预防和改善低骨量和骨质疏松症的草本植物的组合物的制作方法

预防和改善低骨量和骨质疏松症的草本植物的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于在受试者中活化环磷酸腺苷(cAMP)响应元件的组合物，预防和改善低骨量和骨质疏松症的草本植物组合物，更具体的涉及所述的中草药组合中的有效部位及其制备方法。所述组合物的活性物质由以下组成：I)淫羊藿属，II)槲蕨属，以及III)当归属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种。在某些实施方案中，所述组合物由活性物质组成，即，所述组合物由淫羊藿属、槲蕨属、以及当归属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种组成。在第一实施方案中，所述组合物的活性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及当归属组成。在第二实施方案中，所述组合物的活性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及鼠尾草属组成。在第三实施方案中，所述组合物的活性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及枸杞属组成。在各实施方案中，所述组合物除所述活性物质之外还包含至少一种非活性物质。本发明还公开了一种制备所述组合物的方法。
【专利说明】预防和改善低骨量和骨质疏松症的草本植物的组合物 发明领域
[0001] 本发明总体上涉及一种用于在受试者中活化环磷酸腺苷（CAMP)响应元件的组合 物，预防和改善低骨量和骨质疏松症，并且更具体地说一种包含淫羊藿属、槲蕨属、以及当 归属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种的组合物，所述组合物用于预防和改善低骨量和骨 质疏松症的草本植物。
[0002] 相关技术描述 骨质疏松症是以骨量减少，骨微观结构退化，导致骨骼脆性增加，易于骨折的一种疾 病。骨质疏松症严重威胁中、老年人，尤其是绝经后女性的身体健康，据统计平均三位超过 50岁的女性就有一位患有骨质疏松症，全球约两亿女性受骨质疏松症的困扰。健康骨骼 不断的进行骨重建过程，通过骨骨形成和骨吸收的动态平衡调节骨量多少。。特殊时期如青 春期、绝经期或疾病均可以使骨代谢平衡倾向骨形成或者倾向骨吸收，从而增加骨量活着 减少骨量。而，绝经期时雌激素水平降低，导致骨代谢失衡，骨吸收大于骨形成，最终导致低 骨量甚至骨质疏松症。
[0003] 早期诊断与预防是治疗骨质疏松症的关键。而骨密度值减少所致的低骨量，骨强 度同样会降低，与骨质疏松无质的区别，只是程度上的差别：随着年龄增加，其从生理上变 化向病理改变的发展程，其发生率明显高于骨质疏松。因此，我们更应注重对低骨量患者的 防治。
[0004] 许多常规治疗是通过减缓或抑制炎症反应抑制骨吸收，或者通过刺激骨形成来改 善骨质疏松。虽然这种方法有效，但化学药物治疗骨质疏松的副作用时有报道。
[0005] 越来越多的研究表明植物来源提取物可以预防和改善低骨量和骨质疏松。在本领 域，需要植物来源提取物用于药物或保健品，从而调节骨代谢，预防和治疗低骨量和骨质疏 松。
[0006] 发明概述 公开了一种组合物。所述组合物适用于在受试者中活化环磷酸腺苷（cAMP)响应元件， 预防和改善低骨量和骨质疏松症。所述组合物的活性物质由以下组成：1)淫羊藿属，II)槲 蕨属，以及III)当归属、鼠尾属草或枸杞属中的至少一种。
[0007] 在某些实施方案中，所述组合物由活性物质组成，即，所述组合物由淫羊藿属、槲 蕨属、以及当归属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种组成。在本公开的第一实施方案中，所 述组合物的活性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及当归属组成。在本公开的第二实施方案中，所 述组合物的活性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及鼠尾草属组成。在本公开的第三实施方案中， 所述组合物的活性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及枸杞属组成。在各实施方案中，所述组合物 除活性物质之外还包含至少一种非活性物质。
[0008] 还公开了一种制备所述组合物的方法。所述方法包括以下步骤：提供淫羊藿属，提 供槲蕨属，以及提供当归属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种。所述方法还包括以下步骤： 合并淫羊藿属、槲蕨属、以及当归属、鼠尾草属和/或枸杞属以制备所述组合物。
[0009] 附图简述 通过结合附图，参考以下详细说明将更容易地认识和更好地理解本公开的其它优势， 其中： 图1是说明各种实施例⑴抑制核因子-k B(NFkB)的白细胞介素-1 0 (IL-1 0 )活性 的不同水平（Y)的的条形图；并且 图2是说明各种实施例（X)活化环磷酸腺苷（cAMP)响应元件的不同水平（Y)的的条 形图。
