专利名称：一种犬、狐、貂用抗犬瘟热免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗和预防犬、狐、貂犬瘟热的免疫球蛋白，国际专利分类号为A61K39/395。
背景技术：
犬瘟热是一种急性、传染性极强的传染病。犬科(犬、狐等)和鼬科(貂等)均感染。对犬，主要侵犯幼犬，极少见于成年犬，在没有犬瘟热的地区首次爆发犬瘟热，死亡率可达90％；对水貂，犬瘟热称貂瘟，当貂属动物为传染源时，经3～4周即可在貂群中引起广泛传播，症状严重，死亡率高，有时高达80％～90％，特别是幼兽。因此，犬瘟热是养犬业、经济动物养殖业危害最大的传染病。
犬、狐、貂对犬瘟热病毒敏感。犬瘟热康复后能产生坚强持久的免疫力。对其预防接种，可产生抗犬瘟热特异性抗体，又称免疫球蛋白。抗体可以与刺激它们产生的犬瘟热抗原决定簇发生特异性反应。不同种类的动物对同一病毒的不同抵抗力和敏感性是人们早已认识的事实，马属动物(马、驴、骡)对犬瘟热病毒不易感，但在免疫原的刺激下，同样呈现高度特异的免疫反应。用马属动物制备犬、狐、貂用免疫球蛋白不仅生产量大，而且可以避免犬、狐、貂的其它病毒性传染病通过制备过程而造成人为传染。
给犬、狐、貂被动输入免疫球蛋白，常可使其对犬瘟热的感染呈现预防和独特的治疗作用。但必须使输入的免疫球蛋白达到保护所需的水平。这种被动免疫是短暂的，不超过2周，因此用于紧急预防是合理的，用于早期治疗是确实的，也是独特的。
犬、狐、貂的犬瘟热疫苗接种，仍是预防犬瘟热的最为合理的措施。
犬瘟热灭活疫苗，给犬、狐、貂免疫产生的抗体滴度下降很快，与初乳抗体相似，每10天下降50％，不论灭活苗是否加入佐剂，抗体持续期都比弱毒疫苗短得多，一般情况下灭活苗极少应用。
犬瘟热活疫苗，特别是用Vero细胞生产的细胞培养弱毒苗，接种后抗体滴度甚高，免疫力坚强而持久。主要存在的问题是因害怕母源抗体影响，对断奶前的仔兽不能免疫接种，如确系母源抗体在保护所需水平之上，免疫接种一定造成免疫失败。但是如果因初乳中母体抗体低，仔兽通过初乳获得的母源抗体达不到保护所需水平，那么仔兽就有感染犬瘟热病毒的极大可能。又如在接种疫苗后，需经2～3周才能产生免疫力，接种后4周左右，抗体滴度达到高峰。因此接种疫苗后的3～4周内，仔兽就有感染犬瘟热病毒的极大可能；再如犬瘟热弱毒的最小免疫量为104TCID50，使用剂量为20个最小免疫剂量即2×105TCID50；由于犬瘟热弱毒对可见光和温度等较敏感，常使免疫接种的毒量不够而使免疫失败。加之在首次免疫后，间隔21天应再行二次甚至三次免疫，免疫次数不够，以致于在免疫有效期的后期，有了发生犬瘟热的条件。
对犬、狐、貂已发犬瘟热，用犬瘟热活疫苗紧急接种，用麻疹弱毒疫苗紧急接种，对周围健康犬、狐、貂的预防和对发病犬、狐、貂的治疗作用不是很大。因为犬瘟热活疫苗紧急接种，在犬、狐、貂健康的情况下，2～3周才能产生免疫力，在2～3周前，在疫区内发病和未发病的，均有全军覆没的危险。
发明内容
本发明的目的就是提供一种对犬瘟热有预防及治疗作用的一种犬、狐、貂用抗犬瘟热免疫球蛋白。
本发明的免疫原采用从俄罗斯引进的犬瘟热弱毒Rockborn株，经犬腹腔巨噬细胞复壮，用Vero细胞增殖，每0.1ml含毒≥105TCID50，经冷冻超速离心机差异离心浓缩每0.1ml含毒≥107.0TCID50。与弗氏完全佐剂等量(1∶1)混合为抗原；本发明采用吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液(发明名称为一种提高动物免疫功能的苷肽注射液，专利申请号为2005 1 0016626.2)为免疫增强剂，5ml/支。
本发明选择马、驴、骡免疫动物。3～8岁、体型大、性情温顺、健康良好者；马传贫、鼻疽检疫阴性者；免疫前经隔离饲养观察健康者。
免疫程序对马匹实施基础免疫和强化免疫。
1、基础免疫 第一次免疫为基础免疫，抗原1，4ml，背部两侧4点皮内注射，苷肽注射液5.0ml，臀部肌肉注射。
2、强化免疫 基础免疫后21天，行2次强化免疫，每次间隔7天，第一次免疫抗原1的量为8ml，背部两侧4点皮内注射，每点1ml，肩部两侧淋巴结每点2ml；第二次免疫，犬瘟热弱毒细胞培养浓缩病毒液3ml，静脉缓慢注射。每次强化免疫时，臀部肌肉注射苷肽注射液5.0ml。
