转移瘤的治疗的制作方法

专利名称：：转移瘤的治疗的制作方法转移瘤的治疗发明领域本发明一般涉及治疗对象中的转移瘤的方法和组合物。具体地说，本发明提供了化合物如4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮及其互变异构体、盐和混合物在治疗转移瘤和制备用于治疗转移瘤的药物中的应用。发明背景毛细管进入人体的几乎所有组织向这些组织提供氧和养分，同时清除废产物。在一般的条件下，排列成这些毛细管的内皮细胞不分裂，因此，在成人体内这些毛细管的数量或尺寸通常不增加。但是，在特定的正常条件下，比如组织遭受损伤时，或者在月经周期的特定阶段中，毛细管开始快速增生。此从现存的血管形成新的毛细管的过程称为血管发生或新血管形成。参见Folkman，J.ScientificAmerican,275，150-154(1996)。在伤口愈合过程中的血管发生是成人生命过程中病理生理性新血管形成的一个例子。在伤口愈合的过程中，额外的毛细管提供氧和养分、促进生成肉芽组织、并有助于废物的清除。愈合过程终止后，这些毛细管正常退化。Lymboussaki，A的学术论文"胚胎、成人和肿瘤中的血管内皮生长因子及它们的受体"(VascularEndothelialGrowthFactorsandtheirReceptorsinEmbryos,Adults,andinTumors)(Helsinki大学，分子/癌症生物实验室和病理学部，Haartman研究院(1999))中有述。血管发生在癌细胞的生长中也起重要作用。已知一旦癌细胞巢达到一定大小直径约l-2mm时，癌细胞必须产生向肿瘤供血的血管网才能长得更大，因为扩散作用将不足以向癌细胞提供足够的氧和养分。因此，预计抑制血管发生可停止癌细胞生长。受体酪氨酸激酶(RTK)是一种跨膜多肽，它调节发育细胞的生长和分化、成人组织的重建和再生。Mustonen，T等，J.CellBiology,129，895-898(1995);VanderGeer，P等，AnnRev.CellBoil.，10，251-337(1994)中有述。己知称为生长因子或细胞因子的多肽配体能激活RTK。RTK的信号传导涉及配体结合和受体胎外结构域构象变化而导致的二聚化。Lymboussaki,A的学术论文"胚胎、成人和肿瘤中的血管内皮生长因子及它们的受体"(Helsinki大学，分子/癌症生物实验室和病理学部，Haartman研究院(1999));Ullrich,A等，Cell,61，203-212(1990)中有述。配体与RTK的结合导致受体的特定酪氨酸残基转磷酸化，以及随后的催化结构域激活而致胞质底物磷酸化。(同上)。有两个血管内皮特异性亚家族RTK，包括血管内皮生长因子(VEGF)亚家族和Tie受体亚家族。V类RTK包括VEGFR-1(FLT-1)、VEGFR-2(KDR(人)、F1K-1(小鼠)和VEGFR-3(FLT-4)。Shibuya，M等，Oncogene,5，519-525(1990);Terman，B等，Oncogene,6，1677-1683(1991);Aprelikova,O等，CancerRes.，52，746-748(1992)中有述。癌症是一种涉及多种驱使肿瘤细胞增殖的遗传缺陷的疾病。因此，同时抑制多细胞信号传导途径的方法可能导致更好的治疗结果。RTK过表达和/或激活突变通常存在于肿瘤细胞中并与肿瘤生长有关。Blume-Jensen，P和Hunter,T.，"致癌激酶的信号传导"(OncogenicKinaseSignaling),Nature,411，355-65(2001);Carmeliet，P.，"用药物调节血管发生"(ManipulatingAngiogenesisinMedicine),J.Intern.Med.，255，538-61(2004)。大多数RTK包含一个与配体结合相关的胞外结构域和一个介导自磷酸化、募集下游信号传导分子而触发信号转导级联反应的胞内激酶结构域。有30多种RTK参与癌症发生，例如III型(PDGFR、CSF-1R、FLT3和c-KIT)、IV型(FGFRl-4)和V型(VEGFRl-3)RTK。多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性B细胞疾病，其特征为克隆性浆细胞在骨髓(BM)中累积和溶骨性骨损伤。自体干细胞移植(ASCT)和支持疗法的进展对该病和长期存活已有显著效果。Attal，M.等，W.fiwgZ./,1996;335:91-97;禾口Barlogie，B.等，B/ood，1997;89:789-793。然而，患者总是会复发，因而MM仍然是一种普遍的致命疾病。对MM中非随机染色体易位的鉴定导致开发了有力的预后工具和对新的耙分子的鉴定。几乎一半MM患者过表达了一种假定的癌基因，该基因受到以下5种复发性免疫球蛋白重链(IgH)易位之一的异常调节11ql3(细胞周期蛋白Dl)、6p21(细胞周期蛋白D3)、4pl6(FGFR3和MMSET)、16q23(c-maf)和20qll(maffi)。Kuehl，W.M.等，淑細C匿er，2002;2:175-187;和Avet-Loiseau，H.等，飾oa，2002;99:2185-2191。这些易位可能代表MM发展早期可能的一种原始反应。最近，我们已经清楚这些特定的IgH易位具有预后意义。具体地说，约15%患者发生的t(4;14)易位看来表示MM预后特别差，和预示ASCT无明显疗效。Fonseca，R.等，说ood，2003;101:4569-4575;Keats，J丄等，说"，2003;101:1520-1529;Moreau，P.等，5/oot/，2002;100:1579-1583;和Chang，H.等，///"em。to/.，2004;125:64-68。显然，这些患者需要新的治疗方法。t(4;14)易位罕见在于它似乎可异常调节两个可能的癌基因der(4)上的MMSET和der(14)上的FGFR3。Chesi，M.等，Ato.Ge"a.，1997;16:260-265;禾卩Chesi，M.等，别ooc/，1998;92:3025-3034。还不知道对这两个基因中的任何一个或两个的异常调节是否是MM发病机制的关键原因，但一些证据支持FGFR3对肿瘤发生和发展具有作用。WTFGFR3(—种RTK)的活化可促进骨髓瘤细胞增殖和存活，而且转化造血小鼠模型的作用减弱。Plowright，E.E.等，5W，2000;95:992-998;Chesi，M.等，飾od，2001;97:729-736;和Pollett，J.B.等，飾oaf，2002;100:3819-3821。随后获知一些MM发生的FGFR3活性突变与发展成晚期骨髓瘤相关并能强烈转化一些实验模型。Chesi，M.等，胁。d，2001;97:729-736;和Li，Z.等，2001;97:2413-2419。体外研究提示，FGFR3可赋予化疗抗性，临床数据支持这一观察结果，证明对常规化疗反应差和t(4;14)MM患者存活期中值縮短。Fonseca，R.等，说ood，2003;101:4569-4575;Keats，J丄等，肠ot/，2003;101:1520-1529;Moreau，R等，说ood，2002;100:1579-1583;禾BChang，H.等，5C7/"em。to/.，2004;125:64-68。这些发现说明，FGFR3的异常表达在骨髓瘤肿瘤生成中扮演重要但不是唯一的作用，因此使这种RTK成为分子治疗的靶点。在t(4;14)MM细胞系中抑制FGFR3诱导出细胞毒应答说明，无论这些衍生自晚期患者的细胞内遗传改变的复杂性，这些细胞仍依赖于FGFR3信号。Trudel，S.等，5/oot/，2004;103:3521-3528;Paterson，J丄.等，5,.J./faemato/.，2004;124:595-603;和Grand,E.K.等，丄ez^em&，2004;18:962-966。这些观察结果与已经在一些恶性肿瘤人群中证明获得临床成功的受体酪氨酸灭活的结果一致，因而鼓励临床开发用FGFR3抑制剂来治疗这些预后差的患者。Druker，B丄等，W.五ng/.,Met/.，2001;344:1031-1037;Demetri，G.D.等，〃/，2002;347:472-480;Slamon，D丄等，TV.￡"g/.Md2001;344:783-792;和Smith,B.D.等，5/ooc/，2004;103:3669-3676。急性骨髓性白血病(AML)是一种侵袭性癌症，它占所有成年急性白血病的90%，其发病率为3.9/100，000，预计每年新发病例为10,500例。Redaelli，A.等，Ex;er7e乂」"feawcw.7Tzer，3:695-710(2003)。细胞毒剂(AraC+蒽环类抗生素)可使70%的AML患者得到缓解。然而，大比例的复发反映出需要更加有效的治疗方法。Weick，J.K.等，5/ooc/，88:2841-2851(1996);Vogler，W.R.等，C/f",0"co/.，10:1103-1111(1992)。肿瘤细胞基因分型表明25-35%的AML母细胞(blast)携带fms样酪氨酸激酶(flt3/Flk2/Stk-2)突变，而有较大比例(大于70%)表达野生型FLT3。Gilliiand，D.G.等，Cw/r.0//".7femato/.，9:274-281(2002);Nakao，M.等，丄ewfem&，10:1911-1918(1996);Yokota，S.等，丄ewfem/a，11:1605-1609(1997)。FLT3受体是III类受体酪氨酸激酶(RTK)中的一员，它诱导CSF-1R、c-KIT、PDGFR，并已知在造血细胞、树突细胞、天然杀伤(NK)细胞和祖先B细胞的增殖、分化和存活中发挥重要作用。McKenna，H.J.等，说ooc/，95:3489-3497(2000);Mackarehtschian，K.等，/mmwm'^，3:147-161(1995)。和其它RTK—样，FLT3的特征为具有5个IG-样胞外结构域并含有亲水性激酶插入结构域。Blume-Jensen，P.等，AWwe，411:355-365(2001)。FLT3结合后的信号转导调节多种下游途径，其中包括STAT5(信号转导及转录活化蛋白5)、Ras/MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)和PI3K。Hayakawa，F.等，O"cogewe，19:624-631(2000);Takahashi，S.等，所o/7/z;^.Comm,.，316:85-92(2004);Zhang，S.等，/五x;.MM,，192:719-728(2000);Rosnet，O.等，ActaHaematol.，95:218-223(1996)。在含突变型FLT3的细胞中，已知癌的信号传导与失调等激酶活化和/或自身抑制结构域功能丧失所致的组成型激酶活化(在不存在FLT3结合时)相关联。Stirewalt，D丄.等，Ato.Tev.Ca"cer，3:650-665(2003);Brown，P.等，￡wrJCa"ce厂，40:707-721(2004)。这些FLT3突变型分子的特征揭示在FLT3的并列膜区中存在内部串联重复序列(ITD)或在激酶结构域中存在点突变(ASP835/836)，其中17-34%为FLT3ITD，而约7%为点突变。Yamamoto，Y.等，5/oot/，97:2434-2439(2001);Thiede，C等，说ood，99:4326-4335(2002);Abu-Duhier，F.M.等，份.i/flemato/.，113:983-988(2001)。此外，有大量证据表明，这种FLT3ITD突变提示AML预后不良，与疾病复发增加和总体存活率降低相关。Thiede，C.等，5/ood，99:4326-4335(2002);Schnittger，S.等，历oW，100:59-66(2002)。鉴于FLT3突变与AML的关系，许多采用小分子激酶抑制剂/抗FLT3抗体的靶向方法目前已进入临床前研究阶段或早期药物开发。Brown，P.等，￡Omcer，40:707-721(2004);O'Farrell，A.M.等，Ca"cerie&，9:5464-5476(2003);Weisberg，E.等，C朋cerCe〃，1:433-443(2002);Smith,B.D.等，祝ood，(2004);Kelly，L.M.等，OwcerCe〃，1:421-432(2002)。在前列腺肿瘤中，除了VEGFR和PDGFR对血管发生的作用，一些成纤维细胞生长因子(FGF)和它们的受体(FGFR)在人前列腺的发育和内稳态中加快关键的基质-上皮通信。Griffioen，A.W.和Molema，G.，"血管发生药理学干涉对于治疗癌症、心血管疾病禾口慢性炎症的潜能"(Angiogenesis:PotentialsforPharmacologicInterventionintheTreatmentofCancer，CardiovascularDiseases，andChronicInflammation),Pharmacol.Rev.，52，237-68(2000);Ferrara，N.，"有关VEGF生物学和治疗方面的更新"(VEGF:anUpdateonBiologicalandTherapeuticAspects),Curr.Opin.Biotechnol.，11，617-24(2000);Kwabi-Addo，B.，Ozen，M.禾卩Ittmann，M.，"成纤维细胞生长因子和它们的受体在前列腺癌中的作用"(TheRoleofFibroblastGrowthFactorsandtheirReceptorsinProstateCancer),Endocr.Relat.Cancer,11，709-24(2004);和Gowardhan，B.，Douglas,D.A.，Mathers,M.E.等，"成纤维细胞生长因子系统作为治疗人前列腺癌潜在靶点的评价"(EvaluationoftheFibroblastGrowthFactorSystemasaPotentialTargetforTherapyinHumanProstateCancer),Br.J.Cancer,92，320-72005)。已知成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的改变与前列腺癌的发病机制有关。Ozen，M.，Giri，D.，Ropiquet，F.，Mansukhani，A.和Ittmann，M.，"成纤维细胞生长因子受体信号传导在前列腺癌细胞存活中的作用"(RoleofFibroblastGrowthFactorReceptorSignalinginProstateCancerCellSurvival),J.Natl.CancerInst.，93，1783-90(2001)。在多数情况下，前列腺癌优先转移到骨中，因此患者发生骨并发症和/或骨折的风险很高，这是造成前列腺癌患者发病和死亡的主要原因之一。需要治疗前列腺癌的方法和预防前列腺癌转移到前列腺癌患者骨骼中的方法。WO01/29025、WO01/62251和WO01/62252最近公开了各种卩引哚基取代的化合物，且WO01/28993最近公开了各种苯并咪唑基化合物。据报道，这些化合物能够抑制、调节和/或调控受体类型和非受体酪氨酸激酶的信号转导。一些公开的化合物含有与吲哚基或苯并咪唑基结合的喹诺酮结构。合成4-羟基喹诺酮和4-羟基喹啉衍生物的方法公开中许多参考资料中，出于所有目的，它们己通过引用全文纳入本文，这就好像在这里完整列出一样。例如，Ukrainets等公开了3-(苯并咪唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-l，2-二氢喹啉的合成。Ukrainets，I.等，Tet.Lett.42，7747-7748(1995);Ukrainets，I.等，KhimiyaGeterotsiklicheskikhSoedinii，2，239-241(1992)。Ukrainets也公开了合成具有抗惊厥和抗甲状腺活性的其它4-羟基喹诺酮和硫代类似物如lH-2-氧代-3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基喹啉的方法。Ukrainets,I.等，KhimiyaGeterotsiklicheskikhSoedinii，1，105-108(1993);Ukrainets,I.等，KhimiyaGeterotsiklicheskikhSoedinii，8，1105-1108(1993);Ukrainets，I.等，Chem.HeterocyclicComp.33，600-604，(1997)合成各种喹啉衍生物的方法公开在WO97/48694。其中揭示这些化合物能够结合核激素受体并可被用于刺激成骨细胞增殖和骨骼生长。其中还揭示这些化合物可被用于治疗或预防与核激素受体家族有关的疾病。WO92/18483公开了各种喹啉衍生物，其中，喹诺酮的苯环被硫基取代。