速效胰岛素的鼻内施用的制作方法

专利名称：速效胰岛素的鼻内施用的制作方法
专利说明速效胰岛素的鼻内施用
背景技术：
胰岛素是一种重要的葡萄糖调节多肽激素。它是通过胰腺分泌的天然生成的激素。体内细胞需要胰岛素来除去和使用血中的葡萄糖。葡萄糖使细胞生成所需能量以进行细胞的功能。此外，作为碳水化合物稳态的原发性效应物(primary effector)，胰岛素对脂肪代谢有影响。它能改变肝脏释放脂肪储备的能力。胰岛素有各种贯穿全身的药效作用。
研究人员于1922年首次向年轻的糖尿病患者给予含有胰岛素的胰腺活性提取物，并且FDA于1939年首次批准胰岛素。目前，用于治疗的胰岛素来源于牛和猪的胰腺以及重组(人)技术。第一个重组人胰岛素于1982年获FDA批准。
胰岛素在医学上用于某些形式的糖尿病。糖尿病患者没有能力摄取和使用血液的葡萄糖，因而血中的葡萄糖水平升高。在1型糖尿病中，胰腺不能产生足够的胰岛素。因此，需要胰岛素治疗。在2型糖尿病中，患者产生胰岛素，但遍布全身的细胞不能对胰岛素正常地反映。然而，胰岛素也可用于2型糖尿病以克服对胰岛素的细胞抗性。通过增加葡萄糖的细胞摄取和降低血液的葡萄糖浓度，胰岛素预防或减少糖尿病的长期并发症，包括对血管、眼睛、肾脏和神经的损害。胰岛素通常通过皮肤下(皮下)注射施用。优选为腹部的皮下组织，因为胰岛素在这个位置的吸收比其他位置的皮下组织更稳定(consistent)。
当胰岛素首次被发现、并用于糖尿病患者时，仅有一种短效胰岛素。这需要每天注射数次。随着时间推移，开发出持续更长时间的新胰岛素，只需更少次数的注射，但需要严格注意进餐时间。现在，有不同类型的胰岛素可用。这使在施用的次数和时间上更灵活，且更容易保持靶血糖水平，基于患者的生活方式。胰岛素可以不同的形式使用，例如速效、中效和长效。胰岛素通常经皮下注射递送。可使用其他选择如泵递送、以及近来的肺部递送。
用重组DNA技术制备的一些胰岛素类似物可供临床使用。在这些药物中有门冬胰岛素(NovoLogTM；Novo Nordisk Pharmaceuticals)，其与常规人胰岛素类似，除在B28位置上天冬氨酸单取代脯氨酸之外。这种单取代减少了该分子形成六聚体的趋势。因此，门冬胰岛素在皮下注射后能被更快速地吸收，且比短效胰岛素起效更快，效应持续时间更短。
胰岛素混合物也特别用于2型糖尿病患者。胰岛素混合物允许用不同类型的胰岛素以一种组合施用进行治疗。
可注射的胰岛素有三种不同的形式瓶子、预填充的注射器和药筒(cartridges)。该药筒在使注射简单化的笔型装置中使用。人重组胰岛素、赖脯胰岛素(insulin lispro)、门冬胰岛素(insulin aspart)和甘精胰岛素(insulin glargine)都是常用的胰岛素。很少使用牛胰岛素和猪胰岛素。常规人胰岛素(Novolin R；Humulin R)以瓶子、药筒以及预填充的注射器供应。
NPH人胰岛素(Novolin N；Humulin N)以瓶子、药筒以及预填充的注射器供应。70％NPH人胰岛素和30％常规人胰岛素(Novolin 70/30；Humulin 70/30)的混合物以瓶子、药筒以及预填充的注射器供应。
50％NPH人胰岛素和50％常规人胰岛素(Humulin 50/50)的混合物以瓶子供应。慢人胰岛素(Lente human insulin)(Novolin L；Humulin L)以瓶子供应。超慢人胰岛素(Ultralente human insulin)(Humulin U)以瓶子供应。赖脯胰岛素(Humalog)以瓶子和药筒供应。门冬胰岛素(Novolog)以瓶子和药筒供应。甘精胰岛素(Lantus)以瓶子和药筒供应。
胰岛素的单体形式包括胰岛素同系物，且已知为速效的，如赖谷胰岛素(LysB3；GluB29)、HMR-1153(LysB3；IleB28)、HMR-1423(GlyA21、HisB31、HisB32)、门冬胰岛素(AspB28)或(AspB10)、赖脯胰岛素(LysB28、ProB29)。上述的每个例子中，类似物的命名法是基于氨基酸在胰岛素A链或B链上特定位置取代的描述，并从该链N-末端编号，其中该序列的剩余部分为天然人胰岛素的剩余部分。
已描述速效胰岛素的干粉制剂用于肺部递送，所述干粉制剂包括具有天然人胰岛素的氨基酸序列(美国专利第6,737,045号)的胰岛素。这需要进一步开发包括速效胰岛素的药物制剂，即能在60分钟内提供峰值血清水平和在90分钟内提供葡萄糖谷值血清水平的药物制剂。
有数种选择可用于接受胰岛素注射的患者。胰岛素可手动注射，或可借助称为胰岛素泵的小型电输注装置输注至体内。注射器可能是最常用的和最具成本效益的选择，且对于接受混合在一起的两种类型胰岛素的患者而言是有用的。注射器的替代品是胰岛素笔，其用胰岛素预填充，可以是一次性的或可重复用的(用一次性的胰岛素药筒)。该装置类似于大号的笔，其中帽下有细针，而在另一端有柱塞。刻度(dial)允许使用者调整剂量。胰岛素笔也可供给最常开处方的各类型胰岛素的混合物，如70/30(NPH和常规胰岛素)。有些患者优选笔而不是注射器，因为笔携带和使用方便。
另一个称作胰岛素喷射注射器(jet injector)的装置是通过使用高压空气射流工作以传送胰岛素的精细喷雾穿过皮肤。这对那些害怕针头的患者是个不错的选择。然而，喷射注射器需要不菲的资金投入，且不总在保险涵盖的范围内。
胰岛素泵可以是控制某些1型糖尿病患者的更有效的方式，由于其更近似地模拟胰腺的胰岛素生成。胰岛素泵是紧凑的电装置，其连接有输注套件(或管)，所述输注套件全天对患者施用少量且稳定流量(称为“基础速率”)的胰岛素。进餐前，泵使用者将该泵编程以递送速效胰岛素“追加量”从而掩盖进餐后血糖水平相应的升高。泵流量也可通过使用者根据需要全天手动调整。
葡萄糖调节肽是已显示对治疗胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、妊娠期糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、肥胖症和血脂异常有治疗潜力的一类肽。参见美国专利第6,506,724号；美国专利申请公开第20030036504A1号；欧洲专利第EP 1083924B1号；国际专利申请公开第WO 98/30231A1号；和国际专利申请第WO 00/73331A2号。除胰岛素和胰岛素类似物之外，葡萄糖调节肽包括胰高血糖素样肽、GLP如GLP-1、Exendins(特别是Exendin-4，也称为艾塞那肽(Exenatide))以及支链淀粉肽和支链淀粉类似物如普兰林肽。迄今为止，已通过注射对人施用这些肽。
因而，需要开发除通过注射之外施用葡萄糖调节肽(特别是速效胰岛素)的药物制剂。



附图1兔子研究1比较单独PDF与PDF和吐温的制剂的PK结果； 附图2兔子研究2比较PDF和吐温的制剂IN施用与NovoLog SQ施用的PK结果； 附图3比较IN对照组、IN PDF、IN PDF和吐温、IV和SC制剂葡萄糖％(Log线性范围)的兔子研究1的PD结果； 附图4比较研究1与研究2自初始起葡萄糖％数据的PD结果(线性图)； 附图5临床前研究3中给药组自初始起葡萄糖％的PD数据(线性图)； 附图6比较IN PDF和吐温(有和没有DDPC)、SC PDF和SC对照制剂的临床前研究3给药组的PK数据； 附图7比较含有0.2％明胶或PG的IN PDF和吐温(有和没有DDPC)的临床前研究4给药组的PD数据； 附图8比较含有0.2％明胶或PG的IN PDF和吐温(有和没有DDPC)、TDM低渗、TDM等渗、口服PDF(有和没有PG和/或DDPC)、SC对照组的临床前研究4给药组的PK数据； 附图9使用增粘剂制剂(明胶、HPMC、MC、卡波姆和CMC)的所有给药组自初始起葡萄糖％的PD数据；和 附图10使用增粘剂制剂(明胶、HPMC、MC、卡波姆和CMC)的所有给药组的PK数据。
发明描述 为更好地理解本发明，提供下述定义 胰岛素和胰岛素类似物 目前发明主要集中在鼻内施用速效胰岛素，其能在60分钟内提供峰值血清水平和在90分钟内提供葡萄糖谷值血清水平。根据本发明，葡萄糖调节肽也包括游离碱、酸加成盐或金属盐(如所述肽的钾盐或钠盐)和通过下述方法修饰的肽如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化、环化和其他公众已知的共价修饰方法。
如本文所使用的术语“人胰岛素”包括重组的人胰岛素。
药学上可接受的盐包括无机酸盐、有机胺盐、有机酸盐、碱土金属盐和其混合物。药学上可接受的盐合适的例子包括但不限于卤化物、氨基葡萄糖、烷基氨基葡萄糖、硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、氢溴酸盐、N，N’-二苄基乙二胺、三乙醇胺、二乙醇胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、二环己胺、磷酸盐、硫酸盐、磺酸盐、苯甲酸盐、乙酸盐、水杨酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、富马酸盐、硬脂酸盐及其混合物。
因而，根据本发明，上述肽及其混合物结合至适用于透粘膜递送(特别是鼻内递送)的药物制剂。
肽类似物和模拟物(Mimetics) 包括在用于本发明的生物活性肽的定义中有天然的或合成的、治疗活性的或预防活性的肽(包括两个或两个以上共价连接的氨基酸)、蛋白质、肽或蛋白质片段、肽或蛋白质类似物、以及活性肽或蛋白质经化学修饰的衍生物或盐。多种葡萄糖调节肽的有用类似物和模拟物被包括用于本发明，且可根据已知方法制备并测试生物活性。经常，用于本发明的葡萄糖调节肽的肽或蛋白质、或其他生物活性肽或蛋白质是突变蛋白，其可通过部分置换、添加或缺失天然生成的或天然的(例如野生型的、天然生成的突变体或等位基因变异体)肽或蛋白质序列的氨基酸而容易地获得。此外，包括天然的肽或蛋白质的生物活性片段。这些突变体衍生物和片段基本上保留了该天然肽或蛋白质的希望的生物活性。在含有碳水化合物链的肽或蛋白质的情况下，通过在这些碳水化合物种类上的变化标记的生物活性变异体也包括于本发明中。
