专利名称：一种建立人结外鼻型nk/t细胞淋巴瘤动物模型的方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型的方法。
背景技术：
人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(human extranodal nasal-type NK/T celllymphoma)是一种具有独特形态学、免疫表型和生物学行为的肿瘤，多发生于结外器官或组织，与Epstein-Barr病毒(EBV)感染高度相关，但EBV是该淋巴瘤的致病因素还是伴随现象，迄今无明确定论。该肿瘤在亚洲尤其在中国发病率较高，西欧和北美地区少见。过去21年中在四川大学华西医院病理科就诊的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤共有1012例，占所有淋巴瘤的13.83％。该类淋巴瘤为侵袭性肿瘤，病情进展迅速，五年生存率仅为17％左右。
因该肿瘤多发生于中线面部，局部活检组织多较小，除做病理诊断和免疫表型检测外所剩无几，故实验材料的匮乏是制约对该肿瘤深入研究和治疗以及进行药物筛选的主要障碍。迄今为止，仅有少数几个由日本学者建立的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤细胞系，如HANK1(Kagami等，1998)、NK-YS(Tsuchiyama等，1998)、SNK-6和SNT-8(Nagata等，2001)。由于肿瘤细胞在体外培养，离开了体内环境，经过长期传代培养，消除了体内细胞与细胞之间的相互作用，不能完整模拟结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的生物学行为和自然生长过程，也会导致肿瘤细胞生物学特性和遗传学特征的改变，进而影响了实验结果的准确性和结论的可靠性。
文献《人鼻型NK/T细胞淋巴瘤的裸鼠移植与传代》(中华病理学杂志2004年4月)中公开了一种人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的建立方法，但是该方法偏重于应用一般肿瘤动物模型建立的普适性方法，而没有对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的特点进行有针对性的优化，如双抗的浓度选择、传代周期的选择、冻存细胞复苏传代时细胞浓度的选择以及基因序列标签位点的选择等，因此还存在着移植困难、容易污染、传代周期不稳定(最多只能传代至第9代)，不易准确鉴定是否建模成功等不足之处，而且该方法建立的肿瘤模型中尚未发现肿瘤晚期肺、肾等脏器的转移情况，也未观察到脑转移等情况。同时，该方法中未涉及移植瘤的种属鉴定方面的内容，尚不能准确地确认建模成功，使该动物模型还不能直接用于肿瘤的基因治疗和药物筛选等方面的研究或使其使用还受到限制。
因此，当前本领域急需一种能克服现有技术缺点的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法。
发明内容
本发明提供了一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型的方法。该方法包括以下步骤a、接种选取新鲜无坏死肿瘤组织块，立即置入加有青、链霉素的1640培养基中，并将组织在无菌条件下剪成约1mm3大小组织块，接种至处于麻醉状态的裸鼠体内，所述青、链霉素的浓度分别为100～1000u/ml和100～1000ug/ml；b、传代首次移植后，于第25～28周后按步骤a方法取移植瘤组织进行接种传代，第2、3代传代时间为92～98天，第4～10代传代时间为28～32天，传至第10～15代后将传代周期改为18～22天；c、鉴定。
其中，完成步骤a的时间不超过30分钟，所采用的裸鼠都是鼠龄为3～4周的裸鼠。
步骤c中所述的鉴定方法是用PCR技术检测移植瘤中是否有人类特异性的基因序列标签位点(Sequence Tagged Sites，STS)存在。
优选的，当供瘤个体为男性人类时，所述的基因序列标签位点为人类男性性别决定基因序列标签位点SY14。
本发明方法步骤c中所述的鉴定方法还可以是用各代移植瘤的冻存细胞和冻存组织块进行复苏传代，复苏传代方法包括以下步骤1)、将冻存的肿瘤细胞或冻存组织块进行水浴解冻；2)、用加有青、链霉素的1640培养基洗涤，所述青、链霉素的浓度分别为100～1000u/ml和100～1000ug/ml；3)、取0.5ml～1.0ml细胞混悬液或0.5～0.8cm3的组织块接种于处于麻醉状态的裸鼠体内。
步骤1)所述的水浴解冻的条件为37～41℃，30秒钟以内；细胞混悬液的细胞浓度为107～108/ml。
