一种由绞股蓝、西洋参和黄芪制成的药物组合物的制作方法

专利名称：一种由绞股蓝、西洋参和黄芪制成的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的药物组合物，具体涉及一种由绞股蓝或绞股蓝提取物、西洋参或西洋参提取物、黄芪或黄芪提取物组成的药物组合物及其制备方法，以及含有该药物组合物的制剂，属于医药技术领域。
2、背景技术70年代以来，我国癌症发病及死亡率一直呈上升趋势，至90年代的20年间，癌症死亡率上升29.42％，年龄调整死亡率上升11.56％。2000年癌症发病人数约180～200万，死亡140～150万，癌症正在成为新世纪人类的第一杀手。目前现代医学对癌症的治疗，主要是手术治疗配合放疗、化疗。手术虽能去除原发病灶，但不能从根本上杜绝癌细胞的再生与繁殖；放、化疗虽能杀灭癌细胞，但同时也使大量的正常组织细胞受到损害，诱发胃肠反应、骨髓抑制和肝肾、心脏功能损害。中医中药治疗癌症有悠久的历史并形成了自己独特的一些治疗法则，如扶正祛邪、清热解毒、活血化瘀等法则，已证实中医药治疗癌症具有抗癌抑瘤，提高机体免疫功能，降低放化疗毒副反应，调节机体阴阳平衡，提高带癌生存率及生存质量的突出作用，特别是对癌症手术后的康复，以及对放化疗的增效减毒方面发挥了重要的作用。
绞股蓝Gynostemma Pentaphyllum(Thumb.)Makino，又名七叶胆，具有清热解毒、止咳祛痰、益气养阴、延年益寿之功效，有“南方人参”之称。药理研究表明，绞股蓝具有抗衰老、抗应激和疲劳、抗肿瘤、性激素和雌激素样作用、镇咳祛痰、降血脂与治疗肝脏疾病等多种药理作用。绞股蓝的抗癌作用机理为可直接杀灭癌细胞，明显提高小鼠空斑形成细胞和血凝抗体效价，明显增强小鼠的迟发超敏反应，从而提高带瘤动物的免疫力。绞股蓝能增加淋巴细胞数目，提高小鼠自然杀伤细胞(NK)活性和血清溶血素的产生及活性，并能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，提高脾细胞分泌抗体的能力，另外绞股蓝还能降低S180肉瘤小鼠的脂质过氧化反应，提高其血浆中超氧化物歧化酶的活性，保护机体正常的细胞免受过多有害自由基的损伤，从而达到限制肿瘤生长及侵袭作用。
西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根，别名洋参、花旗参、广东人参。西洋参性凉，味甘微苦，入心、肺、肾三经。有补肺降火，养胃生津止渴作用，用于治疗肺虚久咳、失血、咽干、口渴、虚热、烦倦等，还可用于各种肿瘤的治疗。化学成分根茎含苷类，主要是人参皂苷，又含挥发油，树脂等。总皂苷水解后分离得人参二醇、人参三醇和齐墩果酸。现代研究表明，西洋参的药理作用有(1)抗癌和增强机体免疫功能作用本品能增强T细胞产生淋巴因子能力，能明显增强小鼠脾NKC的活性，有抗癌作用；(2)总皂苷和人参皂苷有显著抗疲劳作用，抗利尿，抗缺氧作用；(3)总皂苷影响蛋白质，脂肪代谢，能降低血糖；(4)皂苷有抗心律失常作用，并能降低小白鼠因注射中枢兴奋药戊四氮与士的宁所引起的惊厥死亡率；(5)对大脑有镇静作用，其镇静作用强于中国人参。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气固表、托毒生肌、利水的功效，“可治一切气衰血虚之证”。现代药理研究表明，黄芪除具有显著的免疫增强作用，还具有良好的抗肿瘤、抗衰老的作用。黄芪的免疫增强作用主要表现在对正常机体的抗体生成功能有明显促进作用，可使ConA诱导的T细胞增殖反应和B细胞免疫功能明显增强，可明显地促进小鼠NK细胞的活性，可明显提高老年人的补体溶解免疫复合物(IC)能力，从而降低循环免疫复合物水平，减少IC沉积，黄芪、黄芪多糖、黄芪皂苷对单核-巨噬细胞吞噬功能均有增强作用。黄芪的抗肿瘤作用主要表现在黄芪对造血和免疫系统有保护作用，这对肿瘤的放疗起积极协助作用。
目前，尚未见用绞股蓝、西洋参、黄芪三者的配伍组方来治疗肿瘤的报道。
3、发明内容本发明的目的是提供一种用于抗肿瘤的药物组合物，它主要由绞股蓝、西洋参和黄芪制成，其重量份数为绞股蓝0.5～20份 西洋参1～30份 黄芪1～100份，优选为绞股蓝1～10份 西洋参2～6份 黄芪2～25份，最佳为绞股蓝5份 西洋参3份 黄芪4份。
绞股蓝、西洋参和黄芪药材可以用适宜的溶剂分别或混合经过提取加工得到其提取物，总提取物再和药用辅料混合加工制成各种制剂。总提取物中所含的主要有效成分为皂苷和/或多糖，且总提取物中主要有效成分的总含量不低于50％。
本发明提供了上述绞股蓝、西洋参和黄芪的提取制备方法，但不仅限于下述工艺绞股蓝的提取制备取绞股蓝药材，加75％乙醇回流提取二次，每次2小时，滤过，流液回收乙醇至无醇味，加水使成每1ml相当于2g生药量的溶液，搅匀，放冷，静置过夜，滤过，滤液通过已处理好的大孔树脂柱，先用2倍柱体积的水冲柱，弃去水液，再用3倍柱体积的60％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.08～1.10的浓缩液，喷雾干燥，即得。通过本工艺制得的绞股蓝提取物得率为2～4％，绞股蓝总苷含量不低于50％。
还可以通过以下方法提取制备方法一取绞股蓝药材，加80％乙醇回流提取三次，每次2小时，加醇量为每次10倍量，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水适量，搅匀，放冷，静置过夜，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.09～1.10的浓缩液，喷雾干燥，即得。通过本工艺通过本工艺制得的绞股蓝提取物得率为5～7％，绞股蓝总苷的含量不低于40％。
方法二取绞股蓝药材，加80％乙醇回流提取二次，每次3小时，第一次加醇10倍量，第二次8倍量，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，放置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏状，喷雾干燥即得。通过本工艺通过本工艺制得的绞股蓝提取物得率为6～10％，绞股蓝总苷的含量不低于30％。
西洋参的提取制备取西洋参，加10倍量水，浸泡8小时，滤出浸泡液，继加8倍量常水，煎煮1小时，共二次，合并浸提液，减压浓缩至密度为1.19～1.25(60℃)，喷雾干燥，得水浸膏粉。依次加8、5、5、5倍量正丁醇，沸水浴搅拌提取1h，共4次，合并提取液，减压回收正丁醇，真空干燥得粗总皂苷。将粗总皂苷拌入20倍量(W/W)D101型大孔树脂上，用热水冲洗至洗涤水近无色，用4倍量80％乙醇搅拌洗脱二次，每次1h，合并洗脱液，回收乙醇，喷雾干燥即得。通过本工艺制备的西洋参提取物得率为0.5～2％，总皂苷含量不低于50％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量和不低于5％。
还可以通过以下方法提取制备方法一取西洋参，加水煎煮三次，每次1.5小时，加水量为12倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.26(60)，滤过，滤液减压浓缩、真空干燥，得水提浸膏粉。依次加8、5、5、3倍量80％，沸水浴搅拌提取1h，共4次，合并提取液，减压回收正丁醇，真空干燥即得。通过本工艺制得的西洋参提取物，得率为1～4％，总皂苷含量不低于30％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量和不低于2％。
方法二取西洋参，加水煎煮三次，每次2小时，加水量为10倍量，合并煎液，滤过，滤液上大孔树脂，采用D101型大孔树脂，树脂与生药比例为1∶0.68，用两倍量75％乙醇洗脱。收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.18～1.27(60℃)，真空干燥(60℃)，即得。通过本工艺制得的西洋参提取物，得率为1～3％，总皂苷含量不低于40％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量和不低于3％。