[0010] 发明详述 公开了一种组合物（"组合物"）以及一种形成组合物的方法（"方法"）。所述组合 物适用于在受试者中活化环磷酸腺苷（CAMP)响应元件，预防和改善低骨量和骨质疏松症。 所述受试者通常是人类，更通常是绝经前、绝经或绝经后的女性，最通常是绝经或绝经后女 性，并且又最通常是绝经后女性。其他受试者也可以考虑，包括但不限于各种年龄的男性和 女性。
[0011] 不希望受任何具体理论的约束或限制，认为CAMP响应元件（CRE)是许多细胞外和 细胞内信号的会聚点，包括cAMP、钙、G蛋白偶联受体（GPCR)以及神经营养因子。这些信号 中的一些影响受试者的骨量。
[0012] 甲状旁腺激素（PTH)的间歇应用已充分确立了对啮齿动物和人类的骨量的合成 代谢作用。认为PTH信号转导一般经由cAMP、蛋白激酶A(PKA)以及cAMP响应元件结合蛋 白（CREB)通路来介导。PTH结合至PTH受体并且诱导cAMP形成，从而活化PKA，继而磷酸 化并活化CREB，CREB是碱性亮氨酸拉链（bZIP)结构域DNA-结合蛋白大家族中的一个成 员。活化的CREB联合其它共活化剂经由CRE结合至目标基因并且激活其转录。在这个途 径中，CREB通过转换PTH信号以激活基因表达来发挥关键作用。
[0013] 这类基因表达可以影响成骨细胞分化，这是骨形成的一个重要步骤。认为成骨细 胞和破骨细胞是通过包括PTH的若干激素来调节的，当成骨细胞和破骨细胞之间失衡，骨 吸收大于骨形成就导致低骨量和骨质疏松症。组合物的另外的方面和益处在下文中进一步 描述。
[0014] 所述组合物的活性物质由以下组成：1)淫羊藿属，II)槲蕨属，以及III)当归属、 鼠尾草属或枸杞属中的至少一种。这些组分中的每一个都在下文中更详细地描述。在某 些实施方案中，所述组合物由活性物质组成，即，所述组合物由淫羊藿属、槲蕨属、以及当归 属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种组成。在本公开的第一实施方案中，所述组合物的活性 物质由淫羊藿属、槲蕨属以及当归属组成。在本公开的第二实施方案中，所述组合物的活性 物质由淫羊藿属、槲蕨属以及鼠尾草属组成。在本公开的第三实施方案中，所述组合物的活 性物质由淫羊藿属、槲蕨属以及枸杞属组成。在其它实施方案中，活性物质III)包括组分 的组合，例如，当归属和鼠尾草属、当归属和枸杞属、鼠尾草属和枸杞属、或当归属、鼠尾草 属以及枸杞属。在这些实施方案中，活性物质III)的组分可以以各种重量比存在。
[0015] 在各实施方案中，包括那些其中组合物由活性物质I)、II)以及III)组成的实施 方案，所述组合物不含其它活性物质。这里的"其它活性物质"一般意味着所述组合物不 含不同于淫羊藿属、槲蕨属、当归属、鼠尾草属以及枸杞属的其它类型的中药（TCM;或"中 草药"）。其它类型的TCM在本领域中是理解的。其它类型的TCM的实例在国际公布号TO 01/22934 A2中通常描述为"生物活性物质"，所述文献的内容以引用的方式并入。在某些 实施方案中，所述组合物可以包含如下所述的非活性物质。如果利用的话，所述非活性物质 不同于其它类型的TCM。
[0016] 淫羊藿属，又名淫羊藿属植物、主教帽、仙女翅膀、山羊草、粗暴羊肉药草（rowdy lamb herb)、兰迪牛肉草（randy beef grass)、或淫羊藿（Yin Yang Huo,在中国），它是小 檗科的显花植物属。大部分的淫羊藿属物种是中国特有的，其中较小数量分布在亚洲的其 它地方以及地中海地区的一些地方。淫羊藿属物种通常是多年生草本植物，由地下走茎长 成。在某些实施方案中，所述淫羊藿属是淫羊藿。
[0017] 用于这种组分的科学分类一般如下一目：毛茛目；科：小檗科；以及属：淫羊藿属。 淫羊藿属（E.)的示例性物种包括但不限于：粗毛淫羊藿（E. acuminatum)、高山淫羊藿 (E. alpinum)、龄北淫羊藿（E. baiealiguizhouense)、保靖淫羊藿（E. baojingensis)、 龄北淫羊藿（E. borealiguizhouense)、短莖淫羊藿（E. brachyrrhizum)、心叶淫羊藿 (E. brevicornum)、钟花淫羊藿（E. campanulatum)、绿药淫羊藿（E. chlorandrum)、E. circinatocucullatum、毯毛淫羊藿（E. coactum)、宝兴淫羊藿（E. davidii)、德务淫羊藿 (E. dewuense)、梅花淫羊藿（E. diphyllum)、长蕊淫羊藿（E. dolichostemon)、无距淫羊 藿（E. ecalcaratum)、高莖淫羊藿（E. elatum)、川西淫羊藿（E. elongatum)、恩施淫羊 藿（E. enshiense)、紫距淫羊藿（E. epsteinii)、方氏淫羊藿（E. fangii)、川鄂淫羊藿 (E. fargesii)、天全淫羊藿（E. flavum)、木鱼坪淫羊藿（E. franchetii)、腺毛淫羊藿（E. glandulosopilosum)、长距淫羊藿（E. grandiflorum)、湖南淫羊藿（E. hunanense)、镇坪 淫羊藿（E. ilicifolium)、荆州淫羊藿（E. jingzhouense)、朝鲜淫羊藿（E. koreanum)、 