专利名称：抗小鹅瘟免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用两种免疫原制备治疗和预防小鹅瘟的免疫球蛋白，国际专利分类号为A61K39/395。
背景技术：
小鹅瘟的同义名 鹅细小病毒、雏鹅肝炎、雏鹅渗出性肠炎。小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus)引起的一种以雏鹅急性肠炎以及肝、肾、心等实质脏器为主的疫病。初孵雏鹅感染病毒后，经4～5天的潜伏期，多发生急性败血症死亡。最小发病的雏鹅，一般在3～5日龄开始，数天内波及全群，死亡率可达70％～95％。是养鹅业的重大危害。
我国对这一传染病的研究，走在世界的前列。1956年，我国学者方定一首先分离出了病原(GB株)。用鹅胚和鸭胚连续传代，驯化成功GPV弱毒疫苗株(GD株)，1961年，用成年鹅制备出高免血清。后用免疫母鹅产的蛋制备卵黄抗体等，对预防乃至治疗本病起到了积极的作用。弱毒GD株，对成年鹅和雏鹅均无致病性，通常在产卵留种之前，给母鹅免疫注射1～2次，这样到翌春整个产卵期所孵化出的雏鹅，均能抵抗感染，成活率可达95％以上；应用疫苗免疫成年鹅制备的高免血清，每雏鹅0.3ml，保护率约95％；对患病雏鹅治疗时，每雏鹅0.5～1ml，治愈率约50％，用于雏鹅的紧急预防和治疗。GPVGD株，接种鸭胚，其病毒含量为每0.3ml含毒≥104.5EID50；GPVGB株，接种鹅胚，其病毒含量为每0.3ml≥103ELD。其血清保护试验取3～5只雏鹅，皮下注射标准毒株的免疫血清1.5ml，然后皮下注射GB株含毒尿囊液0.1ml，对照组以生理盐水代替血清，其余同试验组，结果试验组雏鹅应全部保护，对照组于2～5天内全部死亡。
GPV对鸡、鹅、大白鼠、小鼠、兔、猪和绵羊等动物的红细胞均无凝血作用。所以测定免疫鹅血清中的抗GPV抗体效价，不能用血凝抑制试验(HI)，而用鸭胚，GD株测血清的中和抗体效价(SN)。
如前述，雏鹅一般在3～5日龄发病，数天内波及全群，用小鹅瘟活疫苗免疫雏鹅，即使不受母源抗体干扰，使雏鹅血清抗GPV的抗体达到保护水平，也在免疫后14～21天才能达到，因此来不及预防；用小鹅瘟活疫苗在母鹅产蛋留种前，注射1～2次，翌春母鹅产蛋所孵化的雏鹅，由于母源抗体经卵黄传递给雏鹅，而均能抵抗GPV的感染。问题是小鹅瘟疫苗的质量以及严格的对母鹅的免疫程序予以保障。
用疫苗免疫母鹅制备高免血清，用疫苗免疫母鹅在有效期内产蛋制备卵黄抗体，可能存在下述危险，即禽类的传染病非常复杂，特别是病毒性传染病，一旦免疫母鹅感染了GPV以外的病原，如果没有采取有效的灭活手段，那么随着血清和卵黄抗体在鹅群中的应用，有可能造成在同种动物之间某些传染病(特别是病毒性传染病)的人为传播。为保障免疫母鹅在免疫过程中一直不受外源病原的威胁，也是十分棘手的事情。即使没有上述危险，对制备高质量的制品(如精提免疫球蛋白)，而且中和抗体效价高，被动免疫用量小，整个工艺制备量大等方面也有诸多问题存在。
发明内容
本发明的发明目的用马、骡、驴等异种动物，生产抗GPV免疫球蛋白，目的是大量生产对鹅安全、对雏鹅能在孵化出壳后，紧急预防注射，预防小鹅瘟的发生；对已发病的雏鹅，紧急治疗，治愈小鹅瘟；减少小鹅瘟发病的重大损失的抗小鹅瘟免疫球蛋白。
本发明的免疫动物(马、骡、驴)选3～8岁，营养良好，体型大者；马传贫、鼻疽检疫阴性者；免疫前隔离观察健康者。