黄芪的提取制备黄芪多糖和总皂苷均具有抗肿瘤作用，下面分别提供二者的制备方法以黄芪多糖为有效成分的提取物的制备取黄芪药材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小时，提取液弃去，取药渣加水提取二次，提取液合并，浓缩至提取液体积与生药材的比例为1.05∶1，加入乙醇沉淀使含醇量达到70％，过滤，得沉淀，沉淀用70％乙醇洗涤，再用适量水溶解，过滤，滤液过大孔树脂，用水洗脱，收集水洗液，将水洗液浓缩至药液体积与药材比例为1∶2.5，加入乙醇使含醇量达到70％，得沉淀，将沉淀用95％乙醇和丙酮洗涤脱水，减压干燥(60℃)，即得。通过本工艺制备的黄芪提取物得率为0.5～2％，黄芪多糖的含量不低于50％。
还可以通过以下方法提取制备方法一取黄芪药材，加水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.23，加乙醇使含醇量达80％，静置24小时，滤过，沉淀加水溶解，滤过，再加乙醇使含醇量达85％，静置24小时，滤过，收集沉淀，真空干燥即得。通过本工艺制备的黄芪提取物得率为2～4％，黄芪多糖含量不低于40％。
方法二取黄芪药材，加10倍量80％乙醇提取4小时，提取液弃去，取药渣加水提取二次，每次2小时，每次加水10倍量，提取液合并，过滤，滤液加乙醇使含醇量达85％，过滤，滤液减压浓缩至稠膏状，喷雾干燥即得。通过本工艺制备的黄芪提取物得率为3～4％，黄芪多糖含量不低于35％。
以总皂苷为主要成分的提取物的制备取黄芪，加水煎煮三次，每次1.5小时，第一次加水10倍量，二、三次均为8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含醇量为75％，第二次为85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，加于已处理好的大孔吸附树脂柱，先用2倍体积的水冲柱，再用4倍体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、真空干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪提取物得率为0.5～2％，总皂苷含量不低于50％，其中黄芪甲苷含量不低于2.0％。
还可以通过以下方法提取制备方法一取黄芪加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含乙醇量60％，第二次85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，减压浓缩，真空干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪提取物得率为3～5％，总皂苷含量不低于30％，其中黄芪甲苷含量不低于1％。
方法二取黄芪加水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理1次使含乙醇量为60％，冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，并减压浓缩、真空干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪提取物得率为2～4％，总皂苷含量为不低于40％，其中黄芪甲苷含量不低于1％。
本发明药物组合物除可以上述药材投料制得外，还可以提取物代替药材直接投料制得。以总苷为主要有效成分的绞股蓝提取物简称绞股蓝总苷，以总皂苷为主要有效成分的西洋参提取物简称西洋参总皂苷，以总皂苷为主要有效成分的黄芪提取物简称黄芪总皂苷，以多糖为主要有效成分的黄芪提取物简称黄芪多糖。根据绞股蓝总苷相对于药材的得率2～4％，西洋参总皂苷相对于药材的得率0.5～2％，黄芪多糖相对于药材的得率0.5～2％，黄芪总皂苷相对于药材的得率0.5～2％进行计算，有以下两种配比，分别为配比1绞股蓝总苷1～80份、西洋参总皂苷0.5～60份、黄芪多糖0.5～200份，优选2～40份、1～12份、1～50份；最佳为10～20份、1～6份、2～8份。
配比2绞股蓝总苷1～80份、西洋参总皂苷0.5～60份、黄芪总皂苷0.5～200份，优选2～40份、1～12份、1～50份；最佳为10～20份、1～6份、2～8份。
上述药物组合物中绞股蓝总苷中总苷的含量不低于30％，最好不低于50％；西洋参总皂苷中总皂苷的含量不低于30％，最好不低于50％，其中人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量和不低于2％；黄芪多糖中多糖的含量不低于35％，最好不低于50％；黄芪总皂苷中总皂苷的含量不低于30％，最好不低于50％，其中黄芪甲苷的含量不低于1％。
以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减小，如大规模生产可以以千克为原料，或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间重量配比的比例不变。若以千克为单位，可以制成100～10000次用量的制剂，如作为注射剂，可制成100～10000支，每次用量1～10支。如作为片剂，可制成100～10000片，每次服用1～10片。
以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，可以相应调整组成的比例，增加或者减少不超过100％。
本发明进一步要求保护本发明药物组合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。本发明药物组合物可以抑制癌细胞生长，促进机体免疫功能，增加淋巴细胞数目，保护和改善骨髓造血功能，提高内分泌体液的调节功能，提高机体物质代谢，减轻放、化疗毒副作用，增强放、化疗的效果。主要用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤等。
本发明药物组合物可以制成任何一种临床上或药学上可接受的制剂，优选口服制剂或注射剂，以口服或肠胃外给药等方式施用于需要这种治疗的患者。
用于肠胃外给药时，可将其制成注射剂，注射剂系指药物制成的供注入体内的溶液、乳液或混悬液及供临用前配制或稀释成溶液或混悬液的粉末或浓溶液的无菌制剂，包括注射液、注射用无菌粉末和注射用浓溶液。注射液系指药物制成的供注射入体内用的无菌溶液型注射液、乳液型注射液或混悬型注射液，其标示装量可以为0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、250ml、500ml等，一般不小于100ml的供静脉滴注用的大体积注射液也称静脉输液。注射用无菌粉末系指药物制成的供临用前用适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物，无菌粉末可以用溶媒结晶法、喷雾干燥法或冷冻干燥法等制得。注射用浓溶液系指药物制成的供临用前稀释供静脉滴注用的无菌浓溶液。
用于口服给药时，可将其制成常规的固体制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂和口服溶液剂等。片剂系指药物与适宜的辅料混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂；片剂以口服普通片为主，另有含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、缓释片、控释片与肠溶片等。胶囊剂系指药物或加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂；胶囊剂依据其溶解与释放特性，可分为硬胶囊(通称为胶囊)、软胶囊(胶丸)、缓释胶囊、控释胶囊和肠溶胶囊。颗粒剂系指药物与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂；颗粒剂可分为可溶颗粒(通称为颗粒)、混悬颗粒、泡腾颗粒、肠溶颗粒、缓释颗粒和控释颗粒等。丸剂系指药物与适宜的辅料均匀混合，以适当方法制成的球状或类球状固体制剂；丸剂包括滴丸、糖丸、小丸等。口服溶液剂系指药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。