由于对人类实体瘤组织进行染色体核型分析的困难性，为了能快速准确的确认模型是否建立成功，本发明方法的鉴定步骤中采用了用PCR技术检测移植瘤中是否有与人类特异性的基因序列标签位点(Sequence Tagged Sites，STS)一致的核苷酸序列存在的方法。该方法操作简便、费用低廉，且结果准确。另外，当建模的肿瘤供体为男性人类时，与小鼠没有同源性的人类男性性别决定基因序列标签位点(Sequence Tagged Sites，STS)SY14则是一种很好的标记物，能快速准确地确认模型建立。另外，该方法还能对不同组织进行检测，以快速准确地跟踪移植瘤的转移扩散情况。同时，本发明方法的鉴定步骤中还包括了对各代移植瘤的冻存细胞和冻存组织块进行复苏传代的方法，该方法能进一步验证动物模型建立成功及稳定传代，同时本发明复苏传代方法还能应用于细胞培养及细胞系的建立等方面。本发明方法中对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤裸鼠动物模型的冻存肿瘤细胞和冻存组织块复苏传代的操作进行了优化，使人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的冻存细胞的复苏传代成功率达到了100％，经典方法一般使用的细胞浓度为106/ml，其复苏成功率一般为50～100％，解决了现有技术复苏传代成功率低的难题。
本发明的有益效果在于建立了人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，它克服了目前人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型建立过程中的种种难题，建立起了能稳定传代的人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型株系(至少可传至35代)，传代时间短(20天)，且每代的一次接种成功率达100％，鉴定结果迅速准确，远优于现有技术。经实验证明，使用本发明方法所建立的裸鼠移植瘤模型再现了人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的重要生物学特征，从病理形态学、免疫表型、EBV感染情况、分子生物学特征以及分子遗传学等方面均与供体病例基本一致，生长周期稳定。不仅解决了该肿瘤研究材料匮乏的问题，同时由于模拟了该肿瘤在人体内的生长情况，对该肿瘤发病的分子机制和肿瘤的演进的研究、治疗手段的探索、治疗药物的筛选及评价都有重要的实用价值，具有很好的应用前景。
图1人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型供体原发瘤形态学及免疫表型观察结果。其中1A为形态学；1B为CD3ε；1C为CD8；1D为CD56；1E为粒酶B；1F为EBER1/2-ISH。
图2人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型供体继发瘤形态学及免疫表型观察。其中2A为形态学；2B为CD3ε；2C为CD56；2D为粒酶B；2E为EBER1/2-ISH；2F为LMP1。
图3人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型移植瘤，示原代至第30代动物模型。其中3A为F1代；3B为F4代；3C为F5代；3D为F10代；3E为F11代；3F为F12代；3G为F15代；3H为F20代；3I为F20代复苏；3J为F25代；3K为F27代；3L为F30代。
图中各箭头均指向移植瘤，第4、5和27代可见前肢腋窝淋巴结肿大，第11、12和25代可见局部皮肤溃破。
图4 SY14的PCR扩增检测结果。其中M为标准分子量；P为男性人类正常组织样本；C为人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织样本；1、5、10、15、20、30分别为第1、5、10、15、20、30代模型的移植瘤组织样本；Mm为正常小鼠组织样本；B为空白对照。
图5SNK-6的FISH检测结果。
图6移植瘤的FISH检测结果。
图7FCM检测移植瘤HLA-ABC结果。其中纵坐标轴(PMT2LOG)表示对照荧光强度，反映细胞总数；横坐标轴(PMT3LOG)表示HLB-ABC荧光强度；反映HLA-ABC阳性细胞总数。
图8人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型移植瘤形态学及免疫表型。其中8A为形态学；8B为CD3ε；8C为CD56；8D为粒酶B；8E为TIA-1；8F为EBER1/2-ISH；8D为LMP1。
