠的血清显示出足够的抗体值时就用作抗体生成细胞的来源。在最后一次给予抗原后的3到7天，将脾脏等通过已知的方法(Antibodies-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988))从免疫的小鼠或者大鼠上切除，将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞融合。
(3)骨髓瘤细胞的制备对于骨髓瘤细胞，可以使用任何骨髓瘤细胞只要它能在体外增殖，例如8-氮鸟嘌呤-抗性骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(EuropeanJournal ofImmunology，6，511-519(1976))、SP2/0-Ag 14(SP-2)(Nature，276，269-270(1978))、P3-X63-Ag8653(653)(Journal of Immunology，123，1548-1550(1979))、P3-X63-Ag8(X63)(Nature，256，495-497(1975))等。这些细胞系的培养和传代培养可以根据已知的方法(Antibodies-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))进行，从而到细胞融合阶段保证不少于2×107个细胞。
(4)细胞融合洗涤上述制备的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞并向其中加入细胞凝集培养基例如聚乙二醇-1000(下文称为PEG-1000)，细胞在培养基内融合和悬浮。用伊格尔氏培养基(下文称为MEM)、磷酸盐缓冲盐水(下文称为PBS)等来洗涤细胞。对于其中悬浮融合细胞的培养基，使用HAT培养基{将0.1mM次黄嘌呤、15μM胸腺嘧啶和0.4μM氨基蝶呤加入到普通培养基[将1.5mM谷氨酰胺、50μM 2-巯基乙醇、10μg/mL庆大霉素和10％胎牛血清(下文称为FBS)加入到RPMI-1640培养基中所形成的培养基]中所形成的培养基}，来选择性地得到所需要的融合细胞。
培养之后，取出部分培养上清液，通过ELISA来选择与抗原蛋白质反应并且不与非抗原蛋白反应的样品。然后，进行有限稀释法使其形成单个细胞，将通过ELISA显示稳定和高抗体滴度的样品选作单克隆抗体生成杂交瘤。
(5)杂交瘤的选择对产生抗原反应性抗体的杂交瘤的选择通过下文描述的ELISA，根据已知的方法(Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1988))进行。根据这一方法，现在有可能测定转化细胞株(该转化细胞株产生人嵌合抗体、CDR移植抗体或者其抗体片段或者从下文将要描述的培养上清液中纯化的抗体)的培养上清夜中含有的抗体的抗原结合活性。
ELTSA将抗原放置于96孔ELISA板内，用如杂交瘤的培养上清液或者纯化抗体作为一抗进行反应。当一抗反应完成后，洗涤该板，加入二抗。对于二抗，使用能识别一抗的标有生物素、酶、化学发光物质、放射性同位素等的抗体。具体地说，当在杂交瘤的制备中使用小鼠时，将能够识别小鼠抗体的抗体用作二抗。反应后，进行与二抗的标记物质相对应的反应来选择能产生与抗原特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤。
(6)单克隆抗体的纯化将在1(4)中获得的单克隆抗体生成杂交瘤细胞以5×106到2×107细胞/鼠的量腹腔内注射到已经腹腔内给予0.5mL的姥鲛烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)的8到10周龄的小鼠或者裸鼠中，随后饲养2周。在10到21天，杂交瘤变成腹水瘤。收集小鼠或者裸鼠的腹水，离心，用40到50％的饱和硫酸铵盐析，用辛酸沉淀法进行沉淀，用DEAE-Sepharose柱、蛋白A柱、Cellulofine GSL 2000柱(Seikagaku Kogyo制造)等回收IgG或者IgM片段来制备纯化的单克隆抗体。
纯化的单克隆抗体的亚型可通过使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒、大鼠单克隆抗体分型试剂盒等进行鉴定。蛋白质的浓度可以用罗氏蛋白质定量法或者在280nm处的吸光度来计算。
抗体的亚型指在一种类型中的同种型，包括小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人类的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
(7)单克隆抗体的活性评价(7-1)抗原结合活性的评价在培养上清液中的或者从培养上清液中纯化的单克隆抗体的抗原结合活性可以用上述1(5)中提到的ELISA方法、表面等离子体共振(Journal of Immunological Methods，145，229-240(1991))等方法检测。与抗原和抗原决定簇的反应性也可以使用抗原肽和其部分肽通过竞争性ELISA进行分析。通过通常采用的三维结构分析方法或者各种免疫方法的联合应用可以推测抗体是否识别作为抗原的蛋白质的三维结构。三维结构分析方法的实例包括X-线结晶学和核磁共振方法。各种免疫方法联合应用的实例包括对未变性抗原的ELISA和对变性抗原的ELISA的联合应用。在那种情况下，仅对未变性抗原具有反应性的抗体被高度推测能识别抗原的三维结构。对未变性抗原的ELISA的实例包括使未变性抗原与抗体在液相中反应的ELISA。对于对变性抗原的ELISA，可以使用任何方法，只要在ELISA中抗体在抗原不具有其天然三维结构的状态下进行反应，实例包括对直接固定在疏水反应板上的抗原的ELISA以及对被消化到适当长度的部分肽的ELISA。
2.制备抗原的非人类动物多克隆抗体多克隆抗体可以从动物血清中制备，其中在通过上述1(2)描述的方法免疫的动物中，该动物血清显示了足够的抗体滴度。
因此，将从动物收集的血离心分级出血清，通过传统的方法从血清中纯化免疫球蛋白馏分，从而可以制备多克隆抗体。对于多克隆抗体的活性，可以通过上述1(7)中提及的方法评价其抗原结合活性。
3.制备人嵌合抗体和人源化抗体(1)构建人嵌合抗体和人源化抗体的表达载体对于人嵌合抗体和人源化抗体的表达载体(下文两者都称为人源化抗体表达载体)，可以使用表达人源化抗体的任何载体，只要它是编码人抗体CH和/或CL的基因插入其中的动物细胞表达载体。表达人源化抗体的表达载体可通过分别将编码人抗体CH和CL的基因克隆到动物细胞表达载体内而构建。
人抗体的C区可以是任何人抗体的CH和CL，实例包括人抗体H链的IgG1亚型的C区(下文称为hCγ1)、人抗体L链的κ型的C区(下文称为hCκ)等。对于编码人抗体CH和CL的基因，可以使用包括外显子和内含子的染色体DNA，也可以使用cDNA。