宽萼淫羊藿（E. latisepalum)、龄岭淫羊藿（E. leptorrhizum)、时珍淫羊藿（E. lishihchenii)、裂叶淫羊藿（E. lobophyllum)、大萼淫羊藿（E. macrosepalum)、膜叶淫 羊藿（E. membranaceum)、直距淫羊藿（E. mikinorii)、多花淫羊藿（E. multiflorum)、天 平山淫羊藿（E. myrianthum)、芦山淫羊藿（E. ogisui)、小叶淫羊藿（E. parvifolium)、 少花淫羊藿（E. pauciflorum)、阿尔及利亚淫羊藿（E. perralderianum)、齿瓣淫羊藿 (E. pinnatum)、茂汶淫羊藿（E. platypetalum)、齿瓣淫羊藿（E. pinnatum)、假巫山淫 羊藿（E. pseudowushanense)、柔毛淫羊藿（E. pubescens)、淫羊藿（E. pubigerum)、普 定淫羊藿（E. pudingense)、青城山淫羊藿（E. qingchengshanense)、革叶淫羊藿（E. reticulatum)、强莖淫羊藿（E. rhizomatosum)、箭叶淫羊藿（E. sagittatum)、常绿淫羊藿 (E. sempervirens)、大叶淫羊藿（E. setosum)、神农架淫羊藿（E. shennongjiaensis)、 水城淫羊藿（E. shuichengense)、星花淫羊藿（E. stellulatum)、四川淫羊藿（E. sutchuenense)、E. trifoliolatobinatum、偏斜淫羊藿（E. truncatum)、巫山淫羊藿（E. wushanense)以及竹山淫羊藿（E. zhushanense)。淫羊藿属的两个或更多物种之间的杂种 也是可能的。在各实施方案中，淫羊藿属可以选自上述物种中的一个或多个。
[0018] 淫羊藿属植物的任何部分都可用来生产在本公开的组合物中所用的材料，包括但 不限于根、茎、地下茎、叶、花、果实和/或这些部分的提取物。淫羊藿属可以未加工形式、悬 浮形式、脱水形式、浓缩形式或提取物形式使用。通常，淫羊藿属呈干燥或液体形式，更通常 呈干燥形式。如果利用的话，这种组分和/或所述组合物的其它组分的提取物可以经由本 领域中理解的常规提取方法，如通过水（例如蒸汽）提取或通过溶剂（例如醇）提取而获 得。本公开不限于具体的提取方法。
[0019] 淫羊藿属可以以各种量存在于组合物中。在各实施方案中，淫羊藿属基于100重 量份活性物质计以至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或 至少50重量份的量存在。在进一步的实施方案中，淫羊藿属基于100重量份活性物质计以 不大于80、不大于75、不大于70、不大于65、不大于60、不大于55或不大于50重量份的量 存在。其它量也可以考虑并且可以根据需要或要求经由常规实验容易地测定。
[0020] 淫羊藿属中的主要活性成分被认为是淫羊藿苷。淫羊藿苷是黄酮醇苷，一种类黄 酮类型。不希望受任何具体理论的约束或限制，认为淫羊藿属（特别是淫羊藿苷）刺激骨 组织中的成骨细胞活性。
[0021] -般说来，槲蕨属经常是指槲蕨/hrtraei入中华槲蕨（Drj7?aria baronii) n 5^WM (Drynaria propinqua)^M.^W. (Pseudodrynaria coronans)Stl 根。其它常见名称包括岩连姜槲蕨你roosiiA骨碎补（Gu Sui Bu)(在中国）、槲蕨 地下莖（历maria Rhizome)以及青海骨碎补（Rhizoma Z^rj^ariae)。其中，懈蕨（Z^rj^aria 是水龙骨科中的美洲剑蕨种。槲蕨属含有大约16个物种以及一个天然杂种。美 洲剑蕨是附生或岩生的并且原产于热带非洲、南亚、东亚、东南亚、澳洲以及大洋洲。槲蕨植 物是附生草本植物。
[0022] 用于这种组分的科学分类一般如下一目：真蕨目；科：水龙骨科；以及属：槲蕨属。 槲蕨属（D.)的示例性物种包括但不限于：团叶槲蕨（D. bonii)、川滇槲蕨（D. delavayi)、 descensa 懈蕨（D. descensa)、内卷剑蕨（D. involuta)、罗伦懈蕨（D. laurentii)、毛 槲蕨（D. mollis)、小槲蕨（D. parishii)、石莲姜槲蕨（D. propinqua)、栎叶槲蕨（D. quercifolia)、硬叶槲蕨（D. rigidula)、岩连姜槲蕨（D. roosii)、秦岭槲蕨（D. sinica)、 法斗槲蕨（D. sparsisora)、沃氏槲蕨（D. volkensii)、威氏槲蕨（D. willdenowii)、以及 丛林槲蕨（D. X dumicola)(杂种）。槲蕨属的两个或更多物种之间的杂种也是可能的。 在各实施方案中，槲蕨属可以选自上述物种中的一个或多个。
[0023] 槲蕨属植物的任何部分都可用来生产在本公开的组合物中所用的材料，包括但不 限于根、茎、地下茎、叶、花、果实和/或这些部分的提取物。通常，使用根、茎或地下茎，更通 常使用地下茎。如本领域中所理解，地下茎是经常在地下发现的植物的一般改变的地下茎。 在某些实施方案中，槲蕨属是槲蕨地下茎。槲蕨属可以未加工形式、悬浮形式、脱水形式、浓 缩形式或提取物形式使用。通常，槲蕨属呈干燥或液体形式，更通常呈干燥形式。沙灼热是 一种用来干燥槲蕨属的常规方法，但是也可以使用其它干燥方法。本公开不限于用于这种 或任何其它组分的具体干燥方法。