本发明药物组合物的制剂可采用现有制药领域中的常规方法生产，需要的时候可以添加各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。
本发明药物组合物在制成注射剂时，所用溶剂可以是水性溶剂和非水性溶剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。水性溶剂最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9％氯化钠溶液或其他适宜的水溶液；非水性溶剂常用的非水性溶剂为植物油，主要为供注射用大豆油，其他还有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液。常用的渗透压调节剂包括氯化钠、葡萄糖、氯化钾、氯化镁、氯化钙、山梨醇等，优选氯化钠或葡萄糖；常用的pH值调节剂包括醋酸+醋酸钠、乳酸、枸橼酸+枸橼酸钠、碳酸氢钠+碳酸钠等；常用的增容剂包括聚山梨酯80、丙二醇、卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油等；常用的抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等；常用抑菌剂包括苯酚、甲酚、三氯叔丁醇、苯甲醇等。
本发明药物组合物在制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。填充剂包括淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；粘合剂包括羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、胶化淀粉等；崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。
本发明药物组合物具有下列优点(1)本发明提供了一种新的具有抗肿瘤作用的药物组合物，满足了临床需要。
(2)中医认为热毒蕴结是恶性肿瘤的主要病因病理之一。清热解毒法治疗肿瘤既有直接抑制或杀伤肿瘤细胞的作用，又能提高机体的免疫功能而达到治疗效果。临床上多见癌瘤患者呈热郁火毒之证，无论实火(热)、虚火(热)，凡热势驽张，说明肿瘤正在发展，对这类癌瘤患者当拟清热解毒、滋阴降火之法。本发明采用绞股蓝、西洋参、黄芪配伍，绞股蓝清热解毒，西洋参滋阴降火，黄芪温补托里、扶正祛邪，配伍合理。
(3)首次通过药效学实验研究证明本发明药物组合物与单用绞股蓝相比，对荷SRS-82肉瘤小鼠有显著抑瘤作用，可显著增强荷SRS-82肉瘤小鼠的免疫功能，对小鼠肝癌(HePA))实体瘤生长有显著抑瘤作用，能显著提高荷H22小鼠NK细胞的杀伤力及淋巴细胞转化率，抑制小鼠Lewis肺癌肺转移，与放疗药5-氟尿嘧啶及60Co化疗联用有增效作用，而且其最佳配比的疗效与阳性对照药康莱特注射液、环磷酰胺的疗效相当、毒性小，这是本领域普通技术人员所意想不到的。
(4)本发明通过药理试验得出了绞股蓝、西洋参和黄芪的最佳配比。
(5)绞股蓝、西洋参与黄芪合并用药呈协同作用，且用药剂量相对减小。
以下通过实验例来进一步阐述本发明所述药物组合物的有益效果，这些实验例包括本发明药物组合物的药效学以及稳定性实验。
以下实验例中所用的绞股蓝提取物(绞股蓝总苷)来源于实施例1；西洋参提取物(西洋参总皂苷)来源于实施例2；黄芪多糖来源于实施例3；黄芪总皂苷来源于实施例4。绞股蓝或绞股蓝总苷、西洋参或西洋参总皂苷、黄芪(以多糖为主要有效成分)或黄芪多糖的药物组合物以下简称组合物A，绞股蓝或绞股蓝总苷、西洋参或西洋参总皂苷、黄芪(以总皂苷为主要有效成分)或黄芪总皂苷的药物组合物以下简称组合物B。
实验例1本发明药物组合物对荷SRS-82肉瘤小鼠的抑瘤实验实验动物ICR种小鼠，体重18～22g，8周龄，雌雄各半，共380只，每组10只。
SRS-82细胞株，上海细胞生物所。
供试品阳性对照药物康莱特注射液，100ml:10g，浙江康莱特药业有限公司；绞股蓝总苷注射液自制，规格2ml；西洋参总皂苷注射液自制，规格2ml；黄芪多糖注射液自制，规格2ml；黄芪总皂苷注射液自制，规格2ml；
本发明药物组合物A注射液的不同重量配比组，自制；本发明药物组合物B注射液的不同重量配比组自制。
表1本发明组合物对荷SRS-82肉瘤小鼠的抑瘤率比较
注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与西洋参组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01；与黄芪多糖组比较，☆p＜0.05，☆☆p＜0.01；与黄芪总皂苷组比较，&p＜0.05，&&p＜0.01。
实验方法小鼠分组小鼠分为38组空白对照组、阳性对照组、西洋参总皂苷组、黄芪多糖组、黄芪总皂苷组、绞股蓝总苷组、本发明组合物注射液不同配比组。
肿瘤接种分别将培养的SRS-82细胞接种昆明小鼠后第8天，自4只小鼠腹腔中抽取腹水约15ml，用生理盐水稀释成细胞数为1.0×107/ml后(共30ml)，每只小鼠左腹股沟皮下注射0.2ml(2.0×106/只)。
给药方式及时间每只小鼠腹腔注射(ip)给药，康莱特注射液不稀释直接ip给药，于接种肿瘤后的第2天开始给药，1次/天，共10天。
抑瘤率于接种后的第12天，脱颈椎处死各组小鼠，剥离肿瘤块，称取肿瘤重量，并按以下公式计算抑瘤率抑瘤率＝(模型组平均肿瘤重量-给药组平均肿瘤重量)/模型组平均肿瘤重量×100％。
实验结果与结论结果见表1。与空白对照组比较，各给药组对荷SRS-82瘤小鼠肿瘤有明显抑制作用(p＜0.05，p＜0.01)，其中组合物A、B在绞股蓝1～10份、西洋参2～6份、黄芪3～10份的配比范围内疗效均优于单用绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖和黄芪总皂苷，提示绞股蓝、西洋参、黄芪合用有协同增效作用。其中以绞股蓝+西洋参+黄芪(5g+3g+4g)剂量组疗效最为显著，且与阳性对照药康莱特注射液疗效相当，表明抗肿瘤活性强。
实验例2本发明药物组合物对荷SRS-82肉瘤小鼠免疫功能的影响实验动物ICR种小鼠，体重18～22g，8周龄，雌雄各半。
瘤种及试剂小鼠SRS-82细胞株购自上海细胞生物所白细胞介素2(1L-2)注射液，深圳科兴生物技术公司生产；IL-2及α-肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒；刀豆素A(Con-A)购自晶美生物工程公司。
供试品阳性对照药物康莱特注射液，100ml:10g，浙江康莱特药业有限公司；绞股蓝注射液自制；本发明药物组合物A，自制(见实施例8水针剂处方1)，主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)；本发明药物组合物B，自制(见实施例8水针剂处方2)，主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪总皂苷(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)。
实验方法小鼠分组小鼠分为空白对照组、阳性对照组、本发明组合物注射液A组低、中、高剂量组、本发明组合物注射液B组低、中、高剂量组。
肿瘤接种分别将培养的SRS-82细胞接种昆明小鼠后第8天，自4只小鼠腹腔中抽取腹水约15ml，用生理盐水稀释成细胞数为1.0×107/ml后(共30ml)，每只小鼠左腹股沟皮下注射0.2ml(2.0×106/只)。
给药方式及时间每只小鼠腹腔注射(ip)给药，康莱特注射液不稀释直接ip给药，于接种肿瘤后的第2天开始给药，1次/天，共10天。
2.1本发明白细胞数量变化实体瘤小鼠于接种肿瘤后的第11天，眼眶后静脉丛采血约100μl，用日本F-800血细胞自动分析仪检测各组小鼠的白细胞数。
2.2体外巨噬细胞吞噬功能检测各组小白鼠于实验第11天分别腹腔内注射冷DMEM培养基5ml，轻柔腹腔，10min后抽出腹腔液，1000r/min离心10min，弃部分上清液，留约2ml。然后混匀后加入1％鸡血球2ml。放恒温培养箱内60min后，混匀涂片，瑞氏染色，计算100个巨噬细胞吞噬百分率(多少个细胞吞噬了红细胞)及吞噬指数(共吞噬了多少个红细胞)。