其中揭示这些化合物可用于药物制剂并被用作药物。已公开喹诺酮和香豆素衍生物在许多与药物和药物制剂无关的方面都有应用。一些参考资料描述了用于可光聚合组合物或具有发光特性的喹诺酮衍生物的制备方法，其中包括Okamoto等的美国专利No.5，801,212;JP8-29973;JP7-43896;JP6-9952;JP63-258903;EP797376和DE2363459，出于所有目的，它们已通过引用全文纳入本文，这就好像在这里完整列出一样。包括4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮在内的用于抑制血管发生和血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶以及用于抑制其它酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶的各种喹啉酮苯并咪唑化合物或其互变异构体揭示于以下文献中，出于所有目的，各文献通过引用全文纳入本文，这就好像在这里完整列出一样美国专利No.6,605,617;美国专利No.6,756,383;提交的美国专利申请No.10/116,117(2003/02/06作为US2003/0028018Al公开)；美国专利申请No.10/644,055(2004/05/13提交，美国专利申请No.2004/0092535);美国专利申请No.10/983,174;美国专利申请No.10/706,328(2004/11/04作为2004/0220196公开)；美国专利申请No.10/982,757;和美国专利申请No.10/982,543。尽管治疗肿瘤和癌症的方法最近有所进展，但仍旧非常需要治疗癌症的新方法，且尤其是治疗转移癌如转移瘤的新的方法和组合物。还需要治疗多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病和前列腺癌的方法。发明概述本发明提供了治疗转移癌尤其是转移瘤的方法。本发明还提供了化合物、其互变异构体、其盐、及它们的混合物在治疗转移瘤的药物制剂和药物中的应用。一方面，本发明提供了一种治疗对象如人类癌症患者中的转移癌的方法。在一些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、肝癌、肺癌或前列腺癌。在其它实施方式中，提供了治疗转移瘤的方法。在其它实施方式中，提供了治疗具有转移瘤的对象的方法。其它实施方式提供了治疗血液肿瘤的方法。其它实施方式提供了治疗实体瘤的方法。所述方法包括给予对象有效量的结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物。结构I具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中，A是具有以下结构之一的基团:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中，R"选自H或含有1-6个碳原子的直链或支链垸基。在本发明方法的不同实施方式中，(对象中)癌症或转移瘤的生长在给药后被抑制,在一些实施方式中，Ri是甲基，而结构I的化合物具有结构IA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>在一些实施方式中，W是氢，而结构I的化合物具有结构IB<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>在一些实施方式中，W是甲基，而结构i的化合物具有结构ic<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其它实施方式提供了治疗具有转移瘤对象的方法，所述方法包括使转移瘤接触结构IA、IB或IC的化合物。在一些实施方式中，所述化合物是全身给予的。更具体地说，结构I的化合物是口服或静脉内给予的。在一些实施方式中，给予所述对象第二药剂。更具体地说，所述第二药剂用于治疗骨质疏松，如二膦酸盐。在其它实施方式中，所述第二药剂是抗癌药。在一些实施方式中，所述化合物是结构I、IA、IB或IC的化合物，并给予所述对象该化合物或互变异构体的乳酸盐。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，且所述对象是具有t(4;14)染色体易位的多发性骨髓瘤患者。更具体地说，所述肿瘤是血液肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤表达成纤维细胞生长因子受体3。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤已经转移到患者的骨中，如转移到骨髓中。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述患者是人。在一些实施方式中，所述肿瘤是急性骨髓性白血病(AML)，而所述对象是急性骨髓性白血病患者。在一些此类实施方式中，所述对象是哺乳动物，在一些实施方式中，所述哺乳动物是人，而在其它的此类实施方式中，所述哺乳动物是狗或猫。在一些实施方式中，所述肿瘤或癌症选自肝癌、肺癌或乳腺癌。在一些实施方式中，所述肿瘤是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且前列腺癌已经转移到患者的骨中。在一些实施方式中，所述肿瘤是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述患者是人。一方面，本发明提供了结构I、IA、IB和/或IC的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或它们的混合物在制备用于本发明任何方法的任何实施方式的药物或药物制剂中的应用。在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其中装有一容器，容器中包含结构I、IA、IB和/或IC的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐或它们的混合物。所述试剂盒中可装有另一种用于治疗转移瘤或肿瘤的化合物。所述试剂盒还可装有进行任何本发明方法的书面说明书。在一些实施方式中，所述书面说明书可包括与试剂盒中的容器分开的纸件，而在其它实施方式中，所述书面说明书可写在附于试剂盒中容器上的标签上。通过以下详细描述和附图将显见本发明的其它目的、特征和优点。附图简述图l显示，注射KMS-ll-luc细胞并用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮(20mg/kg/天)治疗的SCID-米色鼠显示平均光子计数明显低于用载体治疗的小鼠。图2-5显示了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(111)-酮(化合物l)在SCID-NOD小鼠的人MV4;11或RS4;11白血病肿瘤皮下异种移植物模型中的抗肿瘤活性。(图2)MV4;11或(图3)RS4;11将细胞皮下植入SCID-NOD小鼠的右腹侧(n-10小鼠/组)。在MV4;11研究中，当肿瘤约300mm3时口服给予剂量为1(參)、5(i0或30(■)mg/kg/天的载体(0)或化合物1共15天。在RS4;11研究中，当肿瘤约300mm3时口服给予剂量为10(A)、30(B)、100(令)或150(參)mg/kg/天的载体(O)或化合物1共8天。(图4)化合物1的每日、间歇性和循环剂量方案对MV4;11肿瘤的疗效。化合物1以30mg/kg的剂量每天(B)、隔天/q.o.d.(參)或给药7天/停药7天循环(X)口服给予。(图5)化合物1诱导了MV4;11大肿瘤消退。MV4;11皮下肿瘤(11=10小鼠/组)按照300(▲)、500(翻)或1000(參)mi^划分阶段。数据表示为平均肿瘤体积士SE(n=10小鼠/组)。图6显示，4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮(化合物l)延长了携带静脉内MV4;11细胞SCID-NOD小鼠的存活期。给经过照射的SCID-NOD小鼠静脉内植入MV4;11(1x107细胞，i.v.)。第23天开始治疗，包括在第23-98天每天(A)或给药7天/停药7天(固)口服20mg/kg载体(令)或化合物1。对出现后肢瘫痪早期症状或健康状况差的小鼠实施安乐死。图6显示了Kaplan-Meier存活百分数与时间的曲线(11=10-12小鼠/组)。图7显示注射PC-3M-luc细胞然后用载体、紫杉醇或化合物1治疗的的裸鼠腹部、头部和腿部区域产生的单个光子计数(对数级)。这些图显示，证明化合物1(154258)治疗具有抑制PC-3M-luc光子计数和抑制扩散到骨中的PC-3M-luc细胞生长的趋势。图S显示肿瘤体积与治疗天数的关系。发明详述本发明提供了治疗转移癌，尤其是转移瘤，如转移性多发性骨髓瘤和转移性前列腺癌的方法。本发明还提供了化合物、其互变异构体、其盐和其混合物在制备用于治疗转移癌尤其是实体瘤或血液肿瘤的药物或药物制剂中的应用。在本申请中使用了下列縮写和定义"AML"是急性骨髓性白血病的縮写。"ALS"是肌萎縮性脊髓侧索硬化症的缩写。"AD"是阿耳茨海默病的缩写。"APP"是淀粉样蛋白前体的縮写。"ASCT"是自体干细胞移植术的縮写。"BM"是骨髓的縮写。"bFGF"是碱性成纤维细胞生长因子的縮写。"FGFR1"，也称为bFGFR，是与成纤维细胞生长因子FGF相互作用的酪氨酸激酶的縮写。"Cdc2"是细胞分化周期2的縮写。"Cdk2"是依赖于细胞周期蛋白的激酶2的缩写。"Cdk4"是依赖于细胞周期蛋白的激酶4的缩写。"Chkl"是关卡激酶l的縮写。"CKls"是酪蛋白激酶l问的丝氨酸/苏氨酸激酶。"c-ABL"是最初分离自艾贝尔逊氏白血病病毒的癌基因产物的酪氨酸激酶的縮写。"C-Kit"也称为干细胞因子受体或肥大细胞生长因子受体。"FGF"是与FGFR1相互作用的成纤维细胞生长因子的縮写。"FGFR3"是通常在多发性骨髓瘤型癌中表达的酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体3的縮写。"Flk-l"是胎肝酪氨酸激酶1的縮写，该酶也称为激酶插入结构域酪氨酸激酶或KDR(人)，还称为血管内皮生长因子受体-2或VEGFR2(KDR(人)、Flk-l(小鼠))。"FLT-l"是fms样酪氨酸激酶-l的縮写，该酶也称为血管内皮生长因子受体-1或VEGFR1。"FLT-3"是fms样酪氨酸激酶-3的縮写，该酶也称为干细胞酪氨酸激酶I(STK1)。"FLT-4"是fms样酪氨酸激酶-4的縮写，该酶也称为VEGFR3。"Fyn"是与SRC、FGR、YES相关的FYN癌基因激酶的縮写。"GSK-3"是糖元合酶激酶3的縮写。"PAR-1"是一种激酶的縮写，也称为disheveled相关激酶，也称为HDAK。"Lck"是淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶的縮写。"MEK1"是由Raf-MEK1-ERK形成的模型中的MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)信号转导途径的丝氨酸苏氨酸激酶的縮写。MEK1磷酸化ERK(胞外调节激酶)。"MM"是多发性骨髓瘤的縮写。"NEK-2"是NIM-A相关激酶的縮写。"NIM-A"是从未发生有丝分裂(neverinmitosis)的縮写。"PDGF"是血小板衍生生长因子的縮写。PDGF与酪氨酸激酶PDGFRa和PDGFR(3相互作用。"Rsk2"是核糖体S6激酶2的縮写。"Raf，是MAPK信号转导途径所述的丝氨酸/苏氨酸激酶。"RTK"是受体酪氨酸激酶的缩写。"Tie-2"是含有Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶的縮写。"VEGF"是血管内皮生长因子的縮写。"VEGF-RTK"是血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶的縮写。术语"转移"指癌细胞从肿瘤扩散到身体的其它部分。癌细胞通过通过淋巴系统或血流全身扩散。抑制转移瘤的生长意味着直接抑制肿瘤生长和/或全身抑制来自肿瘤的癌细胞。通常，当提到某些元素如氢或H时意味着包括该元素的所有同位素。例如，如果结构I的化合物上的基团被除去或用H表示，则这意味着包括氢或H、氘和氚。术语"含有1-6个碳原子的直链或支链烷基"指不含有杂原子并含有1-6个碳原子的烷基。因此，该术语包括直链烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。该术语还包括直链烷基的支链异构体，其中包括但不限于以下这些例子-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2C(CH3)3、-0!(013)(:112(:风013)2等等。在一些实施方式中，垸基包括含有l-6个碳原子的直链和支链垸基。在其它实施方式中，烷基含有l-4个碳原子。再在其它实施方式中，所述垸基是含有l-2个碳原子的直链垸基(甲基或乙基)。再在其它实施方式中，所述垸基仅含有1个碳原子，即甲基(-CH3)。"药学上可接受的盐"包括无机碱、有机碱、无机酸、有机酸、或碱性或酸性氨基酸的盐。作为无机碱的盐，本发明包括，例如，碱金属如钠或钾；碱土金属如钙和镁或铝；以及铵。作为有机碱的盐，本发明包括，例如，三甲胺，三乙胺，吡啶，甲基吡啶，乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺。作为无机酸的盐，本发明包括，例如，盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸。作为有机酸的盐，本发明包括，例如，甲酸，乙酸，三氟乙酸，富马酸，草酸，酒石酸，马来酸，柠檬酸，琥珀酸，苹果酸，甲磺酸，苯磺酸和对甲苯磺酸。作为碱性氨基酸的盐，本发明包括，例如，精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸。酸性氨基酸，包括，例如，天冬氨酸和谷氨酸。一方面，本发明提供了一种治疗对象如人类癌症患者中的转移癌的方法。在一些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、肝癌、肺癌或前列腺癌。在其它实施方式中，提供了治疗转移瘤的方法。在其它实施方式中，提供了治疗具有转移瘤的对象的方法。其它实施方式提供了治疗血液肿瘤的方法。其它实施方式提供了治疗实体瘤的方法。所述方法包括给予有此需要的对象有效量的结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物。结构i具有以下结构式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中，A是具有以下结构之一的基团:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中，R'选自H或含有l-6个碳原子的直链或支链烷基，和在一些实施方式中，癌症或转移瘤的生长在给予结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物之后被抑制。在一些实施方式中，W是甲基，而结构I的化合物具有结构IA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>在一些实施方式中，W是氢，而结构I的化合物具有结构IB<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>在一些实施方式中，W是甲基，而结构I的化合物具有结构IC<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其它实施方式提供了治疗具有转移瘤对象的方法，所述方法包括使转移瘤接触结构IA、IB或IC的化合物。在一些实施方式中，所述化合物是全身给予的。更具体地说，结构I的化合物是口服或静脉内给予的。在一些实施方式中，给予所述对象第二药剂。更具体地说，所述第二药剂用于治疗骨质疏松，如二膦酸盐。在其它实施方式中，所述第二药剂是抗癌药。在一些实施方式中，所述化合物是结构I、IA、IB或IC的化合物，并给予所述对象该化合物或互变异构体的乳酸盐。在一些实施方式中，给予结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物之后所述对象的存活率提高。采用本发明可治疗各种转移瘤。血液肿瘤和癌症的例子包括但不限于急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤等等。