图9人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型移植瘤扩散情况。其中9A为肝；9B为淋巴结；9C为脾；9D为肾；9E为肺；9F为外周血。
图10用TVG/JJX特异引物PCR扩增检测的结果。其中M为标准分子量；P为人类正常组织样本；1、5、10、15、20、30分别为第1、5、10、15、20、30代模型的移植瘤组织样本；B为空白对照。
图11用VH/JH特异引物PCR扩增检测的结果。其中M为标准分子量；P为人类正常组织样本；1、5、10、15、20、30分别为第1、5、10、15、20、30代模型的移植瘤组织样本；B为空白对照。
以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
具体实施例方式
实施例一用本发明方法建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型1、人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织样本的采集和鉴定收集四川大学华西医院手术病例中人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤1例。经病理形态学检查、免疫表型及EBER原位杂交技术检测，确诊为人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤。患者接受了放射治疗和化学药物治疗(CHOP)，2个疗程后，局部病变消失，达到临床缓解。患者后因发热、胃部不适再次就诊，确诊为胃继发性结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤。由于进行性加重的幽门梗阻，患者接受手术治疗。手术同时选取切除的胃肿瘤组织种植于裸鼠皮下，见图1～2。
2、实验动物BALB/c(nu/nu)裸鼠，鼠龄为3～4周，体重15～20克，雄雌兼用，饲养在SPF屏障系统内，由四川大学华西动物中心提供。
3、肿瘤组织移植患者手术同时选取切除的胃肿瘤组织，将新鲜、质嫩的活体肿瘤组织立即置入Hank’s液中清洗，然后放入加有青、链霉素(其浓度分别为100～1000u/ml和100～1000ug/ml)的PRMI 1640培养液中，并将组织在无菌条件下剪成约1mm×1mm×1mm大小组织块，用0.6％戊巴比妥钠腹腔注射使裸鼠处于麻醉状态，然后迅速将肿瘤组织接种至裸鼠前肢腋窝皮下。
4、移植瘤观察及首次鼠间传代接种后逐日观察裸鼠全身情况，移植部位有无感染，移植瘤有无生长或自然消退，移植部位皮肤有无溃破以及淋巴结有无肿大等。发现移植瘤开始生长后，每周测量肿瘤的大小。
当移植瘤的直径超过1cm时行鼠间传代在0.6％的戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉下，手术取肿瘤，剪成约1mm×1mm×1mm组织块，种植于全麻状态下的裸鼠(鼠龄3～4周)前肢腋窝皮下，同样观察该传代荷瘤裸鼠全身情况，移植部位有无感染，移植瘤有无生长或自然消退，移植部位皮肤有无溃破以及淋巴结有无肿大等。每周测量肿瘤的大小。
5、移植瘤观察及鼠间传代原代移植瘤潜伏期长达12周，三个月后肿瘤开始生长，经过10周的缓慢生长期后，肿瘤逐渐长至1.38×1.0×1.1cm3，第28周传代。第2、3代传代时间为92～98天，第4代后生长周期逐渐缩短并稳定，第4～10代传代时间为28～32天，第10代后，约20天周左右进行传代，现移植瘤已稳定传至第35代(见图3)。
6、接种结果一次接种成功率第32代接种10只，成功率100％。
实施例二人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤冻存细胞复苏传代实验取实施例一建立的动物模型的第5代、6代、8代、10代、16代、18代、20代、25代和30代的冻存肿瘤细胞。分别将上述冻存细胞在37～41℃水浴中迅速解冻(30秒钟内)，然后在超净工作台内用加有青、链霉素的1640培养基洗涤细胞2～3次，然后调整细胞浓度至107-8/ml，取0.5ml～1.0ml接种于鼠龄为3～4周的健康裸鼠前肢腋窝皮下。注意要在30分钟内完成传代操作。
结果可见，复苏成功率为100％，复苏裸鼠移植瘤与原来源肿瘤生长周期及荷瘤情况相似(见图3)。而经典方法一般使用的细胞浓度为106/ml，其复苏成功率一般为50～100％。