本发明的免疫原采用小鹅瘟活疫苗(市售，鸭胚测每羽份≥103ELD50，100羽份/瓶)；小鹅瘟GB株(广东佛山兽医科学院惠赠鹅胚测，每0.3ml含毒≥103ELD)；小鹅瘟活疫苗与小鹅瘟GB株的混合体积比为(1-2)∶(1-2)；免疫佐剂弗氏完全佐剂；免疫增强剂吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液(发明名称为一种提高动物免疫功能的苷肽注射液，专利申请号为2005 1 0016626.2)，5ml/支；免疫原与弗氏完全佐剂混合的体积比为1∶1。
免疫程序验血、放血及血清分离对马(骡、驴)进行基础免疫1次。背部两侧皮下多点注射。免疫原1的配制将100羽份/瓶疫苗用3ml生理盐水稀释，与3ml弗氏完全佐剂混合均匀，每匹马分6点注射，每点1ml，同时臀部肌注苷肽注射液5.0ml。基础免疫后21天，可强化免疫。
强化免疫两次。免疫原2的配制取鹅胚GB株尿囊毒液与弗氏完全佐剂等量混合，第一次强化免疫6ml，第二次强化免疫9ml，背部两侧皮下多点注射，每点1ml，每次强化免疫同时，臀部肌注苷肽注射液5ml，两次强化免疫间隔10天。第二次强化免疫后14天，采血，测血清抗小鹅瘟中和抗体效价，当抗小鹅瘟中和指数≥103.8(≥6300倍)时，放血。第一次接15～17ml/kg体重放血，隔3～5天第二次采血，二次采血每马比第一次放血少300～400ml，二次采血后，休息20日，行第二程强化免疫，以此类推。采血后用自然加压凝结法分离血清。
血清精制 辛酸提取法在血清中加入倍量的PH4.0的0.06mol/L的醋酸缓冲液，在20℃左右的室温下充分强力搅拌40min，同时按上述血清和缓冲液的混合液计算，以4％的比例滴加化学纯级的辛酸，以4000r/min，过滤取滤液入透析袋，在0.015mol/L的醋酸盐液中透析48h，取出透析袋，在20％PEG中透析脱水至原血清量的70％，收集袋内血清，按总量的0.5％加入氯仿，0.85％加入氯化钠和0.0035％加入硫柳汞，充分摇匀，再用除菌滤器抽滤，即得精制马抗小鹅瘟免疫球蛋白半成品。
半成品无菌检验(应为阴性)和血清中和抗体效价检测(中和指数应≥104.1，即≥12500倍)。
成品制作将半成品适当稀释，使其中和指数≥103.9即≥7900，定量分装，5ml/支，即为本发明产品。该产品抗小鹅瘟中和抗体效价的效检标准为中和指数≥103.8即≥6300。所以按中和指数≥103.9即≥7900分装，是附加了20％的抗体效价滴度。
当成年鹅血清抗GPV中和抗体指数≥101.8(即≥63)，用103EID的GB株攻毒，9/10以上保护，对照组全部发病死亡。(均观察10日。因此，无论是成年鹅和雏鹅，其血清中和指数101.8是最低抗体保护效价。
根据以上试验数据，根据自然发病的均限于雏鹅，成年鹅多为隐性感染的实际情况，在实际应用中，以每公斤体重0.5ml给雏鹅皮下注射，在小鹅瘟已发病的疫区，可使95％的受威胁的雏鹅得到保护，以每公斤体重1ml给病雏鹅注射，90％以上早期治愈。每公斤体重0.5ml给成鹅皮下注射，可消除隐性感染，确保净化疫区。
预防性注射雏鹅达3万余只，治疗性注射液雏鹅达3000余只，给成年鹅注射达5000余羽，初步证实了上述应用技术的应用效果，抗GPV免疫球蛋白可作为紧急预防和紧急治疗的药物。
本发明的积极效果如下①安全性好 按5倍使用剂量的产品，给雏鹅和成年鹅肌注或皮下注射，观察14日，无任何不良反应。
