专利名称：利用转基因灵芝表达人胰岛素降血糖的方法
技术领域：
本发明涉及人工合成人胰岛素基因，并在编码区结构上加以修饰。选用真菌中强表达的启动子构造。置于适合灵芝转化的载体中，通过电击法或农杆菌介导法或PEG介导法遗传转化灵芝。获得表达人胰岛素的灵芝，并通过口服灌喂高血糖大鼠证明有效，从而提供了利用转基因灵芝降血糖的方法。
背景技术：
1、胰岛素胰岛素是由胰岛β细胞分泌的小分子蛋白质，分子量约6000kD，分子中有两条肽链，称为A链和B链，人胰岛素A链有21个氨基酸残基，B链有30个氨基酸残基，A、B链之间通过两个二硫键连接在一起(A链第7位的半胱氨酸残基与B链第7位的半胱氨酸残基连接，A链第20位的半胱氨酸残基与B链第19位的半胱氨酸残基连接)，A链内部有一个二硫键连接(A链第6位的半胱氨酸残基与第11位的半胱氨酸残基连接)。胰岛素分子的结构可分为六个片断A链中两段α螺旋(A1-A8和A12-A18)由A9到A11肽链连接，其中A6、A11由二硫键相连；B链的中部是一段α螺旋(B9-B19)，紧接着一个β回折(B20-B23)，其两端是两段运动性很大的伸展肽段(B1-B9和B24-B30)。六个片断中三段α螺旋和一个β回折是具有一定刚性的二级结构，组成了胰岛素分子的三维骨架，这是胰岛素发挥其生物功能所必需的最基本的空间结构要素。同时它们之间铰链式的相对运动，为胰岛素发挥各种复杂的生物功能提供了结构上的可能性(王志珍，梁栋材，1985)。
胰腺中的β细胞首先合成的是一个大分子的前胰岛素原(Preproinsulin)，以后加工成由86个氨基酸残基组成的胰岛素原(Proinsulin)，在酶的作用下，胰岛素原又进一步裂解，产生一个胰岛素分子和一段连接肽(C肽)。编码前胰岛素原的基因位于第11对染色体的短臂上，基因共有1355个碱基对，其编码区域包括3个外显子，分别编码前胰岛素原的前肽、B链和部分C肽以及A链和其他部分的C肽。
胰岛素起作用的方式是通过与受体的结合实现的。胰岛素的受体是一种跨膜糖蛋白，是由2个α亚单位及2个β亚单位组成的四聚体，前者分子量约为135000Da，后者分子量约为95000Da，4个亚单位由二硫键连接，一种非典型的酪氨酸蛋白激酶(PTK)受体。编码胰岛素受体的基因位于第19号染色体短臂之上，位置与低密度脂蛋白受体基因接近。α亚单位穿过细胞膜，一端暴露在细胞膜表面，具有胰岛素结合位点。β亚单位由细胞膜向胞浆延伸，是胰岛素引发细胞膜与细胞内效应的功能单位。胰岛素与α亚单位结合后，β亚单位中酪氨酸激酶被激活，使受体磷酸化，产生介体，从而调节细胞内酶系统活性，控制物质代谢。每种细胞与胰岛素结合的程度取决于细胞膜上的受体数目与亲和力，此二者又受血浆胰岛素浓度的调节。当血浆胰岛素浓度增高时，胰岛素受体数目下降，这种现象称下降调节。如肥胖的非胰岛素依赖型糖尿病人由于脂肪细胞膜上受体数下降，临床上呈胰岛素不敏感性，称为胰岛素抵抗。而当肥胖的非胰岛素依赖型糖尿病患者经饮食控制、体育锻炼后体重减轻时，脂肪细胞膜上胰岛素受体数增多，与胰岛素的结合力也增强，胰岛素又恢复了其控制血糖的正常功能。
2、糖尿病糖尿病是一个古老的疾病，其名字来源于病人小便中因含糖而味甜。糖尿病在临床上以高血糖为主要标志，常见的症状俗称“三多一少”，即多饮、多尿、多食、消瘦。
糖尿病的病因十分复杂，遗传因素和环境因素均能导致糖尿病。但所有的病因归根结底有三项，即胰岛素绝对缺乏、胰岛素相对缺乏、胰岛素抵抗。因此，在β细胞产生胰岛素、血液循环系统运送胰岛素以及靶细胞接受胰岛素并发挥生理作用这三个步骤中任何一个发生问题，均可引起糖尿病。
A.胰岛β细胞水平由于胰岛素基因突变，β细胞合成变异胰岛素，或β细胞合成的胰岛素原结构发生变化，不能被蛋白酶水解，均可导致II型糖尿病的发生。而如果β细胞遭到自身免疫反应或化学物质的破坏，细胞数显著减少，合成胰岛素很少或根本不能合成胰岛素，则会出现I型糖尿病。
B.血液运送水平血液中抗胰岛素的物质增加，可引起糖尿病。这些对抗性物质为胰岛素受体抗体及一些激素类物质。胰岛素受体与其抗体结合后，便不能再与胰岛素结合，因而胰岛素不能发挥生理性作用，从而导致血糖升高，引起糖尿病。激素类物质也可对抗胰岛素的作用，如儿茶酚胺。皮质醇在血液中的浓度异常升高时，亦可致血糖升高。
C.靶细胞水平胰岛素受体数量减少、受体与胰岛素亲和力降低以及受体的缺陷，均可引起胰岛素抵抗、代偿性高胰岛素血症。这些因素最终使胰腺β细胞逐渐衰竭，血浆胰岛素水平下降。胰岛素抵抗在II型糖尿病的发病机制中占有重要地位。
根据对糖尿病病因的进一步认识，世界卫生组织(WHO)于1996年对糖尿病的分型分类进行了新的修订。WHO在1985年已制定了一套糖尿病的分类方法，鉴于这套分类方法中的胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)主要是基于治疗层面的分类，但不能反映其发病机制的差异，因此在1996年的修订中取消了IDDM和NIDDM的命名术语，而保留了I型及II的分型方法，并在亚型充分体现其发病机制的差异。新的分型分类方法同时取消了糖耐量损害(IGT)的分型，因为IGT是糖尿病发展过程中的一个阶段，而不是一种疾病。
糖尿病最新分型、分类法(WHO，1996年12月)(一)I型糖尿病胰岛β细胞破坏致胰岛素缺乏1.自身免疫性(1)急性发病(1)缓慢发病2.特发性(二)II型糖尿病1.胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌不足2.胰岛素分泌不足为主伴或不伴胰岛素抵抗(三)特异型糖尿病1.胰岛β细胞功能基因缺失2.胰岛素作用的基因缺失3.胰腺外分泌疾病4.内分泌疾病5.药物及化学毒物所致6.感染7.非常见型免疫调节糖尿病8.某些遗传疾病糖尿病链尿霉素诱导的糖尿病大鼠模型链尿霉素(又称链脲佐菌素，英文Streptozocin，简称STZ)能破坏实验大鼠的胰腺β细胞，使得实验大鼠胰岛素的分泌水平降低，从而导致血糖升高，一般在断食4小时后血糖值仍高于14mmol/L，而大鼠正常的血糖值为4～8mmol/L。链霉素诱导的大鼠糖尿病模型是目前常用的糖尿病模型，它模拟了糖尿病患者β细胞分泌胰岛素功能降低的病因。
3、食用真菌生物反应器植物及食用真菌生物反应器通常是指利用转基因的整株植物或食用真菌子实体及菌丝作为工厂大量表达药物、植物次生代谢产物、工业用酶及新兴工业原料等产品。植物及食用真菌作为生物反应器由于具有可以直接口服、对蛋白质正确折叠、糖基化和组装，低廉的生产成本，避免了动物病原体的感染等优势，因此在表达疫苗、抗体及其他药用蛋白质方面具有广阔的应用前景。食用真菌如香菇、金针菇、灵芝等由于蛋白含量大，可以不长出子实体直接在培养基中振荡培养菌丝从而缩短了生长周期，因此也成为一类很有发展前景的生物反应器。