实施例三人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型的鉴定(一)鉴定项目1动物模型移植瘤种属鉴定1.1人源基因鉴定因人与鼠基因组高度同源，而动物模型移植瘤肿瘤组织来源于男性病人。查询基因库结果发现人类男性性别决定基因序列标签位点(Sequence Tagged Sites，STS)SY14与小鼠没有同源性。故用PCR技术检测移植瘤中有无SY14基因，如证明动物模型移植瘤中人源基因SY14的存在，则确认模型建立成功。
1.2荧光原位杂交(FISH)技术检测人Y染色体本研究采用的探针为Spectrum Orange荧光素直接标记的JAB-Y(DYZ1)(Yq12 SatelliteIII)DNA探针(中美合作上海集爱遗传与不育诊疗中心提供)。探针的杂交位点为Y染色体着丝粒，标记为红色。以SNK-6(人结外NK/T细胞淋巴瘤细胞株，来源于男性)为阳性对照，以ddH2O代替探针混合液作空白对照。采用OLYMPUSMICROSCOPE-AX80荧光显微镜观察结果，激发光为蓝色和红色。通过计算机分别采集激发光为蓝色和红色时同一视野下的荧光信号，再经计算机自动合成，就可同时在一个视野内见到红色和蓝色荧光信号。在雌性裸鼠移植瘤肿瘤细胞中见到红色荧光信号即可证明动物模型移植瘤中有人Y染色体。
1.3流式细胞术(flow cytometer，FCM)检测人类白细胞分化抗原(HLA-ABC)按常规方法进行。
2病理形态学观察及免疫表型检测免疫组织化学染色采用SP(streptavidin-biotin immunoperoxidase)法。所用第一抗体名称、克隆号、来源及特异性见表1。
同时用荧光素标记的抗体CD45RO、CD5、CD1a、CD7、CD117、CD34进行流式细胞术检测。
表1免疫表型检测所用抗体及其特异性一览表
*为多克隆抗体3动物模型移植瘤EB病毒检测3.1EB病毒原位杂交技术检测方法一用FITC标记的EBER1/2寡核苷酸探针在石蜡切片上作原位杂交，桥接碱性磷酸酶标记的抗FITC抗体，以NBT/BCIP为碱性磷酸酶底物检测杂交信号。以已知EBER1/2阳性的鼻NK/T细胞淋巴瘤石蜡包埋组织切片为阳性对照片，DEPC水替代含探针的杂交液为空白对照。
方法二用地高辛标记的EBER1/2寡核苷酸探针在石蜡切片上作原位杂交，以鼠抗地高辛抗体为一抗，用SP法，DAB显色检测杂交信号。对照设立同方法一。
原位杂交信号定位于细胞核。采用方法一时，阳性杂交信号为紫蓝色；采用方法二时，阳性杂交信号为棕黄色。
3.2 EB病毒潜伏膜蛋白LMP1表达LMP1单克隆抗体为DAKO公司产品(DAKO-M0897，克隆号为CS1-4)。采用SP法，LMP1阳性信号位于细胞膜和胞浆。
4动物模型移植瘤分子生物学特征检测4.1 T细胞受体(TCR)γ基因重排分析采用TVG/JJX引物(TVG引物5′-AGGGTTGTGTTGGAATCAGG-3′，见SEQ ID No.4；JJX引物5′-CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC-3′，见SEQID No.5)进行PCR，检测TCRγ基因重排。
4.2免疫球蛋白重链(IgH)基因重排分析采用VH/JH引物(VH引物5′-CTGTCGACACGGCCGTGTA TTACTG-3′，见SEQ ID No.6；JH引物5′-AACTGCAGAGGAGACGGTGACC-3′，见SEQ ID No.7)进行PCR，检测IgH基因重排。
(二)实验结果1裸鼠移植瘤种族鉴定1.1人源基因鉴定用人类序列标签位点SY14的特异性引物上游引物5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG-3′(SEQ ID No.2)；下游引物5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′(SEQ ID No.3)；以男性淋巴结反应性增生病例为阳性对照(P)，雄性裸鼠正常组织做阴性对照，ddH2O代替模板DNA(B)为空白对照，对供体组织(C)及第1、5、10、15、20和30代裸鼠移植瘤DNA进行PCR扩增，出现了特异性条带(扩增产物片段大小为472～500bp)。
DNA测序结果与人类序列标签位点SY14序列(SEQ ID No.1)一致(见表2，Query表示要求比较的序列，Sbjct表示基因库中已知序列)，说明移植瘤中存在人源基因(琼脂糖凝胶电泳结果见图4)。