对于动物细胞的表达载体，可以使用任何载体，只要编码人抗体的C区的基因可被插入和表达。实例包括pAGE107(Cytotechnology，3，133-140(1990))、pAGE103(Journal of Biochemistry，101，1307-1310(1987))、pHSG274(Gene，27，223-232(1984))、pKCR(Proceedings of theNational Academy of Science of the United State of America，78，1527-1531(1981))、pSG1βd2-4(Cytoteehnology，4，173-180(1990))等。用作动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40初始启动子和增强子(Journal of Biochemistry，101，1307-1310(1987))、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR启动子和增强子(Biochemical & Biophysical ResearchCommunications，149，960-968(1987))、免疫球蛋白H链启动子(Cell，41，479-487(1985))和增强子(Cell，33，717-728(1983))等。
对于表达人源化抗体的载体，可以使用抗体的H链和L链在不同的载体上的类型或者在同一载体上的(下文称为串联型)类型，但是，考虑到构建人嵌合抗体的表达载体和人源化抗体的表达载体的容易度、导入到动物细胞内的容易度以及动物细胞中抗体H链和L链的表达量的良好平衡，优选串联型人源化抗体的表达载体(Journal ofImmunological Methods，167，271-278(1994))。串联型人源化抗体的表达载体的实例包括pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Hybridoma，17，559-567(1998))等。
构建的人源化抗体表达载体可以用于在动物细胞内表达人嵌合抗体和人源化抗体。
(2)编码非人类动物的抗体V区的cDNA的获得以及其氨基酸序列的分析编码非人类动物的抗体如小鼠抗体的VH和VL的cDNA通过如下方法获得。
从杂交瘤细胞提取mRNA并合成cDNA。合成的cDNA被克隆进入到载体，如质粒或者噬菌体内，从而制备cDNA文库。用小鼠抗体的C区或者V区作为探针，将每个具有编码VH的cDNA的重组噬菌体或者重组质粒以及具有编码VL的cDNA的重组噬菌体或者重组质粒从文库中分离出来。测定在重组噬菌体或者重组质粒上所需的小鼠VH和VL的全长核苷酸序列，并从核苷酸序列推定VH和VL的全长氨基酸序列。
对于非人类动物，可以使用任何动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和兔，只要它能制备杂交瘤。
从杂交瘤制备完整的RNA的方法的实例包括硫氰酸胍-三氟醋酸铯法(Methods in Enzymology，154，3-28(1987))等，从完整的RNA制备mRNA的方法的实例包括低聚(dT)固定的纤维素吸附柱法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，New York，(1989))等。从杂交瘤制备mRNA的试剂盒的实例包括Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen制造)、Quick Prep mRNAPurification Kit(Pharmacia制造)等。
合成cDNA和制备cDNA文库的方法的实例包括传统的方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，New York，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)以及使用市售试剂盒的方法，所述试剂盒如SuperScriptTMPlasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GibcoBRL制造)以及ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)。
对于其中插入了制备cDNA文库时用从杂交瘤提取出来作为模板的mRNA合成的cDNA的载体，可以使用任何载体，只要cDNA可以插入其中。例如，可以使用噬菌体或者质粒载体如ZAP Express(Strategies，5，58-61(1992))、pBluescript II SK(+)(Nucleic Acid Research，17，9494(1989))、λZAP II(Stratagene制造)、λgt10和λgt11(DNACloningA Practical Approach，I，49(1985))、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia制造)、pcD2(Molecular & CelllilarBiology，3，280-289(1983))和pUC 18(Gene，33，103-119(1985))。
对于其中导入了通过噬菌体或者质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，可以使用任何大肠杆菌，只要cDNA库能够被导入、表达和保留。实例包括XL1-Blue MRF’(Journal of Biotechnology，23，271-289(1992))、C600(Genetics，59，177-190(1968))、Y1088和Y1090(Science，222，778-782(1983))、NM522(Journal of Molecular Biology，166，1-19(1983))、K802(Journal of Molecular Biology，16，118-133(1966))、JM105(Gene，38，275-276(1985))等。
对于从cDNA文库中选择编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA克隆的方法，可以通过菌落杂交法或者噬菌斑杂交法(MolecularCloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，NewYork，(1989))使用放射性同位素或者免疫荧光标记探针进行选择。另外，编码的VH和VL的cDNA可通过聚合酶链式反应通过制备引物和从mRNA或者cDNA文库作为模板合成的cDNA来制备(下文称为PCR法；Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLab.Press，New York，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)。
