专利名称：预防/治疗骨质疏松症的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗/保健产品，特别是指一种用于预防和治疗骨质疏松症的组合物及其制备方法。
背景技术：
随着世界人口结构的老龄化，老年人的医疗保健正日益受到社会的广泛重视。而人进入老年的特征之一即是骨质流失，这会导致产生骨质疏松症且大多并发骨折。世界卫生组织的统计表明，目前骨质疏松症的发病率已在世界常见多发病中跃居到第7位，世界上患者总数超过2亿人，其中仅美国、西欧和日本就有7500多万人，每年治疗及住院费用高达250亿美元。尤其是绝经后的妇女，因卵巢功能减退，单位体积骨组织量减少加快，其骨质疏松和骨折并发症的发病率更高。
因此，对于开发出用于预防和治疗骨质疏松症的一种安全、有效、使用方便以及可以长期使用的保健食品或医药产品，以达提高老年人及停经后妇人的生活质量，便具有一定的需求性。
以现代临床用药而言，药品市场主要包括钙制剂、二磷酸盐类、雌激素、雄激素、维生素D3类、降钙素及激素替代疗法这七类药品；保健品市场主要包括目前在市场上有售的补钙制剂。这些产品均不外乎是促进骨生成或是抑制骨吸收。不过，上述两类都因为副作用较多，或长期使用会引起并发症，或价格昂贵，或疗效不确切等缺点，均非治疗骨质疏松症的理想药物。
用于治疗骨质疏松症药物的另外一类是以中药理论。根据中医肾虚理论，认为骨质疏松症与中医肾虚的关系非常密切。已知技术中，由于中医对骨质疏松症的辨证施治的分类复杂，且传统水药的煎煮使其服用不方便，成药的组成成分又非常复杂，产品质量不容易控制，且其剂型落后均为其缺点，使用上受到了一定程度的限制。
而山楂长久以来，就是被归类于药食两用的食品，可以长期使用，疗效确切及服用方便、可以长期服用的产品。在有关山楂的复方制剂用于临床的报告非常多，但主要是在心血管、降血脂、降血压方面的应用，并未有关于山楂对于骨质疏松的预防与治疗上的相关报导。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种预防/治疗骨质疏松症的组合物及其制备方法，将山楂萃取物应用在于骨质疏松症的预防与治疗，不但可以达到明显的使用效果，且无毒性安全的顾虑。
本发明的另一目的在于提供一种预防/治疗骨质疏松症的组合物及其制备方法，其药材取得与质量控制皆较为容易，可获得极大的经济效益。
因此，为达上述目的，本发明提供了一种预防/治疗骨质疏松症的组合物，该组合物包含有山楂萃取物为其有效成分。
该山楂萃取物是选自山楂叶、山楂果或山楂果和山楂叶混合物经萃取后的萃取物。
该山楂果萃取物或该山楂叶萃取物所占的比例为20~80重量百分比，较佳比例为30~70重量百分比。
该组合物是与一载体相结合，该载体可为贴片。
该组合物更包含一种以上的药理学上可接受的添加剂。
组合物的该添加剂可选自佐剂、赋形剂或稳定剂，其中该佐剂选自含镁物质或含钙物质；该含镁物质是氧化镁或脂肪酸镁；以及该赋形剂可选自含钙物质、维生素D3、淀粉、糊精、葡萄糖(glucose)或碳酸镁。
该组合物，更包含有含钙物质、维生素D3或微量元素；其中该含钙物质选自磷酸二氢钙(calcium phosphate，monobasic)、磷酸氢钙(calcium phosphate，dibasic)、无水磷酸氢钙(calcium phosphate，dibasic(anhydrous))、磷酸钙(calcium phosphate，tribasic)、乳酸钙、葡萄糖酸乳酸钙(calcium gluconolactate)、抗坏血酸钙、氧化钙、碳酸钙或本多酸钙(calcium pantothenate)；以及该微量元素可选自钙、镁、磷、锌或铜。
该组合物为膏、丹、丸、散、锭剂、胶囊、经皮吸收贴剂、长效型缓释剂、鼻吸剂、喷剂、液剂、注射粉剂、注射液剂、即溶剂、颗粒剂或饮料的形式。
本发明提供了一种预防/治疗骨质疏松症的组合物的制备方法，步骤包含提供一物质，该物质含有山楂，且该山楂可为山楂叶、山楂果或山楂果与山楂叶混合物；对该物质加入一萃取溶剂以得到一萃取混合物，并加热该萃取混合物；冷却并过滤该萃取混合物；及干燥并粉碎该过滤后的萃取混合物，以取得一山楂萃取物。
