专利名称：一种人工骨及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种骨替代材料，具体涉及一种完全由细胞和细胞分泌的基质构成的 人工骨及其制造方法。
背景技术：
当代医学对于创伤、骨肿瘤病变等各种原因造成的骨缺损、骨不连等，尚无有效 fe治疗手段，主要靠手术固定、连接，或使用植骨材料以及自体骨、异种骨移植。由 于愈合期漫长，易导致各种并发症，其中许多因为没有有效的治疗手段而致残。
组织工程，是近年来发展起来的一门新学科。其最基本的思路是在体外分离、 培养细胞，将细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上，通过细胞之间的相互粘 附、生长繁殖、分泌细胞外基质，形成具有一定结构和功能的组织或器官。由于支架 材料可随着新组织的形成不断降解，最终被完全吸收，再造出的组织与自体正常组织 完全相同，从而再造出生物性的组织或器官。
中国发明专利，专利申请号为02145459，涉及一种组织工程化骨组织及其制备方 法。可根据需要修复的骨缺损的具体形态，对组织工程化骨支架材料进行塑形。所得 组织工程化骨的外层为骨皮质框架，'中间部位由接种有骨髓间质干细胞的松质骨替代 品替代正常骨结构中的松质骨和骨髓成分。其组织工程化骨组织具有与正常骨组织相 似的皮质骨、松质骨及细胞成分。临床应用中，医师可根据患者的CT片预先领i淀手 术切除范围，并按缺损部分的CT重构数据对组织工程化骨支架材料进行塑形，从而 实现个体化治疗。
中国发明专利，申请号00132082，是将猪骨或异体骨制成基本去除抗原性和细胞 成分、保留基本框架的生物衍生骨支架，用于接种细胞成为组织工程骨。美国专利 (6， 228， 117)公开的组织工程骨的制备方法，是先制备聚交酯高分子材料，然后接 种具有成骨潜能的细胞，成为骨替你材料，促进骨缺损的修复。
上述技术的共同点是其骨替代材料中都具有支架，即支架均要随骨替代材料植 入体内。常用的骨组织工程支架材料有生物陶瓷、合成高分子材料、天然高分子材
料。生物陶瓷有羟基磷灰石、磷酸三钙、羟基磷灰石-磷酸三钙双相陶瓷、骨陶瓷
等；合成高分子材料有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚羟基丁酸酯等；天然高分子
材料有胶原蛋白、甲壳素、脱矿骨等。由于这些支架本身的材料不同于骨组织，因此
均存在不同程度的不足。例如羟基磷灰石等生物陶瓷不能降解，植入体内后将作为 异物长期存留；高分子材料等的降，军产物会弓胞慢性炎症反应；胶原蛋白、脱矿骨等 天然高分子材料由于来源于异体或异种组织，存在一定的排斥反应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种人工骨及其制造方法，其解决了背景技术中骨替代 材料中因存在支架，或造成异物长期存留，或,产物引起慢性炎症反应，或存在排 斥反应的技术问题。
本发明技术解决方案如下
一种人工骨，其构成包括诱导后的骨髓基质干细胞以及这些细胞分泌的基质；组 织学表现为软骨样组织；番红"O染色呈阳性；植入裸鼠皮下组织中可以形成成熟的 骨组织。 ，
-种人工骨，其用细胞膜片形成人工骨雏形，再经融合得到；构成包括诱导后的 骨髓基质干细胞以及这些细胞分泌的基质；组织学表现为软骨样组织；番红O染色 呈阳性；植入裸鼠皮下组织中可以形成成熟的骨组织。 一种帝随上述人工骨的方法，其实现步骤包括
(1) 形成人工骨雏形将细胞膜片包裹于成形模具表面，或直接折叠，形成人 工骨的雏形；
(2) 膜片融合将人工骨雏形在具有诱导作用的培养液中培养2-10周，至细胞 膜片相互融合，直接得人工骨；或去除成形模具后得人工骨。
上述述细胞膜片-的获得包括以卞步骤
(1) 获取骨髓基质干细胞取骨髓，得存在于骨髓中的骨髓基质干细胞，进行
抗凝；
(2) 骨髓基质干细胞的培养扩增将具有诱导作用的培养液、抗凝后的骨髓置 入培养容器中，用具有诱导作用的培养M"骨髓基质干细胞进行培养扩增； (3)获得细胞膜片连续培养扩增，至诱导后的骨髓基质干细胞轮廓消失，并 有矿化结节出现，即得细胞膜片。'
上述膜片融合及培养扩增均是在生物细胞保持存活的条件下进行。
上述具有诱导作用的培养液包括用DMEM或DMEM/F12配制的基础液，体积分 数为5-15%的血清，5-100微效毫升的维生素C， 10义10^M的itt米松，5-20mM的f^ 甘油磷酸钠；还可包括0.24). 4 g/L的谷氨翻安。
上述骨髓可采用本体骨髓，也可采用组织配型选择的异体骨髓。 上述成形模具可由管材、片材或网 L材料构成，所述成形模具的形状与缺损形状 相应。
