专利名称：与利培酮临床疗效相关的核酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因技术领域的核酸序列，特别是一种与利培酮临床疗效相关的核酸序列。
背景技术：
利培酮(risperidone)是新一代的抗精神病药物，1984年由比利时杨森制药公司开发，商品名为维思通(Risperidal)，为苯异噁唑(benzisoxazole)衍生物，它与5-HT2受体和DRD2受体都有很高的亲和力，与第一代抗精神病药物相比，利培酮对精神分裂症的阳性症状及阴性症状均有良好疗效，且锥体外系症状(EPS)等不良反应发生率低(Leysen JE，Gommeren W，Eens A，De Chaffog De CoucellesD，Stoof JC，Janssen PAJ.Biochemical profile of risperidone，a newantipsychotic.J Pharmacol Exp Ther 1988；247661-670)。在实际应用中，利培酮的临床疗效存在很大的个体差异，仅有约50％的用药患者可获得较好疗效，其它的服药患者则疗效不明显、甚至出现严重的不良反应，而目前临床上除了试错试验外，尚无有效预测利培酮药物效应的方法，这种临床疗效的不确定性已成为用药安全的重要隐患，而且浪费了大量医疗资源(Miyamoto S，Duncan GE，Marx CE，Lieberman JA.Treatments for schizophreniaacritical review of pharmacology and mechanisms of action of antipsychoticdrugs.Mol Psychiatry 2005；10(1)79-104)。现有研究结果显示，遗传因素是利培酮临床疗效产生个体差异的重要原因，与利培酮临床疗效相关的基因主要包括代谢酶、转运体、靶点等的编码基因。DRD2是利培酮的主要作用靶点(Kapur S，Zipursky RB，Remington G.Clinical and theoretical implicationsof 5-HT2 and D2 receptor occupancy of clozapine，risperidone，andolanzapine in schizophrenia.Am J Psychiatry 1999；156(2)286-93)，DRD2基因的多态性可显著影响DRD2的功能，这提示DRD2基因的多态性可能与利培酮临床疗效的个体差异有关。
单核苷酸多态性rs1799978(A-241G)位于DRD2基因上游调控区，经对现有技术文献的检索发现，至今未见关于DRD2基因的单核苷酸多态性位点rs1799978与利培酮临床疗效相关，可作为分子标记用于预测利培酮临床疗效的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种与利培酮临床疗效相关的核酸序列。使其可用于预测利培酮的临床疗效、指导利培酮的个体化治疗。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位为单核苷酸多态性位点rs1799978，所述的单核苷酸多态性位点rs1799978，是指在SEQ NO1所示序列中的第251为存在A，在其DNA互补链上为T等位位点，位于DRD2基因上游-241位。
所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的单核苷酸多态性位点为A纯合子。个体利用利培酮治疗更易于获得较好疗效。根据该多态性的等位位点特征可以预测利培酮的临床疗效，指导临床合理用药。
本发明所述利培酮临床疗效相关核酸序列如SEQ NO.1所示(a)序列特征*长度1000碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线形(b)分子类型基因组DNA(gDNA文库)(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人(f)SEQ ID NO.1核酸序列描述如下ggcctccttt tgcatttcca tgtcaggtca actccaaaca ggctttttcc 50tttggatgag tccagcaata gaactgacta catagattcc aagacctgaa 100gtcagaaaac ggatgcggac ctcttccaac acctcctctc cttgcctgac 150ttgctggatg ggtggtgcct cccgcaaccc ttggcttctg agtcctcaaa 200
ggagaagact ggcgagcaga cggtgaggac ccagcctgca atcacagctt 250attactctgg gtgtgggtgg gagcgcagtg ggcggtcgag ggttgcgttc 300ccgcctcaaa acaagggatg gcggaatccc ccaacccctc ctacccgttc 350aggccgggga tcgccgagga ggtacagctc ctttggtggg gggcgggggc 400ggggcctgtc tcaggggcgg ggaccggggc acctccctcc cgcgctcccc 450gcgctcgggc gccgcagagc tgtccagctt cagtgccgaa ccggcagcct 500cacgcgcgca ccgcgccgcc tccgccccgt ccccgcgctc cctcctgccc 550gcccgccccg