如本文所使用的术语“保守性氨基酸置换”是指具有相似侧链的氨基酸残基的通用互换性(general interchangeability)。例如，一组通用可互换的具有脂肪族侧链的氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。保守性置换的例子包括非极性(疏水性)残基对另一个残基的置换，所述非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。同样地，本发明包括极性(亲水性)残基的置换，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、以及苏氨酸和丝氨酸之间。此外，也包括碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或谷氨酸)对另一个残基的置换，或酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)对另一个残基的置换。示例性的保守性氨基酸置换基团为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷酰胺。通过肽或蛋白质类似物最优地与相应的天然肽或蛋白质比对，并通过使用合适的分析法如粘附蛋白或受体结合分析法，以检测选择的生物活性，本领域技术人员可容易地鉴别用于本发明方法和组合物的可操作的肽和蛋白质类似物。可操作的肽和蛋白质类似物通常与随相应的天然肽或蛋白质增加的抗体有特异性的免疫反应性。
粘膜递送增强剂 “粘膜递送增强剂”定义为下述的化学品和其他赋形剂，当其加至含有水、盐和/或常用缓冲剂的制剂时，葡萄糖调节肽(对照制剂)产生如下制剂其能有效地增加葡萄糖调节肽的跨粘膜转运，如在浓度对时间的图(plot)中通过最大血液、血清或脑脊液浓度(Cmax)或通过曲线下面积(AUC)测量。粘膜包括鼻、口腔、肠腔、颊、支气管肺、阴道和直肠的粘膜表面，以及实际上包括衬砌(lining)在所有与外部相通的体腔或通道的所有分泌粘液的膜。粘膜递送增强剂有时称为“载体”。
“无内毒素的制剂”是指包括葡萄糖调节肽和一种或多种粘膜递送增强剂的制剂，所述粘膜递送增强剂基本上没有内毒素和/或相关的热原物质。内毒素包括禁闭(confined)在微生物中的毒素，且只有当该微生物被破坏或死去时才释放。热原物质包括来自细菌和其他微生物外膜的引起发热的热稳定物质(糖蛋白)。如果对人施用，这些物质都能引起发热、低血压和休克。生产无内毒素的制剂需要特殊的装备、专家技术人员，且比制备非无内毒素的制剂明显地更昂贵。因为在对啮齿动物输注内毒素的同时静脉内施用GLP或糊精，已显示能预防与单独施用内毒素相关的低血压甚至死亡(美国专利第4,839,343号)，所以并未预期到生产这些和其他葡萄糖调节肽治疗剂的无内毒素制剂对非肠道外(非注射)施用是必需的。
非输注施用 “非输注施用”是指不涉及直接注射入动脉或静脉的任何递送方法，即推动或驱使(通常为流体)至某处的方法，特别是借助针、注射器或其他侵入性(invasive)方法引入至身体部位。非输注施用包括皮下注射、肌内注射、腹腔注射和递送至粘膜的非注射方法。
递送的方法和组合物 对哺乳动物受治疗者粘膜施用葡萄糖调节肽的改进方法和组合物优化了葡萄糖调节肽的剂量时间表。本发明提供了与一种或多种粘膜递送增强剂配制的葡萄糖调节肽的粘膜递送，其中葡萄糖调节肽剂量释放在粘膜施用后基本上正常化和/或在葡萄糖调节肽的有效递送期间持续释放，其持续释放的范围从约0.1-2.0小时；0.4-1.5小时；0.7-1.5小时；或0.8-1.0小时。通过利用本发明方法和组合物的外源性葡萄糖调节肽的重复施用，可促进所达到的葡萄糖调节肽的持续释放。对哺乳动物受治疗者粘膜施用葡萄糖调节肽的改进组合物和方法优化了葡萄糖调节肽的剂量时间表。本发明提供了改进的粘膜(如鼻)递送制剂，所述制剂包括与一种或多种粘膜递送增强剂和一种或多种任选的持续释放增强剂组合的葡萄糖调节肽。本发明的粘膜递送增强剂在递送中产生有效的增加，例如增加最大血浆浓度(Cmax)以增强粘膜施用的葡萄糖调节肽的治疗活性。在血浆中和CNS中影响葡萄糖调节肽的治疗活性的第二个因素是停留时间(RT)。与鼻内递送增强剂组合的持续释放增强剂增加了Cmax以及延长了葡萄糖调节肽的停留时间(RT)。本文公开了聚合物递送运载体(vihicle)和其他试剂，例如聚乙二醇(PEG)，以及本发明产生增强持续释放的制剂的方法。
本发明提供改进的葡萄糖调节肽递送方法和剂型，其用于治疗与下述疾病或病症相关的症状包括糖尿病、高血糖、血脂异常、诱导个体的饱腹感、促进个体的体重减轻、肥胖症、结肠癌、前列腺癌、或哺乳动物受治疗者的其他癌症。
在本发明的粘膜递送制剂和方法中，葡萄糖调节肽经常与适用于粘膜递送的载体或运载体组合或协同施用。如本文所使用的术语“载体”是指药学上可接受的固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料。含水的液体载体可包括药学上可接受的添加剂，如酸化剂、碱化剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、保湿剂、溶剂、悬浮剂和/或增粘剂、等张剂(tonicity agent)、润湿剂或其他生物相容性材料。上述种类所列的成分列表(tabulation)可参见U.S.Pharmacopeia National Formulary，1857-1859，1990。能用作药学上可接受的载体的材料的一些例子有糖(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯)、粉末状的西黄蓍胶、麦芽糖、明胶、滑石粉、赋形剂(如可可脂、栓剂蜡)、油(如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、二醇(如丙二醇)、多元醇(如丙三醇、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇)、酯(如油酸乙酯、月桂酸乙酯)、琼脂、缓冲剂(如氢氧化镁和氢氧化铝)、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏(Ringer’)液、乙醇和磷酸盐缓冲液、和其他在药物制剂中使用的非毒性可相容的物质及其混合物。
因而，保湿剂的一些例子包括丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、多元醇、聚合多元醇、乳酸、脲及其混合物。
缓冲剂和缓冲盐的一些例子是基于谷氨酸盐、乙酸盐、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、乳酸盐、甲酸盐、乙醇酸盐及其混合物。
根据制剂人员的希望，润湿剂、乳化剂和润滑剂(如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂(release agent)、包衣剂、增甜剂、调味剂和增香剂(perfuming agent)、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括水溶性抗氧化剂如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及其混合物。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分量随着施用的特定方式而改变。
在本发明的粘膜递送组合物和方法中，不同的递送增强剂可用来增强葡萄糖调节肽递送进入或跨过粘膜表面。在这方面中，递送葡萄糖调节肽跨过粘膜上皮细胞可“跨细胞”或“细胞旁”发生。这些通道对该葡萄糖调节肽的总通量(overall flux)和生物利用度贡献的程度，取决于粘膜的环境、活性剂的物理化学性质和该粘膜上皮细胞的性质。细胞旁转运只涉及被动扩散，而跨细胞转运通过被动、易化或主动过程发生。通常，亲水性的、被动转运的、极性溶质通过细胞旁路径扩散，而更多的亲脂性溶质使用跨细胞路径。就本发明任何选定的葡萄糖调节肽的细胞旁和跨细胞递送组分而言，各种被动吸收和主动吸收的溶质的吸收和生物利用度(例如，通过渗透系数或生理分析来反映)可容易地评价。对被动吸收的药物，细胞旁和跨细胞通道对药物转运的相对贡献取决于pKa、分配系数、分子半径、药物的电荷、递送药物的腔环境pH以及吸收表面积。细胞旁的路径代表鼻粘膜上皮细胞可接近的表面积相对小的部分。大体上讲，已报道细胞膜所占的粘膜表面积比细胞旁空间所占的面积大一千倍。因此，更小的可接近的面积、以及基于大小和电荷的辨别大分子渗透，表明该细胞旁路径与药物转运的跨细胞递送相比通常是个不太有利的路径。令人惊奇的是，本发明的方法和组合物提供了显著增强的生物治疗药物经由所述细胞旁路径进入和跨过粘膜上皮细胞的转运。因此，本发明的方法和组合物成功地靶向细胞旁和跨细胞的路径，可选地在单一方法或组合物中。
如本文所使用的“粘膜递送增强剂”包括的试剂能增强葡萄糖调节肽或其他生物活性化合物的释放或溶解性(例如，从制剂递送运载体)、扩散速率、渗透能力和定时、摄取、停留时间、稳定性、有效半衰期、峰值或持续的浓度水平、清除率以及其他希望的粘膜递送特征(例如，在递送部位或在选择的活性目标部位如血流或中枢神经系统测量)。因而增强粘膜递送可通过任何的各种机理发生，例如通过增强葡萄糖调节肽的扩散、转运、持久性或稳定性、以及提高膜流动性、调控钙和其他调整细胞内或细胞旁渗透的离子的有效性或作用、增溶粘膜的组成(如脂质)、改变在粘膜组织中的非蛋白质和蛋白质巯基水平、增加跨过该粘膜表面的水流量、调控上皮细胞的连接生理学、减少上覆(overlying)于该粘膜上皮细胞的粘液粘度、减少粘液纤毛清除率和其他机理。
如本文所使用的“葡萄糖调节肽的粘膜有效量”包括葡萄糖调节肽的有效粘膜递送至受治疗者中药物活性的靶部位，其可能涉及各种递送或转运路径。例如，给定的活性剂可通过粘膜细胞之间的间隙找到路，并到达相邻的血管壁，同时通过另一条路径该活性剂被动或主动地，可被摄取进入粘膜细胞以在细胞内作用，或可被排出或被转运出细胞以到达第二个靶部位如全身性循环。本发明的方法和组合物沿着一种或多种这样选择性的路径促进活性剂的易位(translocation)，或可直接作用在该粘膜组织或近端的血管组织上以促进该活性剂的吸收或渗透。本文中吸收或渗透的促进作用并不限于这些机理。
本文所使用的“葡萄糖调节肽在血浆中的峰值浓度(Cmax)”、“葡萄糖调节肽在血浆中浓度对时间的曲线下面积(AUC)”、“葡萄糖调节肽在血浆中达到最大血浆浓度的时间(tmax)”都是本领域技术人员已知的药代动力学参数。Laursen等人，Eur.J.Endocrinology 135309-315，1996。“浓度对时间曲线”测量对受治疗者通过鼻内、肌内、皮下或其他肠道外施用路径施用一定剂量的葡萄糖调节肽后，葡萄糖调节肽在受治疗者血清中与时间相对的浓度。“Cmax”是在对受治疗者施用单一剂量的葡萄糖调节肽后，葡萄糖调节肽在受治疗者血清中的最大浓度。“tmax”是在对受治疗者施用单一剂量的葡萄糖调节肽后，到达葡萄糖调节肽在受治疗者血清中的最大浓度的时间。