将通过上述方法选择的cDNA用适当的限制性内切酶或类似物切断、克隆到质粒载体如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)、再进行通常用于分析核苷酸序列的方法如双脱氧法(Proceeding of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，74，5463-5467(1977))并通过自动测序装置(ABI PRISM 377(ABI制造))或类似装置进行分析，从而可以测定cDNA的核苷酸序列。
从测定的核苷酸序列推定VH和VL的全长氨基酸序列并与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列进行比较(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，U.S.Dept.Health and Human Services(1991))，从而可以证实所得的cDNA是否编码含有分泌的信号序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列。对于含有信号序列长度和信号序列的N-末端氨基酸序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列可以通过与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列进行比较而推知(Sequences ofProteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health and HumanServices(1991))，进一步，也可以测定它们属于哪种亚型。同样，VH和VL的每个CDR的氨基酸序列也可以通过与已知的抗体的VH和VL的氨基酸序列进行比较而发现(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Dept.Health and Human Services(1991))。
可采用序列的同源性检索，如BLAST方法对任意数据库例如SWISS-PROT或者PIR-Protein(Journal of Molecular Biology，215，403-410(1990))使用VH和VL的全长氨基酸序列来检测序列的新颖性。
(3)构建人嵌合抗体表达载体编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA被克隆在上述3(1)中提及的表达人源化抗体的载体的编码人抗体VH和VL的基因上游，从而构建人嵌合抗体表达载体。例如，将编码非人类动物抗体的VH和VL的每个cDNA连接到合成的DNA上，该DNA包括非人类动物抗体的VH和VL的3’-末端核苷酸序列和人类抗体的CH和CL的5’-末端核苷酸序列以及在两端都具有适当的限制性内切酶的识别序列，然后克隆使得它们每个都以适当的形式表达在上述3(1)中提及的表达人源化抗体的载体的编码人抗体的CH和CL的基因上游，从而构建人嵌合抗体表达载体。另外，编码VH和VL的cDNA使用在5’-末端具有适当的限制性内切酶的识别序列的引物，使用含有编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA作为模板的质粒通过PCR法进行扩增，然后将它们每个都进行克隆使其以适当的形式表达在上述3(1)中提及的表达人化抗体的载体的编码人抗体的CH和CL的基因上游，从而构建人嵌合抗体表达载体。
(4)构建编码人源化抗体V区的cDNA编码人源化抗体VH和VL的cDNA可如下进行构建。首先，选择移植了所需的非人类动物抗体VH和VL中的CDR氨基酸序列的人抗体VH和VL中的FR氨基酸序列。对于人抗体VH和VL中的FR氨基酸序列，可以使用人抗体VH和VL中的任何FR氨基酸序列，只要它来源于人抗体。其实例包括登记在数据库例如Protein Data Bank中人抗体VH和VL中的FR氨基酸序列以及人抗体VH和VL中的FR每个亚组的共有氨基酸序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Dept.Health and Human Services(1991))。为了制备具有足够活性的人源化抗体，优选选择上述序列中与所需的非人类动物抗体VH和VL的FR氨基酸序列具有尽可能高(至少60％或者更高)的同源性的氨基酸序列。然后，将所需的非人类动物抗体VH和VL的CDR氨基酸序列移植到所选的人抗体VH和VL的FR氨基酸序列中，来设计人源化抗体VH和VL的氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的核苷酸序列中发现的密码子选择频率，将被设计的氨基酸序列转变为核苷酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Healthand Human Services(1991))，从而设计编码人源化抗体VH和VL的核苷酸序列。基于所设计的核苷酸序列，合成了数个长度为大约100个碱基的合成DNA，通过使用它们进行PCR。在此种情况下，考虑到在PCR中的反应效率和可合成的DNA的长度，对于VH和VL优选设计6个合成DNA。
进一步，通过将适当的限制性内切酶的识别序列引入到位于两端的合成DNA的5’-末端，克隆到上述3(1)中构建的人源化抗体的表达载体将很容易进行。PCR后，扩增的产物克隆到质粒如pBluescriptSK(-)(Stratagene制造)中，通过在3(2)中提及的方法测定核苷酸序列，获得的质粒具有编码所需的人源化抗体VH和VL的氨基酸序列的核苷酸序列。