验血及放血标准 用固定病毒稀释血清法，在最后一次免疫后14天，测免疫马、驴、骡血清中的抗犬瘟热中和抗体效价。待中和抗体效价达到1∶1024时，即可采血。
采血及血清分离 符合放血标准的马、驴、骡，第一次采血，接15～18ml/kg体重，间隔3～5天日进行第二次采血，二次采血量比一次采血量少300～400ml；二次采血后，免疫动物休息20天后进行第二程强化免疫，依此类推。
采集的血液用加压自然凝结法分离血清。
血清的精制血清→倍量加蒸馏水，用2mol/L盐酸调PH至3.4～3.6，按每ml6～9单位的量加入胃蛋白酶，按总量0.2％加入甲苄，29～31℃消化2～21小时→按总量的15％加入硫酸铵，2mol/L的氢氧化钠调PH4.5～4.7，56～58℃水浴30分钟，冷却至43℃以下滤过，取滤液→滤液用2mol/L氢氧化钠液调PH至7.1～7.3，按总量20％加入硫酸铵，帆布滤过，取沉淀→沉淀加5～6倍蒸馏水溶解，按总量加入10％明矾溶液，使明矾含量为1％，用2mol/L的氢氧化钠液，调PH7.7～7.8，静置2～4小时使之沉淀，帆布滤过，取滤液→收集的滤液按总量的38％加入硫酸铵，帆布滤过，弃上清，沉淀压干用透析袋分袋包装，每袋约200～250g加少许氯仿，放置在流水槽内48～72小时→收集袋内血清，按总量的0.5％加入氯仿，0.85％加入氯化钠和0.0035％加入硫柳汞，摇匀，过滤除菌。即为精制抗犬瘟热免疫球蛋白的半成品。
半成品效价测定及分装用固定病毒稀释血清法，测半成品的抗犬瘟热中和抗体效价(log10SN50)SN≥2048；产品的规定效价SN≥1300，附加20％，因此将半成品稀释至SN≥1600，定量分装。
犬、狐、貂血清抗犬瘟热中和抗体效价与犬瘟热强毒攻毒保护的关系；犬、狐、貂血清SN≥50，90％以上保护，SN28～40，50％以上保护；＜16不保护。
用本发明产品，按1ml/kg体重给犬、狐、貂注射，4h后，其血清抗犬瘟热抗体SN≥50，可持续14天以上。因此，犬、狐、貂的预防使用剂量为1ml/kg体重，而对已发犬瘟热的犬、狐、貂，早期治疗为2ml/kg体重，病情重者或二次注射或加大注射剂量。
在犬、狐、貂的养殖场，发生犬瘟热疫情时，紧急预防注射，96％以上保护；发病的隔离早期治疗，90％以上治愈；门诊发病犬，配合辅助治疗，重者2～3次治疗，治愈率约85％。
本发明的积极效果1、安全性好 生产免疫球蛋白的精制工艺中，用胃蛋白酶消化血清；调PH4.5～4.7，56～58℃水浴30分钟，可以消除异种血清对犬、狐、貂可能的过敏反应(过敏反应很少发生)，可以对犬、狐、貂敏感病毒可能污染的有效灭活(外原病毒污染检验为阴性)从根本上保证了产品的安全性。用5倍使用剂量(5ml/kg)给犬、狐、貂的幼兽肌肉或皮下注射，观察两周均无不良反应。
2、抗犬瘟热中和抗体效价高 将犬瘟热弱毒(每0.1ml含毒105TCID50)，经差异离心法浓缩100倍，加佐剂(福氏完全佐剂)，配合免疫增强剂(苷肽注射液)，按最佳途径(皮内、淋巴结、静脉)和剂量，经1次基础免疫和两次强化免疫，而使马、驴、骡的血清抗犬瘟热中和抗体效价≥1024，接近用犬做为免疫动物制备免疫球蛋白的水平。精制工艺又确保中间品抗犬瘟热中和抗体效价≥2048。较好解决了用马制备抗犬瘟热免疫球蛋白效价不高的问题。
3、使用剂量的准确性 犬、狐、貂血清中的抗犬瘟热中和抗体效价≥50时，用犬瘟热强毒攻击，90％以上保护；产品的抗犬瘟热中和抗体的标准为≥1024；用1ml/kg体重的产品给犬、狐、貂肌注，4h后，血清抗犬瘟热中和抗体效价≥50。而且持续14天以上。
4、临床试用效果好 在发生犬瘟热的养犬场(3个，犬300只)，养貂场(5个，貂3万只)养狐场(1个，狐狸600只)，对发病的隔离早期治愈率90％，其余均紧急预防接种，96％以上获保护。在小动物医院就诊治疗犬瘟热病犬，由于达不到早期治疗，所以在辅助治疗及二次(有的三次)注射后，治愈率为85％左右。总之抗犬瘟热免疫球蛋白对犬瘟热的紧急预防和治疗是有特效的。
5、保存运输方便 本品是用免疫马、驴、骡的血清提取的免疫球蛋白，呈无色透明液体，在4℃条件下，抗犬瘟热中和抗体效价SN从1600降为1300的时间为1年，即4℃保存期为1年，运输也比较方便。
具体实施例方式