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，且所述对象是具有t(4;14)染色体易位的多发性骨髓瘤患者。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤表达成纤维细胞生长因子受体3。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤己经转移到患者的骨中如转移到患者的骨髓中。由于本发明的化合物在骨中聚集，因此它们对于治疗转移性血液肿瘤尤其适用且有效。在一些实施方式中，所述肿瘤是实体瘤。在其它实施方式中，所述患者患有乳腺癌、肝癌、肺癌或前列腺癌。因此，在一些实施方式中，丧失癌症或肿瘤是乳腺癌。在其它实施方式中，所述癌症或肿瘤是肝癌。再在其它实施方式中，所述癌症或肿瘤是肺癌。再在其它实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺癌。在其它实施方式中，所述患者患有胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾上腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌、头颈癌、膀胱癌、结肠直肠癌或成胶质细胞瘤。本文所述的方法可用于治疗任何此类癌症。所述方法特别适用于治疗已经转移到骨中的癌症如治疗已经转移到患者骨骼中的前列腺癌。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗具有己经转移到骨中的癌症的患者的方法。这种癌症可以是血液肿瘤或实体瘤。在一些实施方式中，所述癌症是多发性骨髓瘤，而在其它实施方式中，所述癌症是前列腺癌。在一些实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述患者是人。在一些实施方式中，所述肿瘤是急性骨髓性白血病(AML)，而所述对象是急性骨髓性白血病患者。在一些此类实施方式中，所述对象是哺乳动物，在一些实施方式中，所述哺乳动物是人，而在其它的此类实施方式中，所述哺乳动物是狗或猫。在一些实施方式中，所述肿瘤是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述前列腺癌己经转移到患者的骨中。在一些实施方式中，所述肿瘤是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述患者是人。一方面，本发明提供了结构I、IA、IB和/或IC的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物在制备用于本发明任何方法的任何实施方式的药物或药物制剂中的应用。另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其中装有一容器，容器中包含结构I、IA、IB和/或IC的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐或它们的混合物。所述试剂盒中可装有另一种用于治疗转移瘤或肿瘤的化合物。所述试剂盒还可装有进行任何本发明方法的书面说明书。在一些实施方式中，所述书面说明书可包括与试剂盒中的容器分开的纸件，而在其它实施方式中，所述书面说明书可写在附于试剂盒中容器上的标签上。结构I的化合物可以用以下实施例部分描述的过程和以下文献中公开的过程方便地合成，出于所有目的，这些文献已通过引用全文纳入本文，这就好像在这里完整列出一样美国专利No.6,605,617，公开的美国专利申请No.2004/0092535，美国专禾U申请No.10/983,174，公开的美国专利申请No.2004/0220196，美国专利申请No.10/982,757,和美国专利申请No.10/982,543。所述结构l的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、以及它们的混合物可用来制备药物，该药物可用于这里所述的目的，并可用来治疗这里所述的各种生物病症。药物制剂可含有上文所述的任何实施方式中的化合物、互变异构体或盐，以及这里所述的药学上可接受的载体。本发明也提供了组合物，所述组合物可通过将本发明的一种或多种化合物、或其互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物与药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合来制备，该组合物可用来治疗或缓解与转移瘤有关的疾病。本发明的组合物可用来形成用于治疗本文所述转移瘤的制剂。这种组合物可以是以下形式，例如，颗粒、粉剂、片剂、胶凝、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、悬浮或溶液。本发明的组合物可被制成通过各种途径给药，例如，通过口服给药、通过鼻给药、通过直肠给药、皮下注射、静脉注射、肌肉内注射或腹膜内注射。例举了以下剂型但本发明不限于此。对于口服、含服和舌下给药，可接受的固体剂型有粉剂、悬浮剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、凝胶胶囊和囊片。这些剂型可通过，例如，将一种或多种本发明的化合物、药学上可接受的盐、互变异构体、或其混合物与至少一种添加剂如淀粉或其它添加剂混合制得。合适的添加剂是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、壳多糖、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。任选地，口服剂型可含有其它成分以帮助用药，如惰性稀释剂，或润滑剂如硬脂酸镁，或防腐剂如对羟基苯甲酸酯或山梨酸，或抗氧化剂如抗坏血酸，生育酚或半胱氨酸，崩解剂，粘合剂，增稠剂，缓冲剂，调味剂或香味剂。还可用此领域已知的合适的包衣材料来处理片剂和丸剂。供口服的液体剂型可用是药学上可接受的乳剂、糖浆剂、酏剂、悬浮剂和溶液剂，它可含有惰性稀释剂，如水。所述药物制剂和药物可用无菌液体，例如但不限于油、水、醇和它们的混合物，制成液体悬浮剂或溶液剂。可加入制药上合适的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂以进行口服或肠胃外给药。如上所述，悬浮剂可包括油类。所述油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。悬浮制剂还可含有脂肪酸的酯类，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、甘油脂肪酸酯和乙酰化的甘油脂肪酸酯。悬浮制剂可含有醇类，例如但不限于乙醇，异丙醇、十六醇、甘油和丙二醇。醚类，例如但不限于，聚(乙二醇)，石油烃类，如矿物油和矿脂；并可在悬浮制剂中使用水。对于鼻内给药，所述药物制剂和药物可以是喷雾剂或气雾剂，其中含有合适溶剂和任选的其它化合物，例如但不限于稳定剂、杀菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度修饰剂及其组合。气雾剂的推进剂可包括压縮空气、氮气、二氧化碳或基于烃的低沸点溶剂。可注射的剂型通常包括水性悬液或油性悬液，它可用合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂制备。可注射形式可以在溶液相中或以悬浮液的形式，它可用溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或赋形剂包括无菌水、林格溶液或等渗生理盐水。或者，可将无菌油类用作溶剂或悬浮剂。优选的，所述油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油类、脂肪酸、单-、二-或三-甘油酯。为了注射，所述药物制剂和/或药物可以是适合用上述合适溶液重建的粉剂。其例子包括但不限于，冻干、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、粒子、沉淀物或颗粒。为注射，所述制剂可任选含有合适的稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度修饰剂及其组合。为直肠给药，所述药物制剂和药物可以是栓剂、软膏剂、灌肠剂、片剂或乳膏形式，以将化合物释放到肠、乙状结肠和/或直肠。直肠栓剂可通过将一种或多种本发明的化合物、或该化合物的药学上可接受的盐或互变异构体与可接受的载体混合制得，所述载体如可可脂或聚乙二醇，它们在正常储存温度下是固相而在适合将药物释放到体内如直肠的温度下是液相。油还可用来制备软凝胶类型的制剂和栓剂。水、盐水、含水葡萄糖和相应的糖溶液以及甘油可用于制备悬浮制剂，该制剂也可含有果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟基丙基纤维素或羧甲基纤维素之类的悬浮剂，以及缓冲剂和防腐剂。除了上述代表剂型，药学上可接受的赋形剂和载体通常是那些精通此领域的技术人员已知的，因此也包含在本发明中。这种赋形剂和载体描述在，例如，《雷明顿药物科学》(RemingtonsPharmaceuticalSciences),MackPub.Co.，新泽西(1991)，全文参考结合于此，就好像在此全文列出。本发明的制剂还可被设计成短期作用、快速释放、长期作用和持续释放的形式，如下所述。因此，所述药物制剂还可被制成受控释放或缓慢释放形式。所述组合物还包括，例如，微胶粒或脂质体，或一些其它的被囊形式，或者可以延迟释放的形式施用，以提供延长的储存和/或释放效果。因此，所述药物制剂和药物可被压縮入小丸或筒状物，并作为缓释注射物或作为植入物(如移植片固定模(stent))进行肌肉内或皮下移植。特定剂量可根据患者的疾病状况、年龄、体重、身体健康状况、性别和饮食、剂量间隔、给药途径、排泄率和药物组合进行调节。含有有效量的任何上述剂型都在常规试验方法范围之内，故而也在本发明的范围之内。治疗有效量可根据给药途径和剂型变化。优选的一种或多种本发明的化合物是具有高治疗指数的制剂。所谓治疗指数是指毒性和治疗效果的剂量比，它可表示为LD50和EDso之间的比例。LD5o是导致50。/。群体死亡的剂量，EDs。是在50%的群体中治疗有效的剂量。LDso和ED5Q是在动物细胞培养物或试验动物中通过标准药物方法测定的。"治疗"在本发明中是指与病症或疾病有关的症状的减轻，或那些症状的进一步进展或恶化的停止，或防止或预防疾病或病症。例如，在治疗转移瘤患者时，成功的治疗可以包括向肿瘤或疾病组织提供营养的毛细血管增殖减少，与癌性生长或肿瘤、毛细血管增殖或疾病组织有关的症状的减轻，毛细血管增殖停止，或癌症等疾病进展的停止或癌细胞生长停止。治疗还包括与其它疗法联合施用本发明的药物制剂。例如，可在手术过程和/或放疗前、期间或之后给予本发明的化合物和药物制剂。本发明的化合物还可与其它抗癌药物一起施用，所述抗癌药物包括那些用于反义和基因治疗的药物。精通肿瘤学和医学领域的技术人员能确定合适的组合。本发明的药物制剂和药物含有结构I的化合物或其互变异构体、盐或混合物和药学上可接受的载体。因此，本发明的化合物可用来制备药物和药物制剂。这种药物和药物制剂可用于本文所述的治疗方法。本发明的化合物和制剂尤其适用于联合治疗，已显示当它们与喜树碱、阿霉素、顺铂、伊立替康(CPT-ll)、烷基化剂、拓扑异构酶I和II抑制剂等抗癌药以及放疗联用时具有协同效应。因此，本发明提供了含有与抗癌药组合的结构I的化合物以及其互变异构体、盐和/或混合物的药物制剂。本发明还提供了所述化合物、互变异构体、盐和/或混合物在形成这种制剂和药物中的应用。另一方面，本发明提供了通过给予本发明的化合物和另一种抗癌药来治疗转移癌的方法。该方法包括给予有此需要的对象选自以下的抗癌药甲磺酸伊马替尼(Gleevec)，BAY43-9006，Brostallicin，lenalidomide(Revlimid)，沙利度胺(Thalomid)，多西他赛(Taxotere)，erlotinib(Tarceva)，vatalinib(PTK-787)，VEGF-trap，fenretidine，bortezomib，贝伐单抗(Avastin)，pertuzumab和/或利妥昔单抗，以及本发明的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的盐、该互变异构体的盐、它们的混合物，或含有所述化合物、所述互变异构体、该化合物的盐、该互变异构体的盐或混合物的药物组合物。本发明的化合物可用于治疗多种对象。合适的对象包括动物，如哺乳动物和人。合适的哺乳动物包括但不限于灵长类，例如但不限于狐猴、猿和猴；啮齿类，例如大鼠、小鼠和豚鼠；家兔和野兔；牛；马；猪；山羊；绵羊；有袋类动物；和肉食动物，如猫、犬和熊。在一些实施方式中，所述对象或患者是人。在其它实施方式中，所述对象或患者是啮齿类动物，如小鼠或大鼠。在一些实施方式中，所述对象或患者是除了人的其它动物，在一些此类实施方式中，所述对象或患者是人以外的哺乳动物。应该理解，本发明的有机化合物具有互变异构现象。由于本说明书中的化学结构仅表示了一种可能的互变异构形式，但应该理解，本发明包括图示结构的任何互变异构形式。例如，下面显示了结构IA的一种互变异构体一互变异构体Ia:结构IA的其它互变体，互变体Ib和互变体Ic，如下:ib将更加容易理解上面概述的发明，以下实施例是以举例方式提供，而不构成对本发明的限制。实施例根据化学术语，本申请中使用了以下縮写ATP:三磷酸腺苷Boc:N-i-丁氧羰基BSA:牛血清白蛋白DMSO:二甲基亚砜DTT:DL-二硫苏糖醇ED5fl:对50%的群体有疗效的剂量EDTA:乙二胺四乙酸EtOH:乙醇HPLC:高压液相色谱IQo值使被测活性降低50%的抑制剂的浓度KHMDS:二(三甲基甲硅烷基)酰胺钾LC/MS:液相色谱/质谱THF:四氢呋喃化合物的纯化和特征鉴定用带有2690SeparationModule的WatersMillenium色谱系统(Milford，马萨诸塞州)通过高效液相色谱(HPLQ定性本发明的化合物。分析柱是Alltech(Deerfield，伊利诺斯州)的AlltimaC-18反相柱，4.6x250mm。采用梯度洗脱，通常从5%乙腈/95%水开始，并在40分钟内达到100%乙腈。所有的溶剂中都含有0.iy。三氣乙酸(TFA)。用在220或254nm处的紫外光(UV)吸收检测化合物。HPLC溶剂来自BurdickandJackson(Muskegan，密歇根州)或FisherScientific(Pittsburg,宾西法尼亚州)。在一些例子中，纯度是通过薄层层析(TLC)评价的，采用玻璃或塑料背衬的硅胶平板，例如Baker-Flex硅胶1B2-F弹性平板。在紫外光下容易通过视觉检测TLC结果，或采用熟知的碘蒸气或其它各种染色技术进行检测。在两个LCMS装置之一上进行质谱分析Waters系统(AIlianceHTHPLC禾口MicromassZQ质谱仪；柱EclipseXDB-C18,2.1x50mm;溶剂系统5-95%乙腈，用含0.05%TFA的水配制；流速0.8mL/分钟；分子量范围150-850;Cone电压20V;柱温4(TC)或HewlettPackard系统(IIOOHPLC系列;柱EclipseXDB-C18,2.1x50mm;溶剂系统1-95%乙腈，用含0.05%TFA的水配制；流速0.4mL/分钟；分子量范围150-850;Cone电压50V;柱温3(TC)。所有的质量均以其质子化的母体离子计算。GCMS分析在HewletPackard设备(HP68卯系列气相色谱仪，带有质量选择检测器5973;注入器体积lnL;最初柱温5(TC;最终柱温250'C;梯度时间20分钟；气体流速1mL/分钟；柱5%苯基甲基硅氧烷，型号弁HP190915-443，规格30.0mx25,x0.25(im)上进行。用Flash40色谱系统和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville,弗吉尼亚)或用HPLC采用C-18反相柱进行制备性分离。Flash40Biotage系统通常采用的溶剂是二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、己垸和三乙胺。反相HPLC通常采用的溶剂是含有0.1%三氟乙酸的浓度不同的乙腈和水。合成4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基l-lH-喹啉-2-酮A.合成5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺方法A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>将5-氯-2-硝基苯胺(500g，2.898mol)禾卩1-甲基哌嗪(871g，8.693mol)置于装有冷凝器并用氮气吹扫过的2000mL烧瓶中。