(5)修饰人源化抗体V区的氨基酸序列已经知道，当通过简单的将所需的非人类动物抗体VH和VL中的CDR移植到人抗体VH和VL中的FR制备人源化抗体时，人CDR-移植抗体的抗原结合活性低于非人类动物的原始抗体(Bio/Technology，9，266-271(1991))。对于其原因，据认为，在非人类动物抗体的原始VH和VL中，不仅CDR而且FR的一些氨基酸残基都直接或者间接的参与到抗原结合活性中，由于CDR移植的结果，这样的氨基酸残基变成了不同于人抗体VH和VL中的FR的氨基酸残基。为了解决这个问题，在人源化抗体中进行如下的鉴定在人抗体VH和VL中的FR氨基酸序列中，鉴定了与结合到抗原直接相关的氨基酸残基，或者通过与CDR上的氨基酸残基相互作用或者通过维持抗体的三维结构而与结合到抗原间接相关的氨基酸残基，并且氨基酸残基被修饰成在非人类动物原始抗体中发现的氨基酸残基，从而增加了已降低的抗原结合活性(Bio/Technology，9，266-271(1991))。在制备人源化抗体的过程中，如何有效地识别FR中的与抗原结合活性相关的氨基酸残基最为重要，所以构建抗体的三维结构并通过X-线结晶学(Journal of MolecularBiology，112，535-542(1977))、计算机建模(Protein Engineering，7，1501-1507(1994))等进行分析。尽管抗体三维结构的信息已经为制备人源化抗体提供了许多有益的信息，但是迄今为止仍没有建立制备可用于任何抗体的人源化抗体的方法。所以，目前需要进行各种尝试，例如，为每个抗体制备几种修饰的抗体并检验与每个抗原结合活性的相互关系。
通过使用用于修饰的合成DNA进行上述3(4)中提及的PCR法来完成对人抗体VH和VL中的FR氨基酸残基的修饰。对于PCR后的扩增产物，其核苷酸序列通过上述3(2)提及的方法进行测定，从而证实已经进行了所需的修饰。
(6)构建人源化抗体表达载体将在上述3(4)和(5)中构建的编码人源化抗体VH和VL的cDNA克隆到在上述3(1)中提及的表达人源化抗体的载体中编码人抗体CH和CL的基因上游，从而构建人源化抗体表达载体。
例如，在用于构建上述3(4)和(5)中的人源化抗体VH和VL的合成DNA中，在位于两端的合成DNA的5’-末端引入适当的限制性内切酶的识别序列，从而它们被克隆到在上述3(1)中提及的表达人源化抗体的载体中编码人抗体CH和CL的基因上游，以此方式它们可以适当的形式进行表达。
(7)人嵌合抗体和人源化抗体的短暂表达为了有效评估制备的各种人嵌合抗体和人源化抗体的抗原结合活性，可以使用上述3(3)和(6)中提到的人嵌合抗体表达载体和人源化抗体表达载体或者其修饰的表达载体进行人嵌合抗体和人源化抗体的短暂表达。对于导入表达载体的宿主细胞，可以使用任何细胞，只要它是能表达人嵌合抗体和人源化抗体的宿主细胞。通常，考虑到其高表达量，使用COS-7细胞(ATCC CRL 1651)(Methods in Nucleic AcidsResearch，CRC Press，283(1991))。将表达载体导入COS-7细胞的方法是DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283(1991))、脂质转染法(lipofection)(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United State of America，84，7413-7417(1987))等。
导入表达载体后，在培养上清液中表达的人嵌合抗体和人源化抗体的量以及抗原结合活性可以通过例如ELISA方法(AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter14(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic PressLimited(1996))进行测定。
(8)人嵌合抗体和人源化抗体的稳定表达可以通过将上述3(3)和(6)中提到的人嵌合抗体表达载体和人源化抗体表达载体导入到适当的宿主细胞中获得稳定表达人嵌合抗体和人源化抗体的转化细胞。向宿主细胞导入表达载体的方法是电穿孔法(Cytotechnology，3，133-140(1990))等。对于导入人嵌合抗体表达载体和人源化抗体表达载体的宿主细胞，可以使用任何细胞，只要它是能表达人嵌合抗体和人源化抗体的宿主细胞。其实例包括小鼠SP2/0-Ag 14细胞(ATCC CRL 1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCCCRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(下文称为dhfr)缺陷性CHO细胞(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State ofAmerica，77，4216-4220(1980))、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662；下文称为YB2/0细胞)。
导入表达载体后，能够稳定表达人嵌合抗体和人源化抗体的转化株可根据日本已公开未审查的专利申请第257891/90号中公开的方法，通过在用于动物细胞培养的含有如G418硫酸盐(下文称为G418)的试剂的培养基中培养而进行选择。对于用于培养动物细胞的培养基，可以使用RPMI 1640培养基(Nissui Seiyaku制造)、GIT培养基(NipponSeiyaku制造)、EX-CELL 302培养基(JRH制造)、IMDM(Gibco BRL制造)、Hybridoma-SFM(Gibco BRL制造)、通过添加各种添加剂如FBS到其中而获得的培养基等。当所得的转化细胞在培养基中培养时，人嵌合抗体和人源化抗体可以表达并积蓄在培养上清液中。在培养上清液中表达的人嵌合抗体和人源化抗体的量以及抗原结合活性可以通过ELISA测定。而且，在转化细胞中，表达的人嵌合抗体和人源化抗体的量可以根据日本已公开未审查的专利申请第257891/90号中公开的方法，通过使用dhfr系统或类似系统而得到增加。
可以通过使用蛋白A柱将人嵌合抗体和人源化抗体从转化细胞的培养上清液中纯化(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Chapter 8(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，Academic Press Limited(1996))。除此之外，还可以使用通常用于纯化蛋白质的纯化方法。例如，可以联合使用凝胶过滤、离子交换色谱法以及超滤法进行纯化。可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文称为PAGE；Nature，227，680-685(1970))、蛋白质印迹法(westernblotting)(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Chapter12(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，Academic Press Limited(1996))等方法测定纯化的人嵌合抗体和人源化抗体的H链和L链的分子量或者整个抗体分子的分子量。