2.3荷瘤小鼠血清比IL-2及TNP含量的测定于肿瘤接种后第12天，通过眼眶后静脉采血，3000r/min离心10min分离血清，用晶美生物工程公司的小鼠IL-2及TNF-α试剂盒测定血清IL-2及TNF-α水平。
表2本发明药物组合物SRS-82荷肉瘤小鼠白细胞数量的影响
注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
表3本发明药物组合物SRS-82荷肉瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
表4本发明药物组合物对SRS-82荷瘤小鼠血清TNF、IL-2水平的影响
注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
实验结果与结论结果见表2、3、4。由表2结果可以看出本发明药物组合物A、B和绞股蓝均可使荷瘤SRS-82小鼠血白细胞数升高(p＜0.05，p＜0.01)。由表3结果可以看出本发明药物组合物A、B和绞股蓝均可使荷瘤SRS-82小鼠巨噬细胞吞噬功能增强(p＜0.05，p＜0.01)。由表4结果可以看出本发明药物组合物A、B和绞股蓝均可使荷瘤SRS-82小鼠血清的TNF及TL-2水平升高(p＜0.05，p＜0.01)。与绞股蓝比，本发明药物组合物A、B各组疗效尤为显著(p＜0.05，p＜0.01)，其中组合物A、B高剂量组疗效优于阳性对照药物康莱特注射液，提示绞股蓝、西洋参、黄芪三药合用有协同抗肿瘤作用。
实验例3 本发明药物组合物对小鼠肝癌(HePA)实体瘤生长的影响实验动物ICR种小鼠，体重18～22g，8周龄，雌雄各半。
供试品阳性对照药物环磷酰胺注射液；绞股蓝注射液自制；本发明药物组合物A，自制(见实施例9粉针剂处方1)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)；本发明药物组合物B，自制(见实施例9粉针剂处方2)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪总皂苷(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)。
实验方法取小鼠均皮下接种肝癌(HePA)瘤液(2×107/ml)0.2ml/只，次日分组，称体重。各组腹腔注射给药，阳性对照组给药环磷酰胺。接种瘤小鼠次日开始腹腔注射给药，共10天，停药次日称体重，处死小鼠并剥离皮下瘤块，称瘤重，并计算抑瘤率。
实验结果与结论结果见表5。与空白对照组比较，环磷酰胺、绞股蓝、本发明药物组合物A、B组均对小鼠肝癌(HePA)瘤生长有显著抑制作用(p＜0.05，p＜0.01)。其中组合物A、B疗效明显优于单用绞股蓝(P＜0.01)，高剂量组疗效与阳性对照药物环磷酰胺疗效相近，提示绞股蓝、西洋参、黄芪三药合用有协同增效作用。
表5本发明药物组合物对小鼠肝癌(HePA)实体瘤生长的影响
注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
实验例4 本发明药物组合物对荷H22小鼠NK细胞活性及淋巴细胞转化率的影响实验动物ICR种小鼠，雌性，18～22g，共80只，每组10只。
瘤种人肝癌细胞系SMMC-7721、小鼠肝癌细胞系H22，吉林省肿瘤防治研究所提供。
供试品绞股蓝总苷颗粒剂自制；西洋参总皂苷颗粒剂自制；黄芪多糖颗粒剂自制；黄芪总皂苷颗粒剂自制；本发明药物组合物A不同重量配比组，自制(见实施例7颗粒剂处方1)；本发明药物组合物B不同重量配比组，自制(见实施例7颗粒剂处方2)。
各药物用生理盐水溶解成所需溶液。
实验方法接种于昆明小鼠第7天的H22腹水，配制成瘤细胞悬液，活细胞数为1×106个/ml，腹水肿瘤细胞于离体后1h内于小鼠腹腔完成接种，每只鼠接种0.1ml(含105个细胞).各给药组灌胃给药，空白对照组给予同体积生理盐水，每天一次，连续10天。
NK细胞活性观察停药后第1d处死小鼠，无菌摘除脾脏，制备脾细胞悬液，调脾细胞含量为4×106P/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，每只小鼠脾细胞设3复孔，取对数生长期K562细胞，调细胞含量为2×105/ml，每孔加入100μl，使每孔效靶比为20∶1，平行设效应细胞对照孔，按MTT方法加入试剂，计算NK细胞杀伤率。
淋巴细胞转化率观察制备脾细胞悬液(4×106/ml)加入96孔培养板，200μl/孔，实验孔中加入ConA15mg/L，对照孔加入等体积生理盐水，37℃、5％CO2培养48h后，加入MTT10μl/孔，计数淋巴细胞转化指数。
表6本发明药物组合物对荷H22小鼠NK细胞活性及淋巴细胞转化率的影响
注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与西洋参组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与黄芪多糖组比较，&p＜0.05，&&p＜0.01；与黄芪总皂苷组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01；与绞股蓝组比较，☆p＜0.05，☆☆p＜0.01。
实验结果与结论结果见表6。与空白对照组比较，西洋参、黄芪多糖、黄芪总皂苷、绞股蓝显著升高NK细胞活性、淋巴细胞转化率(p＜0.05)，本发明组合物A、B极显著升高NK细胞活性、淋巴细胞转化率(p＜0.01)；与西洋参、黄芪多糖、黄芪总皂苷、绞股蓝组比较，本发明药物组合物A、B显著升高NK细胞活性、淋巴细胞转化率(p＜0.05，p＜0.01)，说明本发明药物组合物A、B的疗效优于单用绞股蓝，提示绞股蓝、西洋参、黄芪三药合用有协同增效作用。
实验例5本发明药物组合物对小鼠Lewis肺癌肺转移的影响实验动物ICR种小鼠，雌性，18～22g，共90只，每组10只。
供试品Lewis肺癌瘤株由中国科学院上海药物研究所肿瘤室提供；参芪金康胶囊由黄芪、人参、姜黄、苦参、仙鹤草、僵蚕、浙贝母13味药组成，北京瑞普达肿瘤药物研究所提供，批号030803；绞股蓝胶囊自制；本发明药物组合物A，自制(见实施例6胶囊剂处方1)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)；本发明药物组合物B，自制(见实施例6胶囊剂处方2)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪总皂苷(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)；各药物用生理盐水溶解成所需溶液。
实验方法将小鼠随机分为9组，空白对照组、参芪金康组、绞股蓝组、本发明组合物A高、中、低剂量组、本发明组合物B高、中、低剂量组，每组10只。小鼠分别肌肉接种Lewis肺癌(1∶3癌细胞匀浆)0.2ml/只，次日各组动物连续灌胃给药21天，在实验第22天处死，取肺用压片法计数肺转移和转移灶数。
表7本发明药物组合对小鼠Lewis肺癌自发转移的抑制作用
注与空白对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与参芪金康组比，#p＜0.05；与绞股蓝组比，$p＜0.05，$$p＜0.01。
实验结果与结论结果见表7。与空白对照组比较，参芪金康、绞股蓝、本发明药物组合物A、B能显著抑制肺癌转移、显著抑制肺癌转移灶数(p＜0.05，p＜0.01)；与参芪金康比较，本发明药物组合物A、B都能显著抑制肺转移率(p＜0.05，p＜0.01)，说明本发明药物组合物A、B对于肺癌的转移具有比较好的抑制作用。与绞股蓝比，本发明药物组合物A、B对于肺癌转移的抑制作用优于单用绞股蓝，提示绞股蓝、西洋参、黄芪三药合用有协同增效作用。
实验例6本发明药物组合物与5-氟尿嘧啶(5-Fu)合用的增效作用实验动物ICR种小鼠，体重18～22g，8周龄，雌雄各半，共90只。
供试品阳性对照药物5-氟尿嘧啶注射液，北京紫竹药业有限公司；绞股蓝注射液自制；本发明药物组合物A，自制(见实施例8水针剂处方1)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)；本发明药物组合物B，自制(见实施例8水针剂处方2)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪总皂苷(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)。