将该烧瓶置于IO(TC的由于中并加热直到通过HPLC测定5-氯-2-硝基苯胺完全反应(通常过夜)。通过HPLC证实5-氯-2-硝基苯胺消失后，边机械搅拌边将反应混合物直接(仍旧是温的)倒入2500mL室温的水中。搅拌所得混合物直到其到达室温，然后将其过滤。将如此获得的黄色固体加入1000mL水中并搅拌30分钟。过滤所得混合物并用TBME(500mL，2X)洗涤所得固体，然后用橡皮障在真空下干燥1小时。将所得固体转移到干燥盘中并在5(TC的真空烘箱内干燥至恒重，得到670g(97.8。/。)黄色粉末状的标题化合物。方法B将5-氯-2-硝基苯胺(308.2g，1.79mol)加入一装有顶部搅拌器(overheadstirrer)、冷凝器、气体入口、加料漏斗和温度计探头的5000mL的4-颈圆底烧瓶中。该烧瓶然后用氮气吹扫。在反应烧瓶中边搅拌边加入1-甲基哌嗪(758.1g，840mL，7.57mol)和200标准强度酒精(508mL)。再用氮气吹扫烧瓶并在氮气下维持反应。用加热套加热该烧瓶使其内部温度达到97"(+/-5°〇)并维持该温度直到通过1^1^确定反应完成(通常约40小时)。反应结束后停止加热，边搅拌边使反应物冷却至内部温度约为20°C-25°C，并将反应物搅拌2-3小时。除非已经发生沉淀，否则在反应混合物中加入5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺晶种(0.20g，0.85mmo1)。在反应混合物中边搅拌边加入1小时水(2450mL)并使内部温度维持在约20-3(TC。加完水后将所得混合物在约20-3(TC的温度下搅拌约1小时。然后过滤所得混合物并用水(3x2.56L)洗涤烧瓶和滤饼。在约5(TC的真空烘箱内将此金黄色固体产物干燥至恒重416g(产率98.6%)。方法C将5-氯-2-硝基苯胺(401g，232mol)加入一装有顶部搅拌器、冷凝器、气体入口、加料漏斗和温度计探头的12L的4-颈圆底烧瓶中。该烧瓶然后用氮气吹扫。在反应烧瓶中边搅拌边加入l-甲基哌嗪(977g，1.08L，9.75mol)和100。/。酒精(650mL)。再用氮气吹扫烧瓶并在氮气下维持反应。用加热套加热该烧瓶使其内部温度达到97r(+A5。C)并维持该温度直到通过HPLC确定反应完成(通常约40小时)。反应结束后停止加热，边搅拌边使反应物冷却至内部温度约为8(TC，并通过加料漏斗在混合物中加入1小时水(3.151^同时使内部温度维持在82°<:(+/-31:)。加完水后停止加热，并使反应混合物冷却至少4小时使内部温度为20-25°C。然后再将反应混合物搅拌1小时，期间内部温度为20-30。C。然后过滤所得混合物并用水(lxlL)、50。/。乙醇(lxlL)和95。/。乙醇(lxlL)洗涤烧瓶和滤饼。在约50。C的真空烘箱内将此金黄色固体产物干燥至恒重546g(产率99%)。B.合成[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基-乙酸乙酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>在一5000mL的4颈烧瓶上装上搅拌器、温度计、冷凝器和气体入口/出口。在装备好的烧瓶内装入265.7g(U2mol丄O当量)5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺和2125mL200标准强度EtOH。所得溶液用氮气吹扫15分钟。然后加入20.0g5%Pd/C(50%H20w/w)。将反应物在40-5(TC(内部温度)剧烈搅拌并在混合物中鼓入氢气。通过HPLC每小时监测5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺是否消失。反应时间通常为6小时。在反应物所有5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺消失后用氮气吹扫该溶液15分钟。然后加入440.0g(2.25mol)盐酸3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酉旨(ethyl3-ethoxy-3-imin叩ropanoatehydrochloride)固体。将反应物在40-50。C(内部温度)搅拌直到反应完成。通过HPLC根据二氨基化合物的消失监测反应。反应时间通常为1-2小时。反应完成后将其冷却至室温并通过硅藻土垫过滤。用绝对EtOH(2x250mL)洗涤硅藻土过滤物质并减压浓縮滤液得到粘稠的棕/橙色油状物。将所得油状物放入850mL0.37。/。的HCl溶液。然后一次性加入固体NaOH(25g)，有沉淀形成。将所得混合物搅拌1小时然后过滤。固体用H2O(2x400mL)洗涤并在5(TC的真空烘箱内干燥，得到251.7g(74.1。/。)淡黄色粉末状的[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯。在一5000mL的4颈夹套式烧瓶上装上机械搅拌器、冷凝器、温度计探头、气体入口和油起泡器。在装备好的烧瓶内装入300g(1.27mol)5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺和2400mL200标准强度EtOH(该反应可用，并且已经用95%的乙醇进行，该反应无需使用200标准强度酒精)。所得溶液用氮气吹扫15分钟。然后在反应烧瓶中加入22.7g5%Pd/C(50%H20w/w)。反应容器用氮气吹扫15分钟。用氮气吹扫之后，使缓慢但恒定流速的氢气持续通过烧瓶以便用氢气吹扫反应容器。将反应物在45-55。C(内部温度)搅拌，同时在混合物中鼓入氢气，直到通过1^1^确定5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺被完全消耗。反应时间通常为6小时。在反应物所有5-(4-甲基-哌嗪-l-基)-2-硝基苯胺消失后用氮气吹扫该溶液15分钟。二胺中间体在空气中是敏感的，因此需小心以免接触空气。在约30分钟内在反应混合物中加入500g(2.56mo1)盐酸3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯。将反应物在45-55'C(内部温度)在氮气下搅拌直到通过HPLC确定二胺被完全消耗。反应时间通常约为2小时。反应完成后，通过硅藻土垫趁热过滤反应物。然后用200标准强度EtOH(3x285mL)洗涤反应烧瓶和硅藻土。将滤液合并在5000mL的烧瓶中并在真空下除去约3300mL乙醇得到橙色油状物。在所得油状物中加入水(530mL)然后加入1MHC1(350mL)并搅拌所得混合物。剧烈搅拌所得溶液同时在约20分钟内加入30%NaOH(200mL)，保持内部温度约为25-30°C同时使pH在9和10之间。将所得悬浮液搅拌约4小时同时保持内部温度约为20-25°C。过滤所得混合物并用H2O(3x300mL)洗涤滤饼。将收集的固体在真空烘箱中于5(TC真空干燥至恒重，得到345.9克(90.1。/。)淡黄色粉末状的[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯。在另一方法中，将滤液合并并在真空下除去乙醇直到至少除去约90%的乙醇。然后在所得油状物中加入中性pH的水并将溶液冷却至约0°C。然后缓慢加入20%的NaOH水溶液，同时剧烈搅拌以使pH升至9.2(用pH计读数)。然后按上述方法过滤和干燥所得混合物。这种方法得到淡棕褐色至淡黄色产物，产率可高达97%。降低[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基卜乙酸乙酯含水量的方法将已经制得并干燥至含水量约为8-9%H20的[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(120.7克)置于2000mL的圆底烧瓶中并溶于无水乙醇(500mL)。用旋转式蒸发器将该琥珀色溶液浓縮成粘稠的油状物，同时加热直到所有溶剂被除去。该方法被重复两次或多次。将如此获得的粘稠的油状物放置在烧瓶中并置于真空烘箱中在5(TC加热过夜。KarlFisher分析结果显示含水量为5.25%。用这种方法获得的降低的含水量提高了以下实施例的方法的产率。也可用甲苯和THF等其它溶剂代替这种干燥方法中的乙醇。C.合成4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮方法AEtO在一5000mL的装有冷凝器、机械搅拌器、温度计探头并用氩气吹扫过的烧瓶中将[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(250g，820mmol)(如上所述用乙醇干燥)溶于THF(3800mL)。在该溶液中加入2-氨基-6-氟-苄腈(95.3g，700mmol)，并使内部温度升至40°C。当所有固体溶解且溶液温度达到4(TC时在5分钟内加入固体KHMDS(376.2g，1890mmol)。当加完钾盐时得到不均一的黄色溶液，同时内部温度升至62°C。60分钟后，内部温度降至40°C，通过HPLC确定反应完全(不存在原料或未环化的中间体)。然后将此粘稠的反应混合物倒入H2O(6000mL)中终止反应并搅拌所得混合物直到其达到室温。然后过滤混合物并用水(2X1000mL)洗涤滤饼。将亮黄色固体置于干燥盘中并在真空烘箱中于5(TC干燥过夜，得到155.3g(47.9%)所需4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮。方法B在一5000mL的4-颈夹套式烧瓶上装上蒸馏设备、温度计探头、氮气入口、加料漏斗和机械搅拌器。在此反应器中加入[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(173.0g，570mmol)并用氮气吹扫该反应器15分钟。然后在烧瓶中边搅拌边加入无水THF(2600mL)。所有固体溶解后通过蒸馏(真空或大气下(较高温度有助于除去水)，需要时可加热)除去溶剂。除去lOOOmL溶剂后停止蒸馏并用氮气吹扫反应物。然后在反应容器中加入1000mL无水THF，当所有固体溶解时再次进行蒸馏(真空或大气下)直到又除去1000mL溶剂。加入无水THF和除去溶剂的方法重复至少4次(第四次蒸馏时，60%的溶剂被除去，而在第三次蒸馏时只有40%)，之后取出lmL样品进行KarlFischer分析以确定含水量。如果该分析显示样品含有少于0.20%的水则按照下段的描述继续反应。然而，如果分析显示含有超过0.20%的水则继续上述干燥过程直到含水量低于0.20%。用上段所述的方法实现含水量低于或约为0.20%后用回流冷凝器代替蒸馏设备，并在反应物中加入2-氨基-6-氟-苄腈(66.2§，470mmol)(有些方法中用0.95当量)。然后加热反应物至内部温度为38-42°C。当内部温度已经达到38-42t:时通过加料漏斗在5分钟内在反应物中加入KHMDS溶液(1313g，1.32mol，20%KHMDS，用THF配制)，加入过程中维持内部温度在约为38-50°C。当加完钾盐后将反应物搅拌3.5-4.5小时(一些实施例中搅拌30-60分钟，反应可在该时间内完成)，同时维持内部温度在38-42°C。然后取出反应物样品并通过HPLC分析。如果反应不完全，则在5分钟内再在烧瓶内加入KHMDS溶液并在38-42。C将反应物搅拌45-60分钟(加入的KHMDS溶液的量可按以下方法确定如果IPC率〈3.50，则加入125mL;如果lO.O^IPC率》3.50，则加入56mL;如果20.0》IPC率》10，则加入30mL。IPC率等于4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮)的面积除以未环化的中间体的面积)。一旦反应完成(IPC率大于20)，将反应器冷却至内部温度为25-30°C，并在15分钟内在反应器中加入水(350mL)，同时维持内部温度为25-35'C(—种替换方案中，反应在4(TC进行并在5分钟内加入水。较快地淬灭减少了随时间形成的杂质的量)。然后用回流冷凝器代替蒸馏设备并通过蒸馏(真空或大气下)除去溶剂，需要时可加热。除去1500mL溶剂后停止蒸馏并用氮气吹扫反应物。然后在反应烧瓶中加水(1600mL)同时维持内部温度在20-30°C。然后在20-3(TC搅拌反应混合物30分钟，之后冷却至内部温度为5-10°C，然后再搅拌1小时。过滤所得悬浮液，用水(3x650mL)洗涤烧瓶和滤饼。如果获得的固体在真空烘箱中于5(TC真空干燥至恒重，得到103.9g(产率42.6Q/。)黄色粉末状的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮。方法C将[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯(608g，2.01mol)(干燥的)和2-氨基-6-氟-苄腈(274g，2.01mol)加入放在加热套上的12L的4-颈烧瓶中，该烧瓶上装有冷凝器、机械搅拌器、气体入口和温度计探头。反应容器用氮气吹扫，并边搅拌边在反应混合物中加入甲苯(7.7L)。反应容器再用氮气吹扫并维持在氮气下。升高混合物的内部温度至63°C(+/-3°C)。将混合物的内部温度维持在63°C(+/-3°C)，同时在减压(380+A10托，蒸馏头1=40°(:(+/-101:)条件下从烧瓶中蒸馏出约2.61^甲苯(用KarlFischer分析来检测混合物的含水量。如果含水量大于0.03%，则再加入2.6L甲苯并再次蒸馏。重复该过程直到含水量低于0.03%)。当含水量低于0.03%后停止加热，在氮气下冷却反应物至内部温度为17-19°C。然后在氮气下在反应物中加入叔丁氧钾的THF溶液(20。/。的THF溶液；3.39kg，6.04摩尔叔丁氧钾)，加入速度为使反应物的内部温度维持低于2(TC。加完叔丁氧钾之后搅拌反应物30分钟，使内部温度低于2(TC。然后将温度升高至25。C，并搅拌反应物至少l小时。然后将温度升高至30°C，并搅拌反应物至少30分钟。然后用HPLC检测原料的消耗情况来监测反应是否完成(通常需2-3小时，两种原料都被消耗(HPLC面积X小于0.5y。))。如果2小时后反应未完成，再一次加入0.05当量叔丁氧钾，直到HPLC显示反应完成才结束该过程。反应完成后，边搅拌边在反应混合物中加入650mL水。然后加热反应物使内部温度为50"C并从反应混合物中减压蒸馏出THF(体积约为3L)。然后用加料漏斗在反应混合物中逐滴加入水(2.6L)。然后将混合物冷却至室温并搅拌至少1小时。然后过滤反应物，滤饼用水(1.2L)、70。/。乙醇(1.2L)和95。/。乙醇(1.2L)洗涤。将亮黄色固体置于干燥盘中并在5(TC的真空烘箱中干燥至恒重，得到674g(85.4。/。)所需4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮。4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基卜lH-喹啉-2-酮的纯化将装有冷凝器、温度计探头、氮气入口和机械搅拌器的3000mL的4-颈烧瓶置于加热套中。在该烧瓶中装入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮(101.0g，0.26mol)，使该黄色固体悬浮于95%的乙醇(1000mL)并搅拌。有些情况下使用8:1的溶剂比例。然后加热该悬浮液至温和回流(温度约为76i:)并搅拌约1小时。然后将反应物搅拌回流45-75分钟。此时停止加热烧瓶并使悬浮液冷却至25-3(TC。然后过滤悬浮液，滤饼用水(2x500mL)洗涤。然后将黄色固体置于干燥盘中并在5(TC的真空烘箱中干燥至恒重(通常为16小时)以得到97.2g(96,2。/。)黄色粉末状的纯化的产物。D.制备4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基-lH-喹啉-2-酮的乳酸盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>在一3000mL的4-颈夹套式烧瓶上安装冷凝器、温度计探头、氮气入口和机械搅拌器。用氮气吹扫此反应容器至少15分钟，然后装入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]-111-喹啉-2-酮(484g，1.23mol)。准备D,L-乳酸(243.3g，1.72摩尔单体，见下段)、水(339mL)和乙醇(1211mL)，然后将它们加入反应烧瓶。以中等速度开始搅拌，然后加热反应物使内部温度为68-72°C。使反应物的内部温度在68-72C维持15-45分钟，然后停止加热。所得混合物通过10-20微米的滤器过滤，将滤液收集在一12L的烧瓶中。