(9)人嵌合抗体和人源化抗体的抗原结合活性评价人嵌合抗体和人源化抗体的抗原结合活性可以通过上述ELISA方法进行测定。
4.抗体片段的制备抗体片段可以从上述1和3所述抗体，通过基因工程技术或蛋白质化学技术来进行制备。
基因工程技术的实例包括这样的方法，其中构建了编码所需抗体片段的基因，并且利用合适的宿主(如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌或类似宿主)进行表达和纯化。
蛋白质化学技术的实例包括利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等的蛋白酶的位点特异性切断的方法或纯化。
下面对生产作为抗体片段的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、双特异抗体、dsFv或包括CDR的肽的方法进行详细描述。
(1)Fab的制备在蛋白质化学技术中通过用蛋白酶，木瓜蛋白酶处理IgG来制备Fab。如果原始抗体是与蛋白质A具有结合特性的IgG亚型，在用木瓜蛋白酶处理之后，将其通过蛋白质A柱有可能从IgG分子和Fc片段中分离回收到均一的Fab(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，third edition(1995))。在IgG亚型与蛋白质A没有结合特性的情况下，通过离子交换色谱，在用低盐浓度洗脱的馏分中可回收到Fab(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，third edition(1995))。
Fab还可以通过基因工程技术来进行制备，在许多情况下使用大肠杆菌或使用昆虫细胞、动物细胞等。例如，在上述3(2)、3(4)和3(5)中所述的编码抗体V区的DNA被克隆至用于表达Fab的载体上，从而可制成Fab表达载体。对于用于表达Fab的载体，可以使用任意载体，只要Fab的DNA可以插入和进行表达即可。实例包括pIT106(Science，240，1041-1043(1988))等。该Fab表达载体被导入进合适的大肠杆菌中，从而可形成Fab并且Fab积聚在包含体或周质中。从包含体中，通过通常用于蛋白质的重折叠方法可获得活性Fab，并且当在周质中表达时，活性Fab泄漏至培养上清液中。在重折叠之后或从培养上清液中，使用与抗原结合的柱可纯化得到均一的Fab(Antibody Engineering，APractical Guide，W.H.Freeman and Company(1992))。
(2)F(ab’)2的制备在蛋白质化学技术中，通过用蛋白酶，胃蛋白酶对IgG进行处理可以制备F(ab’)2。在用胃蛋白酶处理之后，通过与Fab相同的纯化操作来回收均一的F(ab’)2(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，third edition，Academic Press(1995))。F(ab’)2还可以通过以下方法来制备将下列4(3)中所述的Fab’用马来酰亚胺，例如o-PDM或双马来酰亚胺己烷处理以形成硫醚键的方法，或者用DTNB[5，5’-二硫基双(2-硝基苯甲酸)]来处理以形成S-S键的方法(Antibody Engineering，APractical Approach，IRL Press(1996))。
(3)Fab’的制备Fab’可通过用如二硫苏糖醇的还原剂处理上述4(2)所述的F(ab’)2来进行制备。在基因工程技术中Fab’可在多数情况下使用大肠杆菌或者使用昆虫细胞、动物细胞等来进行制备。例如，在上面3(2)、3(4)和3(5)所述的编码抗体V区的DNA被克隆至用于表达Fab’的载体中，从而制成Fab’表达载体。对于用于表达Fab’的载体，可以使用任意载体，只要Fab’的DNA可以被整合和表达。其实例包括pAK19(Bio/Technologhy，10，163-167(1992))等。Fab’表达载体被引入适当的大肠杆菌中，从而在包含体或周质中形成并积聚Fab’。从包含体中，通过通常用于蛋白质的重折叠方法可以获得活性Fab’，并且当Fab’在周质中表达时，通过例如通过溶菌酶、渗透压休克和声裂法和类似方法的部分消化处理使细胞破裂，可对活性Fab’进行细胞外回收。在重折叠之后或从破裂细胞溶液中，使用蛋白质G柱等可以纯化到均一的Fab’(Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL Press(1996))。
(3)scFv的制备通过基因工程技术，可使用噬菌体或大肠杆菌或使用昆虫细胞或动物细胞来制备scFv。例如，在上文3(2)、3(4)和3(5)所述的编码抗体V区的DNA被克隆至用于表达scFv的载体，从而制成scFv表达载体。对于用于表达scFv的载体，可以使用任意载体，只要能够插入和表达scFv的DNA。其实例包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA(HumanAntibodies & Hybridomas，5，48-56(1994))等。当scFv表达抗体被引入适当的大肠杆菌中，并且感染辅助噬菌体，可以获得以与噬菌体表面蛋白融合的形式在噬菌体表面上表达scFv的噬菌体。同样，scFv可以在被导入scFv表达载体的大肠杆菌的周质或包含体中形成并积聚。从包含体中，通过通常用于蛋白质的重折叠方法可以获得活性Fab’，并且当Fab’在周质中表达时，通过例如通过溶菌酶、渗透压休克和声裂法和类似方法的部分消化处理使细胞破裂，可以对活性Fab’进行细胞外回收。在重折叠之后或从破裂细胞溶液中，使用蛋白质G柱等可以纯化到均一的Fab’(Antibody Engineering，A Practical Approach，IRLPress(1996))。
(5)双特异抗体的制备在基因工程技术中，双特异抗体在许多情况下可以使用大肠杆菌制备或使用昆虫细胞、动物细胞等来制备。例如，制备其中通过8个或以下的氨基酸残基编码的连接子将上面3(2)、3(4)和3(5)所述的抗体的VH和VL连接在一起的DNA，并将其可克隆至用于表达双特异抗体的载体内，从而制成双特异抗体表达载体。对于用于表达双特异抗体的载体，可以使用任意载体，只要双特异抗体的DNA能够被整合和表达。其实例包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA(HumanAntibodies & Hybridomas，5，48-56(1994))等。双特异抗体可以在导入了scFv表达载体的大肠杆菌的周质或包含体中形成并积聚。从包含体中，通过通常用于蛋白质的重折叠方法可以获得活性双特异抗体，并且当双特异抗体在周质中表达时，通过例如通过溶菌酶、渗透压休克和声裂法等方法的部分消化处理使细胞破裂，可以对活性双特异抗体进行细胞外回收。在重折叠之后或从破裂细胞溶液中，使用阴离子交换色谱等柱等可以纯化到均一的双特异抗体(Antibody Engineering，APractical Approach，IRL Press(1996))。