4、口服胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。对于I型糖尿病病人而言，降低血糖水平的方法通常有两种一种是注射胰岛素，另一种是胰腺移植。然而，注射胰岛素由于并非模仿胰腺β细胞分泌胰岛素的生理过程，因此只能够控制病情的发展，而不能够使疾病的状况有所改善，并且有可能引起视神经萎缩、皮肤过敏和神经痛等副作用；胰腺移植则经常会引起较强的免疫排斥反应。
口服耐受性是对于口服蛋白质抗原特异的免疫反应，它最近被越来越多的人认为是一种治疗自身免疫疾病和防止移植排斥的好方法。作为一种达到口服耐受性的途径，口服胰岛素成为了一种新兴的治疗方法，并已引起人们的关注。它突破了传统的治疗方法，治疗目的在于防止或减轻β细胞自身免疫的损害，意图在高血糖症出现之前阻止其破坏。已有的实验表明，口服胰岛素可以对I型糖尿病的病情起到一定程度的改善，并且可以预防或延迟I型糖尿病的发生；同时对II型糖尿病也有一定的疗效。
口服胰岛素起作用的方式有两种(I)、没有被胃肠酶类降解的胰岛素穿过肠系膜系统进入血液循环系统，按照注射胰岛素相同的作用机理与肌肉、肝脏及脂肪等器官组织的细胞表面胰岛素受体结合，再通过一系列的后续反应起到降低血糖的作用。(II)、胰岛素及被降解后的部分胰岛素抗原片段激活肠道的粘膜免疫系统，这种自身抗原(即胰岛素和降解后的部分抗原片段)可以引发口服耐受性的产生，口服免疫性的一个作用就是使得原本有害的自身免疫反应被一种无害的过程所代替，可以起到对疾病的预防作用。I型糖尿病就是一种自身免疫疾病，胰腺β细胞分泌的胰岛素导致了人体产生攻击β细胞的T免疫细胞，从而使得β细胞慢慢失去功能。
发明内容
1、克隆了人胰岛素原类似物基因InsK将人胰岛素的B链和A链通过6个氨基酸的柔性连接短肽连接成一个完整的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，并在人胰岛素原类似物基因的C端添加了内质网滞留信号(Endoplasmic Reticulum retention signal)编码序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL)，并命名为人胰岛素原类似物基因InsK。
为了有利于合成的人胰岛素可以正确折叠成天然的构象，在人胰岛素的B链与A链之间设计了一个6个氨基酸的柔性连接短肽以代替胰岛素原的C肽。因为对天然人胰岛素的三维结构进行分析发现，B链C端和A链N端的空间线性距离为16.12埃，而线性排列的五肽的最小空间距离为16.0埃，为了不改变融合的多肽链中A链和B链的构象，推测它们之间的连接肽的最小残基数应不少于5个残基。考虑到B链C端和A链N端在空间上的取向相反，连接肽最好能形成β-转角结构。不同氨基酸在形成二级结构时具有不同的倾向和能力，其中Pro和Gly很少形成α-螺旋和β-折叠，而Pro，Gly，Asn，Ser在β-转角的构象中最常见，推测Gly-Pro-Ser的结构最有可能形成β-转角。基于以上考虑，本实验选用的连接肽序列为Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly。
2、构建了电击法及PEG介导法的表达载体pbinsK和农杆菌介导的表达载体p1300-GinsK在转基因灵芝中采用了香菇三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子驱动人胰岛素原类似物基因InsK，并构建了电击法及PEG介导法的表达载体pbinsK和农杆菌介导的表达载体p1300-GinsK。pbinsK载体以具有除草剂(PPT)抗性的bar基因为选择标记，无左边界序列(Left Border，LB)和右边界序列(Right Border，RB)，p1300-GinsK表达载体以具有除草剂(PPT)抗性的bar基因以及具有潮霉素(Hyg)抗性的hptII基因为选择标记，具有左右边界序列，适合农杆菌介导法转化灵芝。
三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD)是糖代谢途径中的一个关键酶，在糖酵解和糖异生作用中催化三磷酸甘油醛与磷酸甘油酸的相互转化()。NADH通过电子传递链产生三个ATP。该反应是酵解过程中唯一生成NADH的反应，是产生能量的重要一步。因此GPD蛋白在活细胞内含量极其丰富且持续表达。三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)在香菇中呈组成型强表达，GPD启动子在酵母和黑曲霉等工业用真菌中可以驱动外源基因的高效表达(Bitter and Egan 1984)。灵芝与香菇同属于真菌，采用GPD启动子有效解决了人胰岛素原类似物基因在转基因灵芝中的高效表达。
3、通过电击法、PEG介导法及农杆菌介导法遗传转化灵芝利用溶壁酶降解灵芝细胞壁以制备原生质体，在加入高浓度质粒pbinsK后进行电击和PEG转化，在含有PPT(20μg/ml)的筛选CYM培养基上培养5～7天后有转化子长出；农杆菌介导法则无需制备灵芝原生质体，将一定浓度的灵芝菌丝悬浮液与含有表达载体p1300-GinsK的农杆菌LBA4404菌株共培养2天，然后在上层倒上CYM筛选培养基(PPT浓度20μg/ml)，7～10天后有具有PPT抗性的转化子长出。通过电击法、PEG介导法及农杆菌介导法转化的灵芝品种之间差异较小，我们获得了赤芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(Ganoderma japonicum)及南方灵芝(Ganoderma australe)的阳性转基因灵芝株系，由于不同灵芝品种之间的差异较小，因此用同样的方法可以获得薄盖灵芝(Ganodermacapense)、树舌(Ganoderma applanatum)以及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金针姑、猴头等，以及药用真菌虫草菌(Cordyceps sinensis)等。
4、灵芝子实体的培养及孢子的收获所得含有上述胰岛素基因结构的灵芝菌株接种于含木屑、麦麸等成分的固体培养基上。子实体培养基采用通用的木屑加麦麸，即三份体积的细木屑加一份体积的麦麸，加水(含水量80％)，混匀，装瓶(或装于耐高温的塑料袋内)，灭菌。接种后置28℃培养。待菌丝长满后置28℃高湿(相对湿度80-90％以上)条件下使其分化出子实体，长出菌伞。随着菌伞的成熟过程，形成大量灵芝孢子粉。在洁净的条件下，收集灵芝孢子粉。此灵芝孢子粉具有高含量的人胰岛素。此灵芝孢子粉中人胰岛素含量通常不低于试验中的菌丝体。因其具有更为浓密的原生质成分。孢子中代谢稳定，人胰岛素得到很好的保护。孢子粉的外壳及所具有的萌发孔，对人胰岛素在肠道中起缓慢释放的作用。