该12L烧瓶装有内部温度计探头、回流冷凝器、加料漏斗、气体入口出口和顶部搅拌器。然后以中等速度搅拌滤液并加热至回流(内部温度约为78。C)。保持温和回流，在约20分钟内在烧瓶中加入乙醇(3596mL)。然后在15-25分钟内冷却反应烧瓶使内部温度范围约为64-7(TC并维持该温度约30分钟。检查反应器中是否有晶体。如果不存在晶体，则在烧瓶中加入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]-lH-喹啉-2-酮的乳酸盐晶体(484mg，0.1摩尔％)，并在64-7(TC搅拌反应物30分钟，然后再检查烧瓶中是否有晶体。一旦出现晶体则以低速搅拌并再在64-7(TC搅拌反应物90分钟。然后在约2小时内使反应物冷却至约0"C，所得混合物通过25-50微米的烧结玻璃滤器过滤。反应器用乙醇(484mL)洗涤并搅拌直到内部温度约为0'C。用冷的乙醇来洗涤滤饼，并将该过程再重复两次。收集的固体在真空烘箱中于5(TC真空干燥至恒重，得到510.7g(85.7%)4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]-111-喹啉-2-酮乳酸盐黄色晶体。过滤过程中通常采用橡皮障或惰性条件。尽管干燥的固体似乎不十分吸湿，但滤饼会吸水并变得粘稠。需釆取注意事项以避免湿的滤饼长期暴露于空气。商品乳酸通常含有约8-12Q/。w/w水，且除了单体乳酸还含有二聚体和三聚体。乳酸二聚体与单体的摩尔比通常约为1.0:4.7。商品级乳酸可用于上段所述的方法，因为单乳酸盐优先从反应混合物中沉淀出来。代谢物的鉴定如纳入本文的参考资料所述，通过2周的毒理学研究，在合并的大鼠血桨中鉴定到并特征分析了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]-111-喹啉-2-酮(化合物l)的两种代谢物。鉴定到的这两种代谢物为哌嗪的N-氧化物(化合物2)和N-去甲基化合物(化合物3)，如下所示。化合物2化合物1-3的IC50用上述检测许多蛋白酪氨酸激酶的激酶活性的方法检测化合物1-3的ICso值，见下表。表.化合物1-3的IC50<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>合成4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基-4-环氧哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基I喹啉-2(lH)-酮(化合物2)和4-氨基-5-氟-3-(5-哌嗪-l-基-lH-苯并咪唑-2-基)喹啉-2(lH)-酮(化合物3)为了确定化合物l的已确认的代谢物的结构，代谢物被单独合成。化合物2(化合物1的N-氧化物代谢物)，如以下流程中所示进行合成。化合物1在乙醇、二甲基乙酰胺和过氧化氢的混合物中加热。反应接近完成时，用过滤的方式分离化合物2，并用乙醇清洗。如果必要，产物可通过柱层析而进一步纯化。2化合物3(化合物1的N-去甲基代谢物)，如以下流程中所示进行合成。用哌嗪处理5-氯-2-硝基苯胺产生化合物4，随后用叔丁氧基羰基(Boc)保护化合物4，产生化合物5。还原硝基，接着与3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯縮合得到化合物6。用六甲基二硅胺烷钾(potasssiumhexamethyldisilazide)作为碱，将化合物6与6-氟氨基苯甲腈縮合，得到化合物7。粗产物7用盐酸水溶液处理，产生所需的代谢物，纯化后得到的是黄/棕色固体。测定方法丝氨酸/苏氨酸激酶各种蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶的激酶活性可通过提供ATP和含有可磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基的合适肽或蛋白质，用测定磷酸基团向酪氨酸残基转移的试验来测定。用杆状病毒表达系统(InVitrogen)在Sf9昆虫细胞中表达含有GSK-3、RSK-2、PAR-l、NEK-2和CHK-l酶的激酶结构域的重组蛋白质，并通过Glu抗体相互作用(对含Glu-表位尾的构建物)或通过金属离子层析(对含His6(SEQIDNO:l)尾的构建物)纯化。用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中共表达Cdc2(GST融合构建物)和细胞周期蛋白B。重组的活性Cdk2/细胞周期蛋白A可通过商业获得，购自UpstateBiotechnology。该试验使用的纯化Cdc2酶可通过商业获得，可购自NewEnglandBioLabs。对于各试验，测试化合物用DMSO作系列稀释，然后与合适的添加有5-10nM"PY-标记的ATP的激酶反应缓冲液混合。加入激酶蛋白质和相应的生物素化的肽底物至最终体积为150pL。将反应物在室温下培育3-4小时，然后转移到含有100nL中止反应缓冲液的涂有链霉抗生物素蛋白的微量滴定板(ThermoLabsystems)上以中止反应。中止反应缓冲液中含有50mM未标记的ATP和30mMEDTA。培育1小时后用PBS洗涤链霉抗生物素蛋白平板，并在每个孔中加入200pLMicroscint20闪烁液。将平板密封并用TopCoimt计数。用XLFit数据分析软件采用非线性回归计算各种化合物的50%抑制浓度(1(:50)。反应缓冲液含有30mMTris-HCl2pH7.5、10mMMgCl2、2mMDTT、4mMEDTA、25mM(3-磷酸甘油、5mMMnCl2、0.01%BSA/PBS、0.5jiM肽底物和1|iM未标记的ATP。GSK-3酶用量为27nM，CHK1为5nM，Cdc2为1nM，Cdk2为5nM，Rsk2为0.044单位/mL。为测定GSK-3，使用生物素-CREB肽(生物素-SGSGKRREILSRRP(pS)YR-NH2(SEQIDNO:4))。为测定CHK1，使用生物素-Cdc25c肽(生物素-[AHX]SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR[CONH2](SEQIDNO:5))。为测定Cdc2和Cdk2，使用生物素-组蛋白HI肽([lc生物素]GGGGPKTPKKAKKL[CONH2](SEQIDNO:6))。在Rsk2测定中使用了生物素-p70肽、15mMMgCl2、1mMDTT、5mMEDTA、2.7|iMPKC抑制剂肽和2.7PKA抑制剂肽。酪氨酸激酶许多蛋白质酪氨酸激酶的激酶活性可通过提供ATP和含有可磷酸化酪氨酸的合适的肽或蛋白质，用测定磷酸基团向酪氨酸残基转移的试验来测定。用杆状病毒表达系统(InVitrogen)在Sf9昆虫细胞中表达对应于FLT-1(VEGFR1)、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2、PDGFRa、PDGFR卩和FGFR1受体胞质结构域的重组蛋白质，并通过Glu抗体相互作用(对含Glu-表位尾的构建物)或通过金属离子层析(对含His6CSEQIDNO:l)尾的构建物)纯化。对于各试验，将测试化合物用DMSO作系列稀释，然后与合适的添加有ATP的激酶反应缓冲液混合。加入激酶蛋白质和相应的生物素化的肽底物至最终体积为50-100(iL，将反应物在室温下培育1-3小时，并加入25-50jiLof45mMEDTA、50mMHepespH7.5来终止反应。将停止反应混合物(75pL)转移到涂有链霉抗生物素蛋白的微量滴定板(BoehringerMannheim)上并培育1小时。磷酸化的肽产物用DELFIA时间分辨荧光系统(Wallac或PEBiosciences),采用铀标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66测量，有以下改进在DELFIA测定缓冲液中添加1mMMgCl2以稀释抗体。在Wallac1232DELFIA荧光计上或PEVictorII多信号阅读计上读取时间分辨荧光。用XLFit数据分析软件通过非线性回归计算各化合物的50%抑制浓度(IC50)。测定用在50mMHepespH7.0、2mMMgCl2、10mMMnCl2、lmMNaF、1mMDTT、1mg/mlBSA、2|iMATP和0.20-0.50|iM相应的生物素化肽底物配制的FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2和FGFR1激酶(活性)。分别加入0.1jag/mL、0.05pg/mL或0.1pg/mL的FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2和FGFR1激酶。对于PDGFR激酶试验，使用120ng/mL酶和与上述相同的缓冲液条件，但将ATP和肽底物的浓度改变为1.4ATP和0.25|iM生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQIDNO:2)肽底物。就FLT-1、VEGFR2、VEGFR3和FGFR1而言，上述各个化合物的ICs。值小于10pM。重组的活性酪氨酸激酶Fyn和Lck可通过商业获得，可购自UpstateBiotechnology。对于各试验，将测试化合物用DMSO作系列稀释，然后与合适的添加有5-10nM33Py-标记的ATP的激酶反应缓冲液混合。加入激酶蛋白质和相应的生物素化肽底物至最终体积为150|iL。将反应物在室温下培育3-4小时，然后转移到含有100(iL中止反应缓冲液的涂有链霉抗生物素蛋白的微量滴定板(ThermoLabsystems)以中止反应。中止反应缓冲液中含有100mMEDTA和50未标记的ATP。培育1小时后用PBS洗涤链霉抗生物素蛋白平板，并在每个孔中加入20(HiLMicroscint20闪烁液。将平板密封并用T叩Count计数。用XLFit数据分析软件采用非线性回归计算各化合物的50%抑制浓度(1(:5())。Fyn、Lck和c-ABL激酶反应缓冲液含有50mMTris-HClpH7.5、15mMMgCl2、30mMMnCl2、2mMDTT、2mMEDTA、25mMp-磷酸甘油、0.01%BSA/PBS、0.5|iM相应的肽底物(生物素化的Src肽底物:生物素-GGGGKVEKIGEGTYGWYK-NH2(SEQIDNO:3)，用于Fyn和Lck)，1|aM未标记的ATP和1nM激酶。c-Kit和FLT-3的激酶活性可通过提供ATP和含有可磷酸化酪氨酸残基的肽或蛋白质底物，用测定磷酸基团向酪氨酸残基转移的试验来测定。与c-Kit和FLT-3受体胞质域相应的重组蛋白质购自(Proquinase)。在测试举例化合物，例如4-氨基-5-氟_3_[5_(4_甲基哌嗪_1_基)_111-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(111)-酮时，用DMSO稀释，然后与下述加有ATP的激酶反应缓冲液混合。加入激酶蛋白质(c-Kit或FLT-3)和相应的生物素化肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQIDNO:2))至最终体积为100pL。将反应物在室温下培育2小时，并加入50pL45mMEDTA、50mMHepespH7.5终止反应。将停止的反应混合物(75^L)转移到涂有链霉抗生物素蛋白的微量滴定板(BoehringerMannheim)并培育1小时。磷酸化的肽产物用DELFIA时间分辨荧光系统(Wallac或PEBiosciences),采用铀标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66进行测量，进行以下改进在DELFIA测定缓冲液中添加1mMMgCl2以稀释抗体。在Wallac1232DELFIA荧光计或PEVictorII多信号阅读器上读取时间分辨荧光值。用XLFit数据分析软件通过非线性回归计算各化合物的50%抑制浓度(1<:50)。在50mMHepespH7.5、1mMNaF、2mMMgCl2、10mMMnCl2和lmg/mLBSA、8|iMATP和1nM相应的生物素化的肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQIDNO:2))中测定FLT-3和c-Kit激酶。测定FLT-3和c-Kit激酶的浓度为2nM。实时和全面成像评价4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(111)-酮在临床前多发性骨髓瘤模型在的功效多发性骨髓瘤(MM)是一种以造血骨髓中的血浆细胞无性扩增为特征的B细胞瘤，除了进行常规的高剂量化疗，由于固有的获得性药物耐性的出现，它是一种致命的血液恶性肿瘤。已证实MM细胞定居和生长的骨髓微环境在对MM的常规和新型疗法产生耐性中发挥关键性作用。因此，不仅寻耙MM细胞同时还寻耙MM细胞-骨髓微环境相互作用的分子靶向剂提供了一种治疗MM的潜在机会。最近关于MM分子病理学理解的进展为治疗这种疾病提供了一种新的治疗靶点。由于t(4;14)染色体易位导致的异位表达和失调的FGFR-3发生于约15%的MM患者中且在临床上有极差的预后，它已经成为了引人注目的MM的治疗靶点。4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮(化合物l)是一种耙向包括VEGFR-2和PDGFR(在激酶试验中ICso约20nM)和FGFR-3(在激酶试验中ICso约5nM)在内的多种受体酪氨酸激酶的小分子抑制剂。已证实4-氨基-5-氟一3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮在体外抑制FGFR-3的自磷酸化和FGFR-3突变型MM细胞的增殖(S.Trudel等；Blood;出版中)。为评价4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮的抗骨髓瘤功效，建立了体内临床前MM模型，在该模型中，通过尾静脉静脉内注射用萤光素酶构建物稳定转染的表达突变型FGFR-3(Y373C)的人KMS-ll-luc细胞建立多器官MM损伤。采用生物发光成像(BLI)非侵入性监测KMS-ll-lucMM瘤的体内生长和转移。通过BLI对这种模型进行了成功的早期检测和连续全面监测转移性损伤的生长。发现几乎所有注射了KMS-ll-luc肿瘤细胞的动物都在早至第26天时出现MM损伤，损伤主要位于脊骨、头骨和盆骨内，这导致该模型中频繁出现瘫痪。研究了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮对这种体内静脉内注射KMS-ll-lucMM动物模型的抗骨髓瘤功效，并发现每日口服给予20mg/kg的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮能抑制体内KMS-ll-luc肿瘤中ERK的磷酸化，从而导致显著抑制KMS-ll肿瘤生长，连续BLI成像也检测到这种现象。此外，4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮的抗肿瘤生长活性导致与载体治疗相比动物的存活率显著升高。这些研究还为MM患者中进行4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮临床试验提供了临床前基础，并得到批准可利用这种KMS-ll-luc体内模型进一步评价4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(111)-酮与常规或其它的分子靶向剂联合治疗的功效。方法从TheJackson实验室(BarHarbor,ME)获得一组18只雌性(约8周龄)免疫缺陷的SCID-米色鼠，将小鼠关在顶部为无菌滤器的笼子的屏蔽设备中，采取12小时光照/黑暗循环。所有试验由国际试验动物保护评价和鉴定协会(AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCareInternational)认可白勺丰几丰勾按,照、国际动物保护和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的所有指导方针和试验动物保护和使用指南(GuideforTheCareandUseofLaboratoryAnimals)(国家研究委员会(NationalResearchCouncil))进行。带有FGFR-3突变体(Y373C)的KMS-ll-lucMM细胞在Iscove培养基+10%FBS+L-谷氨酰胺中培养，以1:2至1:4每周传代2次。以每只小鼠10"06细胞/100pLHBSS通过静脉内注射将细胞植入尾静脉。在植入细胞的那天以3GY(3.2分钟)照射小鼠。