本发明免疫原是采用从俄罗斯引进的犬瘟热弱毒Rockborn株，经犬腹腔巨噬细胞复壮，用Vero细胞增殖，每0.1ml含毒≥105TCID50，经冷冻超速离心机差异离心浓缩每0.1ml含毒≥107.0TCID50。与弗氏完全完全佐剂等量(1∶1)混合为抗原；本发明采用吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液为免疫增强剂，5ml/支。
免疫程序本发明选择马、驴、骡免疫动物。3～8岁、体型大、性情温顺、健康良好者；马传贫、鼻疽检疫阴性者；免疫前经隔离饲养观察健康者。
对马匹实施基础免疫和强化免疫。
1、基础免疫 第一次免疫为基础免疫，抗原1，4ml，背部两侧4点皮内注射，苷肽注射液5.0ml，臀部肌肉注射。
2、强化免疫 基础免疫后21天，行2次强化免疫，每次间隔7天，第一次免疫抗原1的量为8ml，背部两侧4点皮内注射，每点1ml，肩部两侧淋巴结每点2ml；第二次免疫，犬瘟热弱毒细胞培养浓缩病毒液3ml，静脉缓慢注射。每次强化免疫时，臀部肌肉注射苷肽注射液5.0ml。
验血及放血标准 用固定病毒稀释血清法，在最后一次免疫后14天，测免疫马、驴、骡血清中的抗犬瘟热中和抗体效价。待中和抗体效价达到1∶1024时，即可采血。
采血及血清分离 符合放血标准的马、驴、骡，第一次采血，接15～18ml/kg体重，间隔3～5天日进行第二次采血，二次采血量比一次采血量少300～400ml；二次采血后，免疫动物休息20天后进行第二程强化免疫，依此类推。
采集的血液用加压自然凝结法分离血清。
血清的精制血清→倍量加蒸馏水，用2mol/L盐酸调PH至3.4～3.6，按每ml6～9单位的量加入胃蛋白酶，按总量0.2％加入甲苄，29～31℃消化2～21小时→按总量的15％加入硫酸铵，2mol/L的氢氧化钠调PH4.5～4.7，56～58℃水浴30分钟，冷却至43℃以下滤过，取滤液→滤液用2mol/L氢氧化钠液调PH至7.1～7.3，按总量20％加入硫酸铵，帆布滤过，取沉淀→沉淀加5～6倍蒸馏水溶解，按总量加入10％明矾溶液，使明矾含量为1％，用2mol/L的氢氧化钠液，调PH7.7～7.8，静置2～4小时使之沉淀，帆布滤过，取滤液→收集的滤液按总量的38％加入硫酸铵，帆布滤过，弃上清，沉淀压干用透析袋分袋包装，每袋约200～250g加少许氯仿，放置在流水槽内48～72小时→收集袋内血清，按总量的0.5％加入氯仿，0.85％加入氯化钠和0.0035％加入硫柳汞，摇匀，过滤除菌。即为精制抗犬瘟热免疫球蛋白的半成品。
半成品效价测定及分装 用固定病毒稀释血清法，测半成品的抗犬瘟热中和抗体效价(log10SN50)SN≥2048；产品的规定效价SN≥1300，附加20％，因此将半成品稀释至SN≥1600，定量分装。
权利要求
1.一种犬、狐、貂用抗犬瘟热免疫球蛋白，其特征是免疫原是采用从俄罗斯引进的犬瘟热弱毒Rockborn株；免疫佐剂采用弗氏完全佐剂；采用吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液为免疫增强剂。
2.根据权利要求1所述的一种犬、狐、貂用抗犬瘟热免疫球蛋白，其特征是免疫原犬瘟热弱毒Rockborn株与免疫佐剂弗氏完全佐剂混合的体积比为1∶1；所述的免疫增强剂苷肽注射液，5ml/支。
3.根据权利要求1所述的一种犬、狐、貂用抗犬瘟热免疫球蛋白，其特征是犬瘟热弱毒Rockborn株，经犬腹腔巨噬细胞复壮，用Vero细胞增殖，每0.1ml含毒≥105TCID50，经冷冻超速离心机差异离心浓缩每0.1ml含毒≥107.0TCID50。
全文摘要
一种犬、狐、貂用抗犬瘟热免疫球蛋白，采用犬瘟热弱毒Rockborn株细胞培养物经浓缩后以1∶1的体积比加入完全弗氏完全佐剂作为免疫原；其特点是基础免疫用皮内注射法，加强免疫用皮内注射结合静脉注射和淋巴结内注射，可以有效地提高抗体效价，每次免疫均使用苷肽注射液作为免疫增强剂，以提高抗体效价；本发明的制备方法是按照中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)规定的方法对制备的高免免疫球蛋白进行加工；本发明的产品具有特异性强、安全性好、抗体效价高、不会产生药物残留、保存和使用方便、临床应用效果好等优点。
文档编号A61P31/12GK1958068SQ20061013163
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者张中洋 申请人:张中洋