如本文所使用的“葡萄糖调节肽在血浆中浓度对时间的曲线下面积(AUC)”根据线性梯形法则以及加上残留面积计算。检测到在两个剂量之间减少23％或增加30％的概率是90％(型II误差β＝10％)。通过比较达到最大浓度(Cmax)的时间(tmax)来评价“递送速率”或“吸收速率”。Cmax和tmax都使用非参数方法来分析。比较肌内、皮下、静脉内和鼻内葡萄糖调节肽施用的药代动力学通过方差分析(ANOVA)来进行。对于成对比较，Bonferroni-Holmes序贯方法用于评价显著性。通过回归分析评价在三种鼻剂量之间剂量-反应的联系。认为P＜0.05时有显著性。所给的结果为平均值+/-SEM。
尽管促进吸收的机理可随本发明不同的粘膜递送增强剂而改变，然而本文中的有用试剂基本上没有不利地影响该粘膜组织，并根据特殊的葡萄糖调节肽或其他活性或递送增强剂而选择。在本文中，增加粘膜组织的穿透或渗透性的递送增强剂经常导致该粘膜的保护性渗透性屏障有些改变。对于这些在本发明中有价值的递送增强剂，通常认为在该粘膜的渗透性中任何显著的改变，在适于药物递送的所需期间的时限之内是可逆的。而且，这应该不是实质的、蓄积的毒性，也不是在长期使用该粘膜的屏障性质中诱发的任何长久有害的变化。
本发明的某些方面中，与本发明的葡萄糖调节肽协同施用或组合制剂的吸收促进剂选自小的亲水性分子，包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙醇、丙二醇和2-吡咯烷酮。或者，长链两亲性分子如去乙酰甲基亚砜、氮酮、十二烷基硫酸钠、油酸和胆汁盐可用来促进葡萄糖调节肽的粘膜渗透。在其他方面表面活性剂(如聚山梨酯)用作辅助的化合物、处理剂(processing agents)或制剂添加剂以促进鼻内递送葡萄糖调节肽。如果在递送环境中以足够高的浓度存在(例如，通过在治疗制剂中预先施用或结合)，这些试剂如DMSO、聚乙二醇和乙醇能进入粘膜的水相、改变粘膜的增溶性质，由此增加葡萄糖调节肽从所述运载体至该粘膜的分配。
因此，增溶剂的一些例子包括环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、甲基-β-环糊精以及其混合物。
用于本发明的协同施用和制备方法和组合制剂中的其他粘膜递送增强剂包括但不限于混合胶束；烯胺；一氧化氮供体(如S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉素胺、NOR1、NOR4-优选这些与NO清除剂如羧基-PITO或双氯芬酸钠(doclofenac sodium)共同施用)；水杨酸钠；乙酰乙酸的甘油酯(如1，3-二乙酰乙酸甘油酯或3-乙酰乙酸1，2-异亚丙基甘油酯)；和其他释放-扩散、或上皮细胞内或跨上皮细胞的渗透促进剂，所述渗透促进剂对粘膜递送是生理上相容的。其他吸收促进剂选自增强葡萄糖调节肽的粘膜递送、稳定性、活性或跨上皮细胞渗透的各种载体、基质和赋形剂。这些尤其包括环糊精和β-环糊精衍生物(例如2-羟丙基-β-环糊精和七(2，6-二氧-甲基-β-环糊精))。这些化合物，任选地与一种或多种活性成分共轭和进一步任选地在油质性基质中配制，提高了本发明粘膜制剂的生物利用度。然而，适用于粘膜递送的其他吸收增强剂包括中链脂肪酸，其包括单甘油酯和甘油二酯(如癸酸钠--椰子油的提取物，Capmul)和甘油三酯(如淀粉糊精、Estaram299、Miglyol 810)。
本发明的粘膜治疗和预防的组合物可用任何适合的渗透促进剂补充，所述的渗透促进剂促进葡萄糖调节肽跨过粘膜屏障的吸收、扩散或渗透。所述渗透促进剂(promoter)可以是任何药学上可接受的促进剂。因此，在本发明更详细的方面，提供了组合物，所述组合物结合一种或多种选自下述的渗透促进剂水杨酸钠和水杨酸衍生物(乙酰水杨酸盐、胆碱水杨酸盐、水杨酰胺等)；氨基酸及其盐(例如单氨基羧酸，如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸等；羟基氨基酸，如丝氨酸；酸性氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸等；和碱性氨基酸，如赖氨酸等-包括它们的碱金属盐或碱土金属盐)；和N-乙酰氨基酸(N-乙酰丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甘氨酸、N-乙酰赖氨酸、N-乙酰谷氨酸、N-乙酰脯氨酸、N-乙酰羟基脯氨酸等)以及它们的盐(碱金属盐和碱土金属盐)。也提供了本发明的方法和组合物中作为渗透促进剂的物质，其通常用作乳化剂(例如油基磷酸钠、月桂基磷酸钠、月桂基硫酸钠、肉豆蔻基硫酸钠、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯等)、己酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸以及其碱金属盐、吡咯烷酮羧酸、烷基吡咯烷酮羧酸酯、N-烷基吡咯烷酮、脯氨酸酰基酯等。
在本发明的不同方面，提供了改进的鼻粘膜递送制剂和方法，其允许葡萄糖调节肽和本发明的其他治疗药物递送跨过施用和所选靶部位之间的粘膜屏障。某些制剂特别适用于所选的靶细胞、组织或器官、或甚至特殊的疾病状态。在其他方面，制剂和方法提供了葡萄糖调节肽有效的、选择性的胞吞作用或转胞吞作用(transcytosis)，所述葡萄糖调节肽的特异性路线是沿着指定的细胞内或细胞间通道。通常，该葡萄糖调节肽以有效的浓度水平被有效地加载至载体或其他递送运载体中，并被递送且以稳定的形式保持，如在鼻粘膜和/或在穿过细胞内的室和膜至药物作用的远程靶部位(例如血流或指定的组织、器官或细胞外的室)期间。所述葡萄糖调节肽可以在递送运载体中提供或另外进行修饰(例如，以前药的形式)，其中该葡萄糖调节肽的释放或活化通过生理的刺激物(例如pH变化、溶酶体酶等)触发。经常，该葡萄糖调节肽为药理学上惰性直到它到达活性靶部位。在最多的例子中，所述葡萄糖调节肽和其他制剂组分为非毒性、且非免疫原性。在本文中，通常选择载体和其他制剂组分是根据它们在生理条件下快速降解和排泄的能力。同时，因有效贮存，制剂在剂型中化学和物理稳定。本发明提供了各种有效控制水含量以提高蛋白质稳定性的添加剂、稀释剂、基质和递送运载体。这些在这种意义上有效地用作抗聚集剂的试剂和载体材料包括例如不同官能的聚合物，如聚乙二醇、葡聚糖、二乙氨基乙基葡聚糖和羧甲基纤维素，其显著地提高稳定性，且减少与其混合或与其连接的肽和蛋白质的固相聚集。在一些例子中，蛋白质的活性或物理稳定性也能通过将不同的添加剂加至所述肽或蛋白质药物的水溶液中而得到提高。例如，可以使用添加剂如多元醇(包括糖)、氨基酸、蛋白质(如胶原和明胶)以及不同的盐。
某些添加剂，特别是糖和其他多元醇，也能给予干燥如冻干的蛋白质显著的物理稳定性。这些添加剂不仅在冻干期间而且在干燥状态的贮存期间，均可用于本发明以保护蛋白质抗聚集。例如，蔗糖和Ficoll 70(带有蔗糖单位的聚合物)在不同条件下的固相培养期间显示出抗肽或蛋白质聚集的显著的保护作用。这些添加剂也可提高嵌入聚合物基体内的固体蛋白质的稳定性。
然而，其他的添加剂如蔗糖稳定蛋白质以抵抗于升高的温度在潮湿环境中的固态聚集，如在本发明某些缓释制剂中可能发生。蛋白质如明胶和胶原，也用作稳定剂或增量剂(bulking agent)以减少本文中不稳定蛋白质的变性和聚集。这些添加剂可结合至本发明的聚合物熔解过程和组合物。例如多肽微粒可通过将含有上述不同稳定添加剂的溶液简单冻干或喷雾干燥来制备。未聚集的肽和蛋白质可由此在延长的时间周期内获得持续释放。
本文提供了不同的其他制备的组分和方法、以及具体的制剂添加剂，其产生用于易聚集的肽和蛋白质粘膜递送的制剂，其中所述肽或蛋白质通过使用增溶剂以基本上纯净且未聚集的形式稳定。多种组分和添加剂被预期用于这些方法和制剂。这些增溶剂的示例是环糊精(CD)，其选择性地结合多肽的疏水侧链。已发现这些CD以明显地抑制聚集的方式结合蛋白质的疏水斑(patches)。这种抑制相对于涉及的CD和蛋白质是选择性的。这种蛋白质聚集的选择性抑制提供了本发明的鼻内递送方法和组合物的其他优势。用于本文的其他试剂包括CD二聚体、三聚体和四聚体，其具有特异性阻断肽和蛋白质聚集的连接体(linker)控制的可变化几何结构。然而，本发明结合的增溶剂和方法涉及选择性地阻断蛋白质与蛋白质相互作用的肽和肽模拟物的使用。在一个方面，经由使用类似地阻断蛋白质聚集的肽和肽模拟物，报道的CD多聚体与疏水性侧链的特异性结合扩展至蛋白质。范围广泛的合适方法和抗聚集剂可用于结合入本发明的组合物和方法。
电荷修饰和pH控制剂和方法 为改进增强递送跨过疏水粘膜屏障的生物活性剂(其包括葡萄糖调节肽、其他活性肽和蛋白质、以及大分子和小分子药物)的转运特征，本发明也提供用于所选的生物活性剂或本文所述递送增强剂的电荷修饰的技术和试剂。在这个方面，大分子的相对渗透性通常与它们的分配系数相关。分子的离子化程度取决于分子的pKa和在粘膜表面的pH，并也影响该分子的渗透性。生物活性剂(包括本发明的葡萄糖调节肽和类似物)粘膜递送的渗透和分配可通过该活性剂或透化剂(permeabilizing agent)的电荷改变或电荷扩散而促进，例如这通过改变荷电的官能团、通过调节递送运载体或递送该活性剂的溶液pH、或通过改变电荷或改变pH的试剂与该活性剂协同施用而实现。
与这些通常的教导相一致，当该活性剂以基本上非离子或中性的、荷电状态递送至粘膜表面时，实质上改进了粘膜递送本发明方法和组合物中荷电的大分子种类(包括葡萄糖调节肽和其他生物活性肽和蛋白质)。
用于本发明的粘膜制剂的某些葡萄糖调节肽和其他生物活性肽和蛋白质组分将被荷电修饰以使所述肽或蛋白质的正电荷密度升高。这些修饰也可扩展至本文所公开的肽和蛋白质共轭物、载体和其他递送形式的阳离子化。阳离子化提供了改变本发明的蛋白质和大分子的生物分布和转运性质的便捷的方式。以基本上维持该活性剂的生物活性且潜在地限制不良副作用(包括组织损害和毒性)的方式进行阳离子化。
“缓冲剂”通常用于使溶液的pH保持在接近恒定的值。甚至当少量强酸或强碱加至该溶液中时，通过预防或消除氢离子和氢氧根离子的大的浓度改变，缓冲剂保持溶液的pH。缓冲剂通常由弱酸和其适当的盐(或弱碱和其适当的盐)组成。弱酸适当的盐包括如弱酸中存在的相同阴离子(参见Lagowski，Macmillan Encyclopedia of Chemistry，第一卷，Simon和Schuster，New York，1997，第273-4页)。Henderson-Hasselbach方程式pH＝pKa+log10[A-]/[HA]用于描述缓冲剂，且基于弱酸解离的标准方程式