5、PCR和ELISA检测人胰岛素原类似物基因的整合及表达量将具有PPT抗性的灵芝培养出一定数量，采用SDS法提取灵芝总DNA，并采用PCR检测转基因灵芝中的GPD-InsK片段，以此判断外源基因是否整合到灵芝基因组中。为了定量检测转基因灵芝中人胰岛素原类似物的表达量，采用ELISA方法检测，以人胰岛素标准品为参照作标准曲线。实验结果表明人胰岛素原类似物在转基因灵芝中表达量能达到抽提总蛋白的4.40％～10.40％，每克灵芝菌丝或孢子鲜重中含有的人胰岛素原类似物质量为105.0μg～174.8μg。
6、高血糖大鼠灌喂实验证实转人胰岛素灵芝具有口服降血糖作用为了验证转基因灵芝中含有的人胰岛素原类似物能否在灵芝细胞壁和细胞膜的包裹下避免在胃肠道被大量降解，我们设计了高血糖大鼠灌喂实验。挑选48只体重均为250克左右的雄性大鼠(SD品系)，按照60mg/kg的剂量腹腔注射链尿佐菌素(streptozocin，STZ)来制作高血糖大鼠模型，挑选血糖值14mmol/L以上的大鼠作为造模成功的高血糖大鼠模型。挑选其中的30只大鼠按照血糖值由低到高排序并随机分为三组，每组10只，使得低、中、高血糖的大鼠比较均匀地分入三组中。为了验证转基因灵芝的血糖较低功效是由于转入的人胰岛素原类似物表达所产生的，而非灵芝本身的功效，因此除了做灌喂生理盐水为对照，还以灌喂未转基因的普通灵芝为对照。对实验数据的Student’s t检验表明灌喂转基因灵芝的大鼠组血糖水平与灌喂未转基因灵芝的对照组相比有极显著性降低(P＜0.0002)，除了2只血糖值下降在误差范围内，余下的80％大鼠血糖值均有大幅度下降，下降的最高幅度可达64％。
本发明的有益效果本发明的有益效果在于利用食用真菌灵芝作为生物反应器高效表达了人胰岛素原类似物，每克灵芝菌丝或孢子鲜重中人胰岛素原类似物的含量可以达到105.0μg～174.8μg的水平。高血糖大鼠灌喂实验表明口服这种转基因灵芝在4小时后可以大幅度降低大鼠的血糖水平，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.0002)，从而说明本专利发明的方法制备了一种可以用来治疗糖尿病的转基因灵芝。
四、附图简要说明
图1是表示灵芝表达载体pbinsK构建流程的示图。
图2是表示灵芝表达载体p1300-GinsK构建流程的示图。
图3是电击法转化灵芝原生质体在CYM筛选培养基上的再生。
图4是PEG介导法转化灵芝原生质体在CYM筛选培养基上的再生。
图5是农杆菌介导法转化灵芝菌丝在CYM筛选培养基上的再生。
图6是转基因灵芝的热启动PCR检测。
PCR检测的片段为GPD-InsK，谱带从左到右编号依次为M，+，-，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11。其中M为λDNA/HindIII+EcoRI Marker，+为正对照p1300-GinsK，-为负对照ddH2O，1-11表示不同转基因灵芝株系。热启动PCR是指在94℃10分钟后加入Taq聚合酶。
图7是转基因灵芝Western点杂交。
从左到右依次编号1，2，3，4，5，6。上排表示样品原液，下排表示稀释10倍的样品。其中1为未转基因灵芝，2-6为不同转基因灵芝株系。
图8是转基因灵芝Western杂交。
从左到右依次编号1，2，3，4，5。其中1为未转基因灵芝，2-5为不同转基因灵芝株系。
图9是高血糖大鼠模型灌喂未转基因灵芝后血糖变化图。
从图中可以看出在灌喂前后大鼠的血糖无明显变化，统计学数据显示灌喂前后无显著性差异(P＝0.210)。
图10是高血糖大鼠模型灌喂转基因灵芝4小时后血糖变化图。
从图中可以看出在灌喂后大鼠的血糖明显下降，统计学数据显示灌喂前后有极显著性差异(P＜0.0002)。
图11是高血糖大鼠模型灌喂转基因灵芝4小时及20小时后血糖变化图。
本图反映了灌喂转基因灵芝后4小时大鼠血糖降低及20小时后部分大鼠血糖恢复的情况。
五具体实施例方式所有实施例中的细菌培养和DNA操作均参考《分子克隆实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Promega公司，New EnglandBiolabs公司。
实施例1 InsK基因的克隆根据Murray E.E.等人提供的植物中使用密码子的情况，推测植物偏爱密码子。将人胰岛素原类似物基因InsK的双链分成8段，使得两条链5’端的一端略短，同时可作为PCR反应的引物，另外3’端略长，彼此相互重叠并覆盖基因全长。注意分段时尽量以G、C作为结尾。
表1双链法合成InsK基因所用的8条链
双链DNA的处理第一步将8条寡聚核苷酸引物以每管2.5OD的量合成，并按照下表无菌水的量稀释，使得每一条寡聚核苷酸引物的终浓度均为0.11nmol/μl表2合成InsK基因所用的8条寡聚核苷酸引物基本信息及稀释情况
第二步5’端加磷反应上述8管各取10μl分别加入0.5ml的Eppendorf管中，在冰上放15min，其后进行加磷反应。加磷反应于37℃反应1hr以上，反应体系为25μl体系寡聚核苷酸引物 10μlT4寡聚核苷酸激酶(稀释10倍) 2.5μl10×缓冲溶液 2.5μl无菌水 10μl第三步退火将加磷后的8个片段各取5μl，加入0.2ml Eppendorf管中，再加入10μl10×T4连接酶缓冲溶液及15μl无菌水，混匀；95℃放置10min，用沸水浴逐渐冷却至室温，后转移至4℃冰箱，慢慢冷却。
载体pGEM-11Z的酶切用碱裂解法提取pGEM-11Z质粒，并用EcoRI和BamHI消化pGEM-11Z质粒载体，酶切过夜后补无菌水400ul，用2倍无水乙醇沉淀，其后溶解至30ul。酶切体系为100μl体系pGEM-11Z质粒 59μl10×缓冲溶液 10μlEcoRI 3μlBamHI 3μlRNase 4μl无菌水 21μl碱裂解法提取细菌质粒的步骤(1)、挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜(14～16小时为宜)；(2)、取1.5ml菌液加入1.5ml的Eppendorf离心管中，7000rpm离心20秒；(3)、倒掉上清再加入1.5ml菌液，7000rpm离心20秒后倒掉上清液并倒置于吸水纸上，尽量让液体流尽(这一步相当于富集了菌液3.0ml)；(4)、加入300μl溶液I(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH＝8.0)并于漩涡器上将菌液完全漩涡混匀；(5)、加入新鲜配置的溶液II(0.2mol/L