表2 SY14PCR产物测序与基因库序列比较结果Query 2AGCTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTAACTCTAAGTATCAGTGTGAAACGGGAGAA 61||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 104 AGCTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTAACTCTAAGTATCAGTGTGAAACGGGAGAA 163Query 62 AACAGTAAAGGCAACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCATGAACGCATTCATCGTGTGG 121||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 164 AACAGTAAAGGCAACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCATGAACGCATTCATCGTGTGG 223Query 122 TCTCGCGATCAGAGGCGCAAGATGGCTCTAGAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAGAGATC 181||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 224 TCTCGCGATCAGAGGCGCAAGATGGCTCTAGAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAGAGATC 283Query 182 AGCAAGCAGCTGGGATACCAGTGGAAAATGCTTACTGAAGCCGAAAAATGGCCATTCTTC 241||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 284 AGCAAGCAGCTGGGATACCAGTGGAAAATGCTTACTGAAGCCGAAAAATGGCCATTCTTC 343Query 242 CAGGAGGCACAGAAATTACAGGCCATGCACAGAGAGAAATACCCGAATTATAAGTATCGA 301||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 344 CAGGAGGCACAGAAATTACAGGCCATGCACAGAGAGAAATACCCGAATTATAAGTATCGA 403Query 302 CCTCGTCGGAAGGCGAAGATGCTGCCGAAGAATTGCAGTTTGCTTCCCGCAGATCCCGCT 361||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 404 CCTCGTCGGAAGGCGAAGATGCTGCCGAAGAATTGCAGTTTGCTTCCCGCAGATCCCGCT 463Query 362 TCGGTACTCTGCAGCGAAGTGCAACTGGACAACAGGTTGTACAGGGATGACTGTACGAAA 421|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 464 TCGGTACTCTGCAGCGAAGTGCAACTGGACAACAGGTTGTACAGGGATGACTGTACGAAA 523Query 422 GCCACACACTCAAGAATGGAGCACCAGC 449||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 524 GCCACACACTCAAGAATGGAGCACCAGC 5511.2荧光原位杂交(FISH)技术检测人Y染色体空白对照无任何杂交荧光信号；阳性对照SNK-6细胞株肿瘤细胞中可见红色荧光(见图5)；人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的裸鼠移植瘤肿瘤细胞中也可见红色荧光，提示裸鼠移植瘤确实来源于人(见图6)。
1.3流式细胞术检测人类白细胞分化抗原(HLA-ABC)结果HLA-ABC阳性细胞数占1.3％，可认为HLA-ABC(+)(见图7)。
2动物模型病理形态学观察、免疫表型及EB病毒检测结果2.1大体病理学表现裸鼠移植瘤生长于移植部位皮下，在皮下形成包块，椭圆形或不规则形，边界欠清，灰白色，切面灰白灰红色、质嫩，呈鱼肉状。第11、12和25代有局部皮肤溃破，第4、5和27代可见前肢腋窝淋巴结肿大。与正常裸鼠比较，荷瘤裸鼠肝脏长大不明显，所有荷瘤裸鼠均伴有脾脏体积长大，而肺、肾和脑肉眼未见明显异常(见图3)。
