专利名称：一种预防、治疗骨质疏松症的活性骨肽及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药药品、生化药品、保健食品领域，具体涉及一种预防、治疗骨质松症的活性骨肽及其制备方法背景技术我国现有9000多万人患骨质疏松症，占总人口的7.1％，2050年达到2.2亿。随着世界人口的老龄化，发生骨质疏松症与骨量减少的人数日益增多，面对骨质疏松症庞大的患病群体，药物的需求量逐年增多，从经济学观点看，研究与开发抗骨质疏松症药物，特别是具有自主知识产权的新型药物及保健食品，对提高人类健康水平和生存质量有着重要的经济效益和社会效益。
目前，用于预防和治疗骨质疏松的药物有三类(1)抑制破骨细胞活性药物雌激素、降钙素、双膦酸盐、异丙氧黄酮等；(2)促进成骨生成药物，如氟化物、甲状旁腺激素、蛋白质合成激素等；(3)矿化作用药物，如钙制剂、维生素D等。长期服用这些激素或化学药物会对人体产生大量的毒副作用，甚至导致癌症。开发安全、有效、低毒顺应性强的预防和治疗骨质疏松的药物是医药工作者的重要任务。
现代生物技术认识到动物骨中富含多种氨基酸、活性骨肽、胶原蛋白和促骨生长因子，具有预防和治疗骨质疏松症及促进骨骼发育的用途。骨肽的制备方法大致分为两种酸水解和高温水溶性提取，它们的缺点是选择性差、生物活性低、骨肽的得率低。
本发明采用特定条件下的酶水解骨蛋白方法所制备的活性骨肽可克服以上缺点，提高活性骨肽预防和治疗骨质疏松症及促进骨骼发育的作用。
本发明正是基于这种背景和需求而产生的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存的缺点，提供一种采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法及其用于预防、治疗骨质疏松症。
本发明的技术方案一种采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，该方法是①取新鲜的动物四肢骨，清洗，消毒，粉碎，在恒温反应罐内以蛋白酶控制水解离心分取上清液；②上清液脱脂，浓缩，乙醇提取，滤出上清液；③上清液脱醇，离心超滤，收集滤过液得生物活性骨肽；④活性骨肽原料制成任何一种药剂学上所述的剂型。
所述蛋白酶是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。
所述动物四肢骨为鹿、牛、猪、羊、马、犬、兔等动物四肢骨。
所述采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，在步骤①中动物四肢骨粉碎成1～2mm的骨粒，恒温反应罐温度为50℃，pH为5；在步骤②中上清液置于0～4℃冰箱中放置24小时，脱脂，加热至60℃，60分钟，在50～60℃条件下减压浓缩，在浓缩液中加入6倍体积浓度为95％的乙醇，冷冻保存36小时，滤出上清液；在步骤③中上清液在50～60℃减压脱醇，15～25℃离心超滤，聚丙烯(PP)中空纤维膜截留分子量为10000道尔顿的活性骨肽。
采用蛋白酶水解骨蛋白制备的活性骨肽的分子量小于或等于10000道尔顿。
所述剂型为肠道吸收制剂、肠溶胶囊、肠溶片剂、注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、气雾剂、喷雾剂、滴鼻剂。
一种采用蛋白酶水解骨蛋白制备的活性骨肽的用途，所述活性骨肽用于制备预防和治疗骨质疏松症及促进骨骼发育的药物及保健食品。
本发明的特点1.本发明得到的活性骨肽对成骨细胞的增值、分化作用确定，生物活性高，可用于制备预防和治疗骨质疏松症及促进骨骼发育的药物或保健食品。
2、本发明得到的活性骨肽分子量小于或等于10000道尔顿，制成肠道吸收制剂，易于被人体吸收和利用，避免口服给药后胃酸水解和肝脏的首过效应，显著提高生物利用度。
3、本发明制备的活性骨肽方法，采用蛋白酶对骨蛋白进行选择性受控水解，其工艺条件温和，均在60℃以下操作，有利于保留小分子多肽的生物活性。
4、本发明得到的活性骨肽急性毒性试验结果表明，本发明产品安全可靠。
图1是本发明工艺流程图；图2是100mg/L活性骨肽培养液作用大鼠颅骨细胞矿化骨结节图；图3是50mg/L活性骨肽培养液作用大鼠颅骨细胞矿化骨结节图；图4是25mg/L活性骨肽培养液作用大鼠颅骨细胞矿化骨结节图；图5是12.5mg/L活性骨肽培养液作用大鼠颅骨细胞矿化骨结节图；图6是空白培养液作用大鼠颅骨细胞矿化骨结节图；具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，而不应该是对本发明范围的限制实施例一取鹿新鲜四肢骨20kg，用常水洗净血浆、去掉筋膜、肌肉，用蒸馏水冲洗3次，紫外消毒，入清洁的骨破碎机中，粉碎成骨粒1～2mm，加蒸馏水100kg，在恒温反应罐中加热至50℃，用HCl溶液调节pH值5.0，搅拌下加入木瓜蛋白酶溶液，酶活力为≥6000U/mg，搅拌70～80r/min6小时，离心，取上清液，放置室温，置于0～4℃冰箱内24h，脱脂。加热至60℃，60min，50～60℃真空浓缩器浓缩，浓缩液加入6倍体积的95％乙醇溶液，冷冻保存36小时，滤出上清，50～60℃真空浓缩器回收乙醇至无醇味，用5L无菌蒸馏水溶解，3000r/min离心15min，上清超滤(膜截留分子量为10000)，收集滤液，即得生物活性鹿骨小分子多肽类。