[0024] 槲蕨属可以以各种量存在于组合物中。在各实施方案中，槲蕨属基于100重量份 活性物质计以至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少 50重量份的量存在。在进一步的实施方案中，槲蕨属基于100重量份活性物质计以不大于 80、不大于75、不大于70、不大于65、不大于60、不大于55或不大于50重量份的量存在。其 它量也可以考虑并且可以根据需要或要求经由常规实验容易地测定。
[0025] 不希望受任何具体理论的约束或限制，认为槲蕨属（特别是岩连姜槲蕨 (D. roosii))有效预防骨细胞的再吸收和骨质疏松症，提高骨密度，并且对于骨愈合/生长 有治疗作用。
[0026] 在各实施方案中，淫羊藿属（E)与槲蕨属（D)以约2:1至约1:2、约1. 5:1至约 1:1. 5、或约1:1的重量比（E:D)存在。意外地，
【发明人】们发现淫羊藿属和槲蕨属之间的协 同作用。具体地说，发现当淫羊藿属与槲蕨属以接近或等于1:1的比率（初始原料重量比） 一起使用时，它们比组分单独使用或预期响应更显著地激活CRE响应性测定。此外，发现当 这个比率的淫羊藿属与槲蕨属体内使用时，淫羊藿属和槲蕨属改善雌激素缺乏模型系统的 骨矿物密度。这些及另外的益处在下文中进一步描述。
[0027] 当归属植物是多年生草本植物。在各实施方案中，在本公开的组合物中所利用的 当归属是当归（Angelica sinensis)。当归通常被称为当归（dong quai)(在中国）或"妇人 参（female ginseng)"并且当归的干燥的根通常被称为当归（Chinese angelica)。当归属 具有几种不同的常见名称，如当归（Radix Angelicae Sinensis)、当归（Chinese angelica root)、当归（dongquai)、当归（don quai)、当归草、当归（tong-kui)、当归（tang kuei)等 等。
[0028] 用于这种组分的科学分类一般如下一目：伞形目；科：伞形科；以及属：当归属。 当归属（A.)的示例性物种包括但不限于：东当归（A. acutiloba)、A. adzharica、宽大 当归（A. ampla)、圆叶当归（A. archangelica)、锐叶当归（A. argute)、紫莖当归（A. atropurpurea)、布氏当归（A. breweri)、加利福尼亚当归（A. californica)、卡里当归 (A. callii)、坎比当归（A. canbyi)、长鞘当归（A. cartilaginomarginata)、白]E (A. dahurica)、A. dawsonii、齿状当归（A. dentate)、毛珠当归（A. genuflexa)、朝鲜当归（A. gigas)、光滑当归（A. glabra)、格雷当归（A. grayi)、哈拉雷当归（A. harae)、亨德森当 归（A. hendersonii)、日本当归（A. japonica)、滨海当归（A. keiskei)、kingie 当归（A. kingie)、线裂当归（A. lineariloba)、亮叶当归（A. lucida)、厚皮当归（A. pachycarpa)、 线叶当归（A. palustris)、圆当归（A. pancicii)、羽状当归（A. pinnata)、重齿毛当 归（A. pubescens)、罗斯当归（A. roseana)、锡金当归（A. sikkimensis)、当归（A. sinensis)、糖边当归（A. scabrida)、林当归（A. sylvestris)、绒毛当归（A. tomentosa)、 A. triquinata)、ubatakensis 当归（A. ubatakensis)、美叶当归（A. ursine)、毒当归（A. venenosa)、以及韦氏当归（A. wheeleri)。当归属的两个或更多物种之间的杂种也是可能 的。在各实施方案中，当归属可以选自上述物种中的一个或多个。
[0029] 当归属植物的任何部分都可用来生产在本公开的组合物中所用的材料，包括但不 限于根、茎、地下茎、叶、花、果实和/或这些部分的提取物。通常，使用根、茎或地下茎，更通 常使用根或地下茎。当归属的活性成分一般见于根和地下茎中。当归属可以未加工形式、 悬浮形式、脱水形式、浓缩形式或提取物形式使用。通常，当归属呈干燥或液体形式，更通常 呈干燥形式。
[0030] 当归属可以以各种量存在于组合物中。在各实施方案中，当归属基于100重量份 活性物质计以至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少 50重量份的量存在。在进一步的实施方案中，当归属基于100重量份活性物质计以不大于 80、不大于75、不大于70、不大于65、不大于60、不大于55或不大于50重量份的量存在。其 它量也可以考虑并且可以根据需要或要求经由常规实验容易地测定。