该制备方法的该萃取溶剂选自水、醇、酮与酯类的群组组合物。
由发明的实验结果证实本发明利用单方山楂叶萃取物、单方山楂果萃取物、单方山楂叶萃取物加上单方山楂果萃取物，及个别加上含钙物质，的确可增加成骨细胞的生成，且其效果非常明显。
另外，关于本发明的组合物本身即为中国几年来的食品，经过几千年的实用，并无任何不良的毒性反应。经过细胞毒试验，证实并无毒性，是一种安全可靠的产品。
再者，单独山楂叶萃取物、单独山楂果萃取物、山楂叶搭配山楂果萃取物可再加上含钙物质、维生素D3或微量元素，更具有提高成骨细胞及抑制蚀骨细胞的功效。
另外，本发明也可另外添加为本领域中具有通常知识者所熟知的添加剂，如一或多种以上药理学上可接受的佐剂、赋形剂或稳定剂等，或者是与载体作结合，以增进预防及治疗骨质疏松症的疗效。
图1是本发明进行细胞存活率测定的试验结果的条形图；图2是本发明进行碱性磷酸脢测定的试验结果的条形图；图3是本发明进行乳酸脱氢脢测定的试验结果的条形图。
具体实施例方式
本发明所提供的预防/治疗骨质疏松症的组合物，乃含有中草药材料，即山楂果、山楂叶、或者山楂果与山楂叶混合物的萃取物。山楂在中国传统是一种食物，所以原药材资源非常丰富，价格较便宜，有效成分含量较高，质量容易控制。
山楂(Hawthorn)为蔷薇科植物山里红、山楂(Crataeguspinnatifida Bunge)的成熟果实，果实含左旋表儿茶精(epicatechin)、檞皮素(quercetin)、金丝桃苷(hyperoside)，绿原酸(chlorogenicacid)、枸橼酸(citric acid)及其单甲酯(citric acid symmetricalmonomethyl ester)、二甲酯(citric acid symmetrical dimethyl ester)和三甲酯(citric acid trimethyl ester)、蔗糖(sucrose)、黄烷聚合物(flavan polymers)，还含熊果酸(ursolic acid)…等成分。这些成分经过萃取纯化之后，即可以含有增进成骨细胞及抑制蚀骨细胞的效果。
实施例一取干燥山楂果材料500公克(g)，较佳为粉末形式，于5公升(L)的容器内，并加入混合物质4~10倍体积的20％~80％乙醇，较佳为2800毫升(ml)的50％乙醇作为萃取溶剂，在50~70℃下加热3~10小时后即冷却过滤。接着，把滤液减压浓缩至呈糊状，再加入5％~80％的赋型剂(如含钙物质与维他命D3等)后(也可使用喷雾干燥或冷冻干燥)，干燥粉碎即得粉末状萃取物。
实施例二取山楂叶材料500公克，较佳为粉末形式，于5公升的容器内，并加入材料4~10倍体积的20％~80％乙醇，较佳则为2800公升的50％乙醇作为萃取溶剂，在50~70℃下加热3~10小时后即冷却过滤。接着，把滤液减压浓缩至呈糊状，再加入5％~80％的赋型剂(如碳酸钙与维他命D3等)后(也可使用喷雾干燥或冷冻干燥)，干燥粉碎即得粉末状萃取物。
在本发明的制备方法中，所使用的萃取溶剂可为单一的非极性溶剂或极性溶剂，或是二种以上单一非极性溶剂或极性溶剂的混合。适合的非极性溶剂或极性溶剂，例如但不限于水、醇、酮或酯类。液体的用量，则为本领域中具有通常知识者实施本发明时可视情况斟酌决定。
进一步经由适当的细胞试验，可发现本发明的含有山楂果单独萃取物、山楂叶单独萃取物、或山楂果及山楂叶萃取物的组合物，以及各别再加上含钙物质后，能明显地促进骨细胞生成及抑制蚀骨细胞的生成，且显示并无细胞毒性产生。
在含有山楂果萃取物及山楂叶萃取物的组合物中，山楂果萃取物较佳的比例约为20~80重量百分比，更佳约为30~70重量百分比；而山楂叶萃取物的较佳比例约为20~80重量百分比，更佳约为30~70重量百分比。山楂果及山楂叶萃取物单方使用也有功效。此外，本发明的组合物也可添加为本领域中具有通常知识者所熟知的添加剂，如佐剂、赋形剂或稳定剂等，或者，组合物可根据需要与载体作结合。可用的佐剂可为氧化镁或脂肪酸镁等含镁物质及含钙物质；可用的赋形剂可为含钙物质、淀粉、糊精、葡萄糖(glucose)或碳酸镁等；可用的载体可为贴片。