2.2组织病理学改变与供体鼻原发瘤、胃继发瘤标本的镜下改变基本一致，即在不同程度凝固性坏死和炎症细胞浸润的背景上，肿瘤细胞弥漫分布，间质少，细胞中等大小～中等偏大，圆形或椭圆形，胞浆少，淡染或略嗜酸，细胞核大，呈圆形、卵圆形或不规则形，核染色质呈斑块状均匀分布，部分细胞可见有1～2个嗜碱性核仁，核分裂象3～10个/HPF，可见病理性核分裂(见图8)。可见肿瘤细胞浸润血管现象。肿瘤累及周围软组织及皮肤，导致皮肤溃疡形成。可见肿瘤细胞侵犯神经现象。
晚期，荷瘤鼠发生肿瘤的全身扩散，裸鼠外周血、肝、脾、淋巴结、肾和肺内均可见肿瘤细胞浸润(见图9)。除第28代以外，其余荷瘤鼠肝脏均受累及，主要表现为汇管区肿瘤细胞浸润，肝窦内也可见一些肿瘤细胞浸润。第4～7、10、11、15、20～21代，以及第25～27代荷瘤鼠的淋巴结内有肿瘤细胞浸润，约占40％，主要表现为淋巴结结构不同程度的破坏，多形性的中等偏大的肿瘤细胞成片浸润。100％荷瘤鼠有不同程度的脾脏受累，肿瘤细胞主要在白髓区浸润，同时在红髓区也可见到不等量肿瘤细胞浸润。第14～25、27和29代荷瘤鼠(共13代)有肾脏累及，约占81％，主要表现为肿瘤细胞在肾脏间质和肾周脂肪组织内呈灶性浸润。第14、15、17～25代和第27代荷瘤鼠(共12代)有肺病变，约占86％，主要表现为肺间质内小结节状病灶，与周围组织分界尚清，有的小血管内可见肿瘤细胞存在。对12代荷瘤鼠脑组织形态学观察结果发现所有荷瘤鼠脑组织均未见肿瘤细胞浸润。
2.3免疫组织化学染色结果来源病例和裸鼠移植瘤肿瘤细胞免疫表型及EB病毒检测结果见表3。
表3供体病例和动物模型肿瘤组织免疫表型及EB病毒检测结果
注+阳性-阴性±可疑ND未做由表3见原位移植瘤及在荷鼠瘤各器官、组织中浸润之肿瘤细胞均呈CD3ε(+)、CD3(-)、CD45RO(+)、CD7(-)、CD8(+)、CD56/CD57(+)、CD20(-)、粒酶B(+)和TIA-1(+)，提示与供体鼻腔原发瘤、胃转移瘤肿瘤细胞具有相同的免疫表型(图8)。
CD1a在移植瘤及累及器官之肿瘤中有少数细胞呈阳性表达，与供体病例胃转移瘤肿瘤细胞相似。CD5在移植瘤及累及器官之肿瘤细胞中有少数细胞呈阳性表达，而供体病例胃转移瘤中CD5呈阴性表达。
Ki-67在动物模型肿瘤细胞中Ki-67阳性率高，达60～90％。
2.4流式细胞术检测结果阳性标记CD5阳性细胞数占3.5％、CD1a阳性细胞数占1.4％。
阴性标记CD45RO、CD7、CD117和CD34阳性细胞数百分比分别为0、0.3、0和0.1。
2.5 EB病毒检测人结外NK/T细胞淋巴瘤动物模型EB病毒检测结果见表3。由表3见，EBER1/2原位杂交技术检测示移植瘤之肿瘤细胞呈EBER1/2(+)(结果见图8)，与供体病例的检测结果相同。LMP1免疫组织化学染色示移植瘤及累及器官之肿瘤细胞均为阳性表达，与供体病例的检测结果相同(结果见图8)。
3.T细胞受体(TCR)和免疫球蛋白重链(IgH)基因重排分析3.1 T细胞受体(TCR)基因重排分析用TVG/JJX引物，以人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat为阳性对照(P)，ddH2O代替模板DNA为空白对照(B)，对供体鼻原发瘤(1)、胃继发瘤(2～3)及裸鼠移植瘤DNA(4～8)进行PCR扩增，结果供体病例鼻原发瘤、胃继发瘤及裸鼠移植瘤均未扩增出特异性条带，即未检出TCR-γ受体基因的克隆性重排(见图10)。
3.2免疫球蛋白重链(IgH)受体基因重排分析用VH/JH引物，以人髓外浆细胞瘤为阳性对照(P)，ddH2O代替模板DNA为空白对照(B)，对供体病例鼻原发瘤(1)、胃继发瘤(2～3)及裸鼠移植瘤DNA(4～8)进行PCR扩增，结果供体病例鼻原发瘤、胃继发瘤及裸鼠移植瘤均未扩增出特异性条带，即未检出IgH受体基因的克隆性重排(见图11)。
(三)实验结果分析本发明方法建立的一株人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型，能再现人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的重要生物学特征，从病理组织学、免疫表型、EB病毒感染情况以及分子生物学特征等方面均与供体病例基本一致，具体表现如下(1)病理形态学移植瘤病变组织中见多形性中等偏大的肿瘤细胞在表皮下软组织中呈弥漫性增生和浸润，伴不同程度的凝固性坏死，并可见肿瘤细胞浸润血管现象。移植瘤与供体胃继发瘤和鼻腔原发瘤有相似的病理形态学表现，且移植瘤之肿瘤细胞更丰富，异形性更大，肿瘤间质更少。晚期，荷瘤鼠出现外周血、肝、脾、淋巴结、肾脏和肺等器官和组织的扩散，肿瘤细胞的形态亦与原位移植瘤相似。