从注射KMS-ll-luc细胞48小时后开始让动物每天口服20mg/kg4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1印-酮或载体(11=9/组)。用IVIS成像系统(Xenogen)获得生物发光图像(BLI)，该系统包括一固定在不透光的照相机箱内的高度灵敏的冷却CCD相机。注射萤光素酶底物之后，在第8天获得生物发光信号的图像和测量值(用光子/秒量化)，之后每周获得一次。动物体重每周监测两次，每日记录临床观测结果。根据动物保护规则和指南，在小鼠出现瘫痪或生活质量极大降低时通过吸入C02将它们杀死。结果将KMS-ll-luc细胞静脉内注射到SCID-米色鼠后8天，整体成像证明发生细胞生长且MM损伤可能主要位于包括肺、肝和脾的骨骼外区域。在第41-48天在大多数小鼠中观察到典型的弥散性多发性骨骼损伤(包括头骨、盆骨和脊骨)(如在BLI图像中看到的)，伴有后肢瘫痪，并导致按照协议杀死小鼠。在这种KMS-ll-luc体内模型中检测4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮的抗骨髓瘤功效。从注射KMS-ll-luc细胞48小时后开始让动物每天口服20mg/kg化合物l(n=9/组)。按照每周计划全面并连续监测每只动物的光子计数。如图l所示，与载体治疗相比，4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1&苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮治疗组的平均光子计数明显低于载体治疗组。将获自用载体治疗的与用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-111-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(111)-酮治疗的经KMS-ll-luc注射的小鼠的整体BLI图像进行比较容易观察到这点。有趣的是，KMS-ll多发性骨髓瘤细胞在化合物1治疗小鼠中的分布图案也明显不太分散。转移被限制在腹部和背部区域，而未发现扩散到头颅区域、椎骨或后肢。用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮治疗的小鼠的光子计数减少充分反映为与用载体治疗的小鼠相比存活时间显著增加。在第91天，那9只用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-萄喹啉-2(lH)-酮治疗的小鼠中的5只仍旧存活且整体健康状况良好。相反，载体治疗组中的大多数动物在大约第50天时被处死。此外，用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮治疗的小鼠在该研究中能长期较好耐受这种治疗。由于用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮治疗的小鼠的存活时间显著提高，出于实践考虑，在第91天时终止该研究。有关激酶抑制，一般指对FGFR3的抑制和用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮治疗包括多发性骨髓瘤在内的癌症的进一步的研究列在公开的美国专利申请No.2004/0092535以及美国专利申请No.10/983,174、美国专利申请No.2004/02201%和美国专利No.6,605,617中。因此，出于所有目的，这些参考资料中的每一个通过引用全文纳入本文，这就好像在这里完整列出一样。4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮(化合物1)在实验性人AML肿瘤异种移植物模型中的活性4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮(化合物l)是一种新的、具有口服活性的、多靶点的小分子，它对FLT3激酶以及参与内皮细胞和肿瘤细胞增殖的III、IV和V类RTK显示出强抵抗活性。鉴于FLT3突变与急性骨髓性白血病(AML)相关，在具有不同FLT3突变状态的两种人白血病细胞系中测试化合物l(比较MV4;11FLT3ITD和RS4;11FLT3WT)。化合物1对MV4;11的抗增殖活性约为RS4;11的24倍，这表明它更有力地抑制组成型活化的FLT3。化合物1在MV4;11细胞中剂量依赖性地调节受体磷酸化和下游信号传导(STAT5和ERK7MAPK)证实了该作用的分子机制。采用生物活性剂量的化合物1能在MV4;11肿瘤中实现对pFLT3、pERK的靶调节。在皮下和骨髓(BM)植入物移入(engraftment)白血病异种移植物模型中证实了来自骨髓的AML细胞的肿瘤消退和根治。肿瘤应答的特征为细胞增殖减少以及对胱冬酶-3和切割的PARP的免疫组织化学染色呈阳性，这提示细胞死亡受凋亡介导。这些数据支持了化合物1在AML中的临床评价。细胞系人MV4;11(FLT3ITD)和RS4;11(FLT3WT)白血病细胞获自美国模式培养物保藏所(Rockville，MD)24-26。MV4;11细胞生长在添加有10。/。胎牛血清(FBS，GibcoLifeTechnologies,Gaithersburg，MD)并含有4mML-谷氨酰胺、5ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，R&DSystems,Mi皿eapolis，MN)和1%青霉素和链霉素的Iscoves改进的Dulbecco培养基(IMBM)中。RS4;11生长在含有10%FBS、1mM丙酮酸钠和10mMHEPES(pH7.4)的RPMI-1640培养基中。使细胞悬浮生长并维持在37°〇和5%C02的湿润大气中。激酶试验在存在8|iMATP和化合物1的连续稀释液时用2nMFLT3酶(UpstateBiotechnology,Charlottesville,VA)进行体外FLT3激酶试验。将最终浓度为1pM的磷酸化的肽底物与铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体(PT66)(PerkinElmerLifeSciences,Boston,MA)—起培育。用时间分辨荧光检测铕。用非线性回归计算IC5()。增殖试验将细胞接种在96孔微滴定板中(IO,OOO细胞/孔)并加入化合物1的连续稀释液。RS4;11细胞用FLT3配体(IOOng/ml，R&DSystems,Minneapolis,MN)刺激。在培育期结束时(37。C培育72小时)通过MTS试验(Promega，Madison,WI)测定细胞生存力。用非线性回归计算EC5o值，该值定义为使经过处理的细胞的吸光度相比未处理的对照细胞降低50%所需的浓度。免疫沉淀和Western印迹分析为进行体外试验，用化合物1处理MV4;11和RS4;11细胞3小时。将RS4;11细胞与化合物l一起培育，之后用FLT3配体(100ng/mL)刺激15分钟。与药物一起培育之后收获细胞，用冰冷的PBS洗涤并用含蛋白酶抑制剂(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis,IN)和磷酸酶抑制剂(Sigma，St.Louis,MO)的RIPA缓冲液(1%NonidetP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二垸基硫酸钠，用IX磷酸缓冲盐水配制，pH7.2)裂解。为进行体内耙调节分析，将切除的肿瘤速冻，研磨成粉并储存于-70。C，然后用150mMNaCl、1.5mMMgCl2、50mMHepes，pH7.5、10%甘油、1.0%TritonX-IOO、1mMEGTA、50mMNaF、1mMNa3V04、2mMPefabloc(Roche)以及全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)裂解。用BCA试验(Bio-Rad，Hercules,CA)测定裂解液的蛋白质含量。采用抗pERK的小鼠抗体(1:1000，CellSignaling,Beverly,MA)并在4"C培育过夜进行pERK的Western印迹分析。通过用抗总ERK的抗体(CellSignaling)重探测来评价总ERK水平。然后将膜与1:5000的辣根过氧化物酶偶联的抗-兔IgG(JacksonImmunoresearch，WestGrove，PA)室温培育1小时后。对于免疫沉淀检测FLT3，将等量的蛋白质(STAT5为500吗；FLT3为1000吗)与抗人FLT3或STAT5的抗体(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)—起于4。C培育过夜并与蛋白A-琼脂糖一起在4T:培育2小时。通过用抗-磷酸酪氨酸抗体(CellSignaling的抗-pFLT3抗体和Upstate的抗-pSTAT5抗体)探测来测定FLT3或STAT5的磷酸化。用增强化学发光(ECL;AmershamBiosciences,白金汉郡，英国)检测蛋白质并在对Kodak膜曝光后观察。进行密度扫描定量测定条带的强度。为证实等量加载，剥离印迹并用抗-FLT3(SantaCruzBiotechnology)或抗-STAT5(BDBiosciences)的抗体重探观L以分别测量总的FLT3或STAT5蛋白。将pFLT3、pERK或pSTAT5的含量按总白质水平标准化，并与载体对照或未处理的对照相比较。流式细胞术试验在血清饥饿条件(在OptiMEM培养基中过夜)下用化合物1处理MV4;11细胞3小时。为检测pSTAT5，细胞用1%甲醛固定，并用90%冰冷的甲醇渗透。将经过渗透的细胞(0.5-lxl0勺与抗-pSTAT5抗体(CellSignaling)—起培育30分钟。采用相同浓度的纯化的兔IgG(Oncogene,SanDiego，CA)作为同种型对照。第二抗体为PE-偶联的羊F(ab，)2抗-兔IgG(JacksonImmunoresearch)。样品于4。C避光保存，然后用FACScan流式细胞计数仪(BectonDickinson,SanJose,CA)分析。用CellQuest软件(BectonDickinson)确定pSTAT5染色的平均荧光强度(MFI)，比MFI不同于同种型对照抗体的MFI。为处理来自小鼠MV4;11植入物移入模型的骨髓(BM)细胞，用冷盐水洗净股骨并用FACS裂解缓冲液(BectonDickinson)裂解红血细胞。通过用抗-人HLA-A、B、C-FITC染色确定进入小鼠BM的人白血病细胞的植入物移入百分数(与同种型匹配的抗体-FITC对照相比)(BDPharmingen)。VEGFELISA将MV4;11细胞在含有10。/。FBS和各种浓度(0-1iaM)化合物1的培养基中培养48小时。离心后收集上清液，并通过ELISA(R&DSystems,Minneapolis,MN)测量VEGF水平。用BIO-RAD蛋白质测定(Hercules，CA)测定蛋白质浓度，并将结果标准化成蛋白质浓度。体内功效研究雌性SCID-NOD小鼠(4-6周龄，18-22g)获自CharlesRiver(Wilmington,MA)并在开始研究前使它们在无病原体的环境中适应1周。给动物吃无菌的啮齿类固体食物并随意饮水，将动物关在顶部为无菌滤器的笼子中，采取12小时光照/黑暗循环。所有实验按照国际试验动物保护评价和鉴定协会的指导方针进行。皮下模型将MV4;11和RS4;11细胞从皮下(s.c.)肿瘤传代到SCID-NOD小鼠中。细胞(5x106细胞/小鼠)用50Q/。基质胶(BectonDickinson)重建并皮下植入SCID-NOD小鼠的右腹侧。当肿瘤达到200-1000mm3时开始按照具体的研究设计进行处理。将小鼠随机分组(通常功效研究有10小鼠/组，药效(PD)研究有3-5小鼠溜)。通过口饲管给予化合物1的溶液。肿瘤体积和体重每周评价2-3次。用以下公式将肿瘤的卡尺测量值转化成平均肿瘤体积1/2(长度x[宽度]2)。与载体处理的小鼠比较得到肿瘤生长抑制(TGI)百分数。应答率定义为完全应答CR(无可触诊的肿瘤)或部分应答PR(縮小50-99%)与治疗开始时肿瘤体积的比值。静脉内骨髓(BM)植入物移入模型将SCID-NOD小鼠先照射(3Gy)然后再尾静脉注射溶于0.2ml盐水的l"07MV4;11细胞。接种细胞3周后开始用化合物1或载体治疗。每日监测小鼠并在小鼠垂死或出现后肢活动性丧失早期信号时实施安乐死失能。用与载体治疗的对照小鼠相比存活期中值(MST)的增加百分比计算治疗小鼠的延长的寿命(ILS)。体内靶调节SCID-NOD小鼠(11=3小鼠/组)中的MV4;11皮下肿瘤以300mm3划分阶段，治疗包括以口服给予10mg/kg载体或化合物l，为期5天。为表征化合物1的PD特性，在给予化合物1之后的不同时刻收集肿瘤样品(N-3小鼠/时间点)。免疫组织化学将切除的肿瘤在10%中性缓冲福尔马林中室温放置过夜，转移到70%乙醇中并用ThermoElectronExcelsior组织处理器(Pittsburgh，PA)进行石蜡包埋处理。将骨骼(股骨)样品脱钙(ProtocolTM，FisherDiagnostics,Middletown，VA)。将石蜡块切成4厚的片并放在带有正电荷的玻璃载玻片上。用Discovery自动化载玻片机(VentanaMedicalSystems,Tucson,AZ)染色组织切片。在加压蒸气发生器中用柠檬酸缓冲液(pH6.0)处理载玻片检查Ki-67、pERK和PARP抗原的染色，用Ventana试剂CC1检査胱冬酶-3。采用的第一抗体是Ki-67(1:750稀释，NovoCastraLaboratories,UK)，pERK(1:100稀释，Biosource，Camarillo，CA)，抗-人线粒体(1:200，Chemicon，Temecula，CA)，切割的胱冬酶-3(1:200，CellSignaling)和切割的PARP(1:100，Biosource)。第二抗体是1:100稀释的生物素化的羊抗-兔F(ab，)2抗体(JacksonImmunoResearch)。用苏木精复染载玻片并加上盖玻片。还用苏木精和曙红染色评价常规组织形态。统计学分析用MicrosoftExcel(Redmond,WA)进行线性回归分析。用斯氏t检验检测两治疗组之间的统计学显著性。用单向方差分析法(ANOVA)进行多重比较，并用Student-NewmanKeul检验(SigmaStat，SanRafael,CA)进行试验后治疗差异平均值的比较。对于存活研究，用卡方检验来确定各治疗组与载体组之间存活曲线的显著性(Prism，SanDiego，CA)。认为到研究结束时才处死的具有正常健康状况的小鼠是该分析的长期存活者和检验员。P<0.05认为有统计学显著差异。结果化合物1显示强效抑制FLT3激酶活性如上所述，用ATP竞争性结合试验和纯化的酶检测化合物1对不同RTK的特异性。发现化合物1可以纳摩活性高效对抗FLT3(1nM)、c-KIT(2nM)、VEGFR1/2/3(10nM)、FGFR1/3(8nM)、PDGFR(3(27nM)和CSF-1R(36nM)(见下表)。为证实能选择性对抗ni类、IV类和V类RTK，测试了化合物1对PI3K/Akt和MAPK(K)途径中其它激酶的抑制，发现其活性可以忽略不计(ICso>10^M)(见下表)。表.4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基喹啉基-2(lH)-酮对各种RTK的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>如上所述，在存在纯化的酶和ATP时用各种稀释度的化合物1进行体外RTK试验以得到上表。将磷酸化的肽底物(l^M)与铕-标记的抗-磷酸特异性抗体一起培育，并用时间分辨荧光检测铕。化合物1对MV4;11(FLT3ITD)细胞的强抗增殖作用为确定对FLT3的抑制在体外是否能转化为生长抑制，用MTS试验检测了化合物1对MV4;11和RS4;11细胞的活性。将MV4;11或RS4;11(存在FLT3配体)细胞与化合物1的连续稀释液一起培育。培育72小时之后用MTS试验测定细胞活力。用非线性回归计算EC5o值，该值定义为使经过处理的细胞的吸光度相比未处理的对照细胞降低50%所需的浓度。化合物1以剂量依赖性方式有力抑制MV4;11细胞的增殖，其ECs。-13nM。尽管用RS4;11细胞观察到类似的对增殖的浓度依赖性效应，但与化合物1相比灵敏度低约24倍(ECso=315nM)。还检测了化合物1对FLT3ITD突变细胞的抗增殖作用，M0LM13和M0LM14的ECso浓度与用MV4;11细胞所见类似(EQ()约6nM)。这些数据提示，化合物1对FLT3ITD和WT白血病细胞都具有活性，组成型活化受体对抑制更加敏感。