专利名称：一种可移植的人工替代单元的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种具有特定功能的人造器官或称替代单 元的结构，该替代单元可移植入人体用作维持特定组织功能的暂时替代物。
背景技术：
器官移植是器官衰竭时一个重要的治疗手段。以肝病治疗为例，肝脏是人体最复杂的器官之一，全世界约有3亿多肝病患者，原位肝移植是肝功能衰竭及先天性 肝代谢疾病唯一成熟有效的治疗方法。但是供肝缺乏是世界各国面临的主要问题。 尽管近年来发展了背驮式、劈离式、活体劈离式等多种部分肝移植术式以最大程度 利用供肝，但仍不能解决等待肝移植患者与供肝数量之间的巨大差额，且因其具有 操作复杂、终生免疫抑制及其严重的并发症、花费巨大等缺点，临床应用受到极大 的限制。随着组织工程学概念的提出和不断发展，肝组织工程日益成为终末期肝病 治疗的研究热点，将体外人工构建的肝脏器官替代单元移植到患者体内(部分)代 偿肝脏功能的组织替代物成为医学领域研究方向。与肝病治疗类似，对糖尿病、脊髓损伤、皮肤或软组织巨大缺损、尿道缺损或 畸形、尿毒症等疾病治疗中，使用相应替代单元移植至患者体内补偿或替代相应器 官的形态、结构和功能也是一个重要的医学研究方向。因此，研究具有代偿功能的人工替代单元成为必然，而现有技术中，尚未见此 类替代单元的报道。发明内容本发明的目的，在于提供一种可移植入人体的人工替代单元，其可用作维持特 定组织功能的暂时替代物。本发明的一种人工替代单元，包括 一外包围体， 一置于该外包围体内的中空 支架，置于该支架内腔中的腔内填充细胞和填充物，以及置于该支架与外包围体之 间的功能细胞和营养基质体，且，所述支架和外包围体壁面上均设有多个贯穿的微孑L通道。其中，其中，所述微孔通道直径在100 200Wn。所述微孔通道为自然生成，
材料本身壁面具有有贯穿整个壁面的微孔通道；或者，所述微孔通道为人工开设。其中，所述支架与外包围体以具有孔洞结构的组织工程材料胶原、壳聚糖、聚 乳酸、聚羟基乙酸、聚L一乳酸、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯和聚乳酸羟基乙酸 中的一种制成。所述腔内填充细胞为来自离体骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织、经过向血管内皮细胞即EC定向诱导分化的成体干细胞，所述腔外填充细胞为具有向特定功能细胞分化潜能的来自离体骨髓、脐带、胎盘和脂肪等组织、经过预分化处理的成体干细 胞，所述功能细胞为肝细胞、肝基质细胞、胰岛p细胞、肾上皮细胞、脂肪细胞 中的一种。所述填充物和营养基质体为生物蛋白胶，其内含促进填充细胞定向诱导分化的细胞因子，这些细胞因子为肝细胞生长因子即HGF、表皮生长因子即EGF、成纤维 细胞生长因子即FGF、和血管内皮细胞生长因子即VEGF中的一种或多种。其中，所述支架为平面二分叉形式，主干和两分叉在同一平面上，且两分叉相 对于主干呈一角度分布。所述支架主干端口可包含于外包围体内或伸出外包围体。其中，所述支架为立体多维分级形式，主干下连接两分叉，每一分叉又分成若 干下一级支分叉，支分叉与主干不在同一平面上。所述支架主干和支分叉端口可包 含于外包围体内或伸出外包围体。其中，所述支架为蛇形，该支架为一弯曲的长管。所述弯曲的长管两端口可包 含于外包围体内或伸出外包围体。釆用以上设计，本发明所设支架使得替代单元具有特定的形状和体积，并能提 供物理和营养支撑；外包围体使得填充细胞和细胞的营养基质束缚在一个特定的区 域，而支架和外包围体上所设通孔，便于在该替代单元中生长的细胞进入周围的组 织，形成与受体体内循环相交通的毛细血管网。另一方面，由于提供了替代单元的 设计，腔内填充细胞最终诱导分化为内皮组织细胞，而腔外填充细胞可以根据人工 替代单元的应用方向改变，从而诱导分化为所需的功能细胞，如肝细胞、胰岛P 细胞、肾上皮细胞、脂肪细胞等，从而可以分别形成可移植的组织工程肝单元、胰 岛、肾和脂肪组织单元，大幅提升了本发明的应用范围。