。常用的缓冲剂源的例子包括下述乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乳酸盐、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸盐、蛋氨酸、甲酸盐、乙醇酸盐。
“缓冲容量”是指在明显的pH变化发生之前可加至缓冲溶液的酸或碱的量。如果pH值位于弱酸pK-1和pK+1的范围之内，则该缓冲容量是可观的，但是如在该范围之外，该缓冲容量则下落至很小的值。因此，给定的系统只在弱酸(或弱碱)的pK每侧一个pH单位的范围中有可用的缓冲作用(参见Dawson，Data for Biochemical Research，第三版，Oxford SciencePublications，1986年，第419页)。通常，选择合适的浓度以使该溶液的pH与所述弱酸(或弱碱)的pKa相接近(参见Lide，CRC Handbook ofChemistry and Physics，第86版，Taylor和Francis Group，2005-2006，第2-41页)。此外，强酸和强碱的溶液通常不分类为缓冲溶液，且它们不显示在pH值2.4-11.6之间的缓冲容量。
降解酶抑制剂和方法 另一个可包括于跨粘膜制剂的赋形剂是降解酶抑制剂。示例性的可用于本发明粘膜递送制剂和方法的粘膜粘附聚合物酶抑制剂络合物包括，但不限于羧甲基纤维素-胃蛋白酶抑制剂(具有抗胃蛋白酶活性)；聚(丙烯酸)-Bowman-Brik抑制剂(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-糜蛋白酶抑制剂(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-弹性蛋白酶抑制剂(抗弹性蛋白酶)；羧甲基纤维素-弹性蛋白酶抑制剂(抗弹性蛋白酶)；聚卡波菲-弹性蛋白酶抑制剂(抗弹性蛋白酶)；壳聚糖-木瓜蛋白酶抑制剂(抗胰蛋白酶)；聚(丙烯酸)-杆菌肽(抗氨肽酶N)；壳聚糖-EDTA(抗氨肽酶N、抗羧肽酶A)；壳聚糖-EDTA-木瓜蛋白酶抑制剂(抗胰蛋白酶、抗糜蛋白酶、抗弹性蛋白酶)。如下文更详细地描述，本发明的某些实施方案任选地结合新型壳聚糖衍生物或壳聚糖的化学修饰形式。一种用于本发明的这类新型衍生物表示为β-[1→4]-2-胍基-2-去氧-D-葡萄糖聚合物(聚-GuD)。
任何抑制酶的活性以保护生物活性剂的抑制剂可有用地用于本发明的组合物和方法。例如，用于保护生物活性的蛋白质和肽的有用的酶抑制剂包括大豆胰蛋白酶抑制剂、exendin胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、马铃薯(solanum tuberosum L.)块茎中分离的胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂。可使用抑制剂的组合或混合物。用于本发明的蛋白水解酶的其他抑制剂包括卵类粘蛋白酶、甲磺酸加贝酯(gabaxate mesylate)、α-抗胰蛋白酶、抑肽酶、抑氨肽酶A素(amastatin)、抑氨肽酶B素(bestatin)、嘌呤霉素、杆菌肽、亮肽素(leupepsin)、α2-巨球蛋白、胃蛋白酶抑制剂、蛋清或大豆胰蛋白酶抑制剂。这些和其他抑制剂能单独或组合使用。所述抑制剂在与该生物活性剂的组合或在分别施用(例如预先施用)的制剂中，可以结合至或结合于载体例如亲水聚合物，所述载体包衣在接触该鼻粘膜的剂型表面或结合在该表面的浅层。
抑制剂如任选地结合至本发明组合物的蛋白水解酶抑制剂的量随下述因素而变化(a)具体抑制剂的性质；(b)存在于该分子(其可反应以引进与水凝胶形成单体共聚所需的烯基不饱和度)中的官能团的数目；和(c)存在于抑制剂分子的凝集素基团如糖苷的数目。这也取决于预期施用的具体治疗剂。通常而言，酶抑制剂的有用量从所述制剂量的约0.1mg/ml至约50mg/ml，经常从约0.2mg/ml至约25mg/ml，更通常从约0.5mg/ml至5mg/ml(即单一的蛋白酶抑制剂制剂或与抑制剂和生物活性剂的组合制剂)。
在胰蛋白酶抑制剂的情况下，合适的抑制剂可选自例如抑肽酶、BBI、大豆胰蛋白酶抑制剂、鸡卵类粘蛋白、鸡卵抑制剂、人exendin胰蛋白酶抑制剂、甲磺酸卡莫司他、黄酮抑制剂、木瓜蛋白酶抑制剂、亮肽素、对氨基苯甲咪、AEBSF、TLCK(甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮)、APMSF、DFP、PMSF和聚(丙烯酸酯)衍生物。在糜蛋白酶抑制剂的情况下，合适的抑制剂可选自例如抑肽酶、BBI、大豆胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、苄氧基羰基-Pro-Phe-CHO、FK-448、鸡卵抑制剂、糖二苯基硼酸络合物、DFP、PMSF、β-苯基丙酸酯和聚(丙烯酸酯)衍生物。在弹性蛋白酶抑制剂的情况下，合适的抑制剂可选自例如弹性蛋白酶抑制剂、甲氧基丁二酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮(MPCMK)、BBI、大豆胰蛋白酶抑制剂、鸡卵抑制剂、DFP和PMSF。
用于本发明的其他酶抑制剂选自范围广泛的非蛋白质抑制剂，它们效力和毒性的程度是变化的。如下述更详细的描述，将这些辅助剂固定至基质或其他递送运载体、或开发化学修饰的类似物可容易地实施，以当它们相遇时减少或甚至消除毒性作用。在候选酶抑制剂的广泛组中用于本发明的是有机磷抑制剂，如二异丙基氟磷酸酯(DFP)和苯甲磺酰基氟化物(PMSF)，其是丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和糜蛋白酶)的强效、不可逆转的抑制剂。通过这些化合物的乙酰胆碱酯酶的其他抑制作用使它们在不受控制的递送装配(settings)中具有高毒性。另一个候选的抑制剂4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟化物(AEBSF)与DFP和PMSF相比具有抑制活性，但它毒性显著地较低。(4-氨基苯基)-甲烷磺酰氟盐酸盐(APMSF)是另一个胰蛋白酶的强效抑制剂，但其在不受控制的装配中有毒性。与这些抑制剂比较，4-(4-异丙基哌啶羰基)苯基1，2，3，4-四氢-1-萘甲酸酯甲磺酸盐(FK-448)是低毒性物质，代表糜蛋白酶强效和特异性的抑制剂。这些非蛋白质类抑制剂候选物的更多代表是甲磺酸卡莫司他(N，N’-二甲基氨甲酰基甲基-P-(P’-呱基-苯甲酰氧基)苯乙酸酯甲磺酸盐)。
还用于本发明方法和组合物的另一类型酶抑制剂是阻碍特异性治疗化合物的酶降解的氨基酸及经修饰的氨基酸。对于在本文中的使用，氨基酸和经修饰的氨基酸基本上为非毒性、且可低成本制备。然而，由于它们分子大小较小且溶解性好，因此其容易稀释，并在粘膜的环境中容易吸收。然而在适当的条件下，氨基酸可以用作蛋白酶的可逆的、竞争性抑制剂。某些经修饰的氨基酸能显示更强的抑制活性。本文中希望的经修饰的氨基酸已知为“过渡态”抑制剂。这些化合物强抑制活性是基于它们结构与它过渡态几何构型的底物的相似性，而通常选择它们是因其对酶的活性部位比底物本身具有更高的亲和力。过渡态抑制剂是可逆的、竞争性抑制剂。这类抑制剂的例子有α-氨基硼酸衍生物，如硼-亮氨酸、硼-缬氨酸和硼-丙氨酸。这些衍生物中的硼原子能形成四面体硼酸盐离子，其被认为在它们通过氨肽酶类的水解期间与过渡态的肽类似。这些氨基酸衍生物为强效且可逆的氨肽酶类抑制剂，且据报道硼-亮氨酸的酶抑制作用比抑氨肽酶B素更有效超过100倍，且比嘌呤霉素更有效超过1000倍。另一个据报道具有强蛋白酶抑制活性的经修饰的氨基酸是N-乙酰半胱氨酸，其能抑制氨肽酶N的酶活性。这种辅助剂也显示溶解粘液的性质，所述性质能适用于本发明的方法和组合物以减少粘液扩散屏障的影响。
还有其他用于本发明协同施用方法和组合制剂的有用的酶抑制剂，其可选自肽和经修饰的肽酶抑制剂。这类抑制剂重要的代表是环状十二肽、从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)获得的杆菌肽。此外，这些类型的肽类、某些二肽类和三肽类对一些蛋白酶显示弱的、非特异性抑制活性。通过与氨基酸类比，它们的抑制活性可通过化学修饰而得到提高。例如，次磷酸二肽类似物也是对氨肽酶类具有强抑制活性的“过渡态”抑制剂。据报道，它们已用于稳定鼻施用的亮氨酸脑啡肽。另一个过渡态类似物的例子是经修饰的五肽胃蛋白酶抑制剂，其是非常强效的胃蛋白酶抑制剂。通过测试数种合成类似物的抑制活性，胃蛋白酶抑制剂的结构分析证实该分子的主要结构官能特征影响该抑制活性。经修饰的肽的另一种特别类型包括在它们结构中末端有醛官能的抑制剂。例如，已发现序列苄氧羰基-Pro-Phe-CHO是这类靶蛋白酶强效的可逆抑制剂，其实现糜蛋白酶已知的主要和次要的特异性需要。末端有醛官能的更多抑制剂(例如木瓜蛋白酶抑制剂、亮肽素、糜蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶抑制剂)的化学结构也是本领域已知的，例如其他已知的、可逆的、经修饰的肽抑制剂的结构，如磷酰胺素、抑氨肽酶B素、嘌呤霉素和抑氨肽酶A素。
由于它们比较高的分子量，多肽蛋白酶抑制剂比较小的化合物更易接受在药物载体的基体中的集中递送。本发明制剂和方法的蛋白酶抑制剂的其他试剂涉及螯合剂的使用。这些试剂通过从鼻内环境(或制备的或治疗的组合物)中夺去二价阳离子以介导酶抑制作用，所述二价阳离子是很多蛋白酶的辅助因子。例如，螯合剂EDTA和DTPA作为协同施用的或组合配制的辅助剂以合适的浓度足够抑制选择的蛋白酶，从而增强本发明的生物活性剂鼻内递送。这类抑制剂的更多代表是EGTA、1，10-邻菲咯啉、羟基喹啉。此外，由于它们螯合二价阳离子的倾向，这些螯合剂和其他螯合剂作为直接的吸收促进剂有用于本发明。
如本文其他地方更详细地描述，本发明也包括使用不同的聚合物(特别是粘膜粘附聚合物)作为本发明协同施用、多工序和/或组合制剂的方法和组合物的酶抑制剂。例如，聚(丙烯酸酯)衍生物如聚(丙烯酸)和聚卡波菲能影响不同蛋白酶(包括胰蛋白酶和糜蛋白酶)的活性。这些聚合物的抑制作用也可基于二价阳离子如Ca2+和Zn2+的络合。本发明进一步包括这些聚合物可用作上述的其他酶抑制剂的共轭配体或载体。例如，已开发壳聚糖-EDTA共轭物，其在本发明中有用，并且其显示对锌依赖型蛋白酶的酶活性有强抑制作用。随着本文中其他酶抑制剂的共价连接，并不期望聚合物粘膜粘附的性质作出实质上的妥协，也不期望作为本发明生物活性剂递送运载体的这些聚合物的一般效用(general utility)降低。相反，当该共价键合酶抑制剂保持集中于药物递送的位点，通过所述粘膜粘附机理提供的递送运载体和粘膜表面之间减少的距离将使该活性剂的循环前(presystemic)代谢降至最低，并将不希望的抑制剂稀释效应以及由此引起的毒性和其他副作用降至最低。以这种方式，协同施用的酶抑制剂的有效量由于排除稀释效应可以减少。