并且，本发明的组合物，不论是单方或是复方及单方、复方加上含钙物质，都可以制成医药及食品业界常用剂型及投药方式，例如膏、丹、丸、散、锭剂、胶囊、经皮吸收贴剂、长效型缓释剂、鼻吸剂、喷剂、液剂、注射粉剂、注射液剂、即溶剂、颗粒剂、饮料等投药剂型。
本发明亦可添加一或多种含钙物质、维他命D3或其它常见的微量元素，可增强本发明的组合物的治疗效果，其添加比例为整体组合物的5~80％。上述的含钙物质，亦可作为佐剂、载体、赋型剂或稳定剂等添加剂。其中，含钙物质可为磷酸钙类如磷酸二氢钙(calcium phosphate，monobasic)、磷酸氢钙(calcium phosphate，dibasic)、无水磷酸氢钙(calcium phosphate，dibasic(anhydrous))、磷酸钙(calciumphosphate，tribasic)，或为乳酸钙、葡萄糖酸乳酸钙(calciumgluconolactate)、抗坏血酸钙、氧化钙、碳酸钙、或本多酸钙(calciumpantothenate)。微量元素则可为钙、镁、磷、锌、铜等。
重要的是，本发明所使用的山楂叶或山楂果是中国传统几千年来药食两用的材料，经过几千年的使用，是一种安全的食品；且在细胞毒试验中，并无细胞毒产生。
接着，藉由一些细胞实验对于本发明的功效加以验证，以下详细说明其实验内容。
A.实验动物新生大白鼠(Wistar)B.生化及化学试剂1.Pentothal注射2.培养液1x Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)
3.胎犊血清(fetal calf serum，FCS)4.盘尼西林-链霉素(Penicillin-Streptomycin，PS5.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline，PBS)6.胶原蛋白分解酵素(collagenase)7.10x胰蛋白酵素(Trypsin-EDTA)8.二甲基亚(Dimethyl sulfoxide，DMSO)M.W.＝78.139.血液乙醇(Ethanol，EtOH)10.钙化胆固醇(Vit.D3)11.3-[4，5-Dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)12.37％甲醛(Formaldehyde)13.碱性磷酸酶试剂(Alkaline phosphatase reagent)14.乳酸脱氢试剂(Lactate dehydrogenase reagent)15.Wizard基因组DNA抽提试剂盒(Genomic DNA PurificationKit)C.药材控制组以DMEM+10％FBS(DF)培养实验组分为六组山楂果萃取物山楂叶萃取物山楂叶萃取物+山楂果萃取物山楂果萃取物+含钙物质山楂叶萃取物+含钙物质山楂叶萃取物+山楂果萃取物+含钙物质D.方法1.细胞培养购买初生三天的幼鼠，以麻醉剂由肚脐上方打入0.5mL PENTOTHAL过量致死，泡酒精消毒，在开刀前以食盐水冲掉酒精，取头盖骨与肺脏置于DF中保持新鲜，头盖骨先以PBS冲洗数次，取出头盖骨置于培养皿上，用剪刀剪碎成泥状。将骨碎屑以PBS冲洗数次，稍微离心、移除上层液(含血球)，重复此步骤两次。加入0.2％胶原蛋白分解酵素4毫升，置入37℃ 5％二氧化碳培养箱中30分钟。吸取上层胶原蛋白分解酵素2毫升，再加入新鲜胶原蛋白分解酵素2毫升再置于37℃ 5％二氧化碳培养箱中30分钟，加入PBS稀释10倍以上终止酵素作用，离心1500rpm 5分钟，移除上清液，加入DF定量到1毫升待用。用软针吸取DF冲肺脏，将肺脏细胞冲出，搜集含肺脏细胞的DF溶液于离心管中，离心1500rpm10分钟，移除上清液定量到1毫升待用。以细胞计数盘计算造骨细胞与肺脏细胞的数量，造骨细胞与肺脏细胞以1∶75混合，在培养皿中以D3DF培养基培养，置入37℃ 5％二氧化碳培养箱中7天后作进一步的细胞测试。