[0031] 不希望受任何具体理论的约束或限制，认为当归属（特别是当归（A. sinensis)) 有效预防骨细胞的再吸收和骨质疏松症，提高骨密度，并且对于骨愈合/生长有治疗作用。 [0032]鼠尾草属植物是多年生草本植物。在各实施方案中，在本公开的组合物中所利用 的鼠尾草属是丹参（Sa^Via組7(iorrAiza)。丹参又名一串红、中国鼠尾草、红丹参（Radix Salviae miltiorrhiza)、丹参（tan shen)、丹参（danshen)或丹参（dan shen)(在中国）。 [0033] 用于这种组分的科学分类一般如下一目：野芝麻目；科：唇形科；以及属：鼠尾草 属。鼠尾草属（S.)的示例性物种包括但不限于：白鼠尾草（S. apiana)、戟叶鼠尾草（S. cacaliifolia)、墨西哥鼠尾草（S. divinorum)、凤梨鼠尾草（S. elegans)、水果鼠尾草 (S. fruticosa)、突欧鼠尾草（S. hispanica)、紫绒鼠尾草（S. leucantha)、樱桃鼠尾草 (S. microphylla)、丹参（S. miltiorrhiza)、林荫鼠尾草（S. nemorosa)、药用鼠尾草（S. officinalis)、快乐鼠尾草（S. sclarea)、一串红（S. splendens)、以及深蓝鼠尾草（S. guaranitica)。鼠尾草属的两个或更多物种之间的杂种也是可能的。在各实施方案中，鼠 尾草属可以选自上述物种中的一个或多个。
[0034]鼠尾草属植物的任何部分都可用来生产在本公开的组合物中所用的材料，包括但 不限于根、茎、地下茎、叶、花、果实和/或这些部分的提取物。通常，使用根、根的外部（例 如根皮）和/或地下茎。鼠尾草属可以未加工形式、悬浮形式、脱水形式、浓缩形式或提取 物形式使用。通常，鼠尾草属呈干燥或液体形式，更通常呈干燥形式。
[0035] 鼠尾草属可以以各种量存在于组合物中。在各实施方案中，鼠尾草属基于100重 量份活性物质计以至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或 至少50重量份的量存在。在进一步的实施方案中，鼠尾草属基于100重量份活性物质计以 不大于80、不大于75、不大于70、不大于65、不大于60、不大于55或不大于50重量份的量 存在。其它量也可以考虑并且可以根据需要或要求经由常规实验容易地测定。
[0036] 不希望受任何具体理论的约束或限制，认为鼠尾草属（特别是丹参（S. miltiorrhiza))有效预防骨细胞的再吸收和骨质疏松症，提高骨密度，并且对于骨愈合/ 生长有治疗作用。
[0037] 在各实施方案中，在本公开的组合物中所利用的枸杞属是宁夏枸杞。宁夏枸杞 是茄科中的枸杞的两个物种中的一个，枸杞子或西方雪果由其收获，其它是枸杞（Lycium chinense)。其原产于欧洲的东南部和亚洲。它又名中国雪果、中国枸杞、喜玛拉雅枸杞、西 藏枸杞、米堤亚人衆果、巴巴里枸杞（barbary matrimony vine)、阿盖尔公爵的茶树（Duke of Argyll's tea tree)、阿盖尔公爵的茶树（Duke of Argyll's tea plant)、穆拉里 (Murali)(在印度）、红色枸杞或滨藜叶枸杞。
[0038] 用于这种组分的科学分类一般如下一目：前目；科：前科；以及属：枸杞属。枸杞属 (L.)的示例性物种包括但不限于：尖叶枸杞（L. acutifolium)、多刺枸杞（L. afrum)、阿 梅吉诺枸杞（L. ameghinoi)、小针裂叶枸杞（L. amoenum)、毛叶枸杞（L. andersonii)、沙 地枸杞（L. arenicola)、南方枸杞（L. austral)、宁夏枸杞（L. barbarum)、bosciifolium 枸杞（L. bosciifolium)、伯兰特枸杞（L. berlandieri)、短柄枸杞（L. brevipes)、加 利福利亚枸杞（L. californicum)、卡罗莱纳州枸杞（L. carolinianum)、智利枸杞（L. chilense)、中国枸杞（L. chinense)、灰毛枸杞（L. cinereum)、桶果枸杞（L. cooperi)、倾 伏枸杞（L. decumbens)、铺地枸杞（L. depressum)、eenii 枸杞（L. eenii)、欧洲枸杞（L. europaeum)、露蕊枸杞（L. exsertum)、ferocissimum 枸杞（L. ferocissimum)、弗里芒氏 枸杞（L. fremontii)、南非枸杞（L. gariepense)、grandicalyx 枸杞（L. grandicalyx)、 hassei 枸杞（L. hassei)、密刺枸杞（L. horridum)、陆地枸杞（L. hirsutum)、大齿 枸杞（L. macrodon)、短毛酸衆枸杞（L. mascarenense)、灌木枸杞（L. nodosum)、尖 果枸杞（L. oxycarpum)、白花枸杞（L. pallidum)、柏氏枸杞（L. parishii)、丝叶枸 杞（1^.