示例性的有用于本发明粘膜制剂和方法的粘膜粘附聚合物-酶抑制剂络合物包括但不限于羧甲基纤维素-胃蛋白酶抑制剂(具有抗胃蛋白酶活性)；聚(丙烯酸)-Bowman-Brik抑制剂(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-糜蛋白酶抑制剂(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-弹性蛋白酶抑制剂(抗弹性蛋白酶)；羧甲基纤维素-弹性蛋白酶抑制剂(抗弹性蛋白酶)；聚卡波菲-弹性蛋白酶抑制剂(抗弹性蛋白酶)；壳聚糖-木瓜蛋白酶抑制剂(抗胰蛋白酶)；聚(丙烯酸)-杆菌肽(抗氨肽酶N)；壳聚糖-EDTA(抗氨肽酶N、抗羧肽酶A)；壳聚糖-EDTA-木瓜蛋白酶抑制剂(抗胰蛋白酶、抗糜蛋白酶、抗弹性蛋白酶)。
粘液溶解剂(mucolytic)和粘液清除剂及方法 有效递送经由鼻内施用的生物治疗剂必须考虑跨过衬砌在该鼻粘膜的保护性粘液的药物转运率的减少、以及由于结合至该粘液层的糖蛋白的药物损失。正常粘液是粘弹性的像凝胶样的物质，由水、电解质、粘蛋白、大分子和脱落的上皮细胞组成。它主要用作上覆(underlying)粘膜组织的细胞保护和润滑的覆盖物(covering)。粘液通过位于该鼻上皮细胞和其他粘膜上皮细胞的随机分布的分泌细胞分泌。粘液的结构单位是粘蛋白。这种糖蛋白主要为粘液的粘弹特性负责，尽管其他大分子也可有助于这种性质。在呼吸道的粘液中，这种大分子包括局部产生的分泌型IgA、IgM、IgE、溶菌酶和支气管转铁蛋白(bronchotransferrin)，其也在宿主防御机理中起重要的作用。
本发明的协同施用方法任选地结合有效的粘液溶解剂或粘液清除剂，这有助于降解鼻内粘膜表面的薄或透亮的粘液以促进鼻内施用的生物治疗剂的吸收。在这些方法中，粘液溶解剂或粘液清除剂协同施用作为辅助的化合物以增强该生物活性剂的鼻内递送。或者，有效量的粘液溶解剂或粘液清除剂在本发明的多工序方法中作为处理剂结合或在本发明的组合制剂中作为添加剂，以提供通过减少鼻内粘液的屏障作用而增强生物治疗化合物鼻内递送的改进制剂。
各种粘液溶解剂或粘液清除剂可用于结合在本发明的方法和组合物中。基于它们作用的机理，粘液溶解剂和粘液清除剂经常可被分类至下述组清除粘蛋白糖蛋白的蛋白质核心的蛋白酶类(例如链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶)；分裂粘蛋白二硫键的巯基化合物；和断裂粘液内的非共价键的洗涤剂(例如Triton X-100、吐温20)。在本文中的其他化合物包括但不限于胆汁盐和表面活性剂(例如脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘胆酸钠)和溶血磷脂酰胆碱。
在引起粘液的结构破坏中胆汁盐的有效性按顺序排列脱氧胆酸盐＞牛磺胆酸盐＞甘胆酸盐。根据本发明方法减少粘液粘度或粘附力以促进鼻内递送的其他有效试剂包括例如短链脂肪酸，和通过螯合作用工作的粘液溶解剂，如N-酰基胶原肽、胆酸和皂苷(后者的官能部分是通过螯合在维持粘液层结构中起重要作用的Ca2+和/或Mg2+)。
用于本发明方法和组合物的其他粘液溶解剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸(ACS)，其为减少支气管肺粘液的粘度和粘附力的强效粘液溶解剂，且据报道其在麻醉的大鼠中能适度地提高人生长激素的鼻生物利用度(从7.5％至12.2％)。这些以及其他粘液溶解剂或粘液清除剂与该鼻粘膜接触，通常浓度范围为约0.2-20mM，且与施用该生物活性剂协同以减少鼻内粘液的极性粘度和/或弹性。
还有其他粘液溶解剂或粘液清除剂可选自糖苷酶的范围，所述糖苷酶能裂解该粘液糖蛋白的糖苷键。α-淀粉酶和β-淀粉酶是这类酶的代表，尽管它们溶解粘液的作用可能受到限制。相反，细菌性糖苷酶允许这些微生物渗透它们宿主的粘液层。
对于与本发明的大部分生物活性剂(包括肽和蛋白质治疗药物)组合使用，非离子洗涤剂通常也用作粘液溶解剂或粘液清除剂。这些试剂通常不会改变或基本上不会损害治疗性多肽的活性。
纤毛停滞剂(ciliostatic)和方法 由于某些粘膜组织(例如鼻粘膜组织)通过粘膜纤毛清除率的自我清除能力作为保护性功能(例如去除灰尘、过敏原和细菌)是必需的，所以通常认为这种功能基本上不受粘膜给药损害。在呼吸道的粘膜纤毛转运是抗感染的特别重要的防御机理。为实现这种功能，在鼻和呼吸通道中摆动(beating)的纤毛沿着粘膜移动粘液层以去除吸入的颗粒和微生物。
纤毛停滞剂可用于本发明的方法和组合物以增加葡萄糖调节肽、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂粘膜(例如鼻内)施用的停留时间。特别，在某些方面通过与一种或多种具有可逆地抑制粘膜细胞纤毛活动的功能的纤毛停滞剂协同施用或组合制剂，能显著增强本发明的方法和组合物中这些试剂的递送，从而能暂时地、可逆地提高粘膜施用的活性剂的停留时间。对于在本发明这些方面中的使用，上述纤毛停滞因子(不管是特异性还是间接地影响它们活性)是以合适的量(取决于浓度、持续时间和递送的方式)成功地用作纤毛停滞剂的所有候选物，以至它们在施用的粘膜部位的粘膜纤毛清除率暂时(例如可逆)减少或停止，从而增强葡萄糖调节肽、类似物和模拟物和本文公开的其他生物活性剂的递送，且没有不可接受的不良副作用。
在更详细的方面，特异性的纤毛停滞因子用于与一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物和/或本文公开的其他生物活性剂的组合制剂或协同施用方案。所述文献中分离的和表征的各种细菌性纤毛停滞因子可用于本发明的这些实施方案中。细菌绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的纤毛停滞因子包括吩嗪衍生物、绿脓杆菌素(pyo)化合物(2-烷基-4-羟基喹啉)和鼠李糖脂(也已知为溶血素)。所述绿脓杆菌素化合物产生浓度为50μg/ml的纤毛停滞剂，且没有明显的超微结构的病变。所述吩嗪衍生物也抑制纤毛的运动，但引起一些膜的破裂，尽管在明显高于400μg/ml的浓度时。气管外植体(tracheal explants)与鼠李糖脂的有限接触导致纤毛停滞，所述纤毛停滞与改变的纤毛膜相关。与鼠李糖脂的更广泛接触与轴丝的动力蛋白臂的去除相关。
表面活性剂和方法 在本发明的更详细方面，一种或多种膜渗透增强剂可用于本发明粘膜递送方法或制剂，以促进葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及本文公开的其他生物活性剂粘膜递送。本文中膜渗透增强剂可以选自(i)表面活性剂；(ii)胆汁盐；(iii)磷脂添加剂、混合胶束、脂质体、或载体；(iv)醇；(v)烯胺；(vi)NO供体化合物；(vii)长链的两亲分子；(viii)小分子亲水渗透增强剂；(ix)水杨酸钠或水杨酸衍生物；(x)乙酰乙酸的甘油酯；(xi)环糊精或β-环糊精衍生物；(xii)中链脂肪酸；(xiii)螯合剂；(xiv)氨基酸或其盐；(xv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xvi)降解成所选膜组分的酶；(xvii)脂肪酸合成的抑制剂；(xviii)胆固醇合成的抑制剂；或(xix)(i)-(xviii)所述的膜渗透增强剂的任何组合。
某些表面活性剂作为粘膜吸收增强剂易结合于本发明的粘膜递送制剂和方法中。这些试剂可与葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及本文公开的其他生物活性剂协同施用或组合配制，且可选自已知表面活性剂的广泛组合。表面活性剂通常会分为三类(1)非离子型聚氧乙烯醚；(2)胆汁盐如甘胆酸钠(SGC)和脱氧胆酸钠(DOC)；和(3)梭链孢酸的衍生物如牛磺二氢梭链孢酸钠(STDHF)。这些不同类别表面活性剂的作用机理通常包括生物活性剂的增溶作用。对经常形成聚集的肽和蛋白质来说，这些吸收促进剂的表面活性性质能使蛋白质相互作用，以至于更小的单位如表面活性剂包衣的单体可以更容易地保持于溶液中。其他表面活性剂的例子是二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨酯80和聚山梨酯20。假定这些单体是更易转运而不是聚集的单元。第二个潜在的机理是保护所述肽或蛋白质不受在粘膜环境中蛋白酶的蛋白水解降解。胆汁盐和一些梭链孢酸衍生物据报道通过鼻匀浆(homogenates)在少于或等于增强蛋白质吸收所需的浓度，都能抑制蛋白质的蛋白水解降解。这种蛋白酶抑制作用可能对生物半衰期短的肽类特别重要。
因而，一些表面活性剂的例子包括非离子型聚氧乙烯醚、梭链孢酸及其衍生物、牛磺二氢梭链孢酸钠、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱、聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚乙二醇、十六醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羊毛脂醇、脱水山梨醇单油酸酯及其混合物。
增粘剂 增粘剂或悬浮剂可影响药物从制剂释放的速率和吸收速率。可用作药学上可接受的增粘剂的这些材料的一些例子有明胶、甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC)、纤维素、淀粉、羟乙基淀粉、泊洛沙姆、普朗尼克(pluronics)、CMC钠、山梨醇、阿拉伯胶、聚维酮、卡波姆、聚卡波菲、壳聚糖、壳聚糖微球、海藻酸盐微球、壳聚糖谷氨酸盐、amberlite树脂、透明质酸、乙基纤维素、麦芽糊精DE、滚筒干燥方式(drum-dried way)玉米淀粉(DDWM)、可降解的淀粉微球(DSM)、脱氧甘胆酸盐(GDC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、微晶纤维素(MCC)、聚甲基丙烯酸和聚乙二醇、磺丁基醚B环糊精、交联依地索姆(eldexomer)淀粉生物微球、牛磺二氢梭链孢酸钠(STDHF)、N-三甲基氯化壳聚糖(TMC)、降解的淀粉微球、amberlite树脂、壳聚糖纳米微球、喷雾干燥的交联聚维酮、喷雾干燥的葡聚糖微球、喷雾干燥的微晶纤维素、和交联依地索姆淀粉微球。在Ugwoke等人，Adv.Drug Deliv.Rev.291656-57，1998中的其他增粘剂通过引用结合至本文。