图1为本发明人工替代单元的结构示意图;
图2为图1所示人工替代单元中一种支架形式示意图； 图3为本发明支架和外包围体材料微观结构图。 图4为可用于本发明中的另一种支架形式示意图； 图5为可用于本发明中的又一种支架形式示意图。
具体实施方式
以下将结合附图与具体实施例详述本发明。本发明人工替代单元相当于一个人造器官类似物，其中，需要设计支架使得该 替代物具有特定的形状和体积，并提供物理和营养支撑；单元内部及支架中需要设 计活性细胞使得该替代物具有特定的功能和寿命，同时还应有具有向血管内皮细胞 分化潜能的细胞，能够在该替代单元中生长并进入周围的组织细胞，形成与受体体 内循环相交通的毛细血管网。基于以上设计思想，本发明人工替代单元结构参见图1，包括 一外包围体l， 一置于该外包围体内的中空支架2，置于该支架2内腔中的含有腔内填充细胞3的 填充物4,以及置于该支架:2与外包围体1之间的含有腔外填充细胞5的营养基质 体6，且，支架2与外包围体1壁面上均设有贯穿的微孔通道21和11。在本发明中，腔内填充细胞3是具有向血管内皮细胞分化潜能的前体细胞，其 为多种离体组织来源的(包括骨髓、脐带、胎盘和脂肪等组织)、经过预分化处理 的成体干细胞；腔外填充细胞5为具有向特定功能细胞分化潜能的多种离体组织来 源的(可以来自骨髓、脐带、胎盘和脂肪等组织)、经过预分化处理的成体干细胞， 功能细胞可以为肝细胞、肝基质细胞、胰岛(3细胞、肾上皮细胞、脂肪细胞等。成体干细胞的预分化处理过程以实验室常规的方式进行，可具体参考但不限于 用以下方式进行向血管内皮细胞(EC)预分化处理选取第5代培养扩增的骨髓间充质干细 胞(BDMSC)，以条件培养液重悬，条件培养液L-DMEM， 2%FBS， 2%马血清、 lxITS (Sigma)、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1 pmoL/L、 BSA2g/L、鸟氨酸O.l g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖2 g/L及适量微量 元素(氯化锌、硫酸锌和氯化锰)，向条件培养液中加入10ng/mlVEGF(R&D system) 和2ng/ml bFGF (R&D system);按2X 10Vcm2接种于预先铺好Matrigel (1: 3比
例稀释)的96孔板内，每孔加200ul条件培养液,每3天换液一次诱导培养；将成熟细胞挑出，得到向血管内皮细胞诱导分化的腔内填充细胞；向肝细胞预诱导分化处理选取第5代培养扩增的骨髓间充质干细胞(BDMSC)，以条件培养液重悬，肝细胞条件培养液:5-10。/。胎牛血清的低糖DMEM 中加入ITS、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松O.l pmoL/L、牛血清白蛋白2g/L、鸟氨 酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖2 g/L及适 量氯化锌、硫酸锌和氯化锰，向肝细胞条件培养液中加入10ng/mlHGF、 lng/mlFGF-4;按5X107cm'接种于预先铺好Matrigel (1: 3比例稀释)的96孔板内，每3天换液一次进行诱导培养；将成熟细胞挑出，得到向肝细胞诱导分化的 腔外填充细胞。