(2)免疫表型移植瘤及累及器官之肿瘤细胞呈CD3ε(+)、CD3(-)、CD45RO(+)、CD7(-)、CD8(+)、CD56/CD57(+)、CD20(-)、粒酶B(+)和TIA-1(+)，显示与供体病例人鼻腔原发瘤、胃转移瘤肿瘤细胞有相同的免疫表型。动物模型之肿瘤细胞中Ki-67阳性率高。
(3)EBV感染采用EBER1/2原位杂交和EB病毒潜伏膜蛋白LMP1免疫组织化学染色检测移植瘤肿瘤细胞EBV感染。
(4)分子生物学特征移植瘤的TCRγ和IgH基因重排检测呈胚系构型，即未检出T细胞受体和免疫球蛋白重链基因重排。
(5)种属来源移植瘤存在人类特异性序列标签位点SY14，而小鼠基因组中不存在该序列标签位点。荧光原位杂交(FISH)技术检测发现裸鼠移植瘤肿瘤细胞中含有人类Y染色体。同时裸鼠移植瘤表达HLA-ABC，上述三种方法从不同角度证明了该移植瘤来源于人类。
由上述实施例可知，采用本发明方法建立的模型从第10～15代后生长周期稳定，传代周期为20天左右，比现有方法传代短；一次接种成功率和复苏传代成功率均为100％，高于现有方法；模型传代至少可稳定达到第35代，也优于现有技术的9代。通过种属鉴定证实了该移植瘤来源于人类，而且其病理形态学、免疫表型、EB病毒感染及分子生物学特征等均与供体病例一致。另外，这一人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型经过一系列鉴定，符合异种移植瘤动物模型建立成功的主要标准，是一株理想的人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型。本发明方法解决了现有技术移植困难、容易污染、传代周期不稳定、难于出现肿瘤晚期脏器转移、难于对模型进行鉴定等不足之处，具有很好的应用前景。
以上的较优的具体实施方式
是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。
一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型的方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>四川大学华西医院<120>一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型的方法<130>A060058<160>7<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>448<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<223>人类男性性别决定基因序列标签位点SY14<400>1agctcttcct tcctttgcac tgaaagctgt aactctaagt atcagtgtga aacgggagaa 60aacagtaaag gcaacgtcca ggatagagtg aagcgaccca tgaacgcatt catcgtgtgg120tctcgcgatc agaggcgcaa gatggctcta gagaatccca gaatgcgaaa ctcagagatc180agcaagcagc tgggatacca gtggaaaatg cttactgaag ccgaaaaatg gccattcttc240caggaggcac agaaattaca ggccatgcac agagagaaat acccgaatta taagtatcga300cctcgtcgga aggcgaagat gctgccgaag aattgcagtt tgcttcccgc agatcccgct360tcggtactct gcagcgaagt gcaactggac aacaggttgt acagggatga ctgtacgaaa420gccacacact caagaatgga gcaccagc 448<210>2<211>22<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>SY14特异性上游引物<400>2cgccagggtt ttcccagtca cg 22<210>3<211>24<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>SY14特异性下游引物<400>3gagcggataa caatttcaca cagg 24<210>4<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>TVG引物<400>4agggttgtgt tggaatcagg 20<210>5