化合物1体外对白血病细胞FLT3-介导的信号传导的作用在具有不同FKT3突变状态(用RT-PCR证实)的两种人白血病细胞系MV4;11和RS4;11上研究了化合物1的体外细胞活性。在这些实验中，将血清饥饿的MV4;11(ITD)或RS4;11(WT)细胞与递升浓度的化合物1一起培育3小时，然后裂解细胞。RS4;11细胞用FLT3配体(IOOng/ml)刺激15分钟。全细胞裂解物用抗-人FLT3抗体免疫测定，通过SDS-PAGE分辨。免疫印迹用抗磷酸酪氨酸抗体探测。再将膜剥离并用抗-FLT3重探测以证实FLT3等量加载。用光密度分析法将pFLT3的变化报告为基线(未处理)的百分比。MV4;11细胞在FLT3受体中有内部串联加倍突变(ITD)，这导致组成型活化FLT3。LevisM.等，肠od，99:3885-3891(2002);O'FarrellA.M.等，101:3597-3605(2003)。这种活化导致FLT3在不存在外源配体刺激时也能自身磷酸化。血清饥饿的MV4;11细胞用化合物1处理3小时，并通过分析其磷酸化状态确定对FLT3受体活化的直接影响。使MV4;11细胞接触增加浓度的化合物1以剂量依赖性方式有力抑制pFLT3，其ECso为l-10nM。尽管FLT3ITD在大约20。/。的AML患者母细胞中是普遍的，但大多数急性白血病表达WTFLT3。还研究了用外源性FLT3配体(IOOng/ml，15分钟)刺激FLT3受体磷酸化后化合物1对白血病RS4;11细胞的作用(FLT3WT)。RS4;11FLT3WT细胞在不存在FLT3配体刺激时具有低的基线水平的pFLT3。化合物1处理降低了RS4;11细胞中的pFLT3水平。然而，与ITD相比，调节WTFLT3需要较高浓度。在浓度大于0.5^M时获得完全抑制。化合物1调节FLT3抑制的下游耙点ERK和STAT5为进一步表征化合物1抑制FLT3的功效，研究了对FLT3的下游靶点，即STAT5和ERK的调节，这两个靶点是细胞存活和增殖的关键蛋白质。MV4;11细胞用递升浓度的化合物1处理3小时，然后用流式细胞术和Western印迹检测pERK和p-STAT5。将pERK或pSTAT5的变化报告为基线(未处理)的百分比。在MV4;11细胞中，由于FLT3的信号传导被激活，细胞具有高pERK和pSTAT5基线水平。化合物1可以剂量依赖方式抑制ERK和STAT5的磷酸化。在浓度大于0.1时观察到对pERK和pSTAT5的实质性抑制(大于50%)(流式细胞术和Western印迹)。与FLT3配体刺激的RS4;11细胞相比，MV4;11细胞中化合物1对pERK和pSTAT5的抑制作用更强。化合物1在体外抑制MV4;11细胞自分泌产生VEGF为在体外研究化合物1对VEGF产生的影响，对MV4;11培养物上清液进行ELISA。在这些试验中，将MV4;11细胞用含10%FBS和递升浓度(0-l^M)化合物1的培养基培养48小时。未经药物处理时，MV4;11细胞分泌大量VEGF(180pg/ml)，而化合物1可以剂量依赖方式抑制VEGF产生，其ECso在0.001和0.01pM之间，浓度大于0.5时则完全抑制。化合物1在体内调节FLT3信号传导为检测对体内靶位点的调节，给予具有MV4;11肿瘤的小鼠(肿瘤大小为300-500mmS)化合物l(10mg/kg/天)或载体5天。在第5天时在给药后4、8、24和48小时切除肿瘤，将肿瘤研磨成粉并立即速冻(-7(TC)。将在所选时间点收获的肿瘤匀浆用IP/Western印迹分析pFLT3和pSTAT5水平。对于pFLT3或pSTAT5调节用抗-人FLT3或抗-STAT5抗体免疫沉淀肿瘤裂解液，用SDS-PAGE分辨。免疫印迹用相应的抗磷酸酪氨酸抗体探测。剥离膜并用抗-FLT3或抗-STAT5抗体重探测以确定作为加样对照的FLT3或TAT5蛋白的总量。早在给予单剂或多剂化合物1后4小时时就观察到pFLT3和pSTAT5水平明显降低，而对总FLT3或STAT5蛋白没有影响。FLT3和STAT5的磷酸化相比基线都降低，在给药8小时后达到约90%的最大抑制，并保持抑制24小时(约85%抑制)。磷酸-FLT3返回到接近基线述评，而在给药48小时后p-STAT5仍被抑制(约60%抑制)。还观察到pERK水平的降低，说明下游FLT3信号传导被阻断。体内功效研究化合物1在体内对MV4;11和RS4;11肿瘤的剂量应答效应为确定化合物1的体外作用是否与体内肿瘤生长抑制相关，检测了化合物1对SCID-NOD小鼠中MV4;11或RS4;11肿瘤异种移植物的功效。在小鼠中皮下植入肿瘤细胞并在肿瘤达到200-300mr^时开始用化合物1治疗。在剂量-反应作用研究中，对MV4;11肿瘤口服给予l-30mg/kg/天化合物1，对RS4;11肿瘤为10-150mg/kg/天。化合物1高度有力地抑制MV4;11肿瘤，在剂量大于5mg/kg/天时显示出良好的剂量-反应作用和显著的肿瘤生长抑制(图2)。30mg/kg/天的剂量导致肿瘤消退(9/10肿瘤应答)，这与部分和完全应答者(1CR，8PR)—致。以1mg/kg/天的剂量给药2周后观察到最轻微的肿瘤生长抑制(23%)，并被认为是该模型中的最小统计学有效剂量(与载体相比p〈0.01)。在具有RS4;11肿瘤的小鼠中，用化合物1治疗导致肿瘤生长抑制，但为观察到肿瘤消退(图3)。化合物1对MV4;11肿瘤的抑制功效比对RS4;11肿瘤更强，这可由各模型中各自的最小有效剂量加以证实(第8天100mg/kg/天；对RS4;11肿瘤为48%TGI，pO.Ol，相比1mg/kg/天；对MV4;11肿瘤为23%TGI，p<0.01)。化合物1的另一种剂量方案是等效的还检测了化合物1的间歇性剂量和循环剂量对MV4;11异种移植肿瘤的功效(图4)。化合物1以30mg/kg的剂量每天、隔天(q.o.d.)口服给药，或以给药7天/停药7天循环口服给药2轮(图4)。与每日给药类似，间歇性剂量方案在药物治疗期间产生显著的肿瘤消退(^4Q/。TGI)。所有三种方案得到相等的抗肿瘤活性(第29天，pX).05)，用q.o.d.(6PR)和给药7天/停药7天(9PR)看到的反应数与用每日治疗(1CR、9PR)看到的反应数类似。化合物1有效抵抗大MV4;11肿瘤还研究了化合物1对不同尺寸(300、500或1000mmS)的大MV4;11肿瘤的功效。用化合物1(30mg/kg/天)治疗导致所有MV4;11肿瘤显著消退，且这种消退与治疗开始时的肿瘤最初大小无关(图5)。药物治疗3-5天内明显发现肿瘤消退。所有治疗的肿瘤都有反应(11=27)，其中15%完全反应，70%部分反应。剩余的15%有最小的反应或保持稳定。在50天后停止给药。在50天的治疗期内没有肿瘤重新生长，说明为产生对化合物l的耐药性。还检测了停止治疗后反应的持久性。lCR和大约50。/o的PR在停止给予化合物1后能持续40天。从研究的第90天开始用30mg/kg/天化合物1重新治疗又生长(长至600-2000mm"的10个肿瘤，治疗从停药后40天开始并持续60天。所有肿瘤对第二轮化合物1有反应(2CR，8PR)，这清楚表明肿瘤对化合物l没有耐药性。体内生物活性的组织学评价除了肿瘤体积和靶调节终点，免疫组织化学读数也被用作药物活性指标。我们采用组织学和免疫组织化学分析评价用30mg/kg4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮(化合物l)治疗的SCID-NOD小鼠中MV4;11或RS4;11肿瘤的肿瘤凋亡/坏死及对细胞增殖的抑制。在该研究中，具有皮下MV4;11肿瘤的SCID-NOD小鼠(11=3-5/组)用载体或30mg/kg/天的化合物1治疗5天。在第2-5天切除肿瘤。石蜡包埋的肿瘤用苏木精和曙红染色，或者用Ki67(增殖标记)、pERK(药代动力学标记)、切割的胱冬酶-3(凋亡标记)或PARP(凋亡标记)(用苏木精复染)免疫染色。研究了给予1或5剂化合物1后对MV4;11肿瘤的时间作用(30mg/kg/天)。用H&E染色进行形态学评价，显示载体治疗的肿瘤含有表明骨髓增生的显著过多的MV4;11肿瘤细胞。在载体治疗组中，Ki67强烈染色的肿瘤细胞表明肿瘤由高增殖性细胞构成。给药24小时后，用化合物1治疗的肿瘤显示出紧密堆集的细胞减少，含有由凋亡/坏死细胞构成的稀疏区域(第1天)。凋亡/坏死区域在给药5天后更加显著，出现明显的无活性肿瘤细胞区域，这与Ki67染色减少相一致。体内pERK免疫组织化学染色结果证实了对靶细胞的调节。5天给药期内，用化合物1治疗的肿瘤中磷酸化-ERK明显降低，确证了对肿瘤pERK的Western分析结果。与载体治疗对照相比，第5天时肿瘤中活化的胱冬酶-3和切割的PARP染色增加证明化合物1诱导了凋亡。用30mg/kg化合物1治疗后我们还检测了RS4;11肿瘤的免疫组织化学染色。RS4;11肿瘤(!1=3-5/组)用载体或30mg/kg/天化合物1处理。在第9天切除肿瘤。石蜡包埋的肿瘤用苏木精和曙红染色，或者用Ki67(增殖标记)或pERK(如上所述)免疫染色。用化合物1(30mg/kg/天)治疗RS4;11肿瘤观察到具有相似的细胞数量和增殖降低以及pERK减少作用。此外，我们评价了肿瘤的组织学，即部分(>50%肿瘤抑制)或完全反应(无可触诊的肿块)。在这些研究中，具有皮下MV4;ll肿瘤的SCID-NOD小鼠(r^3-5/组)用载体或30mg/kg/天化合物1处理。在第15天切除载体处理的肿瘤，在第89天切除化合物1处理的肿瘤(每天给予化合物1为期50天+不处理39天)。石蜡包埋的肿瘤用苏木精和曙红染色，或者用Ki67(用苏木精复染)免疫染色。完全反应者都没有MV4;11肿瘤细胞，之显示出残余的坏死和/或疤痕组织。在部分反应鼠中，肿瘤边缘观察到袋状Ki67-阳性增殖肿瘤细胞。化合物1延长了具有弥散性人白血病细胞的小鼠的存活时间检测了化合物1在MV4;11白血病模型中的功效，在该模型中，细胞被接种到经过照射的SCID-NOD小鼠的尾静脉(图6)。在该模型中，MV4;11细胞扩散到骨髓(BM)，从而在病理学上模拟了与人白血病类似的疾病模式。在第1天给小鼠注射MV4;11细胞，并在MV4;11细胞移入BM后从第23天开始用化合物1治疗(20mg/kg，每天或者给药7天/停药7天，n-10-12/组)。对照(载体治疗的)小鼠通常出现后肢瘫痪，这是肿瘤细胞浸润BM的结果，其存活时间中值(MST)为51天(图6)。在存活研究中，与载体治疗的对照(MST=51天)相比，每天用化合物1治疗(第23-100天)显著延迟了疾病发展的时间(MST=134天)(p句.OOOl)，表明延长的寿命(ILS)为163%(图6)。惊人地是，每天用化合物1治疗有4只小鼠长期存活(MST〉160天)。用组织学分析和流式细胞术来量化进入BM的MV4;11细胞的植入物移入％。在流式细胞术分析中，用结合人MHCI上表位的抗-人HLA-A1B1C抗体鉴定了小鼠BM内的人MV4;11细胞。在载体治疗的小鼠中，总的分离的BM细胞中约有2-19%由移入的MV4;11细胞构成(第51天)。用人线粒体抗体进行免疫组织化学也证明了这一点，该抗体能够染色MV4;11细胞从而表明小鼠BM基质中存在人细胞。与载体治疗相比，每天给予化合物1(20mg/kg)为期25天显著降低了白血病负荷(BM中的MV4;11细胞<1%)。有趣的是，用化合物1治疗后存活小鼠的免疫组织化学显示BM中不存在肿瘤细胞(在第167天时未发现抗-人线粒体阳性细胞)，这被定义为"治愈"。循环给予化合物l(给药7天/停药7天，5轮)也使存活时间显著增加(MST二118天，与对照相比ILS为13P/0，p=0.0001)，但这不如每日方案有效(p^0.007，图6)。化合物1在治疗前列腺癌细胞系中的功效由于化合物1对III、IV和V类受体酪氨酸激酶(RTK)具有多耙激酶选择性，在转移性前列腺癌模型中检测了化合物1的活性。用表达被化合物1抑制的关键RTKVEGFR和FGFR的PC-3M肿瘤评价了化合物1的抗肿瘤功效。PC-3M细胞已显示转移到骨中，因此该模型被用来研究化合物1在人前列腺癌的转移性异种移植物裸鼠试验模型中的活性。细胞系。在Xenogen认可的许可下获得表达p53、delPTEN、VEGFR、FGFR并用萤光素酶构建物稳定转染的转移性人前列腺细胞系PC-3M。体内功效研究。雄性裸鼠(nu/nu)(4-6周龄，18-22g)获自CharlesRiver(Wilmington,MA)并在开始研究前使它们在无病原体的环境中适应1周。给动物吃无菌的啮齿类固体食物并随意饮水，将动物关在顶部为无菌滤器的笼子中，采取12小时光照/黑暗循环。所有试验按照国际试验动物保护评价和鉴定协会的指导方针进行。PC-3Mluc骨转移模型。将用萤光素酶构建物稳定转染的人前列腺癌细胞系PC-3M-luc细胞(1.5x106细胞)注射入心脏内。细胞接种后用生物荧光成像(Xenogen的IVIS成像系统)来非侵入性地监测PC-3M-luc肿瘤的体内生长和转移。注射了PC-3M-luc肿瘤细胞的动物几乎都出现前列腺损伤，且损伤主要位于股骨和下颚骨。接种细胞4周后开始用化合物1、紫杉醇或载体治疗(11=7/组)(研究的第0天)。每日监测小鼠并在其垂死时实施安乐死。组信息。接种细胞4周后开始给药(研究的第0天)1.载体(n=8)2.化合物l，50mg/kg，p.o.，每天(n-7)3.紫杉醇，15mg/kg，i.p.，每周3次(n=7)终点。功效(用Xenogen的1￥18@成像系统对肿瘤进行体内实时成像)。免疫组织化学。将骨(股骨，下颚骨)样品脱钙(ProtocolTM，FisherDiagnostics,Middletown，VA)。将石蜡块切割成4mm厚的切片并放在带有正电荷的玻璃载玻片上。组织用苏木精和曙红染色以观察组织的一般形态和鉴定骨中的PC-3M细胞。经心内注射接种给雄性裸鼠接种PC-3M-luc细胞，通过PC-3M-luc肿瘤细胞连续全体体内成像和组织学评价检测到PC-3M-luc细胞在心内注射后显示出弥散性生长(图7)。将PC-3M细胞接种到裸鼠4周后，全身摄像证实细胞生长发展且转移性损伤主要位于头部和腹部区域，组织学评价证实PC-3M细胞转移到骨骼(股骨和下颚骨)中。在一些小鼠中，还在胸部区域检测到肿瘤细胞，这可能是心内接种后的一些残余细胞。接种细胞4周后一旦发现肿瘤转移到骨骼便开始用化合物1治疗(第0天)。对小鼠进行全身摄像也证实骨骼中存在肿瘤。以50mg/kg/天的剂量口服给予化合物1，通过连续扫描小鼠证实，相比载体治疗有在裸鼠中抑制PC-3Mluc肿瘤细胞转移性生长的趋势。与用载体治疗的小鼠相比，用化合物1治疗的小鼠在第0、8、15/18天显示出降低的平均光子强度(抑制)。还用光子计数抑制中值评价了用化合物1治疗对肿瘤生长的抑制(图7)。如图7所示，每天用化合物1(50mg/kg/天)治疗比用紫杉醇(15mg/kg)治疗更加有效。观察到用紫杉醇治疗和用载体治疗的治疗功效之间没有区另U(图7)。结果概述。检测了化合物l对于治疗已经转移到骨髓的实体瘤的功效。在该模型中，给裸鼠心内接种PC-3M-luc细胞。PC-3M-luc细胞是己经用萤光素酶稳定转染的人前列腺癌细胞系。接种后，PC-3-luc细胞扩散到包括骨骼在内的多个器官。通过购自Xenogen公司的体内成像设备观察扩散的肿瘤细胞。用1.5><106个细胞给裸鼠心内接种PC-3M-Luc细胞。接种4周后开始给药(第0天)载体(n-8);化合物l，50mg/kg，p.o.，每天(11=7);和紫杉醇，15mg/kg,i.p.，每周三次(11=7)。PC-3M-luc细胞系购自Xenogen，用Xenogen的1VIS②成像系统对小鼠成像°相比用载体和紫杉醇治疗的小鼠。用化合物1治疗的小鼠有光子计数降低的趋势。从小鼠的头部和腿部区域产生的光子计数中值和图示于图7。该试验证实，用化合物1治疗能有效抑制已经转移到骨骼的PC-3M-luc细胞生长。化合物1在4T1鼠科乳腺肿瘤模型中的功效以下研究评价了化合物1的日口服剂量在自发性转移性4T1鼠科乳腺肿瘤模型中的功效。给9周龄的雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)的右腹侧皮下植入2.5"05个4T1细胞(衍生自转移性肝结节的细胞)。13天后当平均肿瘤体积为140mmS时开始治疗。这被认为是研究的第1天。用纯水将化合物1配成溶液并通过口饲管每天给予，共给予17天。治疗组包括(11=10/组)载体(水)；10、30、60、100和150mg/kg五组化合物剂量。研究终点包括肿瘤生长、动物观察及肺和肝转移计数。用斯氏t检验评价治疗组和载体组的成对比较。用非参数ANOVA(Kruskal-Wallis)比较治疗组之间的差异，然后用Dimn的方法进行成对多重比较。根据载体组的肿瘤体积在第18天时结束研究。结果概述。治疗开始4天后，除了10mg/kg剂量组，所有组的原发性肿瘤生长在统计学上被显著抑制。剂量为10、30、60、100和150mg/kg时的最大肿瘤生长抑制分别为32、45、50、74和82%(图25，表X)。组间比较显示了10、30和60mg/kg剂量水平与150mg/kg剂量水平以及10与100mg/kg组之间的差异(p0.05)。