NaCl，1％SDS)300μl，轻轻上下颠倒混匀，并置于冰上2分钟；(6)、加入300μl预冷的溶液III(100ml溶液中加5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，无菌水28.5ml)，上下颠倒混匀5～6次，置于冰上5分钟；(7)、12000rpm离心5分钟；(8)、取出上清液至另一管中，并加入450μl氯仿(CI)，颠倒混匀后12000rpm离心5分钟；(9)、取上清液至另一管中，加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀后室温放置10分钟以上；(10)、12000rpm离心5分钟；(11)、弃上清液，沉淀晾干后每管分别加入200μl无菌水，待其溶解后加入100μl预冷的乙酸铵(7.5mol/L)，颠倒混匀后于冰上放置8分钟；(12)、12000rpm离心5分钟；(13)、取上清液入另一管，加入250μl异丙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟以上；(14)、12000rpm离心5分钟；(15)、弃上清液，在吸水纸上使液体尽量流尽，加入500μl 70％的乙醇进行洗涤并真空抽干；(16)、质粒用20μl无菌水溶解。
人胰岛素原类似物基因InsK与载体的连接将退火后的体系取出，冰上放置10min，再加入载体pGEM-11Z酶切后沉淀的大片段27μl及8μl T4DNA连接酶(3U/μl)，于16℃连接过夜。连接体系为100μl体系寡聚核苷酸引物 8×5μl(即8条引物各加5μl)载体大片段 27μl10×连接酶缓冲溶液 10μlT4DNA连接酶 8μl无菌水 15μl连接产物p11Z-InsK的转化及鉴定连接产物采用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，并通过蓝白筛和PCR扩增对重组子进行鉴定。对鉴定阳性的重组子进行测序，测序由上海生工公司进行。测序结果出来后通过DNAMAN分析软件与原来设计的序列进行比对，将核对后测序无误的重组子中所含的质粒命名为p11Z～InsK。
大肠杆菌感受态细胞的制备(1)、挑取大肠杆菌(E.coli)DH5α单菌落接种于100ml液体LB培养基中，37℃培养至OD600约0.4；(2)、冰浴10分钟，分装于无菌离心管中，4℃，4000rpm离心5分钟并收集细胞；(3)、重悬于600μl预冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分钟；(4)、4℃，4000rpm离心10分钟收集细胞。用100μl预冷的0.1M CaCl2重悬细胞沉淀，待用。
感受态细胞的转化(1)、取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；(2)、于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却2分钟；(3)、加200μl LB液体培养基，37℃振荡培养45分钟至1小时；(4)、均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
重组子的蓝白斑筛选对于载体上含有lacZ基因的重组质粒，可以利用X-Gal/IPTG选择培养基进行初步筛选，没有插入外源片段的自身环化质粒菌落为蓝色，插入外源片段的重组质粒转化子为白色菌落。pGEM-11Z质粒含有lacZ基因，BamHI和EcoRI酶切位点位于lacZ基因的中间，插入DNA片段后破坏了lacZ基因的读码框，因而可进行蓝白斑筛选。
PGR扩增反应体系为25μl，体系中各组分的用量如下DNA模板1μl5’引物1μl3’引物1μlPCR缓冲液(10×)2.5μlTaq酶 0.3μldNTP 0.2μl无菌水 19μl
PCR扩增反应条件如下 实施例2 灵芝表达载体pbinsK的构建用HindIII和BamHI完全消化pL221质粒，从中切出1.4kb的含有PLeGPD启动子的片段，回收该小片段，并将该片段连接至同样用HindIII和BamHI酶切消化并回收大片段的pGEM11Z-insK质粒中，构建成功的质粒命名为pLinsK。用HindIII和SacI从pLinsK质粒上切下含有GPD-insK的大小约1.6kb的片段，并将该片段连接至同样用HindIII和SacI酶切消化并回收大片段的pL321b质粒上，构建成功的质粒命名为pbinsK。构建流程见附图1。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
本构建流程中用到的初始质粒pL221和pL321b由本实验室的孙丽构建(见孙丽2001年博士论文)。
实施例3 灵芝表达载体p1300-GinsK的构建用HindIII和KpnI完全消化pbinsK质粒，从中切出3.4kb的片段，回收该片段，并将该片段连接至同样用HindIII和KpnI酶切消化并回收大片段的p1300-Super-PAnos质粒中，构建成功的质粒命名为p1300-GinsK。构建流程见附图2。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PGR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
本构建流程中用到的初始质粒p1300-Super-PAnos由美国Purdue大学StantonB.Gelvin教授实验室惠赠并在本实验室保存。
实施例4 电击法转化灵芝原生质体灵芝菌丝的培养将不同种类的灵芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方灵芝Ganoderma australe、薄盖灵芝Ganoderma capense)接种于CYM固体培养基，28℃培养5天。将活化好的菌种接种于装有玻璃珠的100ml液体CYM培养基中，28℃静止培养4～5天，每天摇瓶1～2次以打散菌丝。菌丝培养过程可以发现，紫芝和薄盖灵芝生长要快于赤芝和南方灵芝，此外树舌(G.applanatum)及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金针姑、猴头等，以及药用真菌虫草菌(Cordyceps sinensis)等也同样可以按照以下的实施例进行基因遗传转化和动物实验，也能达到相同的降血糖效果。
灵芝对除草剂的抗性将灵芝接种于含不同浓度除草剂(PPT)的CYM平板上(0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml)，28℃培养14天，以菌丝生长被显著抑制的最低除草剂浓度作为灵芝的抗性选择压力。
