专利名称：一种丹参水溶性成分的衍生物erjt－12及其抗肿瘤应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丹参水溶性成分的衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
中药丹参是唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhizae Bge.，SM)的干燥根及根茎，性味苦微寒凉。丹参是我国传统医学中应用最广泛的中药之一，有悠久的临床应用历史。丹参首载于《神农本草经》，历代本草多有收载。《中华人民共和国药典》(2000年版第一部)归纳丹参的功能与主治为活血通络，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦等。以丹参为主的制剂有复方丹参注射剂、复方丹参滴丸及丹参片。近十年来主要应用于下列疾病冠心病、肺心病、缺血性中风、慢性肾功能不全、急性肾炎、急慢性肝炎等。
丹参的化学成分主要分为脂溶性成分和水溶性成分。20世纪早期的研究主要集中在以丹参酮为代表的脂溶性成分方面，经过几十年的努力，取得了巨大成就。丹参酮具有多种生物活性，主要表现为保护心肌、抗肿瘤、抗炎、抑制血小板聚集和抗血栓形成等；对丹参水溶性成分的研究起步较晚，主要原因是受到分离材料及分离鉴定技术的限制，而且早期的工作主要围绕在水溶性成分的分离和结构鉴定方面，涉及生物活性的研究较少。从70年代中期开始，对丹参水溶性有效成分的研究成为研究丹参的重要内容。丹参水溶性有效成分主要为丹酚酸，具有抗肝损伤和肝纤维化、保护心脑血管、防治动脉粥样硬化等作用。遗憾的是，丹参水溶性成分抗肿瘤方面的研究仍然很少。
1991年，香港中文大学黄乃正从丹参水溶性成分中分离到天然的苯并呋喃类化合物5-(3-羟基丙基)-7-甲氧基-2-(3-甲氧基-4-羟基)-3-苯并[b]呋喃甲醛，它是腺苷A1受体拮抗剂，在治疗心绞痛、心肌梗塞方面具有良好的应用前景。2004年，台湾学者发现，该化合物能够抑制多种人肿瘤细胞的生长，并能抑制肿瘤细胞微管蛋白的聚合。这一发现为探索丹参水溶性成分的抗肿瘤作用提供了重要参考。然而，上述化合物在丹参中的含量仅为0.1×10-6，因此，如果能够以这个天然化合物为基础，设计合成并筛选出抗肿瘤活性突出的新型衍生物，那是具有重要意义的事情。
发明内容
本发明的目的是提供一种丹参水溶性成分的衍生物ERJT-12。
本发明的另一个目的是提供上述衍生物ERJT-12在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明根据从丹参水溶性成分中分离到天然的化合物苯并呋喃类化合物5-(3-羟基丙基)-7-甲氧基-2-(3-甲氧基-4-羟基)-3-苯并[b]呋喃甲醛，设计合成衍生物ERJT-12，中文名称为2-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4-甲酰基-5-(2-甲氧基羧基乙基)-7-甲氧基苯并[b]呋喃；英文名称为2-(3’-methoxy-4’-hydroxyphenyl)-4-formyl-5-(2’-(methoxycarbonyl)ethyl)-7-methoxybenzo[b]furan；分子式C21H20O7；分子量为384.38；熔点为110～112℃；浅黄色固体。结构式如式(I) 该化合物以微管为靶点。体外药理实验表明，化合物ERJT-12对多种人肿瘤细胞，包括人乳腺癌MCF-7，人肺腺癌GLC82，人卵巢癌HeLa，胃腺癌MGC803，膀胱癌ECV304，口腔上皮癌KB-3-1和白血病CCRF/CEM细胞等，具有明显的生长抑制作用；Wright-Giemsa染色显示，化合物ERJT-12使乳腺癌MCF-7细胞阻滞于有丝分裂期(M期)；微管蛋白聚合活性实验表明，化合物ERJT-12能够抑制纯化微管蛋白的聚合。
本发明的有益效果本发明的化合物结构新颖，合成方法切实可行；该化合物具有显著的体外抗肿瘤活性，特别是其作用靶点明确，即作用于细胞的微管蛋白，而目前能够用于临床治疗的以微管蛋白为靶点的抗肿瘤药物非常有限。
图1为ERJT-12诱导人乳腺癌细胞MCF-7阻滞于有丝分裂期；图2为ERJT-12对微管蛋白聚合活性的影响。其中，a为对照细胞，b为ERJT-12处理细胞。
具体实施例方式
实施例1化合物ERJT-12的合成将3.0mmol化合物ERJT-11溶于10mL DMF中，0℃下滴加20mmol POCl3，r.t.搅拌20分钟，95℃加热搅拌2小时，将反应液倒入3.8g醋酸钠和4.6g氯化铵的30ml冰水溶液中，二氯甲烷(15mL×3)提取，饱和氯化钠水溶液洗涤(5mL×3)，无水NaSO4干燥，用100～200目硅胶柱层析，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2洗脱得产物ERJT-12。