降解酶与脂肪酸和胆固醇合成的抑制剂 在本发明的相关方面，粘膜施用的葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及其他生物活性剂与渗透增强剂一起配制或协同施用，其中所述渗透增强剂选自降解酶、或代谢刺激剂、或脂肪酸、甾醇或其他所选的上皮细胞屏障组分合成的抑制剂，美国专利第6,190,894号。例如，降解酶例如磷脂酶、透明质酸酶、神经氨酸酶和软骨素酶可用于增强葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及其他生物活性剂的粘膜渗透，且不会对粘膜屏障引起不可逆转的伤害。在一个实施方案中，软骨素酶可用于本文提供的方法或组合物，以改变该粘膜渗透性屏障的糖蛋白或糖脂组成，由此增强葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及本文公开的其他生物活性剂的粘膜吸收。
关于粘膜屏障组成的合成抑制剂，应了解游离脂肪酸占上皮细胞脂质以重量计的20％-25％。在游离脂肪酸生物合成中的两种限速酶是乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合成酶。通过一系列步骤，游离脂肪酸代谢成为磷脂。因此，用于本发明方法和组合物的游离脂肪酸合成和代谢的抑制剂包括，但不限于乙酰CoA羧化酶抑制剂(如5-四癸氧基-2-呋喃羧酸(TOFA))；脂肪酸合成酶的抑制剂；磷脂酶A抑制剂(如戈米辛A(gomisin A)、2-(对戊烷基肉桂基)氨基-4-氯苯甲酸、溴苯甲酰甲基溴、monoalide、7，7-二甲基-5，8-二十碳二烯酸、尼麦角林(nicergoline)、千金藤素、尼卡地平、槲皮素、二丁酰基-环状AMP、R-24571、N-油酰乙醇胺、N-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-基)磷脂酰基丝氨酸、环孢菌素A、局部麻醉药(包括地布卡因)、普尼拉明、视黄素(如所有反式和13-顺-视黄酸)、W-7、三氟拉嗪、R-24571(钙咪唑啉(calmidazolium))、1-十六烷基-3-三氟乙基甘油-sn-2-磷甲醇(MJ33))；钙通道阻滞剂(包括尼卡地平、维拉帕米、地尔硫卓、硝苯地平和尼莫地平)；抗疟药(包括阿的平、米帕林、氯喹和羟基氯喹)；β阻滞剂(包括普萘洛尔(propanalol)、拉贝洛尔)；钙调素拮抗剂；EGTA；硫汞撒(thimersol)；糖皮质激素(包括地塞米松、强的松龙)；非甾体抗炎药(包括吲哚美辛和萘普生)。
游离甾醇(主要是胆固醇)占上皮细胞脂质以重量计的20％-25％。在胆固醇的生物合成中的限速酶是3-羟基-3-甲基戊二酰基(HMG)CoA还原酶。用于本发明的方法和组合物的胆固醇合成的抑制剂包括，但不限于(HMG)CoA还原酶的竞争性抑制剂(如辛伐他汀、洛伐他汀、fluindostatin(氟伐他汀)、普伐他汀、美伐他汀、以及其他HMG CoA还原酶抑制剂(如胆固醇油酸酯、胆固醇硫酸酯和磷酸酯)、和氧合甾醇如25-OH-和26-OH-胆固醇)；角鲨烯合成酶抑制剂；角鲨烯环氧酶抑制剂；DELTA7或DELTA24还原酶抑制剂如22，25-二氮杂胆甾醇、20，25-二氮杂胆甾醇、AY9944和曲帕拉醇。
每个脂肪酸合成抑制剂或甾醇合成抑制剂可以与一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂协同施用或组合配制，以实现该活性剂的上皮细胞渗透的增强。在粘膜递送的治疗性或辅助的制剂中该甾醇抑制剂的有效浓度范围以总数的重量计通常从约0.0001％至约20％，更通常从约0.01％至约5％。
一氧化氮供体剂和方法 在本发明的其他相关方面，一氧化氮(NO)供体被选择用作膜渗透增强剂以增强一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及本文公开的其他生物活性剂的粘膜递送。各种NO供体在本领域已知，且在本发明的方法和制剂有效的浓度中有用。示例性的NO供体包括但不限于硝酸甘油、硝普盐(nitropruside)、NOC5〔3-(2-羟基-1-(甲基-乙基)-2-亚硝基肼基)-1-丙胺〕、NOC12〔N-乙基-2-(1-乙基-羟基-2-亚硝基肼基)-乙胺〕、SNAP〔S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺〕、NORI和NOR4。在本发明的方法和组合物中，所选的NO供体的有效量与一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物和/或本文公开的其他生物活性剂协同施用或组合配制进入或通过该粘膜上皮细胞。
用于调控上皮细胞的连接结构和/或生理学的试剂 本发明提供药物组合物，所述组合物包括一种或多种葡萄糖调节肽、蛋白质、类似物或模拟物、和/或其他生物活性剂，且与本文公开的粘膜递送增强剂组合配制成用于粘膜递送的药物制品。
该透化剂可逆地增强粘膜上皮细胞的细胞旁转运，通常通过在受治疗者的粘膜上皮细胞表面上调控上皮细胞连接结构和/或生理学。这种效应通常涉及在邻近上皮细胞的上皮细胞膜粘附蛋白质之间同型或异型结合该透化剂的抑制作用。阻断同型或异型结合的靶向蛋白质可选自不同相关的连接粘附分子(JAM)、咬合素(occludins)或整合素(claudins)。这种的例子是结合至这些蛋白质的细胞外区域的抗体、抗体片段或单链抗体。
仍然在其他详细的实施方案中，本发明提供用于增强粘膜上皮细胞的细胞旁转运的渗透肽及肽类似物和模拟物。这种对象肽及肽类似物和模拟物通常通过调控在哺乳动物受治疗者中的上皮细胞连接结构和/或生理学而在本发明的组合物和方法中工作。在某些实施方案中，该肽和肽类似物和模拟物有效地抑制上皮细胞膜粘附蛋白质的同型和/或异型结合，所述上皮细胞膜粘附蛋白质选自连接粘附分子(JAM)、咬合素或整合素。
一种已广泛研究的这类试剂是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的细菌毒素，其称为“封闭带毒素”(zonula occludens toxin)(ZOT)。这种毒素介导增强的肠粘膜渗透性，且引起包括受感染的受治疗者腹泻的疾病症状。Fasano等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.85242-5246，1991。当在兔子回肠粘膜上检测时，ZOT通过调控细胞间紧密连接的结构来增加肠的渗透性。更常见的是，已发现ZOT能可逆地打开肠粘膜的紧密连接。据报道，ZOT也能可逆地打开鼻粘膜的紧密连接。美国专利第5,908,825号。
在本发明的方法和组合物中，ZOT和ZOT的不同类似物和模拟物(用作ZOT活性的激动剂或拮抗剂)，有用于增强生物活性剂的鼻内递送-通过增强进入或跨过鼻粘膜的细胞旁的吸收。在上下文中，ZOT通常通过引起紧密连接的结构重组而起作用，所述紧密连接由连接蛋白质ZO1改变的位置标记。在本发明的这些方面中，ZOT与有效量的生物活性剂协同施用或组合配制，其通过可逆地增强鼻粘膜渗透性而显著增加该活性剂的吸收，且没有实质上的不良副作用。
血管扩张剂和方法 然而，另一类吸收促进剂在本发明的协同施用和组合制剂方法和组合物中显示有益的用途，其为血管扩张的化合物，更具体的是血管扩张剂。这些化合物在本发明中起作用以调控粘膜下血管的结构和生理学，并增强葡萄糖调节肽、类似物和模拟物以及其他生物活性剂进入或跨过粘膜上皮细胞和/或至特异性靶组织或室(例如系统性循环或中枢神经系统)的转运速率。
用于本发明的血管扩张剂通常通过胞浆钙的减少、一氧化氮(NO)的增加或通过抑制肌球蛋白轻链激酶，而引起粘膜下血管的驰豫。它们通常会分为9类钙拮抗剂、钾通道开放剂、ACE抑制剂、血管紧张素-II受体拮抗剂、α-肾上腺素能和咪唑类受体拮抗剂、β1-肾上腺素能激动剂、磷酸二酯酶抑制剂、类花生酸和NO供体。
尽管化学差异，钙拮抗剂的药代动力学性质很相似。进入系统性循环的吸收较高，因此这些试剂能承受相当大的肝首过代谢，导致药代动力学的个体差异。除二氢吡啶类型的新药(氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼维地平、尼索地平和尼群地平)之外，钙拮抗剂的半衰期较短。因此，为维持很多这些新药有效的药物浓度，需要通过多剂量或控释制剂递送，如本文其他地方描述。用钾通道开放剂米诺地尔(minoxidil)的治疗方法也可能由于潜在的不良副作用而受限于施用的方式和水平。
ACE抑制剂防止将血管紧张素-I转变为血管紧张素-II，且其当肾素产量增加时最为有效。由于ACE与激肽酶-II相同，所述激肽酶-II使强效的内源性血管扩张剂缓激肽灭活，所以ACE抑制剂引起缓激肽降解的减少。ACE抑制剂提供增加心肌保护和心肌修复作用的优势，通过预防和逆转在动物模型中的心肌纤维化和心室肥厚。大多数ACE抑制剂主要的消除途径是通过肾脏排泄。因此，肾脏的损害与减少的消除是相关的，且对中度至重度肾脏损害的患者推荐的剂量减少25-50％。
关于NO供体，由于它们对粘膜渗透性有其他的作用，这些化合物特别地有用于本发明。除上述的NO供体之外，NO与亲核试剂的络合物(称为NO/亲核试剂或NO-亲核复合体)，当在水溶液中生理pH下溶解时，自发地且非酶促地释放NO。相反，硝基血管扩张剂如硝酸甘油需要NO释放的特异性酶活性。NO-亲核复合体以指定的化学计量释放NO且预测速率的范围从二乙胺/NO的＜3分钟至二乙烯三胺/NO(DETANO)的约20个小时。
在本发明的某些方法和组合物中，所选的血管扩张剂与有效量的一种或多种葡萄糖调节肽、类似物和模拟物、以及其他生物活性剂协同施用(例如系统性或鼻内、同时地或组合地有效暂时联合(temporal association))或组合配制，以增强该活性剂到达受治疗者的靶组织或室的粘膜吸收(例如肝、肝门静脉、CNS组织或流体、或血浆)。
选择性的转运增强剂和方法 本发明的组合物和递送方法任选地结合选择性的转运增强剂，所述转运增强剂能促进一种或多种生物活性剂的转运。这些转运增强剂可用于与一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和本文公开的模拟物组合制剂或协同施用方案，以协同增强一种或多种其他的生物活性剂跨过粘膜转运屏障的递送，增强该活性剂到达受治疗者靶组织或室的粘膜递送(例如粘膜上皮细胞、肝、CNS组织或流体、或血浆)。或者，转运促进剂可用于组合制剂或协同施用方案以直接增强一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物的粘膜递送，不管是否增强其他生物活性剂的递送。