灵芝原生质体的制备将100ml菌丝培养物用4层医用纱布过滤，无菌水冲洗，无菌吸水纸吸干菌丝，将菌丝转移至15ml塑料螺口离心管中，加入1ml酶解液(1.5％溶壁酶，0.6M甘露醇，0.1MNa2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH5.6；液氮反复冻融3次灭菌后分装于Effendorf管中，-20℃保存)，充分混匀后置37℃水浴中酶解，每隔15min将离心管颠倒几次以促进原生质体的释放，显微镜下观察有大量原生质体释放时结束反应，加入2ml 0.6M甘露醇，混匀后倒入装有0.5cm脱脂棉柱的10ml玻璃注射器内过滤，滤液收集于Effendorf管中，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml 0.6M甘露醇离心洗涤2次，将纯化的原生质体悬浮于100μl 0.6M甘露醇中。
灵芝原生质体的再生将纯化的原生质体加入5ml CYM再生培养基(含0.6M甘露醇，1％低熔点琼脂糖；熔化后保持37～40℃)，混匀，倒入用30ml CYM再生培养基(含1％琼脂糖)铺好的平板上，待上层培养基完全凝固后，将平板用封口膜封好，置28℃温箱培养。
用于电击转化的质粒pbinsK的大量提取与纯化质粒的大量提取将含有质粒的E.coli DH5α接种于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的100ml液体LB培养基中，37℃摇床中培养至对数生长期，将菌体离心收集于50ml离心管中，加入5ml溶液I将菌体完全悬起，加入5ml溶液II，充分混匀，室温放置10min，加入5ml溶液III，混匀，冰浴5min，12000rpm 4℃离心5min，取上清，加入16ml异丙醇，混匀，12000rpm离心5min，DNA沉淀用1.2ml双蒸水溶解后平均分装于2个Effendorf管中进行纯化。
质粒的纯化分别取300μl 7.5M NH4Ac加入上述2个Effendorf管中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心5min，取上清，CI抽提后加入600μl异丙醇，12000rpm离心5min，两管沉淀合在一起，用250μl双蒸水溶解，加入250μl 5M LiCl(预冷)，-20℃放置10min，12000rpm离心5min，取上清，加入1ml乙醇，混匀，12000rpm离心5min，沉淀用300μl双蒸水溶解后加入300μl PEG溶液(13％PEG8000，1.6M NaCl)，混匀，12000rpm离心10min，沉淀300μl双蒸水溶解后加入150μl 7.5M NH4AC，-20℃放置10min，12000rpm离心10min，取上清，加入1ml无水乙醇，12000rpm离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤后真空抽干，加入50μl无菌双蒸水溶解，进行琼脂糖凝胶电泳检测质粒的含量，将质粒浓度调整至1μg/μl(保持无菌状态)，-20℃保存备用。
灵芝原生质体的电击转化将1ml电击缓冲液(0.6M甘露醇，10mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0)加入纯化的原生质体(107-108)，4000rpm离心5min，弃上清，将原生质体重悬于200μl电击缓冲液中，加入10μg质粒DNA，混匀后转入电击杯，冰浴10min，在电压500v、电容25μF、电阻400Ω的条件下施加一次电脉冲，冰浴10min，加入5ml CYM选择性再生培养基(含0.6M甘露醇，20μg/ml除草剂，1％低熔点琼脂糖；熔化后保持37～40℃)，混匀，倒入用30ml CYM选择性再生培养基(含1％琼脂糖)铺好的平板上，待上层培养基完全凝固后，将平板用封口膜封好，置28℃培养。
另取部分纯化的原生质体(不加质粒)，在CYM再生培养基上(不加除草剂)分别检测电击前与电击后的原生质体的再生率。
实施例5 PEG介导法转化灵芝原生质体灵芝菌丝的培养同实施例4。
用于PEG介导法质粒pbinsK的大量提取与纯化同实施例4。
灵芝原生质体的制备将100ml菌丝培养物用4层纱布过滤，无菌水冲洗，无菌吸水纸吸干菌丝，将菌丝转移至15ml塑料螺口离心管中，加入1ml酶解液(1.5％溶壁酶，0.6M甘露醇，0.1MNa2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH5.6；液氮冻融灭菌后分装于Effendorf管中，-20℃保存)，充分混匀后置30℃水浴2h(每隔15min将离心管颠倒几次以促进原生质体的释放)，加入2ml 0.6M甘露醇，混匀后倒入装有0.5cm脱脂棉柱的10ml注射器内过滤，滤液收集于Effendorf管中，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml MTC缓冲液(10mM CaCl2，0.6M甘露醇，10mM Tris-HCl，pH7.5)离心洗涤2次，将原生质体悬浮于100μl MTC缓冲液中。
PEG介导的灵芝原生质体转化取10μg经PEG纯化的质粒pbins或pbinsK加入100μl原生质体悬液中，混匀，冰浴10min，加入20μl PEG溶液(60％PEG4000，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)，混匀后冰浴20min，加入1ml PEG溶液，混匀后室温静置20min，加入5ml CYM选择性再生培养基(含0.6M甘露醇，40μg/ml除草剂，1％低熔点琼脂糖；熔化后保持37～40℃)，混匀，倒入用30ml CYM选择性再生培养基(含1％琼脂糖)铺好的平板上，待上层培养基完全凝固后，将平板用封口膜封好，置28℃培养。
实施例6 农杆菌介导法转化灵芝菌丝灵芝菌丝的培养将不同种类活化好的灵芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方灵芝Ganoderma australe、薄盖灵芝Ganoderma capense)接种于装有玻璃珠的500ml液体CYM培养基中，与28℃静止培养4～5天，每天摇瓶1～2次以打散菌丝，使得菌丝始终保持极小的不规则颗粒状。菌丝培养过程可以发现，紫芝和薄盖灵芝生长要快于赤芝和南方灵芝，此外树舌(G.applanatum)及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金针姑、猴头等，以及药用真菌虫草菌(Cordyceps sinensis)等也同样可以按照以下的实施例进行基因遗传转化和动物实验，也能达到相同的降血糖效果。
含有p1300-GinsK质粒的农杆菌LBA4404菌株的培养将含有p1300-GinsK质粒的农杆菌LBA4404接种到LB(Km100μg/ml+Sm100μg/ml+Rif50μg/ml)液体培养基中，于28℃振荡(250r/min)培养过夜，第2天加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为200μmol/L。农杆菌培养至OD660为0.6～0.8。