用本发明制备的活性骨肽对新生大鼠颅骨进行体外培养，进行了成骨细胞增殖、分化试验，以证明采用本发明制备的活性骨肽所具有预防、治疗骨质疏松症、促进骨骼发育的作用细胞培养于无菌条件下，取新生大鼠颅骨，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗数次，剔除结缔组织，剪碎，0.25％胰蛋白酶消化10min，弃酶液，加入0.1％的透明质酸酶和0.2％I型胶原酶消化液，37℃恒温振荡消化30min，取上清，2000r/min离心10min，取沉淀细胞用不含血清的DMEN培养液洗涤、离心一次，再取沉淀细胞以10％的胎牛血清DMEN(L-谷氨酰胺、丙酮酸钠)培养基重悬，如此反复消化颅骨碎片5次，将分次收集的细胞混匀，细胞数1×105.ml-1，接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱内培养，24h换液，以后每隔2～3d换液一次，细胞融合后，用0.25％胰蛋白酶消化、传代。
1.活性骨肽对新生大鼠成骨细胞增殖作用取0.25％胰蛋白酶消化融合成片的成骨细胞，吹打成单细胞悬液，5×104.ml-1，接种于96孔培养板中，100μl/孔，24小时后将培养液换成1％的胎牛血清DMEN培养基，90μl/孔，同时加入各种浓度的活性骨肽，使其终浓度为含原液的0.1、1、10、25、50mg/L，对照组加入等量的三蒸水，加药后24、48、96小时加入MTT(噻唑蓝法)20μl，37℃孵育4小时，吸出培养液，加入150μl DMEM(Dulbcco’s Modifed Eagle Medium)培养液，待结晶完全溶解后，用酶标仪测定吸光值，检测波长570nm，参比波长630nm。检测结果见表1表1活性骨肽对新生大鼠成骨细胞增殖率的测定结果(x±S，n＝8)
△与空白对照组比较P＜0.01数据显示，活性骨肽25mg/L、50mg/L剂量组对新生大鼠颅骨成骨细胞有显著增殖作用。本实验说明，活性骨肽刺激大鼠颅骨成骨细胞增殖，在决定新骨形成中起重要作用，可预防、治疗骨质疏松症以及促进骨骼发育。
2.活性骨肽对新生大鼠成骨细胞ALP(碱性磷酸酶)活性的作用
细胞培养液加入活性骨肽的量及对照组设置与成骨细胞增值率测定的设置相同，方法为置于37℃，5％CO2培养箱内培养5d，吸出培养液，用PBS洗孔2次，加入PNPF孵育液150μl，置于37℃恒温培养箱内孵育30min，加入0.4mol.L-1NaOH 50μl终止反应，采用酶标仪检测A值(吸光度值)，波长405nm。检测结果见表2表2活性骨肽对新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的测定结果(x±S，n＝8)
△与空白对照组比较P＜0.01数据显示，活性骨肽0.1mg/L、1mg/L、10mg/L剂量组新生大鼠颅骨成骨细胞碱性磷酸酶活性显著升高，说明骨形成作用增强。碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白，通过分解磷酸酯、增加局部无机磷酸的浓度而促进骨基质钙化，促进骨骼发育及骨的形成。
3.活性骨肽急性毒性试验取小鼠20只，观察活性骨肽300mg/ml腹腔注射给药0.4ml/20g所产生的毒性反应和死亡情况，7日内无异常反应、无死亡。小鼠急性毒性试验结果是人用量的3500倍，证明本发明产品安全可靠。
4.活性骨肽对大鼠颅骨细胞体外培养矿化骨结节的作用通对大鼠颅骨细胞培养观察，说明100mg/L、50mg/L、25mg/L活性骨肽培养液对大鼠颅骨细胞培养矿化骨结节的作用较强，矿化骨结节的数量，100mg/L培养液24孔板每孔可达4010个矿化骨结节，根据培养液的浓度依次递减。见附图2至6。
5.肠溶胶囊释放度测定结果
在人工肠溶液中50分钟时全部崩解并释放。在人工胃液中5小时，胶囊不崩解、变形。说明活性骨肽肠溶胶囊可避免胃酸的水解，在肠部吸收，提高了活性骨肽的生物利用度。
6.活性骨肽肠溶胶囊对切除卵巢SD大鼠抗骨质疏松作用取3月龄的雌性SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只。假手术组、切除卵巢组、切除卵巢+己烯雌酚组、切除卵巢+低剂量活性骨肽(5mg.kg-1)组、切除卵巢+中剂量活性骨肽(20mg.kg-1)组、切除卵巢+高剂量活性骨肽(80mg.kg-1)组。给药3个月后，检测①股骨矿含量钙(Ca)、磷(P)含量测定；②骨形态计量学分析测定骨小梁密度、骨小梁面积、皮质骨面积、皮质骨面积。