cgcccggccc cgccccgccc cgccccgccg cggcccgtcc 600actgctcccc gcgggccaga gccggccgag ctgctgcccg ccggggctct 650gaacggcgcg gcggggccgg gagccaggga ccggccgagg agagtggcgg 700ccccggacgg ctgccggagg ggcggccgcg cgtggatgcg gcgggagctg 750gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc ccccgggcgc cctatggctt 800gaaggtaagc accggccgga tggagcggcg ggcgactcag tgtcacgggg 850agaggaggag ggacctccaa ggggagcgag gccaggacca gaagtttgtg 900cggccactcc tggccgcctg ctcgggagcg cccgcctggg atccggctct 950gcatgggctc cccgtcgggc gggggcagag ggcgtctgga gcccgcggct 1000序列中251号的字母代表单核苷酸多态性位点(single nucleotidepolymorphisms，SNP)A/G的等位位点位置。
利用本发明提供的利培酮临床疗效相关的单核苷酸多态性位点的核酸序列，构建预测利培酮临床疗效的试剂盒，可用于利培酮的个体化治疗。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1基因的收集和抽提精神分裂症患者来自于中国上海市精神卫生中心，以DSM-IV(中国精神病分类方案与诊断标准第二版修订版)为诊断标准。在知情同意的前提下参加本课题的研究，采集血液，并签署知情同意书。所有入组患者均无第二代抗精神病药物用药史，经过周期为4周的药物清洗期后开始临床实验。分别于实验开始、4周、8周时采用简明精神病量表(Brief Psychiatric Rating Scale，BPRS)对患者临床症状评分，BPRS减分率大于或等于40％者定义为有效，小于40％者为无效。
实施例2核苷酸序列的获得以及单核苷酸多态性位点rs1799978的检测本发明采用直接测序的方法对DRD2基因单核苷酸多态性位点rs1799978(其等位位点为A/G)等位位点在利培酮治疗有效患者组和利培酮治疗无效患者组中的频率分布情况进行了检测。PCR反应均采用96孔板，用Gene Amp PCR system9700完成。
(1)PCR反应扩增引物正向引物(Pri-F)5’-CCCCACCAAAGGAGCTGTACCT-3’(SEQ ID NO2)反向引物(Pri-R)5’-CAGAAAACGGATGCGGACCTCT-3’(SEQ ID NO3)反应试剂反应体系总体积为10.0ul，其中ddH2O 5.8ul灭菌双蒸水Buffer 1.0ul聚合反应缓冲液包含Mg2+ Tris-HCl溶液dNTP1.0ul2mM dNTP溶液Pri-F 0.5ul 10pmol/ul正向引物Pri-R 0.5ul 10pmol/ul反向引物Taq0.2ul DNA合成多聚酶DNA1.0ul 10ng/ul人体DNA扩增模板反应条件94℃ 4min，37×(94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min，4℃∞(2)测序反应PCR产物采用shrimp alkaline phosphatase(Roche，Basel，Switzerland)and exonulease I纯化，具体过程按说明书操作。
测序反应体系DNA 3.0ul 纯化后DNA，计200ngBDT 1.0ul ABI BigDyeTerminator Cylce sequencing Ready Reaction
Kit 3.1Primer 1.0ul所获得的PCR产物的正向或反向引物3pmol/ul测序反应条件96℃ 2min，40×(94℃ 30s，50℃ 30s，60℃ 120s)，4℃∞结束后加入70％乙醇避光静置15分钟，4000转/分钟离心30分钟，甩去乙醇，70％乙醇洗两次，静置晾干，加入HIDI变性后上样。测序采用ABI PRISM3100 DNA Sequencer进行。
实施例3单核苷酸多态性位点rs1799978与利培酮临床疗效的相关性统计利用SPSS10.0计算等位位点、基因型的分布和Hardy-Weinberg平衡，并计算Odds Ratio(OR)及其95％的可信区间，采用G Power Program计算所用样本量的统计学力度，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为P小于0.05。
结果位于11q22-23区域DRD2基因上游调控区的rs1799978(其等位位点为A/G)等位位点在利培酮治疗有效患者组和利培酮治疗无效患者组中的频率分布情况见表1。
表1.rs1799978等位位点和基因型在利培酮治疗有效患者组和无效患者组中的分布和分析结果
注OROdds Ratio；CIConfidence intervals从上表可见，位于11q22-23区域DRD2基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs1799978的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点，在利培酮治疗有效组中的分布频率明显大于其在利培酮治疗无效组中的频率(P＝0.007)，因此可作为预测利培酮临床疗效的标记分子。rs1799978位于DRD2基因上游-241位，可能影响DRD2基因的表达，或与其它功能性多态性位点连锁。