农杆菌介导法转化灵芝菌丝在超净台中用4层医用纱布过滤培养好的灵芝菌丝，并用无菌水洗涤4～5次，用1ml无菌水悬浮。取100μl悬浮的灵芝菌丝与100μl活化好的农杆菌LBA4404(p1300-GinsK)混匀，涂布在CYM固体培养基(1％琼脂糖)上于28℃共培养2天。2天后在培养基上倒入10ml筛选培养基(CYM固体培养基+PPT20μg/ml+Cb500μg/ml)，于28℃继续培养，大约7～10天后有白色的再生菌落出现。
实施例7 转基因灵芝的鉴定及人胰岛素原类似物含量的测定转基因灵芝总DNA的制备用双层纱布过滤不同种类灵芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方灵芝Ganoderma australe、薄盖灵芝Ganoderma capense)的菌丝，将收集到的菌丝用蒸馏水洗涤、滤纸吸干。取0.1g(湿重)菌丝置于1.5ml的effendorf管中，液氮冷冻数秒后将菌丝在研钵中充分研碎，加入800μl DNA提取缓冲液(50mM EDTA，0.5M NaCl，1.5％SDS，1％(v/v)β-巯基乙醇，0.1M Tris-HCl，pH8.0)，充分混匀后置65℃水浴15min，加入250μl 5M KAc，-20℃冰箱中放置5min，12000rpm离心5min，上清液转移后加入300μl CI，混匀后12000rpm离心5min，转移上清，加入600μl异丙醇，混匀后12000rpm离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤后置室温下晾干，用50μl无菌双蒸水溶解备用。
转基因灵芝总DNA的PCR鉴定PCR扩增反应以灵芝的总DNA为模板，以含有目的基因的质粒为正对照，无菌去离子水为负对照，在PE2000型PCR扩增仪(Perkin Elmer Co.)上进行。反应体系为25μl，在200μl无菌PCR专用管中依次加入无菌双蒸水 19μl10×PCR缓冲液(含15mM MgCl2) 2.5μl上游引物(10μM)GPDIns_5’或InsK 5’1μl下游引物(10μM)GPDIns_3’或Ins_new 3’ 1μldNTP(10mM) 0.3μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl模板 1μl扩增条件为94℃预变性10min，30个循环(94℃60s，50℃50s，72℃50s)后72℃延伸8min。如扩增效果不好，可采用热启动PCR，即在94℃预变性10min后再在每管中加入Taq DNA聚合酶。
用于检测Ins基因的引物InsK 5’，编号e5715，21bp，序列为5’-GTT AAC CAA CAC CTT TGC GGA T-3’
Ins_new 3’，编号e11582，22bp，序列为5’-GAG AGC AGA TAG AGG TGC AGC A-3′用于检测GPD-InsK这段DNA的引物GPDIns_5’，编号97831，22bp，序列为5’-ACC AAG AAA GCT CGT GAA GAG G-3’GPDIns_3’，编号97832，21bp，序列为5’-CCG CAA ACA AGG TAA AGA GCC-3’转基因灵芝总蛋白的提取将转基因灵芝与未转基因的对照接种于CYM液体培养基中，在转速为200rpm的摇床上28℃培养7d，取少量菌丝(约0.05g鲜重)放于研钵中，加液氮冷冻数秒后将其充分研碎，加入500μl提取缓冲液(0.1M PBS，0.001％NaN3，0.00029％PMSF)，混匀后12000rpm离心5min，取上清用于检测。
转基因灵芝Western点杂交(1)、将样品提取液用TNT buffer(TNT 100mmol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，0.5％Tween 20，pH8.0)缓冲液稀释10倍。
(2)、取未处理的尼龙膜，切去左上角标记，放在玻璃板上一块watman吸水纸上。
(3)、取转基因灵芝及未转基因灵芝的总蛋白提取液(未稀释和稀释10倍)各4μl，轻轻点在膜上，记下相应位置，取标样胰岛素4μl，1mg/ml点于对应位置。
(4)、在空气中室温晾干尼龙膜。
(5)、将干膜放入约10ml TNT buffer中，清洗10min(2次，换液一次)。
(6)、将膜转入含1％BSA的TNT buffer中，室温封闭1小时，轻轻摇动。
(7)、封闭后，用TNT buffer漂洗2次，5min/次(室温轻摇)。
(8)、加入用TNT buffer稀释的一抗(1∶10000)10ml，室温轻摇1小时。
(9)、用TNT buffer洗三次，每次10min。
(10)、加入10mlTNT buffer稀释的二抗(1∶2000)10ml，室温1小时。
(11)、用TNT洗3次，10min/次。
(12)、用AP buffer(0.1M NaCl，0.05M MgCl2，0.1M Tris-HCl，pH9.5)平衡10min后，加入20ml含显色剂NBT(133μl)/BCIP(67μl)的显色缓冲液，室温暗处显色10min～数小时。
(13)、用TNT buffer清洗5min，终止反应，用蒸馏水清泡5min后取出晾干，扫描。
转基因灵芝的ELISA测定用于计算人胰岛素原类似物含量溶液的准备1)包被液50mM Na2CO3-NaHCO3，pH9.6
2)洗涤液0.05％Tween-20，0.01M磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)，pH7.43)封闭液1％牛血清白蛋白(BSA)，洗涤液4)一抗溶液豚鼠抗人胰岛素抗体(干粉制剂用10ml洗涤液溶解后直接应用)或兔抗人胰岛素抗血清(抗血清用洗涤液稀释10000倍后应用)5)二抗溶液羊抗兔IgG-HRP或羊抗豚鼠IgG-HRP，根据对应的一抗加相应的二抗，用2000倍的洗涤液稀释后应用6)TMB显色应用液10ml PBS(0.1M，pH6.0)，100μl TMB储存液(60mg TMB粉末溶于1ml DMSO中，避光保存)，15μl H2O2(30％)7)终止液2M H2SO4ELISA检测的具体步骤为1)胰岛素标准品的包被在反应孔中加入100μl的用包被液配置的不同浓度梯度的胰岛素标准品(0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.5μg/ml，0.8μg/ml，1.0μg/ml)，同时在阴性对照中加入100μl包被液。