②抗体效价高 用弱毒做为基础免疫原，用强毒做为强化免疫原，加福氏完全佐剂，配合苷肽注射液，能使免疫马GPV的抗体效价达到较高的水平(中和指数≥103.8)；用辛酸提取法提取免疫球蛋白，收率在70％以上。半成品的效价检测中和指数≥104.1；以中和指数≥103.9定量分装；以中和指数≥103.8为成品效检标准。这样高的中和抗体效价确保以较少的用量(每公斤体重0.5ml)快速(4h)给鹅血清抗GPV中和指数达到最低保护水平(中和指数≥101.8。且能维持14天以上。
③临床应用效果好 最小发病的雏鹅，一般在3～5日龄开始，数天内涉及全群死亡率可达70～75％，全军覆没也常见。在发病疫区，按每公斤体重0.5ml给雏鹅皮下紧急预防注射(已注射了万余只)，95％的雏鹅得以保护；对发病雏鹅，按每公斤体重1ml给雏鹅皮下紧急治疗(治疗3000余只)，90％的病雏鹅得以治愈。此外，在疫区给雏鹅皮下按每公斤体重皮下预防注射，对于消除成年鹅隐性感染和净化疫区是确实的。具有紧急预防和治疗的免疫球蛋白的效果。
④用马(驴、骡)异种动物生产鹅用抗GPV免疫球蛋白与用鹅生产鹅用免疫球蛋白相比，一是生产量大，二是可以避免同种动物之间某些病毒传染病的人为传播。
⑤本发明产品是用免疫马(驴、骡)血清精提的免疫球蛋白，无色透明液体。在4℃条件，产品的中和指数从103.9的时间为1年，所以产品很稳定。同时运输也很方便，能鹅皮下注射剂量小，操作容易。
具体实施例方式
实施例1本发明的免疫原采用小鹅瘟活疫苗(市售，鸭胚测每羽份≥103ELD50，100羽份/瓶)；小鹅瘟GB株(广东佛山兽医科学院惠赠鹅胚测，每0.3ml含毒≥103ELD)；小鹅瘟活疫苗与小鹅瘟GB株的混合体积比为1∶1.5；免疫佐剂弗氏完全佐剂；免疫增强剂吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液，5ml/支；免疫原与弗氏完全佐剂混合的体积比为1∶1。
免疫程序验血、放血及血清分离对马(骡、驴)进行基础免疫1次。背部两侧皮下多点注射。免疫原1的配制将100羽份/瓶疫苗用3ml生理盐水稀释，与3ml弗氏完全佐剂混合均匀，每匹马分6点注射，每点1ml，同时臀部肌注苷肽注射液5.0ml。基础免疫后21天，可强化免疫。
强化免疫两次。免疫原2的配制取鹅胚GB株尿囊毒液与弗氏完全佐剂等量混合，第一次强化免疫6ml，第二次强化免疫9ml，背部两侧皮下多点注射，每点1ml，每次强化免疫同时，臀部肌注苷肽注射液5ml，两次强化免疫间隔10天。第二次强化免疫后14天，采血，测血清抗小鹅瘟中和抗体效价，当抗小鹅瘟中和指数≥103.8(≥6300倍)时，放血。第一次接15～17ml/kg体重放血，隔3～5天第二次采血，二次采血每马比第一次放血少300～400ml，二次采血后，休息20日，进行第二程强化免疫，以此类推。采血后用自然加压凝结法分离血清。
血清精制 辛酸提取法在血清中加入倍量的PH4.0的0.06mol/L的醋酸缓冲液，在20℃左右的室温下充分强力搅拌40min，同时按上述血清和缓冲液的混合液计算，以4％的比例滴加化学纯级的辛酸，以4000r/min，过滤取滤液入透析袋，在0.015mol/L的醋酸盐液中透析48h，取出透析袋，在20％PEG中透析脱水至原血清量的70％，收集袋内血清，再用除菌滤器抽滤，即得精制马抗小鹅瘟免疫球蛋白半成品。