在本发明中，填充物4和营养基质体6可为含有特定生长因子组合的生物胶。 具体可选用商品化的医用生物蛋白胶，如纤维蛋白元和凝血酶(广州倍绣生物技术 有限公司)，其内可加入促进成体干细胞定向诱导分化的细胞因子，如填充物4中 可加入10-50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)，营养基质体6中可加入 10-40ng/ml肝细胞生长因子::HGF)、10-40ng/ml表皮生长因子(EGF)、和10-40ng/ml 成纤维细胞生长因子(FGF)中的一种或多种，这些生长因子均可以从商业渠道购 买。在本发明中，支架2与外包围体1可选用具有孔洞结构的可降解的生物材料， 可选用的材料如胶原、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚L一乳酸、 聚羟基烷酸酯(PHA)、聚羟基丁酸酯(PHB)和聚乳酸羟基乙酸(PLGA)中的一种； 这些材料可以使用NaCl颗粒制孔/浸出法制备成多孔薄膜材料，进而制备成本发明 中的支架2和外包围体1;在本发明中，支架2和外包围体1材料制成的壁面应具有贯穿整个壁面的较大 的微孔通道21或11，参见图3所示，箭头所指为较大微孔通道。当材料本身微孔 不具有贯穿性时，需要人工在支架2和外包围体1壁面上开设微孔通道21和11， 该微孔通道21和11直径在100 200Wn。在本发明中，支架2的形式可以有各种变化。图2示出了一种平面二分叉形式， 该种形式两分叉22和主干23在同一平面上且相对于主干23呈一角度分布。结合 图1所示，使用该种形式的支架2的人工替代单元，其主干23端口和两分叉22 置于外包围体1内，含有腔内填充细胞3的填充物4填充在支架2内管，含有腔外 填充细胞5的营养基质体6填充在支架2外壁和外包围体1之间，形成了本发明的
一种人工替代单元。当然，支架2的主干23也可伸出外包围体1，以利于与周围组织融合。另一种支架2的变化形式可参见图4。该支架2为立体多维分级的形式，主干 23下连接两分叉22，每一分叉22又继续分成若干下一级支分叉24 (图中示出两 个分支叉24)，支分叉24与主干23不在同一平面上，这样形成的支架2具有多维 立体构象，主干23和末端的支分叉24端口均处于外包围体1内，如此结合含有腔 内填充细胞3的填充物4和含有腔外填充细胞5的营养基质体6形成了本发明的另 一种人工替代单元。这种多维立体分级支架2，更易于形成毛细血管网，有效体积 和表面积更大，易于物质交换和替代物的存活及其功能发挥。当然，支架2的主干23和末端的支分叉24端口也可伸出外包围体1，以利于 与周围组织融合。此外，还有一种支架2的变化形式为蛇形，参见图5所示，该支架2可为一弯 曲的长管，弯管内填充有腔内填充细胞和填充物，弯管外填充腔外填充细胞和营养 基质体，弯管包于外包围体从而形成另一种人工替代单元。这种形式的人工替代 单元适用于制备胰岛、肝、肾、脂肪组织等替代物。该人工替代单元一个具体的应用为构成组织工程肝单元。该应用中，在支架2 中植入的腔内填充细胞3为向内皮细胞预诱导的间充质干细胞，填充物4为添加 VEGF的生物蛋白胶；包裹支架2周围的腔外填充细胞5是向肝细胞及肝基质细胞 预诱导的间充质干细胞，营养基质体6为添加HGF、 EGF和FGF的生物蛋白胶，由 此构成了具有辅助、支持、替代功能的、以及可移植的组织工程肝单元。改变腔外填充细胞5，可以改变人工替代单元的应用方向。如，腔外填充细胞 5分别为胰岛日细胞、肾上皮细胞、脂肪细胞等时，可以分别形成可移植的组织 工程胰岛、肾和脂肪组织单元，用于腹腔内或损伤缺损部位移植或填充。以上列举了几种可行的人工替代单元，仅作为具体实施例，并非穷举。事实上， 作为不同器官组织的替代单元，可以依据本发明的设计思想，根据不同器官组织的特点变化替代单元的形式，卯外包围体l的形状，内部支架2的形式，填充细胞的 类型，填充物或营养基质及其内的细胞因子组合类型等等，这些变化与实施，无需 -一-列举，均应包含在本发明范围之内。