通过观察第18天切除的组织对肺和肝转移进行计数。载体治疗的对照小鼠的肺部肿瘤未达到之前研究中观察到的程度(降低约50%)，这影响了统计学比较。与载体相比，给予化合物1降低了肺转移，具体为150mg/kg剂量组的肝肿瘤结节数相比对照降低91%，而30、60和100mg/kg治疗组的肝肿瘤结节数相比对照降低77y。以上(表Y)。表X.化合物1对4T1原发性肿瘤生长抑制的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表Y.给药17天后化合物1对4T1自发性肝和肺转移的功效<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>总之，该试验证实了每日口服给予该化合物在4T1鼠科乳腺肿瘤模型中的功效。治疗4天后观察到显著的原发性肿瘤生长抑制。剂量为30、60、100和150mg/kg的化合物1分别以45%、50%、74%和82%抑制原发性肿瘤生长。化合物1治疗导致显著抑制自发性肺和肝转移。肝转移数被150mg/kg剂量水平完全抑制，而在剂量为30、60和100mg/kg时显著降低。在150mg/kg剂量水平时肺转移在统计学上被显著降低(91%抑制)。讨论肿瘤细胞增殖中出现寻耙异常的胞内激酶信号传导途径会中断细胞过程并抑制肿瘤生长。其例子包括已经两种小分子靶向剂，其中伊马替尼(Gleevec)用于治疗CML(Bcr-Abl)和胃肠道间质瘤(c-KIT)，gefitinib(Irressa)用于治疗难治性进行性或转移性非小细胞肺癌(EGFR)。DrukerB丄Owcoge"e，21:8541-8546(2002);GiacconeG.C〃"a^cw/^.10:4233S-4237S(2004)。这两种化合物都靶向肿瘤细胞特异的分子缺陷，这种成功使得对分子靶向剂的研究转向了其它致癌激酶，包括FLT315、20-23。FLT3基因的突变是AML中最常见的遗传改变，几乎35%的患者带有活性突变。已知FLT3突变会带来差的临床预后，因此使FLT3成为AML的治疗靶。ThiedeC.等，别ood，99:4326-4335(2002);SchnittgerS等，说ood，2002;100:59-66(2002)。化合物1是一种多靶点的激酶抑制剂，它在纳摩尔浓度时有效抵抗参与肿瘤增殖和血管发生的III、IV和V类RTK。生化激酶试验证实，化合物1具有强抗FLT3活性(IC5o为1nM)。与FLT3状态相反，化合物1的特征是在MV4;11(FLT3ITD)和RS4;11(FLT3WT)两种白血病细胞系中具有活性。化合物1显示能以剂量依赖性方式降低FLT3的磷酸化，这证实了它在细胞中的分子活性。在体外，化合物l随后阻断促分裂MAPK和STAT5途径中下游信号传导分子，这两者都是细胞增殖途径中的关键调节物。有趣的是，对FLT3靶调节的活性在MV4;11细胞中比在RS4;11细胞中更加显著，化合物1在细胞毒性/细胞增殖试验中的效果也是如此。其它FLT3抑制剂抗FLT3-ITD和野生型FLT3的效果也有类似差异。其原因可能是FLT3ITDMV4;11细胞具有驱使细胞增殖的组成型活化信号(Ras，STAT5)，而FLT3WT(RS4;11)细胞可以不依赖于FLT3的活化和/或依赖于其它致癌途径维持生长。MinamiY.等，102:2969-2975(2003);KiyoiH.等，Owcogewe，21:2555-2563(2002);SpiekermannK.等，C/Z"Ca"ceri化9:2140-2150(2003)。体内研究的结果证实，化合物1对实体瘤和白血病弥散性BM模型都有强抵抗活性。用PD终点表示化合物1在临床前模型中的分子活性以研究耙调节的程度和持续时间。化合物1显示在MV4;11肿瘤中pFLT3和pERK都被充分下调。给予单剂量或多剂量化合物1四小时后观察到耙调节(pFLT3)，并在肿瘤中持续最长达24小时。肿瘤的组织病理学也证明了生物效应，其中，在给予药物l-2天后在肿瘤中观察到降低的pERK、增殖和凋亡反应。在MV4;11的实体瘤异种移植物中，药物治疗之后的几天肿瘤明显消退。化合物1在MV4;11模型中的强抑制作用可能源于在抑制其它RTK的同时直接抑制FLT3。数据(RT-PCR，未显示)表明，MV4;11细胞也表达VEGFR1、cKIT、PDGFR(3、FGFR1和CSF-1R，所有RTK被化合物1有力抑制。化合物l对VEGFl/2/3激酶的活性〈10nM，该数据清楚证明，化合物1可抑制体外培养物中MV4;11中自分泌VEGF的水平。在体内，肿瘤细胞或肿瘤基质细胞(包括内皮细胞)对分泌的VEGF或FGF的自分泌或旁分泌抑制可抑制这些细胞的增殖和存活。FerraraN.等，M/,，9:669-676(2003);CompagniA.等，Ca"cer60:7163-7169(2000);CarmelietP.A^Med，9:653-660(2003)。化合物1对实体瘤的其它活性可能源于它在血管发生期间影响周细胞聚集和血管成熟从而有效抵抗PDGFRp。CarmelietP.TVaf.Med9:653-660(2003);OstmanA.qytoh"eOowA_Fa"orAev.，15:275-286(2004)。在AMLBM模型中，我们证明化合物1能改善小鼠的存在，且在一些小鼠中能根治疾病。这反映了化合物1通过直接的抗增殖作用或调节骨髓血管发生(可能在母细胞存活中发挥作用)而根除循环母细胞和BM疾病的潜能。CarowCE.等，肠od，87:1089-1096(19%);DrexlerH.G.Leukemia,10:588-599(1996)。基于化合物1的药理学和耙抑制，研究了化合物1的间歇剂量方案和循环剂量方案。证明化合物的交替给药方案与化合物1的日剂量方案有类似活性，说明了弹性剂量方案在临床上的潜在作用。多剂量的化合物1能够持续抑制肿瘤生长，并发现在治疗停止后出现的任何复发性肿瘤对用药物复治同样敏感。这些发现如果转换成临床情况是相关的，除了持续治疗，一些用激酶抑制剂治疗的AML患者已经出现复发。FiedlerW.等，5/ood，(2004);CoolsJ.等，Cflwcer64:6385-6389(2004)。已显示包括代谢或细胞流出(efflux)(通过表达药物转运体如P-糖蛋白)，或者干扰药物结合的酶活性位点中ATP结合域的突变在内的多种机制与激酶抑制剂的耐药性有关。BagrintsevaK,等，胁od，103:2266-2275(2004);GrundlerR.等，飾od，102:646-651(2003)。化合物1不是P-GP底物，贯穿药物治疗阶段的持续反应可能意味着用化合物1可避免产生耐药性。对用于治疗AML的FLT3抑制剂(SU11248PKC412、CEP-701、MLN518)的临床开发仍旧处于早期。0'Farre11A.M.等，Cawcwi"9:5465-5476(2003);FiedlerW.等，(2004);StoneR.M.等，X""//画to/.83增刊1:S89-90(2004);SmithB.D.等，说ood，103:3669-3676(2004);DeAngeloDJ.等，5/ood，102:65a(2003)。选择单一药剂疗法还未产生明显的反应，且用于治疗AML的FLT3抑制剂未来的临床发展可能取决于将这些药剂与细胞毒药物或其它分子靶向剂的组合。这里报告的化合物1的数据确保了其临床价值，化合物1是一种强FLT3抑制剂，还对己知在AML的发病机制中发挥作用的RTK具有活性。按照上文的描述制备了其它结构I的化合物，如结构IB和IC的化合物。用上文对4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-l-基)-lH-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(lH)-酮描述的方法对这些化合物进行了研究。这些研究将显示，这些化合物也可用于治疗小鼠、人和其它哺乳动物对象中的包括血液肿瘤在内的转移瘤。出于所有目的，文中引用的所有文献或参考资料已通过引用全文纳入本文，这就好像在这里完整列出一样。应理解，本发明不限于这里列出的用于说明的实施方式，而是包括以下权利要求范围内其所有的形式。权利要求1.一种治疗转移瘤患者的方法，所述方法包括给予该对象结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物，其中，A是具有以下结构之一的基团:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，W选自含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，和再其中，转移瘤的生长在给予该对象结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物之后被抑制。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，W是甲基，而结构I的化合物具有结构IA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述化合物是全身给予的。4.如权利要求1所述的方法，还包括给予对象第二药剂。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予对象结构I的化合物或其互变异构体的乳酸盐。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，而所述对象是具有t(4;14)染色体易位的多发性骨髓瘤患者。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤表达成纤维细胞生长因子受体3。8.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤已经转移到患者的骨中。9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二药剂用于治疗骨质疏松。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述患者是人。11.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是急性骨髓性白血病，且所述对象是急性骨髓性白血病患者。12.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是血液肿瘤。13.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是实体瘤。14.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤已经转移到对象的骨中。15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象患有乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌，和/或所述肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌。16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是前列腺癌，而所述对象是前列腺癌患者。17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述前列腺癌已经转移到患者的骨中。18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二药剂是是二膦酸盐。19.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述患者是人。20.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述对象是人。21.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二药剂是抗癌药。22.如权利要求3所述的方法，其特征在于，结构I的化合物是口服给予的。23.结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物在制备用于治疗对象的转移癌的药物中的应用，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，A是具有以下结构之一的基团:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，W选自含有l-6个碳原子的直链或支链垸基，和再其中，所述对象中肿瘤的生长在给予该对象结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物之后被抑制。24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，W是甲基，而结构I的化合物具有结构IA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>25.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述药物还包含第二药剂。26.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述结构I的化合物或其互变异构体的乳酸盐被用于制备药物。27.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，而所述对象是具有t(4;14)染色体易位的多发性骨髓瘤患者。28.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤表达成纤维细胞生长因子受体3。29.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述多发性骨髓瘤已经转移到患者的骨中。30.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是多发性骨髓瘤，所述对象是多发性骨髓瘤患者，且所述患者是人。31.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症是急性骨髓性白血病，且所述对象是急性骨髓性白血病患者。32.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症是血液肿瘤。33.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症是实体瘤。34.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述肿瘤已经转移到对象的骨中。35.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述对象患有乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌，和/或所述肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌。36.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是前列腺癌，而所述对象是前列腺癌患者。37.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述前列腺癌已经转移到患者的骨中。38.如权利要求23-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症是前列腺癌，所述对象是前列腺癌患者，且所述患者是人。39.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述第二药剂用于治疗骨质疏松。40.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述第二药剂是二膦酸盐。41.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述第二药剂是抗癌药。全文摘要治疗转移癌如转移瘤的方法，该方法包括给予对象结构I的化合物、该化合物的互变异构体、该化合物的药学上可接受的盐、该互变异构体的药学上可接受的盐、或其混合物。所述化合物、互变异构体、该化合物的盐、该互变异构体的盐、或其混合物可用于制备治疗转移癌的药物。变量A具有文中定义的值。文档编号A61K31/497GK101146538SQ200680009463公开日2008年3月19日申请日期2006年1月27日优先权日2005年1月27日发明者C·海斯,D·洛佩兹德门尼泽斯,辛小华申请人:诺华疫苗和诊断公司