实验方法取小鼠，均皮下接种S180瘤液(2×107/ml)0.2ml/只，次日分组，称体重。除空白对照组外，其余各组均腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)60mg/kg。各组腹腔注射给药，空白对照组给药生理盐水，阳性对照组给药环磷酰胺。共10天。停药次日称体重，处死小鼠剥离皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率和增效率。
增效率(％)＝(化疗加水组平均瘤重-化疗加药组平均瘤重)/化疗加水组平均瘤重×100％表8本发明药物组合物与5-氟尿嘧啶抗S180肿瘤的增效作用
注与5-Fu组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与5Fu+绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
实验结果与结论结果见表8。与空白对照组比较，绞股蓝、本发明药物组合物A、B均与5-氟尿嘧啶有协同增效作用(p＜0.05，p＜0.01)，其中组合物A、B增效作用强于单用绞股蓝，组合物A、B高剂量组疗效增效作用最强(p＜0.01)，提示绞股蓝、西洋参、黄芪三药合用有协同增加抗肿瘤药物的药效的作用。
实验例7本发明药物组合物对放疗的增效作用实验动物ICR种小鼠，体重18～22g，8周龄，雌雄各半，每组10只，共90只。
供试品绞股蓝注射液自制；本发明药物组合物A，自制(见实施例9粉针剂处方1)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)；本发明药物组合物B，自制(见实施例9粉针剂处方1)主要有效成分为绞股蓝总苷、西洋参总皂苷、黄芪总皂苷(相当于绞股蓝5g，西洋参3g，黄芪4g)。
实验方法取小鼠，均皮下接种S180瘤液(2×107/ml)0.2ml/只，次日分组，称体重。除空白对照组外其余各组均在接种后第3、第6天用60Co全身照射，照射剂量为0.05Gy/min。各组腹腔注射给药，空白对照组给药生理盐水，阳性对照组给药环磷酰胺。共给药10天，停药次日称体重，处死动物。剥离皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率和增效率。
表9本发明药物组合物与氟尿嘧啶抗S180肿瘤的增效作用
注与60Co组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与60Co+绞股蓝组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
实验结果与结论结果见表9。与空白对照组比较，绞股蓝、本发明药物组合物A、B均与60Co放疗有协同增效作用(p＜0.05，p＜0.01)，其中组合物A、B增效作用强于单用绞股蓝，组合物A、B高剂量组疗效增效作用最为显著(p＜0.01)，提示绞股蓝、西洋参、黄芪三药合用有协同增加化疗疗效的作用。
实验例8本发明药物组合物水针剂特殊安全性实验1、过敏性实验实验动物豚鼠，24只，体重280～310g，雌雄兼用，随机分为供试药A组、供试药B组、阴性对照和阳性对照四组，每大组6只。
供试品本发明药物组合物A，规格5ml，来源于实施例5；本发明药物组合物B，规格5ml，来源于实施例5；阴性对照氯化钠注射液，山东华信制药有限公司；
阳性对照药5％卵白蛋白生理盐水溶液，自制。
给药剂量致敏剂量0.5ml/只；致敏次数隔日腹腔注射1次，连续3次；攻击剂量1ml/只，静脉注射。
实验方法按上述分组分别给豚鼠隔日腹腔注射上述药液0.5ml，共注射三次。然后将每大组豚鼠再分成两小组，每小组3只。第一小组豚鼠于第一次致敏后14天，第二小组于第一次致敏后14天进行抗原攻击，每只豚鼠均静脉注射上述药液1ml。观察并记录攻击后15min内豚鼠的表现。
实验结果与结论供试药组和阴性对照药组豚鼠均未发现过敏反应，而卵白蛋白组产生过敏反应并死亡。表明，组合物注射液无明显致敏作用。
2、溶血性实验试验动物雄性家兔，2只，体重2.5kg。
供试品本发明药物组合物A，剂型水针，规格5ml，来源于实施例5；本发明药物组合物B，剂型水针，规格5ml，来源于实施例5；阴性对照氯化钠注射液，山东华信制药有限公司。
实验方法制备2％红细胞生理盐水混悬液备用。取洁净试管7支，编号并排列在试管架上，按下表顺序操作，混匀后置37℃水浴中温育，观察记录15min、30min、45min、1h、2h、3h的结果。
实验结果与结论供试品0.1～0.5ml各管在15min、30min、45min、1h、2h、3h均未出现溶血和红细胞凝集现象。表明组合物注射液无明显溶血性。
3、血管刺激性实验实验动物家兔，体重2.1～2.3kg，雌雄兼用。
供试品本发明药物组合物A，剂型水针，规格5ml，来源于实施例8；本发明药物组合物B，剂型水针，规格5ml，来源于实施例8；对照药氯化钠注射液，山东华信制药有限公司。
给药剂量家兔静滴给药剂量为100ml/kg。
实验方法取健康家兔9只，随机分为供试药A组、供试药B组、和0.9％氯化钠注射液对照组，每组3只，剂量均为20ml/kg。给药前将兔置固定箱中，于耳缘静脉按上述分组分别滴注供试药和0.9％氯化钠注射液，滴速为1ml/min(20滴/min)，观察给药后24h注射局部有无充血、水肿、出血、坏死。连续给药3天，于末次给药后24h在远离注射部位1cm的向心端取兔耳用10％福尔马林固定，做病理学检查。
实验结果与结论肉眼观察及病理检查表明，给药组与对照组无明显差别，用药部位的血管及周围组织均未见充血、水肿、出血、坏死，病理检查无异常。表明，组合物注射液静脉静滴对血管无刺激性。
实验例9本发明药物组合物注射液稳定性实验样品本发明药物组合物A，剂型水针，规格5ml，来源于实施例8；本发明药物组合物B，剂型水针，规格5ml，来源于实施例8；考察项目性状、pH值、澄明度；长期稳定性实验方法及结果将本品置温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下放置6个月、12个月，各项指标均无明显变化，实验结果表明组合物注射液长期放置基本稳定。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。
实施例1绞股蓝总苷的制备取绞股蓝药材，加75％乙醇回流提取二次，每次2小时，滤过，流液回收乙醇至无醇味，加水使成每1ml相当于2g生药量的溶液，搅匀，放冷，静置过夜，滤过，滤液通过已处理好的大孔树脂柱，先用2倍柱体积的水冲柱，弃去水液，再用3倍柱体积的60％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.08～1.10的浓缩液，喷雾干燥，即得。
分别制得三批绞股蓝总苷，提取物得率和含量见表10。
含量测定对照品溶液的制备 精密称取在60℃减压干燥3小时的绞股蓝皂苷-A对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含2mg的溶液。
供试品溶液的制备 精密称取本品50mg，加甲醇溶解，制成每1ml含2mg的溶液。
测定法 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各100μl，分别置15ml具塞试管中，精密加入新配制的含5％香草醛冰醋酸溶液与高氯酸(2∶8)的混合液2ml，摇匀，密塞，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即放入冰水中冷却2分钟，精密加入冰醋酸10ml，摇匀，以试剂作空白，照分光光度法(中国药典1990年版一部附录51页)试验，在555±5nm波长处测定吸收度，计算，即得。
本品按干燥品计算，含绞股蓝总苷以绞股蓝皂苷-A(C53H90O21)计，不得少于50.0％。
以下实施例中所用的绞股蓝总苷，均为本实施例中制备。
表10绞股蓝提取物总皂苷的得率及含量