口；[11；1^01；[11111)、软毛枸杞（1^卩油61'11111111)、细叶枸杞（1^411111；[111111)、黑果枸杞（1. ruthenicum)、三明治枸杞（L. sandwicense)、裂萼枸杞（L. schizocalyx)、非洲枸杞（L. schweinfurthii)、沙威枸杞（L.shawii)、肖克利枸杞（L. shockleyi)、sokotranum 枸杞 (L. sokotranum)、strandveldense 枸杞（L. strandveldense)、纤叶枸杞（L. tenue)、 tenuispinosum 枸杞（L. tenuispinosum)、四蕊枸杞（L. tetrandrum)、texanum 枸杞（L. texanum)、托雷枸杞（L. torreyi)、tweedianum 枸杞（L. tweedianum)、以及红果枸杞 (L.villosum)。枸杞属的两个或更多物种之间的杂种也是可能的。在各实施方案中，枸杞 属可以选自上述物种中的一个或多个。
[0039] 枸杞属植物的任何部分都可用来生产在本公开的组合物中所用的材料，包括但不 限于根、茎、地下茎、叶、花、果实和/或这些部分的提取物。通常，使用根，更通常使用根的 外部（例如根皮）。枸杞属可以未加工形式、悬浮形式、脱水形式、浓缩形式或提取物形式使 用。通常，枸杞属呈干燥或液体形式，更通常呈干燥形式。
[0040] 枸杞属可以以各种量存在于组合物中。在各实施方案中，枸杞属基于100重量份 活性物质计以至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少 50重量份的量存在。在进一步的实施方案中，枸杞属基于100重量份活性物质计以不大于 80、不大于75、不大于70、不大于65、不大于60、不大于55或不大于50重量份的量存在。其 它量也可以考虑并且可以根据需要或要求经由常规实验容易地测定。
[0041] 不希望受任何具体理论的约束或限制，认为枸杞属（特别是宁夏枸杞（L. barbarum))有效预防骨细胞的再吸收和骨质疏松症，提高骨密度，并且对于骨愈合/生长 有治疗作用。
[0042] 在各实施方案中，所述组合物除活性物质之外还包含至少一种非活性物质。换句 话说，所述组合物可以由活性物质和至少一种非活性物质组成。各种非活性物质可以被利 用，但对于受试者，例如对于人类将是生物学上可接受的。此外，这类非活性物质将不会负 面地影响活性物质，例如通过降解活性物质1)、11)以及III)中的一或多种。在某些实施 方案中，所述非活性物质选自以下的组：生物学上可接受的填充剂、生物学上可接受的媒介 物（或载体）或其组合。本领域的普通技术人员可以根据需要或要求选择合适的非活性物 质。如果利用的话，本公开不限于一种或多种具体的非活性物质。
[0043] 所述组合物可呈各种形式。在某些实施方案中，所述组合物呈固体、液体或凝胶形 式。组合物可以根据针对受试者的所要类型或施用途径来定制。例如，所述组合物可以定 制为呈经口 /可摄取的形式、局部/皮肤形式、或可注射/输注形式。用于经口 /可摄取使 用的组合物的实例包括固体和液体形式，如丸剂、片剂、胶囊、锭剂、糖浆、粉末、凝胶、溶液、 混悬液或酊剂。用于皮肤/局部使用的组合物的实例包括固体、液体以及凝胶形式，如软膏 剂、霜剂、凝胶、擦剂、糊剂、薄膜或贴片。用于注射/输注的组合物的实例包括液体和混悬 液形式，如那些一般定制用于静脉内、肌肉内、皮内或皮下注射的形式。本领域的普通技术 人员可以根据需要或要求将所述组合物定制为合适的形式。
[0044] 所述组合物可以按要求每日、每日若干次或以使得实现或获得所要结果的任何合 适的方案来施用。施用频率将取决于若干因素，包括所要的CRE活化水平。给药同样如此， 例如活性物质的剂量。一般说来，方案包括向受试者每日施用至少一次。在每次施用期间 利用的组合物的量可取决于若干因素，包括所要结果的水平以及具体组合物。本公开不限 于具体的施用方案。
[0045] 所述方法包括以下步骤：提供淫羊藿属，提供槲蕨属，以及提供当归属、鼠尾草属 或枸杞属中的至少一种。所述方法还包括以下步骤：合并淫羊藿属、槲蕨属、以及当归属、鼠 尾草属和/或枸杞属以制备所述组合物。所述组合物的组分可以以任何顺序合并。所述组 分可以使用常规的仪器、方法或技术合并。
[0046] 本公开的工业实用性和进一步的益处 不希望受任何具体理论的约束或限制，以下描述旨在说明而非限制本发明。所述组合 物可以用作增加骨密度和改善骨健康产品。认为所述组合物适用于治疗和/或预防骨代谢 失衡（骨吸收/骨形成），低骨量/或骨质疏松症的一种负面特征。用本公开的组合物， 认为淫羊藿属和槲蕨属协同活化CRE以改善骨矿物密度。此外，认为当归属、鼠尾草属和/ 或枸杞属（当归属和/或鼠尾草属尤其如此）的进一步协同作用相对于淫羊藿属与槲蕨属 单独的组合改善骨小梁结构。
[0047] 有利的是维持或改善身体骨重建以及抑制破坏骨的发炎过程的能力。经由施用 所述组合物，cAMP及其CRE的活化改善受试者的骨构建活动。具体地说，认为骨形态发生 蛋白-2 (BMP-2)(主要的骨构建激素）是通过cAMP上调的。
[0048] 另外的骨构建激素，甲状旁腺激素（PTH)和甲状旁腺激素相关肽（PTHrP)经由其 与PTH受体的相互作用以及随后的BMP-2上调来提高cAMP水平。CRE活化的这些改进造成 切除卵巢的（即雌激素缺乏的）大鼠模型中骨的增加，所述切除卵巢的大鼠模型是用于模 拟包括人类的动物中的骨质疏松症的充分表征和接受的动物模型。因此，认为所述组合物 解决了至少两种生物活动以实现骨密度维持。