造骨细胞培养则不需要与肺脏细胞一起培养，只需以上述的头盖骨处理流程，即可以DF培养基培养造骨细胞，同样置入37℃ 5％二氧化碳培养箱中7天后作进一步的细胞测试。
2.生化分析控制组以DMEM+10％FBS(DF)培养实验组分为六组山楂果萃取物山楂叶萃取物山楂叶萃取物+山楂果萃取物山楂果萃取物+含钙物质山楂叶萃取物+含钙物质山楂叶萃取物+山楂果萃取物+含钙物质2-1.细胞存活率测定(MTT assay)由细胞培养步骤所得96 well micro-plate培养2天后去除DF，造骨细胞加入180奈升(μL)DF(或蚀骨细胞加入含10nM/mL Vit.D3、CaCO3的DF)与不同浓度中药萃取液培养。于加药后的第1、3、7天测定细胞存活率，先去除培养液后加入25奈升MTT溶液(5mg/mL)，在37℃培养4小时，除去反应剩余的MTT溶液，再加100奈升0.04NHCl-isopropanol，以Microelisa reader测定570奈米吸光值。
2-2.碱性磷酸脢(Alkaline phosphatase，ALP)测定a.造骨细胞或蚀骨细胞分盘于6well plate培养2天后，去除培养液，加入DF(或CaCO3、Vit.D3 10nM/mL DF)2.7毫升与固定浓度中药(由MTT求得)培养，加药后不同时间(1、3、7天)分别收集培养液与细胞，储存于-70℃。细胞进行酵素测定前须以超音波样品处理器于冰浴下震碎细胞。
b.96 well micro-plate加入培养液或细胞液5奈升与Alkalinephosphatase reagent 250μL，置于Microelisa reader波长405奈米下读吸光值，所得细胞液或培养液吸光值可换算ALP含量(U/mL)。
2-3.乳酸脱氢脢(Lactate dehydrogenase reagent，LDH)测定a.培养液与细胞收集方式同2-2。
b.96well micro-plate加入培养液或细胞液10奈升与Lactatedehydrogenase reagent 200奈升，置于Microelisa reader波长340奈米下读吸光值，所得细胞液或培养液吸光值可换算LDH含量(U/L)。
表1、本发明的组合物以空白对照组、山楂叶单方、山楂果单方萃取、山楂叶萃取加上山楂果萃取及以上三组相同浓度(10ng)分加上含钙物质，进行细胞7天存活率试验(MTT assay)，而图1即为此试验结果的条形图。
表1
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与空白对照组比较在本试验中，可以看出不管是单独山楂果萃取物、单独山楂叶萃取物、或是山楂果萃取物加上山楂叶萃取物以及前述三项加上含钙物质的组合物，其对于成骨细胞均有促进增生的效果，而且其增生效果是非常明显的。
表2、本发明的组合物以空白对照组、山楂叶单方萃取物、山楂果单方萃取物、山楂叶萃取物加上山楂果萃取物及以上三组相同浓度(10ng)分加上含钙物质，进行成骨细胞的碱性磷酸脢(Alkaline phosphatase，ALP)测定，而图2即为此试验结果的条形图。
表2
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与空白对照组相比较由以上的数据得知，六组试验组数据，在ALP的测定都没有明显变化，可以说明这些细胞都一直保持在造骨细胞(osteoblast)的表现型(phenotype)，由于ALP的增加是在造骨细胞分化为硬骨细胞(osteocyte)时会大量产生，所以说明此测试期间内的细胞没有分化。
表3、细胞毒性试验本发明的组合物以空白对照组、山楂叶单方萃取物、山楂果单方萃取物、山楂叶萃取物加上山楂果萃取物及以上三组相同浓度(10ng)分加上含钙物质，进行成骨细胞的乳酸脱氢脢(Lactate dehydrogenasereagent，LDH)测定，而图3即为此试验结果的条形图。
表3
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与空白对照组相比较本发明的六组组合物由LDH的测定，第1天，第3天和第7天的蚀骨细胞，经过LDH的测定的后并没有明显的增高，故无毒性反应，是一种安全可靠的产品。