示例性的用于本发明这个方面的选择性转运增强剂包括但不限于糖苷、含糖分子、和结合剂如凝集素结合剂，已知所述结合剂特异性地与上皮细胞转运屏障组分相互作用。例如，包括不同的植物和细菌凝集素的特异性“生物粘附”配体通过受体介导的相互作用结合至细胞表面糖部分，且可用作增强本发明生物活性剂的粘膜如鼻递送的载体或共轭转运介导剂。用于本发明的某些生物粘附配体将介导生物信号的传输至上皮靶细胞，所述靶细胞通过专门的细胞转运过程(胞吞作用或转胞吞作用)触发选择性地摄取该粘附配体。因此，这些转运介导剂能用作“载体系统”以刺激或直接选择性地摄取一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及其他生物活性剂进入和/或通过粘膜的上皮细胞。这些和其他选择性转运增强剂显著地增强本发明的大分子生物制剂(特别是肽、蛋白质、寡核苷酸和聚核苷酸载体)粘膜递送。凝集素是结合至在真核细胞的糖蛋白和糖脂表面上的特异性糖的植物蛋白质。凝集素的浓溶液有“牵引”作用，并且不同的研究证实凝集素和凝集素共轭物(例如与胶态金颗粒共轭的伴刀豆球蛋白A)的快速受体介导的胞吞作用(RME)跨过粘膜表面。其他研究已报道凝集素的摄取机理可用于体内肠的药物靶向。在某些这类研究中，聚苯乙烯纳米颗粒(500nm)共价耦合至番茄凝集素，且据报道在对大鼠口服施用后系统性摄取得到改善。
除植物凝集素之外，微生物粘附和入侵因子提供丰富的候选物来源，所述候选物可用作本发明的粘膜递送方法和组合物中的粘附性/选择性转运载体。两种组分对细菌粘附过程是必需的，一种是细菌“粘附素(adhesin)”(粘附或定居因子(colonization factor))，另一种是在宿主细胞表面上的受体。引起粘膜感染的细菌在将它们附着至该上皮细胞表面之前，需要穿透粘液层。所述附着通常通过细菌菌毛或纤毛(pilus)结构介导，尽管其他细胞表面组分也可参与该过程。粘着的细菌通过信号转导机理(不管是否有毒素的帮助)借助在该靶细胞中增殖和触发一系列生物化学反应而移居至粘膜上皮细胞。与这些侵入机理相关，最初通过不同细菌和病毒产生的很多各种生物粘附的蛋白质(例如侵袭素(invasin)、内化素(internalin))是已知的。这使这些微生物以对宿主种类和甚至特殊的靶组织令人深刻印象的选择性进行细胞外附着。通过这种受体-配体相互作用传输的信号触发完整的、活微生物进入且最终通过胞吞作用和转胞吞过程穿过上皮细胞的转运。根据本文的教导，可以利用(例如通过与粘附素络合生物活性剂如葡萄糖调节肽)这种天然存在的现象以增强生物活性化合物递送进入或跨过粘膜上皮细胞和/或至其他指定的药物作用靶向部位。
以特异性的凝集素样的方式结合上皮细胞表面的不同细菌和植物毒素也用于本发明的方法和组合物。例如，白喉毒素(diptheria toxin)(DT)通过RME快速进入宿主细胞。同样地，大肠杆菌(E.coli)不耐热毒素的B亚单位以高度特异性的凝集素样的方式结合至肠上皮细胞的刷状边缘。体内和体外摄取这种毒素以及转胞吞至肠上皮细胞基底外侧都有报道。其他研究人员已表示大肠杆菌的白喉毒素的跨膜区域作为麦芽糖结合的融合蛋白质，且已将它化学地耦合至高分子量(Mw)的聚L-赖氨酸。所得的络合物成功地用于介导体外报道基因的内化。除这些例子之外，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生一系列可用作超抗原和毒素的蛋白质(例如葡萄球菌肠毒素A(SEA)、SEB、毒性休克综合征毒素1(TSST-1))。关于这些蛋白质的研究已报道在Caco-2细胞中SEB和TSST-1剂量依赖的、易化的转胞吞作用。
病毒血凝素包括促进本发明方法和组合物的生物活性剂粘膜递送的另一类型转运剂。在很多病毒感染中的起始步骤是结合表面蛋白质(血凝素)至粘膜细胞。已对大多数病毒鉴别了这些结合蛋白质，包括轮状病毒(rotaviruses)、水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、腺病毒(adenoviruses)、马铃薯卷叶病毒(potatoleafroll virus)和呼肠病毒(reovirus)。这些和其他示例性的病毒血凝素能用于与一种或多种葡萄糖调节肽、类似物和本文公开的模拟物组合制剂(例如混合物或共轭制剂)或协同施用方案，以协同增强一种或多种其他生物活性剂的粘膜递送。或者，病毒血凝素能用于组合制剂或协同施用方案，以直接增强一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物的粘膜递送，不管是否增强其他生物活性剂的递送。
各种内源性的、选择性转运介导因子也可用于本发明。哺乳动物细胞已形成促进特异性底物的内化且将这些底物靶向至指定的室中的机理分类。集中地，这些膜形变的过程称为“胞吞作用”，其包括吞噬作用、胞饮作用、受体介导的胞吞作用(网格蛋白介导的RME)和细胞饮液作用(非网格蛋白介导的RME)。RME是高度特异性的细胞生物过程，通过该过程(如其名称暗示的)不同的配体结合至细胞表面受体，继而内化并在细胞内转运(traffick)。在很多细胞中，胞吞作用的过程如此有活性以至于完整的膜表面被内化且在少于半小时中被代替。建议的两类受体是基于它们在细胞膜中的定位；类型I受体的氨基末端位于该膜的细胞外侧，然而类型II受体在细胞间的环境中有相同的蛋白质尾。
还有本发明的其他实施方案利用转铁蛋白作为粘膜递送生物活性剂的RME载体或刺激物。转铁蛋白是80kDa铁转运糖蛋白，且能通过RME有效地摄取进入细胞。发现转铁蛋白受体在大多数增殖细胞的表面上，并在成红细胞和很多种类肿瘤上的数目增高。转铁蛋白(Tf)和转铁蛋白共轭物的转胞吞作用据报道在真菌的代谢物布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BFA)的存在下增强。在其他研究中，据报道BFA治疗能快速增加在MDCK细胞中的蓖麻毒素和HRP的心尖(apical)胞吞作用。因此，BFA和其他刺激受体介导的转运的试剂可作为组合配制(例如共轭)和/或协同施用剂用于本发明的方法中，以增强包括葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物的生物活性剂的受体介导的转运。
聚合物递送运载体和方法 在本发明的某些方面，一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、本文公开的其他生物活性剂以及上述的递送增强剂单独或组合地结合至粘膜(例如鼻)施用的制剂，所述制剂包括用作载体或基质的生物相容性聚合物。这种聚合物载体包括聚合物粉末、基质或微粒递送运载体，以及其他的聚合物形式。所述聚合物可以是植物、动物或合成来源。经常所述聚合物是交联的。此外，在这些递送系统中，葡萄糖调节肽、类似物和模拟物能以下述的方式官能化其中可共价结合至该聚合物且通过简单的洗涤(ishing)不能使其与所述聚合物分离。在其他实施方案中，该聚合物用酶抑制剂或其他降解或灭活该生物活性剂的试剂和/或递送增强剂进行化学修饰。在某些制剂中，所述聚合物是部分或完全地水不溶但水溶胀型的聚合物，例如水凝胶。期望用于本发明的这个方面的聚合物是与水交互作用的(interactive)和/或本质上是亲水的以吸收大量的水，且当它们与水或水溶性媒介相接触并放置一段充分达到水平衡的时间时，经常形成水凝胶。在更详细的实施方案中，所述聚合物是水凝胶，当与过量的水相接触时，该聚合物在平衡时吸收的水是当于室温接触水达平衡时吸收的水的至少两倍重量。美国专利第6,004,583号。
基于生物可降解的聚合物的药物递送系统在很多生物医学应用中是优选的，因为这些系统被水解或酶促反应破坏成非毒性分子。降解速率通过操纵该生物可降解的聚合物基质的组成来控制。这些类型系统因而可用于生物活性剂的长期释放的某些装配。生物可降解聚合物如聚(羟基乙酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)和聚(D，L-乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)作为可能的药物递送载体已经受到很大的关注，因为已发现这些聚合物的降解产物有低毒性。在身体的正常代谢功能期间，这些聚合物降解成二氧化碳和水。这些聚合物也显示有极佳的生物相容性。
为延长葡萄糖调节肽、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂和任选的递送增强剂的生物活性，这些试剂可结合进入聚合物基质，例如聚原酸酯、聚酐、或聚酯。这产生持续的活性以及该活性剂的释放，例如，如通过该聚合物基质的降解检测。尽管在合成的聚合物中包封生物治疗药物分子可使它们在贮存和递送期间稳定，但是基于聚合物的释放技术最大的障碍是在制剂加工期间该治疗药物分子活性的丧失，所述制剂加工通常涉及热、超声或有机溶剂。
包括用于本发明的吸收促进聚合物可包括上述类型的聚合物经化学或物理修饰的种类(除其他天然存在或合成的聚合物、胶、树脂和其他试剂之外)和衍生物、以及这些物质相互或与其他聚合物的混合，只要改变、修饰或混合不会不利地影响希望的性质，如水吸收、水凝胶形成、和/或有用的应用的化学稳定性。在本发明更详细的方面，聚合物如尼龙、腈纶(acrylan)和其他正常疏水的合成聚合物，可通过反应充分修饰使在水性媒介中成为水溶胀型的和/或形成稳定的凝胶。
本发明的吸收促进聚合物可包括均聚物和共聚物组的聚合物，所述均聚物和共聚物基于下述乙烯基单体的不同组合丙烯酸和甲基丙烯酸、丙烯酸胺、甲基丙烯酸胺、羟乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、和聚乙烯醇和其共聚物和三聚物、聚乙酸乙烯酯和它的与上述列出的单体的共聚物和三聚物和2-丙烯酰胺-2-甲基-丙磺酸(

)。上述列出的单体与共聚型官能的单体是非常有用的，如丙烯基或甲基丙烯基酰胺丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，其中酯基团是来源于直链或支链烷基、具有达4个芳环的芳基，所述芳环可包括1-6个碳的烷基取代基；甾醇、硫酸盐、磷酸盐、或阳离子单体如N，N-二甲氨基烷基(甲基)丙烯酰胺、二甲氨基烷基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰氧基烷基三甲基氯化铵、(甲基)丙烯酰氧基烷基二甲基苄基氯化铵。