(6)dsFv的制备在基因工程技术中，dsFv在许多情况下可以使用大肠杆菌制备或使用昆虫细胞、动物细胞等来制备。首先，将突变引入上文3(2)、3(4)和3(5)所述的编码抗体VH和VL的DNA的适当位置中，制成其中被编码的氨基酸残基被半胱氨酸取代的DNA。每一种如此制备的DNA被克隆至用于表达dsFv的载体中，从而制成VH和VL的表达载体。对于用于表达dsFv的载体，可以使用任意载体，只要dsFv的DNA能够被整合和表达。其实例包括pULI9(Protein Engineering，7，697-704(1994))等。VH和VL的表达载体被引入适当的大肠杆菌中，dsFv在包含体或周质中形成并聚集。VH和VL可以从包含体或周质中获得，混合并进行通常用于蛋白质的重折叠方法，从而获得活性dsFv。在重折叠之后，通过离子交换色谱、凝胶过滤法等进行进一步纯化(Protein Engineering，7，697-704(1994))。
(7)包括CDR的肽的制备包括CDR的肽可以通过化学合成法，如Fmoc法或tBoc法来制备。而且，制备编码包括CDR的肽的DNA，并将所得的DNA克隆至适当的载体中以进行表达，从而制成包括CDR的肽的表达载体。对于用于表达的载体，可以使用任意载体，只要编码包括CDR的肽的DNA可以被插入和表达。其实例包括pLEX(Invitrogen制造)、pAX4a+(Invitrogen制造)等。该表达载体被引入适当的大肠杆菌中，并在包含体或周质中形成并积聚。包括CDR的肽可以从包含体或周质中获得，并通过离子交换色谱、凝胶过滤法等进行纯化(ProteinEngineering，7，697-704(1994))。
(8)抗体片段和抗原的结合活性的评价抗体片段和抗原的结合活性的评价使用上文1(7)所述的ELISA来进行。
5.本发明的治疗药物用于本发明的治疗子宫内膜异位症的药物可以为任意药剂，只要其包括IL-5拮抗剂作为活性成分，但通常优选将其与一种或多种药学可接受的载体混合，根据制药学领域内已知的任意方法制成药物制剂的形式。优选，使用将其溶解在如水的水性载体中，或盐、甘氨酸、葡萄糖或人白蛋白的水溶液中制成的无菌溶液。还可以添加药学可接受的添加剂，如缓冲剂或等渗剂，使制剂溶液更加类似于生理条件，其实例包括乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、柠檬酸钠等。也可通过冷冻干燥来进行保存，并且在实际使用中，可以将其溶解在适当的溶剂中来使用。
对于本发明的治疗药物的给药途径，优选采用治疗的最有效的途径。其实例包括口服给药和胃肠外给药，如经口、气管支气管、直肠内、皮下、肌内内和静脉内，其中，优选静脉内给药。
适于口服给药的制剂的实例包括乳剂、糖浆剂、胶囊、片剂、稀释粉末、颗粒等。液体制剂如乳剂和糖浆剂可以使用水，糖类如蔗糖、山梨醇和果糖，乙二醇类如聚乙二醇和丙二醇，油类如芝麻油、橄榄油和大豆油，防腐剂如p-羟基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和薄荷香料等作为添加剂。胶囊、片剂、稀释粉末、颗粒等可以使用以下物质来制备，赋形剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇，崩解剂如淀粉和海藻酸钠，润滑剂如硬脂酸镁和滑石、粘合剂如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶，表面活性剂如脂肪酸酯，增塑剂如甘油，作为添加剂。
适于胃肠外给药的制剂的实例包括注射剂、栓剂、气雾剂等。例如，注射剂使用包括盐溶液、葡萄糖溶液或其两者的混合物等的载体来制备。栓剂使用载体如可可脂、氢化脂或羧酸来制备。气雾剂使用这样的拮抗剂来制备，或者使用例如不会刺激要给药的人体的口腔和气管粘膜，并且将拮抗剂分散成为微细颗粒使其很容易被吸收的载体来进行制备。载体的具体实例包括乳糖、甘油等。根据拮抗剂和使用的载体的性质，可以制备气雾剂、干粉等。此外，甚至在胃肠外制剂中，可以添加在口服制剂中作为添加剂所举例的成分。
本发明的治疗药物的给药剂量或次数根据所需的治疗效果、给药方法、治疗周期、年龄、体重等进行变化，通常成人每天10μg/kg至10mg/kg/。
下面用实施例来描述本发明。
实施例1抗-IL-5受体抗体和抗-IL-5抗体对大鼠子宫内膜异位症自体移植模型的抑制活性对于抗-IL-5受体抗体和抗-IL-5抗体对大鼠子宫内膜异位症自体移植模型的抑制活性，进行下列的试验。
关于此方法，对已知的方法[Fertility and Sterility，44，684-694(1985)]进行改进并使用。
购买不小于8周龄的雌性SD大鼠(Nippon Charles River)，这些大鼠被认为处于性成熟期，每天用大鼠阴道阻抗检测器测定它们的性周期(Muromachi Kikaisha制造的MK-10B)。在观察了两次或者更多次的性周期为4到5天的大鼠中，选择那些处于发情前期的大鼠进行如下所述的子宫内膜组织自体移植。
在静脉给予大鼠试验药物之后，大鼠腹腔内给予戊巴比妥(TakedaSchering Plough Animal Health制造的Somnopentyl)全麻，腹部剃毛并沿中线切开约6cm。在子宫的两角中，将距右侧子宫根部约1cm的上方区域以及距卵巢约2cm的下方区域结扎，切开位于两者之间的子宫。切开的子宫(管状)纵向打开，用含有青霉素-链霉素(Invitrogen制造)的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(Invitrogen制造)冲洗，露出一片粘膜。从该片上，制备约2mm见方的子宫内膜片。将这样制成的子宫内膜片用带有无菌缝线的缝合针(外科手术用的稍微弯曲的12号针-6-0号黑尼龙线，Natsume Seisakusho制造)自体移植到右侧和左侧腹膜。在那段时间，进行自体移植使子宫内膜表面与腹膜接触。作为对照，同时从同一大鼠上切下与子宫内膜片同样大小的脂肪组织自体移植到腹膜。最后，移植的部位和子宫切除的部位用含有小奴霉素(Sagamicin注射剂，Kyowa Hakko Kogyo制造)的生理盐水冲洗，并立即将腹膜和皮肤用带有无菌缝线的缝合针小心缝合。