实施例2西洋参总皂苷的制备取西洋参，加10倍量水，浸泡8小时，滤出浸泡液，继加8倍量常水，煎煮1小时，共二次，合并浸提液，减压浓缩至密度为1.19～1.25(60)，喷雾干燥，得水浸膏粉。依次加8、5、5、5倍量正丁醇，沸水浴搅拌提取1h，共4次，合并提取液，减压回收正丁醇，真空干燥得粗总皂苷。将粗总皂苷拌入20倍量(W/W)D101型大孔树脂，用热水冲洗至洗涤水近无色，用4倍量80％乙醇搅拌洗脱二次，每次1h，合并洗脱液，减压回收正丁醇，喷雾干燥，即得。
西洋参总皂苷的鉴别取本品粉末0.5g，加甲醇25ml，加热回流1小时，方冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，弃去乙醚液，水层用饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取西洋参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取拟人身皂苷F11对照品，人参皂苷Rb1对照品，人身皂苷Re对照品，人身皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述六种溶液各5ul分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及子紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
分别制得三批西洋参总皂苷，提取物得率和含量结果见表12。
西洋参总皂苷含量测定对照品溶液 精密称取西洋参总皂苷对照品4mg，置2ml量瓶中、加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液(每1ml含西洋参总皂苷2mg)。
供试品溶液 精密称取本品1g，加甲醇提取4次(50、40、40、40ml)，每次提取30min。合并提取液，减压回收至干。加蒸馏水溶解并转移至50ml量瓶中，用蒸馏水分数次洗涤容器，洗液与水溶液合并，加蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取水溶液20ml置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取4次(20、15、15、15ml)，萃取液用正丁醇饱和的水20ml洗涤后，置水浴上减压回收至干。残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，用甲醇多次洗涤容器，洗液并入量瓶，加甲醇至刻度摇匀，即得。
标准曲线 精密量取对照品溶液20、40、60、80、100ul，分别置10ml具塞试管中，置水浴中挥干溶剂，立即取出精密加5％香草醛一冰醋酸液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15min，取出，立即以流动水冷却2min，精密加冰醋酸5ml，摇匀。以相应的试剂为空白，于550nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，西洋参总皂苷的ug数为横座标绘制标准曲线，计算回归方程。
测定法 分别精密吸取供试品溶液20ul，置10ml具塞试管中。在水浴中挥干溶剂。其余步骤同标准曲线的制备。在550nm波长处测得吸收度，由回归方程计算出总皂苷的量。
人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量测定照高效液相色谱法色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙睛为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm；柱温40℃。理论板数按人参Rb1峰计算不低于4000。
表11梯度洗脱流动相配比表
对照品溶液得制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参Rb1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品0.1mg、人参皂苷Re对照品0.4mg、人参皂苷Rb11mg，供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，称定重量，置水浴中加热回流提取1.5小时，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。以下实施例中所用的西洋参总皂苷，均为本实施例中制备。
表12西洋参总皂苷的得率及含量
实施例3黄芪多糖的制备取黄芪药材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小时，提取液弃去，取药渣加水提取二次，提取液合并，浓缩至提取液体积与生药材的比例为1.05∶1，加入乙醇沉淀使含醇量达到70％，过滤，得沉淀，沉淀用70％乙醇洗涤，再用适量水溶解，过滤，滤液过大孔树脂，用水洗脱，收集水洗液，将水洗液浓缩至药液体积与药材比例为1∶2.5，加入乙醇使含醇量达到70％，得沉淀，将沉淀用95％乙醇和丙酮洗涤脱水，减压干燥(60℃)，即得。
分别制得三批黄芪多糖，提取物得率和含量结果见表13。
黄芪多糖的鉴别(1)取本品约0.2g，加水5ml溶解后，加碱性酒石酸铜试液5滴，加热即产生红色沉淀，冷却，滤过，取滤液加盐酸1滴使成酸性，水浴加热10分钟，放冷，调节pH值至中性，加碱性酒石酸铜试液0.5ml，水浴加热即产生红色的氧化亚铜沉淀。
(2)取本品约0.2g，加水2ml溶解后，加5％α-萘酚乙醇溶液0.5ml摇匀，缓缓加入硫酸3ml，两液面交界处显紫红色环。
黄芪多糖含量测定标准溶液的制备 取105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。
标准曲线绘制 精密量取标准溶液0.1ml～0.6ml共6份，分别置25ml量瓶中，加水至2.0ml，并加苯酚溶液(取苯酚300g，铝片0.3g，碳酸氢钠0.15g，混合蒸馏，收集182℃馏分，配制成5％水溶液)1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5min，置水浴中加热15min，取出，迅速冷却至室温，另以2.0ml水同上平行操作作为空白对照，在490nm波长处测定吸收值，计算回归方程。
测定方法 取黄芪提取物0.5g置25ml量瓶中，照标准曲线绘制项下的方法自“加水至2.0ml”起，依法测定吸收值，依回归方程计算多糖的含量。
以下实施例中所用的黄芪多糖，均为本实施例中制备。
表13黄芪多糖的得率及含量
实施例4黄芪总皂苷的制备取黄芪药材，加水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)g，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含醇量为75％，第二次为85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，用注射用水稀释至每1ml相当于原药材1g，冷藏放置12小时，滤过，滤液减压浓缩、真空干燥，即得。
分别制得三批黄芪总皂苷提取物，提取物得率和含量结果见下表14。
黄芪总皂苷鉴别试验鉴别试验一 取本品0.01g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100～120目，5g，内径10～15mm)上，用40％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液；用水洗涤2次，每次20ml；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点；紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点。