本发明的具有实用性的例证1)可以利用本发明所介绍的rs1799978的A等位位点(即在其DNA互补链上为T等位位点)作为预测利培酮临床疗效的标记分子，为临床合理用药提供依据。
2)利用本发明提供的多态性位点rs1799978的核酸序列，构建用于指导利培酮个体化治疗的试剂盒。
3)由于DRD2基因是多种抗精神病药物的作用靶点，因此，本发明为今后对DRD2基因与其他抗精神病药物疗效关系公开了前期最宝贵的经验、实验基础和应用技术。
序列表<110>上海交通大学<120>与利培酮临床疗效相关的核酸序列<160>1<210>1<211>1000<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220>
<221>allele<222>(251)…(251)<223>序列中第251位核苷酸为a或g<400>1ggcctccttt tgcatttcca tgtcaggtca actccaaaca ggctttttcc 50
tttggatgag tccagcaata gaactgacta catagattcc aagacctgaa 100gtcagaaaac ggatgcggac ctcttccaac acctcctctc cttgcctgac 150ttgctggatg ggtggtgcct cccgcaaccc ttggcttctg agtcctcaaa 200ggagaagact ggcgagcaga cggtgaggac ccagcctgca atcacagctt 250attactctgg gtgtgggtgg gagcgcagtg ggcggtcgag ggttgcgttc 300ccgcctcaaa acaagggatg gcggaatccc ccaacccctc ctacccgttc 350aggccgggga tcgccgagga ggtacagctc ctttggtggg gggcgggggc 400ggggcctgtc tcaggggcgg ggaccggggc acctccctcc cgcgctcccc 450gcgctcgggc gccgcagagc tgtccagctt cagtgccgaa ccggcagcct 500cacgcgcgca ccgcgccgcc tccgccccgt ccccgcgctc cctcctgccc 550gcccgccccg cgcccggccc cgccccgccc cgccccgccg cggcccgtcc 600actgctcccc gcgggccaga gccggccgag ctgctgcccg ccggggctct 650gaacggcgcg gcggggccgg gagccaggga ccggccgagg agagtggcgg 700ccccggacgg ctgccggagg ggcggccgcg cgtggatgcg gcgggagctg 750gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc ccccgggcgc cctatggctt 800gaaggtaagc accggccgga tggagcggcg ggcgactcag tgtcacgggg 850agaggaggag ggacctccaa ggggagcgag gccaggacca gaagtttgtg 900cggccactcc tggccgcctg ctcgggagcg cccgcctggg atccggctct 950gcatgggctc cccgtcgggc gggggcagag ggcgtctgga gcccgcggct 1000
权利要求
1.一种与利培酮临床疗效相关的核酸序列，其特征在于，所分离出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位为单核苷酸多态性位点rs1799978。
2.根据权利要求1所述的与利培酮临床疗效相关的核酸序列，其特征是，所述的单核苷酸多态性位点rs1799978，是指在SEQ NO1所示序列中的第251为存在A。
3.根据权利要求2所述的与利培酮临床疗效相关的核酸序列，其特征是，所述的DNA，在其互补链上为T等位位点，位于DRD2基因上游-241位。
4.根据权利要求1所述的与利培酮临床疗效相关的核酸序列，其特征是，所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的单核苷酸多态性位点为A纯合子。
全文摘要
本发明涉及的是一种基因技术领域的与利培酮临床疗效相关的核酸序列。本发明所分离出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位为单核苷酸多态性位点rs1799978，所述的单核苷酸多态性位点rs1799978是指在SEQ NO1所示序列中的第251为存在A。所述的DNA，在其互补链上为T等位位点，位于DRD2基因上游－241位。所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的单核苷酸多态性位点为A纯合子。通过本发明预测利培酮的临床疗效不依赖于医生的主观判断，且时效性强，因此是临床合理用药可以借助的有力工具。
文档编号A61P25/00GK1884528SQ200610028329
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者贺林, 邢清和, 秦炜, 高建军, 钱学庆, 李华芳 申请人:上海交通大学