一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型的方法.ST25<211>24<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>JJX引物<400>5cgtcgacaac aagtgttgtt ccac 24<210>6<211>25<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>VH引物<400>6ctgtcgacac ggccgtgtat tactg25<210>7<211>22<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>JH引物<400>7aactgcagag gagacggtga cc 2权利要求
1.一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征是包括以下步骤a、接种选取新鲜无坏死肿瘤组织块，立即置入加有青、链霉素的1640培养基中，并将组织在无菌条件下剪成约1mm3大小组织块，接种至处于麻醉状态的裸鼠体内，所述青、链霉素的浓度分别为100～1000u/ml和100～1000ug/ml；b、传代首次移植后，于第25～28周后按步骤a方法取移植瘤组织进行接种传代，第2、3代传代时间为92～98天，第4～10代传代时间为28～32天，传至第10～15代后将传代周期改为18～22天；c、鉴定。
2.根据权利要求1所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于完成步骤a的时间不超过30分钟，所述裸鼠鼠龄为3～4周的裸鼠。
3.根据权利要求1所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于步骤c中所述的鉴定方法是用PCR技术检测移植瘤中的人类特异性基因序列标签位点。
4.根据权利要求3所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于当供瘤个体为男性人类时，所述的基因序列标签位点人类男性性别决定基因序列标签位点SY14。
5.根据权利要求1所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于步骤c中所述的鉴定方法是用各代移植瘤的冻存细胞或冻存组织块进行复苏传代。
6.根据权利要求5所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于所述复苏传代方法包括以下步骤1)将冻存的肿瘤细胞或冻存组织块水浴解冻；2)用加有青、链霉素的1640培养基洗涤，所述青、链霉素的浓度分别为100～1000u/ml和100～1000ug/ml；3)取0.5ml～1.0ml细胞混悬液或0.5～0.8cm3的组织块接种于处于麻醉状态的裸鼠体内。
7.根据权利要求6所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于步骤1)所述的水浴解冻的条件为37～41℃，时间为30秒以内。
8.根据权利要求6所述的建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法，其特征在于步骤3)所述的细胞混悬液的细胞浓度为107～108/ml，或者，用于接种的组织块的体积至少应为0.5～0.8cm3。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种建立人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型的方法。本发明方法包括a.接种；b.传代；c.鉴定等步骤，并对各步骤的主要参数进行了优选，克服了现有技术的缺点。本发明方法传代时间短，每代的一次接种成功率高，鉴定结果迅速准确，远优于现有技术，建立起了能稳定传代的人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的动物模型株系。使用本发明方法所建立的裸鼠移植瘤模型再现了人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的重要生物学特征，各方面均与供体病例基本一致，生长周期稳定，具有很好的应用前景。
文档编号A61K49/00GK1879892SQ20061002070
公开日2006年12月20日 申请日期2006年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者刘卫平, 何妙侠, 唐琼兰, 杨帆, 王晓凌, 赵莎, 江炜, 李甘地 申请人:四川大学华西医院