在上述实验结果中，证实本发明利用单方山楂叶萃取物、单方山楂果萃取物、单方山楂叶萃取物加上单方山楂果萃取物，及个别加上含钙物质，的确可增加成骨细胞的生成，且其效果非常明显。
另外，关于本发明的组合物本身即为中国几年来的食品，经过几千年的实用，并无任何不良的毒性反应。经过细胞毒试验，证实并无毒性，是一种安全可靠的产品。
虽然本发明以前述的实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。在不脱离本发明的精神和范围内，所为的更动与润饰，均属本发明的专利保护范围，都应涵盖在本发明的保护范围的内。
权利要求
1.一种预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于包含有山楂萃取物为其有效成分。
2.根据权利要求1所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于该山楂萃取物是选自山楂叶、山楂果或山楂果和山楂叶混合物经萃取后的萃取物。
3.根据权利要求2所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于该山楂果萃取物或该山楂叶萃取物所占的比例为20~80重量百分比。
4.根据权利要求1所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于该组合物是与一载体相结合，该载体可为贴片。
5.根据权利要求1所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于更包含一种以上的药理学上可接受的添加剂。
6.根据权利要求5所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于该添加剂是选自佐剂、赋形剂或稳定剂，其中该佐剂是选自含镁物质或含钙物质；该含镁物质是氧化镁或脂肪酸镁；以及该赋形剂是选自含钙物质、维生素D3、淀粉、糊精、葡萄糖或碳酸镁。
7.根据权利要求1所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于还包含有含钙物质、维生素D3或微量元素；其中该含钙物质是选自磷酸二氢钙、磷酸氢钙、无水磷酸氢钙、磷酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸乳酸钙、抗坏血酸钙、氧化钙、碳酸钙或本多酸钙；以及该微量元素是选自钙、镁、磷、锌或铜。
8.根据权利要求1所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于该组合物为膏、丹、丸、散、锭剂、胶囊、经皮吸收贴剂、长效型缓释剂、鼻吸剂、喷剂、液剂、注射粉剂、注射液剂、即溶剂、颗粒剂或饮料的形式。
9.一种预防/治疗骨质疏松症的组合物的制备方法，其特征在于包括步骤提供一物质，该物质是含有山楂，且该山楂为山楂叶、山楂果或山楂果与山楂叶混合物；对该物质加入一萃取溶剂以得到一萃取混合物，并加热该萃取混合物；冷却并过滤该萃取混合物；及干燥并粉碎该过滤后的萃取混合物，以取得一山楂萃取物。
10.根据权利要求9所述的预防/治疗骨质疏松症的组合物的制备方法，其特征在于该萃取溶剂选自水、醇、酮与酯类的群组组合物。
全文摘要
本发明提供了一种预防/治疗骨质疏松症的组合物及其制备方法，利用以山楂萃取物为有效成分的组合物，用在骨质疏松症的治疗与预防上，可明显提高成骨细胞的生成及抑制蚀骨细胞的生成，此山楂萃取物可取自山楂果、山楂叶、或山楂果与山楂叶混合物的萃取物，无论是单方或复方的组合物皆有明显效果，此外，组合物也可以与含钙物质、维他命D3或微量元素共同使用，以加强功效。
文档编号A61K33/34GK101049357SQ20061006647
公开日2007年10月10日 申请日期2006年4月3日 优先权日2006年4月3日
发明者毛玉麟 申请人:毛玉麟