结果见表4表4活性骨肽肠溶胶囊对SD大鼠抗骨质疏松作用(x±S，n＝10)
注△P＜0.05，△△△P＜0.001与假手术组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01与切除卵巢模型组比较本实验说明活性骨肽中、高剂量组的骨钙含量与切除卵巢模型组比较有显著升高的作用(P＜0.001)；经活性骨肽治疗的切除卵巢大鼠骨小梁数目明显增多、变粗、排列略整，骨小梁体积明显增大，大剂量组接近假手术组，与切除卵巢模型组比较有显著性差异(P＜0.001)；经活性骨肽治疗的切除卵巢大鼠皮质骨明显增加，骨髓腔变小，个别大鼠皮质骨厚度接近假手术组，皮质裂隙变小。
此实验结果说明活性骨肽能明显改善去卵巢大鼠骨钙含量和松质骨、皮质骨病理形态，说明活性骨肽具有增加组织的承载力，提高骨骼的抵抗外界冲击能力，降低骨脆性、防止骨量丢失，能预防和治疗骨质疏松症。
实施例二分别取新鲜羊、牛、猪、马、犬、兔等动物的四肢骨，按上述实施例一的方法制备活性骨肽，经细胞培养及动物实验观察，也有一定的促进骨形成的作用，可用于预防、治疗骨质疏松症。
实施例三分别取新鲜羊、牛、猪、马、犬、兔等动物的四肢骨，按上述实施例一的方法，分别改用胃蛋白酶，胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶，取代木瓜蛋白酶进行酶解所制备的活性骨肽，经细胞培养及动物实验观察，也有很好的促进骨形成的作用，也可用于预防、治疗骨质疏松症。
权利要求
1.一种用于预防、治疗骨质疏松症的活性骨肽的制备方法，该方法是采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽，其特征是①取新鲜的动物四肢骨，清洗，消毒，粉碎，加入蒸馏水，在恒温反应罐内以蛋白酶控制水解，离心分取上清液；②上清液脱脂，浓缩，乙醇提取，滤出上清液；③上清液脱醇，离心超滤，收集滤过液得生物活性骨肽；④活性骨肽原料制成任何一种药剂学上所述的剂型。
2.据权利要求1所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，其特征是所述蛋白酶是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。
3.据权利要求1所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，其特征是所述动物四肢骨为鹿、牛、猪、羊、马、犬、兔等动物四肢骨。
4.据权利要求1、2或3所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，其特征是在步骤①中动物四肢骨粉碎成1～2mm的骨粒，恒温反应罐温度为50℃，pH＝5；在步骤②中上清液置于0～4℃冰箱中放置24小时，脱脂，加热至60℃，60分钟，在50～60℃条件下减压浓缩，在浓缩液中加入6倍体积浓度为95％的乙醇，冷冻保存36小时，滤出上清液；在步骤③中上清液在50～60℃减压脱醇，15～25℃离心超滤，截留分子量为10000道尔顿活性骨肽。
5.据权利要求4所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，其特征是所得到活性骨肽的分子量小于或等于10000道尔顿。
6.据权利要求5所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制备活性骨肽的方法，其特征是所述剂型为肠道吸收制剂、肠溶胶囊、肠溶片剂、注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、气雾剂、喷雾剂、滴鼻剂。
7.一种采用蛋白酶水解骨蛋白制备的活性骨肽的用途，其特征是所述活性骨肽用于制备预防和治疗骨质疏松症及促进骨骼发育的药物及保健食品。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防、治疗骨质疏松症的活性骨肽及其制备方法，该方法是①取新鲜的动物四肢骨，清洗，消毒，粉碎，加入蒸馏水，在恒温反应罐内以蛋白酶控制水解，离心分取上清液；②上清液脱脂，浓缩，乙醇提取，滤出上清液；③上清液脱醇，离心超滤，收集滤过液得生物活性骨肽；④活性骨肽原料制成任何一种药剂学上所述的剂型。本发明工艺条件温和，均在60℃以下操作，有利于保留小分子多肽的生物活性，得到的活性骨肽，分子量小于或等于10000道尔顿，对成骨细胞的增值、分化作用确定，生物活性高，易于被人体吸收和利用，适用于制成肠道吸收制剂，显著提高生物利用度，并可制成保健食品。
文档编号A61K35/32GK1843502SQ20061003305
公开日2006年10月11日 申请日期2006年1月16日 优先权日2006年1月16日
发明者李延平, 崔燎, 邓亦峰, 吴科锋, 艾春媚, 刘义, 黄连芳 申请人:广东医学院