鉴别试验二 取本品0.01g，加乙醇30ml，加热回流20分钟，滤过，滤液加0.3％氢氧化钠溶液15ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH值至5～6，用乙酸乙脂15ml振摇提取，分取乙酸乙脂液，用铺有无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙脂1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材2g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)作为展开剂，展开，取出，凉干，置氨蒸气中熏后置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。
黄芪总皂苷含量测定总皂苷的含量测定对照品溶液的制备 精密称取于105℃干燥至恒重的黄芪甲苷对照品约10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含黄芪甲苷干品0.1mg)。
供试品溶液的制备 取本品0.1g，精密称定，加水25ml使溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次10ml，弃去水液，正丁醇至水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，移至25ml量瓶中，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 精密量取对照品溶液、供试品溶液各1ml，置25ml钠氏比色管，置水浴中蒸干，放冷，加新鲜配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，摇匀，放置5分钟，置沸水浴中显色15分钟，取出，立即置冰浴中冷却至室温，加入8ml冰醋酸，摇匀，在538nm波长处测定吸光度，计算，即得。
黄芪甲苷的含量测定色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙睛-水(32∶68)为流动相；蒸发光散射检测器。理论板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000。
对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 精密称取本品0.04g，精密称定，置索氏提取器中，甲甲醇40ml，冷侵过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，方冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点对数方程计算，即得。
以下实施例中所用的黄芪总皂苷，均为本实施例中制备。
表14黄芪总皂苷的得率及含量
实施例5本发明药物组合物片剂的制备处方1绞股蓝提取物128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖43.2g(相当于黄芪4kg)淀粉120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 1000片处方2绞股蓝提取物128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷 46.0g(相当于黄芪4kg)淀粉120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 1000片处方3绞股蓝提取物12.8g(相当于绞股蓝0.5kg)西洋参提取物13.4g(相当于西洋参1kg)黄芪多糖10.8g(相当于黄芪1kg)淀粉120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 1000片处方4绞股蓝提取物12.8g(相当于绞股蓝0.5kg)西洋参提取物13.4g(相当于西洋参1kg)黄芪总皂苷 11.5g(相当于黄芪1kg)淀粉120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 1000片处方5绞股蓝提取物 512.0g(相当于绞股蓝20kg)西洋参提取物 402.0g(相当于西洋参30kg)黄芪多糖 1080.0g(相当于黄芪100kg)淀粉 120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 5000片处方6绞股蓝提取物 512.0g(相当于绞股蓝20kg)西洋参提取物 402.0g(相当于西洋参30kg)黄芪总皂苷 1150.0g(相当于黄芪100kg)淀粉 120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 5000片处方7绞股蓝提取物 256.0g(相当于绞股蓝10kg)西洋参提取物 80.4g(相当于西洋参6kg)黄芪多糖 270.0g(相当于黄芪25kg)淀粉 120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 5000片处方8绞股蓝提取物 256.0g(相当于绞股蓝10kg)西洋参提取物 80.4g(相当于西洋参6kg)黄芪总皂苷 287.5g(相当于黄芪25kg)淀粉 120.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 2.0g羧甲淀粉钠 10.0g共制备 5000片制备工艺原料和淀粉、微晶纤维素加2％HPMC水溶液制软材，然后制粒、干燥，加入硬脂酸镁、羧甲淀粉钠整粒，半产品检验后确定片重，压片、包装得成品。
实施例6本发明药物组合物胶囊剂的制备处方1绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖 43.2g(相当于黄芪4kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方2绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷 46.0(相当于黄芪4kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方3绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 26.8g(相当于西洋参2kg)黄芪多糖 21.6g(相当于黄芪2kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方4绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 26.8g(相当于西洋参2kg)黄芪总皂苷 23.0g(相当于黄芪2kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方5绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 80.4g(相当于西洋参6kg)黄芪多糖 10.8g(相当于黄芪1kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方6绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 80.4g(相当于西洋参6kg)黄芪总皂苷 11.5g(相当于黄芪1kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方7绞股蓝提取物 256.0g(相当于绞股蓝10kg)西洋参提取物 26.8g(相当于西洋参2kg)黄芪多糖 43.2g(相当于黄芪4kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒处方8绞股蓝提取物 256.0g(相当于绞股蓝10kg)西洋参提取物 26.8g(相当于西洋参2kg)黄芪总皂苷 46.0(相当于黄芪4kg)淀粉 60.0g微晶纤维素 20.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁 1.0g共制备 1000粒制备工艺原料和淀粉、微晶纤维素加2％HPMC水溶液制软材，然后制粒、干燥，加入硬脂酸镁整粒，半产品检验后确定装量，装胶囊、包装得成品。