权利要求
1、一种人工替代单元，其特征在于，包括一外包围体，一置于该外包围体内的中空支架，置于该支架内腔中的腔内填充细胞和填充物，以及置于该支架与外包围体之间的腔外填充细胞和营养基质体，且，所述支架和外包围体壁面上均设有多个贯穿的微孔通道。
2、 根据权利要求l所述人工替代单元，其特征在于，所述微孔通道为自然生成， 材料本身壁面具有有贯穿整个壁面的微孔通道。
3、 根据权利要求l所述人工替代单元，其特征在于，所述微孔通道为人工开设。
4、 根据权利要求2所述人工替代单元，其特征在于，所述支架与外包围体以具 有孔洞结构的组织工程材料胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚L一乳酸、聚羟 基烷酸酯、聚羟基丁酸酯和聚乳酸羟基乙酸中的一种制成。
5、 根据权利要求1至4任一所述人工替代单元，其特征在于，所述腔内填充细 胞为来自离体骨髓、脐带和脂肪组织、经过向血管内皮细胞即EC定向诱导分化的成 体干细胞，所述腔外填充细胞为具有向特定功能细胞分化潜能的来自离体骨髓、脐 带、胎盘和脂肪等组织、经过预分化处理的成体干细胞，所述功能细胞为肝细胞、 肝基质细胞、胰岛(3细胞、肾上皮细胞、脂肪细胞中的一种。
6、 根据权利要求1至4任一所述人工替代单元，其特征在于，所述填充物和营 养基质体为生物蛋白胶，其P3含促进填充细胞定向诱导分化的细胞因子，这些细胞 因子为肝细胞生长因子即HGF、表皮生长因子即EGF、成纤维细胞生长因子即FGF、 和血管内皮细胞生长因子即VEGF中的一种或多种。
7、 根据权利要求1至6任一所述人工替代单元，其特征在于，所述微孔通道直 径在100 200Wn。
8、 根据权利要求7所述人工替代单元，其特征在于，所述支架为平面二分叉形 式，主干和两分叉在同一平面上，且两分叉相对于主干呈一角度分布。
9、 根据权利要求7所述人工替代单元，其特征在于，所述支架为立体多维分级 形式，主干下连接两分叉，每一分叉又分成若干下一级支分叉，支分叉与主干不在 同一平面上。
10、 根据权利要求7所述人工替代单元，其特征在于，所述支架为蛇形，该支 架为一弯曲的长管。
全文摘要
本发明公开了一种人工替代单元，其可移植入人体用作维持特定组织功能的暂时替代物。包括一外包围体，一置于该外包围体内的中空支架，置于该支架内腔中的腔内填充细胞和填充物，以及置于该支架与外包围体之间的功能细胞和营养基质体，且，所述支架和外包围体壁面上均设有多个贯穿的微孔通道。本发明中腔内填充细胞最终诱导分化为内皮组织细胞，而腔外填充细胞可以根据人工替代单元的应用方向改变，从而诱导分化为所需的功能细胞，如肝细胞、胰岛β细胞、肾上皮细胞、脂肪细胞等，从而可以分别形成可移植的组织工程肝单元、胰岛、肾和脂肪组织单元。
文档编号A61F2/00GK101147704SQ200610113180
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月18日 优先权日2006年9月18日
发明者雪 南, 岳慧敏, 磊 张, 峰 林, 王韫芳, 管利东, 峰 粱, 裴雪涛, 颜永年 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所