上述成形模具可采用金属材料、，高分子材料或生物陶瓷材料等。 本发明具有以下优点
(1) 仅需要少量的本体或异体骨髓，艮阿获得足够的细胞数量用于移植。
(2) 再造出的骨组织中无支架，是完全性的生物组织，既无引发慢性炎症之 虑，也无引起排斥反应之忧。
(3) 人工骨在体外培养，大大减少了植入体内的愈合、修复期。
(4) 可根据缺损骨的形状、大小成形。或直接成形至与缺损形状相应，或由多 个拼合成形。
(5) 使用安全、可靠，可完全替代缺损骨的功能。
'
图1为本发明细胞相互接触、连接成片的倒置显微镜下观察图2为本发明中获得的细S^莫片图3为本发明的人工骨雏形图4为本发明可用于移植的管状人工骨图5为本发明人工骨的组织学表现为软骨样组织、番红"O染色阳性的图； 图6为本发明人工中有转质沉积、voi-kossa染色阳性图； 图7为本发明人工骨植入裸鼠皮下组织中形成的成熟骨组织图。
具体实施例方式
本发明人工骨，采用具有诱导作用的i咅养自骨髓基质干细M行i咅养扩增获得 细胞膜片，用细胞膜片形成人工骨雏形，再经融合得到。由诱导后的骨髓基质干细胞 以及这些细胞分泌的基质构成，组织学表现为软骨样组织，番红O染色呈阳性。植 入裸鼠皮下组织中，可以形成成熟的骨组织。
本发明人工骨的制造方法如下 ..l.获取骨髓基质干细胞取骨髓，得存在于骨髓中的骨髓基质干细胞，进行抗
凝。骨髓可以是本体骨髓，也可以i通过组织配型选择的异体骨髓。抗凝采用抗凝血
齐U， { 肝素，也可采用枸橼酸钠。
2. 骨髓基质干细胞的培养扩增将具有诱导作用的培养液、抗凝后的骨髓置入培
养容器中，在生物细胞保持存活的条件下，通过具有诱导作用的培养^xtt髓基质干 细胞进行培养扩增。具有诱导作用的培养液，其基础液由DMEM或DMEM / F12配 制得， 一般至少含有体积分数为5-15%的血清、5-100微^7毫升的维生素C、 10—9-:10^Mitt米松及5-20mM卩-甘油磷酸钠，此外还可含有0.2K). 4 g/L的谷氨酉划安。 培养扩增的条件温度34-39t:均可，以37士0.5。C为宜。 一般取常规条件是37°C、 饱和湿度、5%C02^#。 -
3. 获得细胞膜片连续培养扩增，倒置显微镜下观察至诱导后的骨髓基质干细胞 轮廓消失并有矿化结节出现，即得细胞膜片。
4形成人工骨雏形将细胞膜片包裹于成形模具表面，或直接折叠，形成人工骨
的雏形。！^f乡模具多用于管状骨，其形状与缺损形状相应。直接折叠形成的人工骨雏
形， 一般用于非管状骨，其可直接折叠的形状与缺损形状相应，也可由二个或多个拼 合成与缺损形状相应。成形模具由管材构成，或由片材或网孔状材料围成管状。成形 模具以采用网状材料为最佳，其可使具有诱导作用的培养液作用至细胞膜片内侧，更
利于细胞膜片的培养。成形模具的材质一般为金属、高分子材料或生物陶瓷等。如 不锈钢、尼龙等。 '
5J莫片融合在标准条件下，将人工骨的雏形在具有诱导作用的培养液中继续培 养2-10周，至细胞膜片相互融合，即得人工骨。或去除成形模具得人工骨。膜片融
合时间一般为2-10周，可根据人工骨雏形的大小以及生长情况选择。
实验实例1:
(1) 无菌劍牛下从髂嵴抽取3ml骨髓，用肝素抗凝。
(2) 将骨髓转入75o^培养瓶中，用具有诱导作用的i咅养^)(寸骨髓基质干细胞进 行培养扩增。具有诱导作用的培养液为DMEM，其中含有瓶血清、50^ml维生素 C、 10^Mitt米松、10raM^甘油磷酸钠。
(3) 连续i音养扩增，每3-4天更换一次具有诱导作用的培养液。用倒置显微镜 观察，至诱导后的骨髓基质干细胞相互接触、连接成片、轮廓消失、并有矿化结节出 现。X100倒置显微镜下观察图，见图l。用刮刀将其从培养瓶底部抬起，获得细胞膜 片，参见图2。
(4) 将细胞膜片包裹于直径4誰、长3cm的管状不锈钢网的成形模具表面，形 成管状人工骨的雏形，见图3。
(5) 将管状人工骨雏形用具有诱导作用的培养液继续培养6周，使细胞膜片相 互融合，然后去除成形模具，成为奇用于移植的管状人工骨，见图4。
实验结果 _
将管状人工骨用10%|昌尔马林固定，梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片、染 色，进行组织学检查，显示细胞膜片相互融合，人工骨为软骨样组织，番红"O染色 呈阳性，X400显微镜下观察图见图5。其中不含外源性支架材料。有钙质沉积，von-kossa染色呈阳性，X100显微镜下观察图，见图6。 实验实例2:
当需要植入的骨组织不是管状时，将实验实例1中形成的细胞膜片直接折叠成为 约10X10X2mm的方块形，形成人工骨的雏形。体外继续培养4周，形成方块形人 工骨。 .