在自体移植1周后，乙醚麻醉下放血处死大鼠，打开腹腔，肉眼评估子宫内膜病变(测量移植片的大小)。对于移植片的大小，使用模具千分卡尺(die micrometer caliper)(最小刻度0.5mm)测量纵向和横向的直径。5只大鼠组成一组进行试验。如果需要，根据常规的方法制作移植部位的病理标本并进行组织病理学分析。
作为试验药物，使用1mg/kg的抗鼠IL-5受体抗体和抗鼠IL-5抗体(International Immunology，3(2)，135-9(1991))，同时使用1mg/kg的大鼠IgG抗体(ICN制造)作为对照抗体。所有抗体都用无菌磷酸盐缓冲液(ICN制造)稀释后使用。
移植片的大小的结果列于表1中。对于移植片的大小，使用纵向直接与横向直接相乘计算而得到的值，并显示了右侧和左侧移植片的平均大小。
如表1所示，通过给予抗-IL-5抗体和抗-IL-5受体抗体，移植1周后增加的移植片的大小被减小了(抑制率抗-IL-5抗体14％，抗-IL-5受体抗体15％)。
表1
实施例2抗-IL-5抗体对大鼠子宫内膜异位症自体移植模型中粘连的抑制活性。
为了证实抗-IL-5受体抗体抑制子宫内膜粘连，使用大鼠子宫内膜异位症自体移植模型进行下列试验。根据实施例1中的方法进行实验。
购买不小于8周龄的雌性SD大鼠(Nippon Charles River制造)，这些大鼠通常被认为处于性成熟期，每天用大鼠阴道阻抗测试器(Muromachi Kikaisha制造的MK-10B)测定它们的性周期。在观察了两次或者更多次的性周期为4到5天的大鼠中，选择那些处于发情前期的大鼠进行如下所述的子宫内膜组织自体移植。
在静脉给予大鼠试验药物之后，大鼠腹腔内给予戊巴比妥(TakedaSchering Plough Animal Health制造的SomNOpentyl)全麻，腹部剃毛并沿中线切开约6cm。在子宫的两角中，将距右侧子宫根部约1cm的上方区域以及距卵巢约2cm的下方区域结扎，切开位于两者之间的子宫。切开的子宫(管状)纵向打开，用含有青霉素-链霉素(Invitrogen制造)的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(Invitrogen制造)冲洗，露出一片粘膜。从该片粘膜上，制备约2mm见方的子宫内膜片。将这样制成的子宫内膜片用带有无菌缝线的缝合针(外科手术用的稍微弯曲的12号针-6-0号黑尼龙线，Natsume Seisakusho制造)自体移植到右侧和左侧腹膜。在那段时间，进行自体移植使子宫内膜表面与腹膜接触。作为对照，同时从同一大鼠上切下与子宫内膜片同样大小的脂肪组织自体移植到腹膜。最后，移植的部位和子宫切除的部位用含有小奴霉素(Sagamicin注射剂，Kyowa Hakko Kogyo制造)的生理盐水冲洗，并立即将腹膜和皮肤用带有无菌缝线的缝合针小心缝合。
在自体移植1周后，乙醚麻醉下放血处死大鼠，打开腹腔，肉眼评估子宫内膜病变(粘连分数)。根据下列标准对病变进行评分。
没有观察到粘连；0分观察到粘连，但很轻微；1分尽管观察到明显的粘连，但它是表皮脱落样的；2分有明显粘连并且不是表皮脱落样的；3分由5只大鼠组成一组进行试验。如果需要，根据常规的方法制作移植部位的病理标本并进行组织病理学分析。
作为试验药物，使用抗鼠IL-5受体抗体(International ImmuNOlogy，3(2)，135-9(1991))，同时使用大鼠IgG抗体(ICN制造)作为对照抗体。所有抗体都用无菌磷酸盐缓冲液(ICN制造)稀释后使用。
病变部位的粘连分数的结果列于表2。对于粘连分数，以点值表示，并显示了右侧和左侧移植片的平均粘连分数。
表2
如表2所示，在大鼠子宫内膜异位症自体移植模型上，在临床上患子宫内膜异位症的患者的病变部位中所观察到的粘连可以清楚地观察到。与这样的粘连分数相反，给予抗-IL-5受体抗体的组中有抑制的趋势(抑制率29％)。另外，当移植脂肪组织作为对照时，几乎观察不到粘连。
实施例3抗小鼠IL-5受体抗体对小鼠子宫内膜异位症模型中子宫内膜病变形成的抑制活性为了检测抗-IL-5受体抗体对子宫内膜异位症的作用，进行了下列实验。
对于此方法，对已知的方法[Human Reproduction，14，2944-2950(1999)]进行改进并使用。
购买不小于8周的雌性Balb/c小鼠(Nippon Charles River)用于本实验，这些小鼠被认为处于性成熟期。在购买后适应1周后，将所有小鼠的右侧和左侧卵巢切除使得性激素水平一致，然后给予外源性的雌激素。腹腔内给予50mg戊巴比妥(Takeda Schering Plough Animal Health制造的Somnopentyl)全麻，沿中线切开小鼠背部皮肤约1cm并在右侧和左侧卵巢位置的腹膜上作切口(约3mm)。当从切口切除两侧卵巢之后，背部皮肤迅速缝合并放回饲养笼内。之后，将100μg/kg的雌激素(ProgyNOnDepot 10mg，Nippon Schering制造，戊酸雌二醇酯注射液)注入左后爪肌肉内。如此处理的结果是，证实子宫膨大到其重量几乎与发情前期小鼠子宫的重量相同，发情前期是小鼠性周期中的高歌高雌激素周期，每天每4个小时就可观察到。
然后，在卵巢切除1周后，将所有小鼠分为供体小鼠和受体小鼠，构成比为1∶2，将通过切除供体小鼠的子宫制备的子宫内膜片接种到受体小鼠的腹腔中。从而，从放血处死的供体小鼠切下的右侧和左侧子宫上去除周围的脂肪组织和子宫颈，用外科手术小剪刀细心切下含有子宫内膜的子宫体制成片。将子宫内膜片悬浮在含有抗生素的无菌的HBSS(Hank’s平衡盐溶液，Sigma制造)中并将所有供体小鼠的子宫内膜片集中在一起。将受体小鼠用带有19G注射针头的注射器(Thermo制造)以40mg/kg戊巴比妥全麻，将子宫内膜片悬浮液(0.8mL；相当于约50mg子宫内膜片)经腹腔内给予受体小鼠进行接种。向注射器内注入子宫内膜片悬浮液，通过充分地搅拌悬浮液使液体不会变得不均匀而进行给药。然后，将100μg/kg的雌激素和作为雌激素溶剂的芝麻油通过肌肉给药，每周一次分别给予阳性对照组和药物评价组以及阴性对照组。
在接种子宫内膜片3周后，放血处死大鼠，打开腹腔，肉眼评估子宫内膜病变(测量成形的囊肿的大小)。对于病变的大小，使用模具千分卡尺(最小刻度0.5mm)测量纵向和横向的直径，通过横径乘以纵径计算得到的面积进行评估。当大量病变形成时，它们的总和当作总面积，由10只小鼠组成一组进行试验。如果需要，根据常规的方法制作移植部位的病理标本并进行组织病理学分析。
作为试验药物，使用抗小鼠IL-5受体抗体(InternationalImmunology，3(2)，135-9(1991)；10mg/kg，每周给药1次)。在阳性对照组，大鼠IgG抗体(ICN制造；10mg/kg，每周给药1次)作为对照抗体。所有抗体都用无菌的生理盐水溶液(Otsuka Pharmaceutical制造)稀释后使用。
病变大小的结果如图1所示。