2)待测样品的包被在反应孔中加入90μl包被液，同时加入10μl待测样品。封上Pala Film膜后置4℃过夜或37℃恒温箱温浴1h。
2)封闭弃去孔内液体，每孔中加200μl洗涤液，静置3min后弃去，重复3次，扣在滤纸上吸去水分并用力甩干。每孔加入200μl封闭液，加膜后置37℃恒温箱1h，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次。
3)加入一抗取100μl已稀释好的一抗溶液加于孔中，加膜后置37℃恒温箱1h，用洗涤液洗涤3次。
4)加入二抗取100μl已稀释好的二抗溶液加于孔中，加膜后置37℃恒温箱1h，用洗涤液洗涤3次，用ddH2O洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分并用力甩干。
5)显色每孔加入100μl TMB显色应用液，等待3～5min至反应液变蓝后迅速加入50μl终止液终止反应，ELISA板放入BioRad酶标仪中读数并用热敏纸打出结果。
6)人胰岛素原类似物含量的计算根据胰岛素标准品的A450nm值及对应的浓度在Excel 2000中自动生成平滑线散点图，并作出线性回归直线和对应的等式，根据等式就可以算出不同转基因灵芝株系的人胰岛素原类似物含量。
转基因灵芝总蛋白含量的测定配制考马斯亮蓝试剂(0.01％考马斯亮蓝G-250，4.7％乙醇，8.5％磷酸)，用水配制不同浓度的BSA梯度溶液(100μg/ml，200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml)。取Eppendorf管均加入0.5ml考马斯亮蓝试剂，然后每管中分别加入不同梯度的BSA溶液或转基因灵芝总蛋白提取液，在紫外分光光度计上分别读出每个样品的A595nm值，将A595nm值与对应的浓度在Excel 2000中自动生成平滑线散点图，并作出线性回归直线和对应的等式，根据等式就可以算出不同转基因灵芝株系的总蛋白含量。
表3胰岛素标准品标的ELISA测定
根据标准曲线得出样品A450值(y)与胰岛素浓度(x)的线性回归公式y＝0.165x-0.0192(R2＝0.9845)，根据该公式算出测定样品的人胰岛素含量。
表4不同转基因灵芝提取液的A450nm值及通过公式算出的浓度
备注1、转基因灵芝代入公式的的y值＝测定值-未转基因灵芝背景A450值，代入的公式为y＝0.165x-0.0192(R2＝0.9845)2、因为ELISA加样时是10ul样品加入90ul包被液中，因此抽提液中目的蛋白的浓度为公式算出值的10倍。
3、另有转基因灵芝GinsK8～15为除草剂(PPT)筛选阳性和PCR鉴定阳性，但尚未进行ELISA检测。
表5转基因灵芝抽提总蛋白浓度测定
在Excel 200中输入测定数据得出公式y＝0.0015x+0.494(R2＝0.9398)表6人胰岛素原类似物在转基因灵芝中含量比较
备注用于抽提的灵芝鲜重为0.05g。
实施例8 灵芝子实体的培养及孢子粉的制备转基因灵芝菌株接种于含木屑、麦麸等成分的固体培养基上。子实体培养基采用通用的木屑加麦麸，即三份体积的细木屑加一份体积的麦麸，加水(含水量80％)，混匀，装瓶(或装于耐高温的塑料袋内)，灭菌。接种后置28℃培养。待菌丝长满后置28℃高湿(相对湿度80-90％以上)条件下使其分化出子实体，长出菌伞。随着菌伞的成熟过程，形成大量灵芝孢子粉。在超净工作台中收集灵芝孢子粉。
光镜下观察可以看到孢子具有坚固的孢壁，并有萌发孔的结构。利用模拟胃液和模拟肠液对孢子粉进行体外降解实验，样品分别加入等量模拟胃液和肠液后于37℃分别消化10min、30min及60min，然后液氮研磨使蛋白全部进入提取液(0.01M磷酸缓冲液)中，取15μl样品进行SDS-PAGE，结果发现与未消化的阳平相比，10min、30min及60min蛋白条带无明显差别。这个结果说明灵芝孢子的坚硬外壁有效防止了胃部和肠道中各种消化酶类对所含胰岛素蛋白的降解作用，从而使得人胰岛素能在肠道内被大量吸收，进而进入血液发挥降血糖的功效。此外，孢子粉与灵芝菌丝相比，其总蛋白的含量与菌丝相当，含有的人胰岛素量亦同菌丝相当。
模拟胃液成分0.2％胃蛋白酶pepsin，0.9％NaCl，pH1.2模拟肠液成分0.2％胰酶trpsin，0.9％NaCl，pH8.5实施例9 高血糖大鼠灌喂转基因灵芝降血糖实验一、实验设计挑选48只体重均为250克左右的雄性大鼠(SD品系)，按照60mg/kg的剂量腹腔注射链尿佐菌素(streptozocin，STZ)来制作高血糖大鼠模型，约7天后大部分大鼠窝内变得比较湿润(血糖升高后导致试验动物多饮多尿)，用强生稳捷型血糖仪配合强生One Touch血糖试纸测定大鼠空腹血糖(断食8小时)，挑选血糖值14mmol/L以上的大鼠作为造模成功的高血糖大鼠模型。挑选其中的30只大鼠按照血糖值由低到高排序并随机分为三组，每组10只，使得低、中、高血糖的大鼠比较均匀地分入三组中。由于每只大鼠通过在毛上涂抹黄色的苦味酸来进行编号识别，为了容易识别，动物的编号并不是连续的，而是按照容易识别的编号系统进行。
为了验证转基因灵芝的血糖较低功效是由于转入的人胰岛素原类似物表达所产生的，而非灵芝本身的功效，因此除了做灌喂生理盐水为对照，还以灌喂未转基因的普通灵芝为对照。
二、实验材料1实验试剂无菌生理盐水(0.9％NaCl)购自北京双鹤药业，链尿佐菌素(streptozocin，STZ)由实验委托单位北大医学部实验动物中心购买。
2实验动物及饲料雄性SD大鼠(平均质量为250克)及专用饲料由北大医学部实验动物中心从北京维通利华实验动物公司购买。
3实验器材及仪器血糖仪及试纸血糖仪为购自强生公司的稳捷型血糖仪，搭配试纸为强生One Touch血糖试纸。
用于处理灵芝菌球的榨汁机榨汁机为购自家乐福超市的西贝乐多功能食品加工机。
灌喂针灌喂所有的注射器为医用注射器，灌喂针为头部圆形内径约0.8mm，长8cm的钢针，由北大医学部实验动物中心提供。
三、实验方法1、转基因灵芝灌喂样品的制备及灌喂(1)将不同转基因灵芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方灵芝Ganoderma australe、薄盖灵芝Ganoderma capense)菌球(CYM培养基中摇成菌球)用纱布过滤并洗去培养基后挤去多余水分(约80克)，并加入1/5的生理盐水(0.9％NaCl溶液)，用家用榨汁机旋转匀浆10秒种，使得菌球匀浆成含有较小颗粒(直径不大于0.5mm)的悬浮液，马上置于冰浴中直至灌喂前取出。在超净工作台中收集转基因灵芝孢子，用1∶1比例的0.9％NaCl溶液悬浮，取其中的6ml用于灌喂每只高血糖大鼠。此外树舌(G.applanatum)及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金针姑、猴头等，以及药用真菌虫草菌(Cordyceps sinensis)等也同样可以按照实施例中提到的基因遗传转化、菌丝及子实体培养、孢子收集和动物灌喂实验，也能达到相同的降血糖效果。