实施例7本发明药物组合物颗粒剂的制备处方1绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖 43.2g(相当于黄芪4kg)糖粉 2000.0g矫味剂 适量2％HPMC50％乙醇溶液 适量共制备 1000包处方2绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷 46.0(相当于黄芪4kg)矫味剂 适量糖粉 2000.0g2％HPMC50％乙醇溶液 适量共制备 1000包处方3绞股蓝提取物 25.6g(相当于绞股蓝1kg)西洋参提取物 26.8g(相当于西洋参2kg)黄芪多糖 21.6g(相当于黄芪2kg)糖粉 2000.0g矫味剂 适量2％HPMC50％乙醇溶液 适量共制备 1000包处方4绞股蓝提取物 25.6g(相当于绞股蓝1kg)西洋参提取物 26.8g(相当于西洋参2kg)黄芪总皂苷 23.0g(相当于黄芪2kg)矫味剂 适量糖粉 2000.0g2％HPMC50％乙醇溶液 适量共制备 1000包制备工艺原料和糖粉加2％HPMC50％乙醇溶液制软材，然后制粒、干燥，半产品检验后确定装量，分装得成品。
实施例8本发明药物组合物水针剂的制备处方1绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖 43.2g(相当于黄芪4kg)聚山梨酯-80 100ml注射用水 加至5000ml共制备 1000支处方2绞股蓝提取物128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷 46.0(相当于黄芪4kg)聚山梨酯-80 100ml注射用水加至5000ml共制备 1000支处方3绞股蓝提取物256.0g(相当于绞股蓝10kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖270.0g(相当于黄芪25kg)聚山梨酯-80 100ml注射用水加至5000ml共制备 1000支处方4绞股蓝提取物256.0g(相当于绞股蓝10kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷 287.5g(相当于黄芪25kg)聚山梨酯-80 100ml注射用水加至5000ml共制备 1000支处方5绞股蓝提取物25.6g(相当于绞股蓝1kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖21.6g(相当于黄芪2kg)聚山梨酯-80 100ml注射用水加至5000ml共制备 1000支处方6绞股蓝提取物25.6g(相当于绞股蓝1kg)西洋参提取物40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷 23.0g(相当于黄芪2kg)聚山梨酯-80 100ml注射用水加至5000ml共制备 1000支制备工艺原辅料用注射用水溶解配液，经活性炭吸附处理后过滤、定容、精虑、半成品检验、灌封、灭菌、检漏、灯检、包装制成成品。
实施例9本发明药物组合物粉针剂的制备处方1绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖 43.2g(相当于黄芪4kg)聚山梨酯-80 100ml甘露醇300g无菌注射用水 加至5000ml共制备1000支处方2绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷46.0(相当于黄芪4kg)聚山梨酯-80 100ml甘露醇300g无菌注射用水 加至5000ml共制备1000支制备工艺原辅料用无菌注射用水配液，经活性炭吸附处理后过滤、定容、精虑、半成品检验、灌装、冻干、压塞、轧盖、包装制成成品。
实施例10本发明药物组合物葡萄糖注射液的制备处方1绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪多糖 43.2g(相当于黄芪4kg)聚山梨酯-80 100ml葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml共制备1000瓶处方2绞股蓝提取物 128.0g(相当于绞股蓝5kg)西洋参提取物 40.2g(相当于西洋参3kg)黄芪总皂苷46.0(相当于黄芪4kg)聚山梨酯-80 100ml葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml共制备1000瓶制备工艺原辅料用注射用水溶解配液，经活性炭吸附处理后过滤、定容、精虑、半成品检验、灌装、加塞、轧盖、灭菌、检漏、灯检、包装制成成品。
权利要求
1.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，制成该药物组合物所含药效成分的原料药的组成为绞股蓝0.5～20份、西洋参1～30份、黄芪1～100份。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，制成该药物组合物所含药效成分的原料药的组成为绞股蓝1～10份、西洋参2～6份、黄芪2～25份。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，制成该药物组合物所含药效成分的原料药的组成为绞股蓝5份、西洋参3份、黄芪4份。
4.如权利要求1-3所述的任一药物组合物，其特征在于，其中的原料药可以用适宜的溶剂和方法单提或混提制备得到提取物，总提取物再与药学上可接受的辅料混合制成任一制剂。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，总提取物中所含的主要有效成分为皂苷和/或多糖，总提取物中主要有效成分的总含量不低于50％。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该组合物还可以由下列原料药制成，其重量配比为绞股蓝总苷1～80份、西洋参总皂苷0.5～60份、黄芪多糖0.5～200份；或者为绞股蓝总苷1～80份、西洋参总皂苷0.5～60份、黄芪总皂苷0.5～200份。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该组合物还可以由下列原料药制成，其重量配比为绞股蓝总苷2～40份、西洋参总皂苷1～12份、黄芪多糖1～50份；或者为绞股蓝总苷2～40份、西洋参总皂苷1～12份、黄芪总皂苷1～50份。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，绞股蓝总苷中总苷的含量不低于30％；西洋参总皂苷中总皂苷的含量不低于30％，其中人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量和不低于2％；黄芪多糖中多糖的含量不低于35％；黄芪总皂苷中总皂苷的含量不低于30％，其中黄芪甲苷的含量不低于1％。
9.如权利要求1、2、3、6、7所述的任一药物组合物，其特征在于，该药物组合物可以加药学上可接受的辅料制成任何一种制剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物可以制成注射剂或口服制剂。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了一种药物组合物及其制备方法，以及含有该药物组合物的制剂，该药物组合物主要由绞股蓝、西洋参和黄芪制成，其重量配比为绞股蓝0.5～20份、西洋参1～30份、黄芪1～100份。该组合物还可以由绞股蓝总皂苷、西洋参总皂苷、黄芪多糖或黄芪总皂苷制成，其重量配比为绞股蓝总皂苷1～80份、西洋参总皂苷0.5～60份、黄芪多糖0.5～200份；或者为绞股蓝总皂苷1～80份、西洋参总皂苷0.5～60份、黄芪总皂苷0.5～200份。该药物组合物可以制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型。该药物组合物具有抗肿瘤作用，可用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤等。
文档编号A61P35/00GK1954840SQ20061014263
公开日2007年5月2日 申请日期2006年10月25日 优先权日2005年10月26日
发明者黄振华 申请人:黄振华