在子宫内膜片接种三周后，在阳性对照组中病变发生率为100％，但在阴性对照组，仅在一个小鼠上出现。所有成形的病变为沿着子宫内膜上皮细胞排列的囊肿，并通过组织病理学证实为子宫内膜病变。因此，本实验模型被认为是可使用的模型，能反映以雌激素依赖方式生长的子宫内膜炎。
在本模型中，抗小鼠IL-5受体抗体与如图1所示阳性对照组相比表现出显著的抑制活性。另外，当同样重量的小肠粘膜片代替子宫内膜片接种时，即使给予雌激素也根本形成不了病变。
实施例4抗小鼠IL-5受体抗体对小鼠子宫内膜异位症模型中子宫内膜病变形成的抑制活性根据实施例3的方法测定抗-IL-5受体抗体对子宫内膜异位症的效应。
实验方法与实施例3中的相同，除了用抗小鼠IL-5抗体(International Immunology，3(2)，135-9(1991)；1和10mg/kg，每周给药1次)作为试验药物来替换抗小鼠IL-5受体抗体。
病变大小的结果如图2所示。
与阳性对照组相比，给予10mg/kg的组中抗小鼠IL-5抗体显示出了明显的抑制活性。
工业应用性本发明提供了一种包括白细胞介素-5拮抗剂作为活性成分的治疗子宫内膜异位症的药物。
序列列表的自由正文SEQ ID NO9-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO10-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO11-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO12-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO13-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO14-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO15-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO16-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列SEQ ID NO17-用于说明合成序列抗体重链可变区域氨基酸序列序列表<110>协和发酵工业株式会社<120>治疗子宫内膜异位症的药物<130>1726<150>JP2004-314031<151>2004-10-28<150>JP2005-169027<151>2005-06-09<160>29<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>蛋白质<213>小家鼠<400>1Ser Tyr Val Ile His1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>2Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys1 5 10 15Gly<210>3<211>12<212>蛋白质<213>小家鼠<400>3Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr1 5 10<210>4<211>11<212>蛋白质<213>小家鼠<400>4Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr Leu Asn1 5 10<210>5<211>7<212>蛋白质<213>小家鼠<400>5His Thr Ser Arg Leu Gln Ser1 5<210>6<211>9<212>蛋白质
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1.一种治疗子宫内膜异位症的药物，其特征在于所述的药物包括白细胞介素-5拮抗剂作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于其中所述的白细胞介素-5拮抗剂是抑制白细胞介素-5与白细胞介素-5受体结合的抗体或其抗体片段。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于其中所述的抑制白细胞介素-5与白细胞介素-5受体结合的抗体是与白细胞介素-5结合的抗体。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于其中所述的白细胞介素-5是人白细胞介素-5。
5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于其中所述的抑制白细胞介素-5与白细胞介素-5受体结合的抗体是与白细胞介素-5受体结合的抗体。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于其中所述的白细胞介素-5受体是白细胞介素-5受体α链。
7.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于其中所述的白细胞介素-5受体是人白细胞介素-5受体。
8.根据权利要求2到7任意一项所述的药物，其特征在于其中所述的抗体是单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于其中所述的单克隆抗体是基因重组抗体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于其中所述的基因重组抗体是选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的基因重组抗体。
11.根据权利要求2到10任意一项所述的药物，其特征在于其中所述的抗体片段是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚可变区(双特异抗体)、二硫化物稳定可变区(dsFv)以及包括CDR的肽的抗体片段。
12.根据权利要求1到11任意一项所述的白细胞介素-5拮抗剂在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用。
13.一种治疗子宫内膜异位症的方法，其特征在于所述的方法包括给予权利要求1到11任意一项所述的白细胞介素-5拮抗剂。
全文摘要
本发明提供了一种包括白细胞介素－5拮抗剂作为活性成分的用于治疗子宫内膜异位症的药物。
文档编号A61P15/08GK101090734SQ20058004120
公开日2007年12月19日 申请日期2005年10月28日 优先权日2004年10月28日
发明者大岛悦男, 川崎博和, 木本直哉, 渡边昭彦 申请人:协和发酵工业株式会社