ERJT-12的合成路线为 ERJT-12为浅黄色固体，产率为54％。产物经元素分析、IR谱、1H NMR谱、MS谱测定。分析结果如下元素分析(计算值/测定值)(％)C 65.63/65.89，H 5.21/5.25；IR谱υ3442，1729，1642，1508，1405，1287，1141，858，829，815cm-1；1H NMR谱(500MHz，CDCl3)δ2.73(2H，t，J＝8.0Hz，CH2)，3.42(2H，t，J＝8.0Hz，CH2)，3.68(3H，s，OCH3)，4.00(3H，s，OCH3)，4.11(3H，s，OCH3)，5.88(1H，br，OH)，6.66(1H，s，ArH)，6.98(1H，d，J＝8.5Hz，ArH)，7.38(1H，d，J＝2.0Hz，ArH)，7.49(1H，dd，J＝8.0Hz，2.0Hz，ArH)，7.67(1H，s，ArH)，10.49(1H，s，CHO)；FAB-MS谱m/z(％)384(M，48％)。
实施例2发明所述化合物的体外实验(1)化合物体外抗肿瘤细胞增殖实验所选细胞株包括人乳腺癌MCF-7，人肺腺癌GLC82，人卵巢癌HeLa，胃腺癌MGC803，膀胱癌ECV304，口腔上皮癌KB-3-1和白血病CCRF/CEM细胞等。取对数生长期肿瘤细胞制成一定浓度的细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入一定浓度的ERJT-12，对照孔不加化合物。培养72小时后加入一定量MTT，继续培养4小时，弃去培养液，每孔加入200ul二甲基亚砜，用酶标仪测定570/630nm双波长吸光光度值，计算抑制50％细胞生长的化合物浓度(IC50)。结果见表1。
(2)化合物诱导MCF-7细胞有丝分裂阻滞分别收集对照细胞和ERJT-12处理的细胞，用细胞固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定15分钟，离心后重悬细胞，滴片于载玻片上晾干，用Giemsa染液染色15～20分钟，用水冲洗掉多余的染液，晾干后于显微镜下观察。处于有丝分裂期的细胞核膜消失，染色体松散地分布于胞浆中，而间期细胞具有完整的核膜。结果见图1(放大300倍)a，对照细胞；b，ERJT-12处理细胞。
(3)微管蛋白聚合活性实验迅速融化-80℃保存的纯化微管蛋白溶液并放入冰浴，用聚合缓冲液稀释到2mg/ml，加入GTP至1mmol/L。从冰浴上马上取适量微管蛋白溶液加入比色杯，在紫外分光光度计350nm下调定为“0”点。然后将比色杯置于37℃保温，每5分钟测定吸光光度值一次，共45分钟。随着保温时间的延长，微管蛋白逐渐聚合，表现为OD值上升，直至达到坪值。重复上述过程，在样品中加入化合物ERJT-12或秋水仙素。根据记录的OD值绘制变化曲线。结果见图2。
表1ERJT-12体外抑制肿瘤细胞生长活性实验
IC50为50％抑制浓度体外药理实验表明，化合物ERJT-12对多种人肿瘤细胞，包括人乳腺癌MCF-7，人肺腺癌GLC82，人卵巢癌HeLa，胃腺癌MGC803，膀胱癌ECV304，口腔上皮癌KB-3-1和白血病CCRF/CEM细胞等，具有明显的生长抑制作用；Wright-Giemsa染色显示，化合物ERJT-12使乳腺癌MCF-7细胞阻滞于有丝分裂期(M期)；微管蛋白聚合活性实验表明，化合物ERJT-12能够抑制纯化微管蛋白的聚合。因此，化合物ERJT-12可用于制备抗肿瘤药物。
权利要求
1.一种丹参水溶性成分的衍生物ERJT-12，其分子式为C21H20O7；分子量为384.38；熔点为110～112℃；结构式如式(I)所示
2.权利要求1所述丹参水溶性成分的衍生物ERJT-12在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丹参水溶性成分的衍生物ERJT－12及其抗肿瘤应用。本发明根据从丹参水溶性成分中分离到天然的化合物苯并呋喃类化合物5－(3－羟基丙基)－7－甲氧基－2－(3－甲氧基－4－羟基)－3－苯并[b]呋喃甲醛，设计合成衍生物ERJT－12，该化合物以微管为靶点，对多种人肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用，能使乳腺癌MCF－7细胞阻滞于有丝分裂期，并能够抑制微管蛋白的聚合。
文档编号A61P35/00GK1803786SQ200610033300
公开日2006年7月19日 申请日期2006年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者冼励坚, 杨华, 庞冀燕, 许遵乐 申请人:中山大学