[0049] 说明组合物的以下实施例旨在说明而非限制本发明。 实施例
[0050] 评估组分以测定抗炎活性及其激活CRE活化的骨构建途径的能力。发现并选择淫 羊藿属和槲蕨属。另外，评估其它组分以确定骨结构改善。发现并且选择当归属、鼠尾草属 以及枸杞属。
[0051] 参看图1，淫羊藿属和槲蕨属抑制主要的炎症信号传导途径，在骨质疏松症期 间被激活的活化的B细胞的核因子k-轻链增强子。另外，淫羊藿属和槲蕨属增强CRE 活化，一种骨重建活动。如图1中一般所示且如下所述，淫羊藿属和槲蕨属抑制核因 子-k MNFkB)的白细胞介素-1 MIL-1 0 )活化。
[0052] 将含有NFkB/Re 1结合元件控制荧光素酶表达的4个拷贝（pGL4. 17，Promega Corporation, Madison, WI)的 A549 细胞在 Bay 11-7085 ( "对照"或"对照（Con.) " ；25 剛)、淫羊藿属（"Epi. ";40吨/ml)或槲蕨属（""Dry. ";40吨/ml)存下或不存在下用 IL-10 (100 pg/ml)处理。在图 1 的 X轴中，i 未被处理，ii 是 IL-10，iii 是 IL-10+Con.， iv是IL-1 0 +Epi.，并且v是IL-1 0 +Dry.。图1的Y轴是相对发光单位（RLU)。图表/误 差线表示平均RLU 土标准偏差（std. dev)。
[0053] 参看图2,当淫羊藿属与槲蕨属以特殊比率一起使用时，它们以超过这些任一个 单独的组分协同提高cAMP水平以增强CRE活化。具体地说，如图2中一般所示并且如下所 述，淫羊藿属与槲蕨属协同以活化CRE。
[0054] 使用人类胚肾（HEK)细胞以及含有3个CREB结合位点的CRE响应性荧光素酶载 体构建体（pGL4. 29，Promega Corporation, Madison, WI)制造稳定的转染子。这些细胞 或未被处理或用毛喉素（"Fsk. "；100 nM)、淫羊藿属（Epi. ;40 μg/ml)、槲蕨属（Dry.; 40 y g/ml)或淫羊藿属和槲蕨属（"观察的";40 y g每种/ml)处理。在图2的X轴中， I是未处理的，II是Fsk.，III是Epi.，IV是Dry.，V是预期的，并且VII是观察的。"预期 的"平均值表示加在一起的来自在40 μg/ml下的淫羊藿属和在40 μg/ml下的槲蕨属的 单一组分响应的相加。如所示，所观察的大于所预期的，这证实了淫羊藿属和槲蕨属之间的 协同作用。图2的Y轴是RLUs。图表/误差线表示平均RLUs 土标准偏差。
[0055] 当淫羊藿属和槲蕨属以1:1的比率（初始原料重量比）使用时，它们比任一单独 使用组分或预期反应更显著地激活CRE响应性测定。此外，当这个比率的淫羊藿属与槲蕨 属体内使用时，这些组分改善雌激素缺乏模型系统的骨矿物密度（下表1)。以下表1说明淫 羊藿属和槲蕨属处理组在卵巢切除术（或卵巢摘除术）之后是如何维持骨矿物密度（BMD) 的。
[0057] 在有和没有（"假"）卵巢切除术的外科手术之后，将个体随机分配到6个处理组。 个体或未被处理（"〇vx"）或进一步分成5组；雌激素（E 2)0. 105 mg/kg/天；淫羊藿属和槲 蕨属（Epi + Dry);淫羊藿属及槲蕨属及枸杞属（Epi + Dry + Lyc);淫羊藿属及槲蕨属及 当归属（Epi + Dry + Ang);或淫羊藿属及槲蕨属及鼠尾草属（Epi + Dry + Sal)2 g/kg/ 天。槲蕨属是槲蕨地下茎，当归属是当归，枸杞属是宁夏枸杞（根皮），并且鼠尾草属是丹 参。
[0058] 样品喂养3个月之后，测定每个个体的BMD并且取平均值。通过方差分析（AN0VA) 分析数据并且具有不同上标（即a或b)的平均值在P〈0. 05水平下是不同的。
[0059] 如表1所示，次要组分（即当归属、枸杞属和/或鼠尾草属）与主要组分（即淫羊 藿属和槲蕨属）的使用不会负面地影响所处理个体的骨密度。每种组合物均能很好的发挥 维持和改善骨密度作用，并且比未处理的模型组（0VX)组表现得更好。
[0060] 如表2所示，相对于单独使用主要组分（即淫羊藿属和槲蕨属），次要组分（当归 属和/或鼠尾草属)与主要组分（即淫羊藿属和槲蕨属）的组合进一步改善了骨小梁HE染 色评分，既骨组织的微观结构。以下表2说明次要组分与主要组分的组合对骨小梁苏木精 &伊红（HE)染色评分优于主要组分单独处理组。
[0061] ^2
[0062] 在有和没有（"假"）卵巢切除术的外科手术之后，将卵巢切除术后的个体随机分配 到6个处理组。未处理的模型组（Ovx)或进一步分成5组：雌激素（E 2)0. 105 mg/kg/天；淫 羊藿属和槲蕨属（Epi + Dry) 2.0克/千克/天；淫羊藿属及槲蕨属及枸杞属（Epi + Dry + Lyc) 2. 3克/千克/天；或淫羊藿属及槲蕨属及当归属（Epi + Dry + Ang) 2. 6克/千 克/天；或淫羊藿属及槲蕨属及鼠尾草属（Epi + Dry + Sal) 2. 3克/千克/天。