实验结果无菌条件下植入裸鼠皮下组织中，2个月后形成成熟的骨组织，X100 显微镜下观察图，见图7。
权利要求
1.一种人工骨，其构成包括诱导后的骨髓基质干细胞以及这些细胞分泌的基质；组织学表现为软骨样组织；番红-O染色呈阳性；植入裸鼠皮下组织中可以形成成熟的骨组织。
2. —种人工骨，其用细胞膜片形成人工骨雏形，再经融合得到；构成包括诱导后 的骨髓基质干细胞以及这些细胞分泌的基质；组织学表现为软骨样组织；番红O染 色呈阳性；植入裸鼠皮下组织中可以形成成熟的骨组织。
3. —种制造权利要求1或2所述人工骨的方法，其实现步骤包括(1) 形成人工骨雏形将细胞膜片包裹于成形模具表面，或直接折叠，形成人 工骨的雏形；(2) 膜片融合将人工骨雏形在具有诱导作用的培养液中培养2-10周，至细胞 膜片相互融合，直接得人工骨；或去除成形模具后得人工骨。
4. 根据权利要求3所述人工骨的制造方法，其特征在于，所述细胞膜片的获得包 括以下步骤(1) 获取骨髓基质干细胞取骨髓，得存在于骨髓中的骨髓基质干细胞，进行抗凝；(2) 骨髓基质干细胞的培养扩增将具有诱导作用的培养液、抗凝后的骨髓置入培养容器中，用具有诱导作用的培养M骨髓基质干细胞进行培养扩增；(3) 获得细胞膜片连续培养扩增，至诱导后的骨髓基质干细胞轮廓消失，并 有矿化结节出现，即得细胞膜片。
5. 根据权利要求3或4所述人工骨的制造方法，其特征在于所述的膜片融合、培养扩增均在生物细胞《呆持存活的割牛下进行。
6. 根据权利要求5所述人工骨的制造方法，其特征在于，所述具有诱导作用的培 养液包括DMEM或DMEM / F12配制的基础液，体积分数为5-15%的血清，5-100微 克/毫升的维生素C， 10—9-10^4的地塞米松，5-20 mM的~β甘油磷酸钠；或还包括 0. 2－0.4g/l 的谷氨酰胺。
7. 根据权利要求6所述人工骨的制造方法，其特征在于所述的骨髓是本体骨髓，或魏媳且织配型选择的异体骨髓。
8. 根据权利要求7所述人工骨的制造方法，其特征在于所述的成形模具由管 材、片材或网孔材料构成，所述成形模具的形状与缺损形状相应。
9. 根据权利要求8所述人工骨的制造方法，其特征在于所述的成形模具为金属 材料、高分子材料或生物陶瓷材料。
全文摘要
一种人工骨及其制造方法，其用细胞膜片形成人工骨的雏形，在具有诱导作用的培养液中培养至细胞膜片相互融合获得。人工骨构成包括诱导后的骨髓基质干细胞以及这些细胞分泌的基质；组织学表现为软骨样组织；番红-O染色呈阳性；植入裸鼠皮下组织中可以形成成熟的骨组织。本发明解决了背景技术中的骨替代材料因存在支架，或造成异物长期存留，或降解产物引起慢性炎症反应，或存在排斥反应的技术问题。本发明可根据缺损骨的形状、大小成形，再造出的骨组织中无支架，是完全性的生物组织，使用安全、可靠，可完全替代缺损骨的功能。
文档编号A61L27/00GK101168072SQ200610104790
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月23日 优先权日2006年10月23日
发明者陈富林 申请人:西安瑞捷生物医疗技术有限公司;西北大学