半成品无菌检验(应为阴性)和血清中和抗体效价检测(中和指数应≥104.1，即≥12500倍)。
成品制作将半成品适当稀释，使其中和指数≥103.9即≥7900，定量分装，5ml/支，即为本发明产品。该产品抗小鹅瘟中和抗体效价的效检标准为中和指数≥103.8即≥6300。所以按中和指数≥103.9即≥7900分装，是附加了20％的抗体效价滴度。
当成年鹅血清抗GPV中和抗体指数≥101.8(即≥63)，用103EID的GB株攻毒，9/10以上保护，对照组全部发病死亡。(均观察10日。因此，无论是成年鹅和雏鹅，其血清中和指数101.8是最低抗体保护效价。
根据以上试验数据，根据自然发病的均限于雏鹅，成年鹅多为隐性感染的实际情况，在实际应用中，以每公斤体重0.5ml给雏鹅皮下注射，在小鹅瘟已发病的疫区，可使95％的受威胁的雏鹅得到保护，以每公斤体重1ml给病雏鹅注射，90％以上早期治愈。每公斤体重0.5ml给成鹅皮下注射，可消除隐性感染，确保净化疫区。
预防性注射雏鹅达3万余只，治疗性注射液雏鹅达3000余只，给成年鹅注射达5000余羽，初步证实了上述应用技术的应用效果，抗GPV免疫球蛋白可作为紧急预防和紧急治疗的药物。
实施例2本发明的免疫原采用小鹅瘟活疫苗(市售，鸭胚测每羽份≥103ELD50，100羽份/瓶)；小鹅瘟GB株(广东佛山兽医科学院惠赠鹅胚测，每0.3ml含毒≥103ELD)；小鹅瘟活疫苗与小鹅瘟GB株的混合体积比为1.5∶1.2；免疫佐剂弗氏完全佐剂；免疫增强剂吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液，5ml/支；免疫原与弗氏完全佐剂混合的体积比为1∶1。
免疫程序与实施例1相同。
权利要求
1.抗小鹅瘟免疫球蛋白，其特征是免疫原采用小鹅瘟活疫苗和小鹅瘟GB株；免疫佐剂弗氏完全佐剂；免疫增强剂吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液。
2.根据权利要求1所述的抗小鹅瘟免疫球蛋白，其特征是所述的小鹅瘟活疫苗与小鹅瘟GB株的混合体积比为(1-2)∶(1-2)；所述的免疫原与弗氏完全佐剂混合的体积比为1∶1；所述的免疫增强剂苷肽注射液，5ml/支。
全文摘要
抗小鹅瘟免疫球蛋白，属于生物技术领域，是采用小鹅瘟鸭胚培养尿囊液和小鹅瘟鹅胚培养尿囊液与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫动物，使用苷肽注射液作为免疫增强剂。免疫途径采用皮内、皮下多点注射、后海穴注射等多种免疫途径。按照中华人民共和国兽用生物制品规程规定的方法对制备的高免免疫球蛋白进行加工，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，在用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，不同pH作用，杀灭其他不同动物易感病毒。本发明的产品特异性强，可作为紧急预防和治疗小鹅瘟的生物制剂，具有使用安全性好、抗体效价高、不会产生药物残留、保存和使用方便、临床应用效果确实的优点。
文档编号A61P31/12GK1958072SQ20061013163
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者张中洋 申请人:张中洋