[0063] 样品喂养3个月之后，完整取出左侧股骨，剔除周围软组织，脱钙完全后切片。选 择胫骨近段干骺端，矢状位，连续切片，待切片烘干后按照常规HE染色步骤进行HE染 色、拍照。并且根据中国食品药品监督局制定的《增加骨密度功能评价方法(征求意见稿)保 健食品评价试验项目、试验原则及结果判定》进行评分并取平均值。通过AN0VA分析数据并 且具有不同上标（即a、b或c)的平均值在P〈0. 05水平下是不同的。
[0064] 如表2中所示，当归属或鼠尾草属在含有淫羊藿属和槲蕨属的组合物中的使用能 进一步改善雌激素缺乏模型大鼠的骨小梁结构，从而使得这些组合物相对于主组分组合物 进一步改善骨健康的更有效的配方。
[0065] 本公开的组合物改善cAMP介导的骨重建活性以及雌激素缺失所引起的骨吸收活 性（抗炎性反应）。许多产品和公司将其增加骨密度的功能性成分技术聚焦在补充钙或抗 炎症反应。这些努力没有取得成功。本公开的组合物优化细胞内cAMP的产生以促进身体 的骨重建活性并且抑制炎性反应或骨吸收（破坏）活性。此外，本公开还能增加骨密度和 进一步改善骨组织的微观结构。
[0066] 本发明已经以说明性方式在本文中描述，并且可以理解的是已使用的术语旨在具 有描述文字的本质而非限制。本发明的许多修改和变化根据以上教义是可能的。本发明可 以以不同于具体描述的方式在所附权利要求书的范围内实施。独立和从属权利要求（单项 从属和多项从属）的所有组合的主题在本文中被明确地预期。
【主权项】
1. 一种用于在受试者中活化环磷酸腺苷（CAMP)响应元件的，预防和改善低骨量和骨 质疏松症的草本植物组合物，所述组合物的活性物质由以下组成： I)淫羊藿属； Π )槲蕨属；以及 ΠΙ)以下的至少一种： 当归属、 鼠尾草属或 枸杞属。2. 如权利要求1所述的组合物，其中： i) 所述活性物质III)是当归属； ii) 所述当归属是当归；或 iii) i)和 ii)两者。3. 如权利要求1所述的组合物，其中： i) 所述活性物质III)是鼠尾草属； ii) 所述鼠尾草属是丹参；或 iii) i)和 ii)两者。4. 如权利要求1所述的组合物，其中： i) 所述活性物质III)是枸杞属； ii) 所述枸杞属是宁夏枸杞；或 iii) i)和 ii)两者。5. 如权利要求1所述的组合物，其中： i) 所述淫羊藿属是淫羊藿； ii) 所述槲蕨属是槲蕨地下茎；或 iii) i)和 ii)两者。6. 如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述淫羊藿属（E)和所述槲蕨属 (D)以约2:1至约1:2,或者约1. 5:1至约1:1. 5的重量比（E:D)存在。7. 如权利要求6所述的组合物，其中所述E:D是约1:1。8. 如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述淫羊藿属和所述槲蕨属中的每 一种基于100重量份所述活性物质计分别以至少10重量份或者至少15重量份或者至少20 重量份或者至少25重量份的量存在。9. 如权利要求8所述的组合物，其中所述活性物质III)基于100重量份所述活性物 质计以至少10重量份或者至少15重量份或者至少20重量份或者至少25重量份的量存在。10. 如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其由所述活性物质组成。11. 如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其还包含至少一种非活性物质。12. 如权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种非活性物质选自以下的组：生物 学上可接受的填充剂、生物学上可接受的媒介物或其组合。13. 如权利要求12所述的组合物，其由所述活性物质和所述至少一种非活性物质组 成。14. 如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其呈固体、液体或凝胶的形式。15. -种用于在受试者中活化环磷酸腺苷（cAMP)响应元件，预防和改善低骨量和骨 质疏松症的草本植物的组合物，所述组合物由以下组成： I)淫羊藿属； Π )槲蕨属；以及 ΠΙ)以下的至少一种： 当归属、 鼠尾草属或 枸杞属。16. 如权利要求15所述的组合物，其中所述淫羊藿属（E)与所述槲蕨属（D)以约2:1 至约1:2或者约1. 5:1至约1:1. 5的重量比（E:D)存在。17. 如权利要求16所述的组合物，其中所述E:D是约1:1。18. -种制备用于在受试者中活化环磷酸腺苷（cAMP)响应元件，预防和改善低骨量 和骨质疏松症的草本植物的组合物的方法，所述方法包括以下步骤： 提供淫羊藿属； 提供槲蕨属； 提供当归属、鼠尾草属或枸杞属中的至少一种；以及 合并所述淫羊藿属、所述槲蕨属、以及所述当归属、所述鼠尾草属和/或所述枸杞属以 制备所述组合物。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述组合物如权利要求1或15所述。
【文档编号】A61K36/537GK105853489SQ201510031935
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】韩强, 李敏杰, 杜勤, 岑澔, 桂敏, 申晓娟, M.胡德, J.肖尔滕, J.F.雷布胡恩
【申请人】捷通国际有限公司