(2)灌喂前测定每组各只大鼠的血糖值(剪大鼠尾部采血，每次10ul的血量能满足血糖仪的要求)；(3)用带灌喂针(孔径0.8mm，长8cm，便于能伸到大鼠胃部灌喂，针头为圆形，不对大鼠食道及胃造成损伤)的医用注射器吸取6ml生理盐水灌喂高血糖大鼠，另分别取6ml的处理后的转基因灵芝和未转基因灵芝悬浮液灌喂对应的实验组。
2、血糖测定及数据分析分别于灌喂前、灌喂4小时后和灌喂20小时后测定每组大鼠的血糖值。采用Excel 2000中的Student’s t-TEST统计功能来检验不同实验组及对照组灌喂4小时后与灌喂前两组大鼠的血糖值有无显著性变化。
表7未转基因灵芝组大鼠血糖变化情况
备注血糖值单位为mmol/L，血糖值测定的误差为±10％。
表8转基因灵芝组大鼠血糖变化情况
备注血糖值单位为mmol/L，血糖值测定的误差为±10％。
六、专利菌种说明此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为灵芝(Ganoderma lucidum)，保藏代号为GinsK3，保藏编号为CGMCC NO.1708，保藏日期为2006年5月10日。
总之，本发明人工合成了一个新的人胰岛素原类似物基因(InsK)，并采用在食用真菌中组成型高效表达的GPD启动子驱动，构建了适合电击法和PEG介导法转化灵芝原生质体的表达载体pbinsK和适合农杆菌介导法转化灵芝菌丝的表达载体p1300-GinsK，获得了一批转基因灵芝株系，PCR检测表明目的基因已整合到灵芝基因组中，ELISA检测表明人胰岛素原类似物在灵芝中的表达量达到105.0μg/g～174.8μg/g灵芝鲜重的水平。高血糖大鼠灌喂实验表明转基因灵芝与未转基因灵芝相比显著降低了大鼠的血糖水平，两组大鼠之间具有极显著性差异(P＜0.0002)。动物降血糖实验说明转基因灵芝能有效降低血糖水平，可以作为一种口服胰岛素用于糖尿病的血糖降低调节。转基因灵芝培养与普通灵芝一样，能够大规模放大生产。
序列表<110>林忠平<120>利用转基因灵芝表达人胰岛素降血糖的方法<140>
<141>
<160>1<210>1<211>195<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(6)...(194)<400>1gatccatgtt cgttaaccaa cacctttgcg gatctcacct tgttgaggct ctttaccttg 60tttgcggaga gaggggattc ttctacaccc caaagaccgg aggaccatct ggaggaggaa 120tcgttgagca atgctgcacc tctatctgct ctctttacca acttgagaac tactgcaaca 180aggacgagct ttaag 19权利要求
1.一种利用转基因灵芝表达人胰岛素来降低糖尿病患者血糖水平的方法，其特征在于人工合成人胰岛素原类似物基因，选用真菌中强表达的GPD启动子，置于适合灵芝转化的载体中，通过电击法或农杆菌介导法或PEG介导法遗传转化灵芝，获得表达人胰岛素的灵芝，并通过口服灌喂高血糖大鼠证明能有效降低血糖水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该人胰岛素原类似物基因中的碱基用植物偏爱的密码子替代，所述胰岛素具有类似天然胰岛素的三维结构。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该人胰岛素原类似物基因在所翻译蛋白的C端添加了内质网滞留信号KDEL序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于转基因灵芝中人胰岛素原类似物的含量为105.0μg/g～174.8μg/g灵芝鲜重的水平，占灵芝可溶总蛋白的4.40％～10.40％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对高血糖大鼠灌喂权利要求1所述的转基因灵芝菌丝或孢子后，大鼠的血糖水平大幅度降低，最大幅度可达64％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过电击法或农杆菌介导法或PEG介导法转化的宿主选自赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方灵芝Ganoderma australe、薄盖灵芝Ganoderma capense、树舌Ganoderma applanatum及多孔菌科的其它食用菌香菇、蘑菇、平菇、草菇、金针姑、猴头和药用真菌虫草菌Cordyceps sinensis中的任何一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于电击法或PEG介导法所用的表达载体为附图1所述的pbinsK。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于农杆菌介导法所用的表达载体为附图2所述的p1300-GinsK。
9.一种药品，是利用权利要求1所述的方法产生的能表达人胰岛素原类似物的灵芝菌丝、子实体及孢子。
10.一种灵芝表达载体，其特征在于它含有权利要求1所述的人工合成的人胰岛素原类似物基因。
11.根据权利要求10所述的灵芝表达载体，其特征在于该灵芝表达载体具有附图1所述pbinsK的质粒结构。
12.根据权利要求10所述的灵芝表达载体，其特征在于该灵芝表达载体具有附图2所述p1300-GinsK的质粒结构。
全文摘要
本发明人工合成了人胰岛素原类似物基因，并在编码蛋白的C端添加了KDEL的内质网滞留序列以便蛋白更多地积累在内质网中从而防止细胞中酶的降解。选用高等真菌中高效表达的GPD启动子驱动目的基因，并置于适合灵芝转化的载体中，通过电击法或农杆菌介导法或PEG介导法遗传转化灵芝。ELISA检测表明转基因灵芝中人胰岛素原类似物的含量为105.0μg/g～174.8μg/g灵芝鲜重的水平，占灵芝可溶总蛋白的4.40％～10.40％。将表达人胰岛素的灵芝口服灌喂链尿霉素诱导的糖尿病大鼠模型证明能有效降低血糖，从而提供了利用灵芝生物反应器降血糖的方法。
文档编号A61K36/074GK1879891SQ20061007884
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月10日 优先权日2006年5月10日
发明者林忠平, 倪挺, 胡鸢雷, 孙丽, 陈溪 申请人:林忠平