其他的用于本发明的吸收促进聚合物是那些分类为葡聚糖类、糊精类的聚合物，和分类为天然胶和树脂类的材料类，或这类天然聚合物如经处理的胶原、壳多糖、壳聚糖、pullalan、zooglan、海藻酸盐和经修饰的海藻酸盐如“Kelcoloid”(聚丙二醇修饰的海藻酸盐)、结冷胶(gellan gums)如“Kelocogel”、黄原胶如“Keltrol”、estastin、α-羟基丁酸盐和其共聚物、透明质酸和其衍生物、聚乳酸和羟基乙酸。
可用于本发明的非常有用的一类聚合物是包括至少一个活化的碳-碳烯系(olefinic)双键和至少一个羧基的烯系-未饱和羧酸；即酸或官能团易转换成含有烯系双键的酸，所述烯系双键因其在该单体分子中存在，在关于羧基的α-β位置中或作为末端亚甲基基团的部分而易起聚合作用。这类烯系-未饱和酸包括如以丙烯酸本身为代表的丙烯酸类材料、α-氰基丙烯酸、β-甲基丙烯酸(巴豆酸)、α-苯基丙烯酸、β-丙烯酰氧基丙酸、肉桂酸、对氯肉桂酸、1-羧基-4-苯基丁二烯-1，3、衣康酸、柠康酸、甲基反丁烯二酸、戊烯二酸、乌头酸、马来酸、富马酸和三羧酸乙烯。如本文所使用的术语“羧酸”包括聚羧酸和那些酸酐，如马来酸酐，其中该酸酐基团通过位于同一羧酸分子上的两个羧基消除一分子的水而形成的。
在本发明中用作吸收促进剂的代表性的丙烯酸酯类包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸甲酯、乙基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸辛酯、丙烯丙烯酸壬酯、丙烯酸己酯、甲基丙烯酸正己酯等。高级烷基丙烯酸酯是丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸异癸酯、丙烯酸十二酯、丙烯酸十八酯、丙烯酸二十二酯和丙烯酸三十酯及其甲基丙烯酸酯种类。两种或三种或更多种长链丙烯酸酯的混合物可成功地与一种羧酸单体聚合。其他共聚单体包括烯烃，其包括α烯烃、乙烯醚、乙烯酯及其混合物。
包括丙烯酸腈类的其他亚乙烯基单体也可用作本发明的方法和组合物中的吸收促进剂，以增强一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、以及其他生物活性剂的递送和吸收，包括增强该活性剂递送至受治疗者的靶组织或室(例如肝、肝门静脉、CNS组织或流体、或血浆)。有用的α，β-烯系未饱和腈类优选含有3至10个碳原子的单烯系未饱和腈如丙烯腈、甲基丙烯腈等。最优选丙烯腈和甲基丙烯腈。也可使用含有3至35个碳原子的包括单烯系未饱和酰胺的丙烯酰胺。代表性的酰胺包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-叔-丁基丙烯酰胺、N-环己基丙烯酰胺、在氮上的烷基包括8至32个碳原子的高级烷基酰胺，包括那些具有4至10个碳原子的α，β-烯系未饱和羧酸的N-烷醇酰胺的丙烯酰胺，如N-亚甲醇丙烯酰胺、N-丙醇丙烯酰胺、N-亚甲醇甲基丙烯酰胺、N-亚甲醇马来酰胺、N-亚甲醇马来酸酯、N-亚甲醇-对-乙烯基苯甲酰胺等。
其他有用的吸收促进材料是含有2至18个碳原子的α-烯烃，更优选的是2至8个碳原子；含有4至10个碳原子的二烯；乙烯酯和烯丙基酯如乙酸乙烯酯；乙烯芳香烃如苯乙烯、甲基苯乙烯和氯-苯乙烯；乙烯基和烯丙基醚和酮如乙烯基甲基醚和甲基乙烯基酮；氯丙烯酸酯；氰烷基丙烯酸酯如α-氰甲基丙烯酸酯和α-、β-和γ-氰丙基丙烯酸酯；丙烯酸烷氧基酯如丙烯酸甲氧基乙酯；卤代丙烯酸酯如丙烯酸氯乙酯；乙烯基卤化物和乙烯基氯化物、亚乙烯基氯化物等；二乙烯、二丙烯酸酯和其他多官能单体如二乙烯基醚、二丙烯酸二甘醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、亚甲基-双-丙烯酰胺、烯丙基季戊四醇等；和双(β-卤烷基)烯基磷酸酯，如双(β-氯乙基)乙烯基磷酸酯等，这些对本领域技术人员是已知的。根据本文公开的方法，容易制备以下共聚物其中包括单体的羧基是次要组成，另一个亚乙烯基单体为主要组分。
当水凝胶用作本发明的吸收促进剂时，这些可能包括选自下述组的合成共聚物与水相互作用且可溶胀的丙烯酸和甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酸酯(HEA)或甲基丙烯酸酯(HEMA)和乙烯基吡咯烷酮。有用聚合物(特别用于肽和蛋白质的递送)的具体说明性的例子是下述类型的聚合物(甲基)丙烯酰胺和0.1-99wt％(甲基)丙烯酸；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲基)丙烯氧基乙基三甲基氯化铵；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲基)丙烯酰胺；丙烯酸和0.1-75wt％烷基(甲基)丙烯酸酯；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％AMPS.RTM.(Lubrizol公司的商标)；(甲基)丙烯酰胺和0-30wt％烷基(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％AMPS.RTM.；(甲基)丙烯酰胺和0.1-99wt％HEMA；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％HEMA和0.1-99％(甲基)丙烯酸；(甲基)丙烯酸和0.1-99wt％HEMA；50摩尔％乙烯基醚和50摩尔％马来酸酐；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲基)丙烯氧基烷基二甲基苄基氯化铵；(甲基)丙烯酰胺和0.1-99wt％乙烯基吡咯烷酮；(甲基)丙烯酰胺和50wt％乙烯基吡咯烷酮和0.1-99.9wt％(甲基)丙烯酸；(甲基)丙烯酸和0.1-75wt％AMPS.RTM.和0.1-75wt％烷基(甲基)丙烯酰胺。在上述的例子中，烷基是指C1-C30，优选C1-C22，直链和支链和C4-C16环状；其中所用的(甲基)是指包括有和没有甲基时的单体。其他非常有用的水凝胶聚合物是可溶胀的，但是不溶种类的聚(乙烯吡咯烷酮)淀粉、羧甲基纤维素和聚乙烯醇。
其他用于本发明的聚合物水凝胶材料包括(聚)羟基烷基(甲基)丙烯酸酯；阴离子和阳离子水凝胶；聚(电解质)络合物；含有低级乙酸酯残基的聚(乙烯醇)；交联琼脂和交联羧甲基纤维素的溶胀型混合物；与难溶的交联琼脂混合的包括甲基纤维素的溶胀型组合物；通过分散马来酸酐与苯乙烯、乙烯、丙烯或异丁烯的精细分散的共聚物而制备的水溶胀型共聚物；N-乙烯基内酰胺的水溶胀型聚合物；溶胀型羧甲基纤维素的钠盐等。
其他凝胶化的、吸收和保留液体(fluid imbibing and retaining)的聚合物用于形成本发明生物活性剂的粘膜递送的亲水性水凝胶，所述聚合物包括果胶；多糖如琼脂、阿拉伯胶、梧桐树胶(karaya)、黄芪胶(tragacenth)、褐藻胶(slgins)、瓜尔胶和其交联的种类；丙烯酸聚合物、共聚物和盐衍生物、聚丙烯酰胺；水溶胀型茚马来酸酐聚合物；淀粉接枝共聚物；具有其原重约2至400倍的水吸收性的丙烯酸酯类型聚合物和共聚物；聚葡聚糖(polyglucan)的二酯；交联聚(乙烯醇)和聚(N-乙烯-2-吡咯烷酮)的混合物；聚氧丁烯-聚乙烯嵌段共聚物凝胶；角豆胶(carob gum)；聚酯凝胶；聚脲凝胶；聚醚凝胶、聚酰胺凝胶、聚酰亚胺凝胶、多肽凝胶、聚氨基酸凝胶；聚纤维素凝胶、交联茚-马来酸酐丙烯酸酯聚合物和聚多醣。
用于本发明的合成的水凝胶聚合物可通过数种单体以几种比率无限组合而制备。该水凝胶可被交联、并通常具有吸取和吸收液体且溶胀或扩胀至扩大的平衡状态的能力。该水凝胶通常在鼻粘膜表面的递送中溶胀或扩胀，并吸收其重量约2-5、5-10、10-50、多达50-100或更多倍的水。对不同生物活性剂检测给定水凝胶的溶胀性的最佳程度，这取决于下述因素，如分子量、大小、溶解度和通过或捕获或包封于聚合物中加载的活性剂的扩散特征、和特定空间以及与每个单独聚合物相关的合作链运动。
用于本发明的亲水性聚合物是水不溶但水溶胀的。这些水溶胀型的聚合物通常是指水凝胶或凝胶。这些凝胶可通过交联该聚合物的方法由合适的交联剂从水溶性聚合物方便地制备。然而，稳定的水凝胶也可根据本领域已知的方法通过pH、温度和/或离子浓度指定的条件下从具体聚合物形成。通常所述聚合物是交联的，即交联至以下程度该聚合物具有良好的亲水性性质、已改善的物理整体性(与相同或相似类型的非交联聚合物相比)和显示保留在感兴趣生物活性剂和随其共同施用的其他化合物(如细胞因子或酶抑制剂)的凝胶网络结构(network)中的改善的能力、同时保留在适当位置和时间释放该活性剂的能力。
通常用于本发明的水凝胶聚合物的交联是双官能交联，基于形成共聚物的单体的重量，交联剂的量是从0.01至25重量百分比，更优选从0.1至20重量百分比，特别优选从0.1至15重量百分比。交联剂的另一个有用量是0.1至10重量百分比。也可使用三、四或高级多官能交联剂。当使用这些试剂时，需要较低的量以维持等量的交联密度即交联的程度，或网络结构性质能充分有效地包括该生物活性剂。
该交联可以是共价的、离子的或与聚合物的氢键，所述聚合物具有在含有水的流体存在下溶胀的能力。这种交联剂和交联反应是本领域技术人员已知的，且在很多情况下取决于该聚合物系统。因此，交联的网络结构可通过未饱和单体的自由基共聚作用形成。聚合物水凝胶也可通过在该聚合物上存在的官能团如醇、酸、胺与这种基团如乙二醛、甲醛或戊二醛、二酸酐等反应进行交联而形成。
该聚合物也可与以下物质交联任何聚烯如癸二烯或三乙烯环己烷；丙烯酰胺如N，N-亚甲基-双(丙烯酰胺)；多官能丙烯酸酯如三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；或含有至少2个末端CH2＜基团的多官能亚乙烯基单体，包括例如二乙烯基苯、二乙烯基萘、丙烯酸烯丙酯等。在某些实施方案中，用于制备共聚物的交联单体是每个分子含有超过一个烯基醚基团的聚烯基聚醚，其可任选地含有烯基，该烯基中有烯系双键连接在末端的亚甲基上(例如，通过含有至少2个碳原子和至少2个羟基的多元醇的醚化而制备)。这类化合物可通过将烯基卤化物(如烯丙基氯化物或烯丙基溴化物)与一种或多种多元醇的强碱水溶液反应而制备。这种产物可以是具有不同数目醚基的聚醚的复杂混合物。聚醚交联剂的效力随分子潜在的聚合基团数目的增加而增加。通常，使用每个分子平均含有两个或更多个烯醚基团的聚醚。其他交联单体包括例如二烯丙基酯、二甲代烯丙基(dimethallyl)醚、烯丙基或甲代烯丙基丙烯酸酯和丙烯酰胺、四乙烯基硅烷、聚烯基甲烷、二丙烯酸酯、和二甲基丙烯酸酯、二乙烯基化合物如二乙烯基苯、聚烯丙基磷酸酯、二烯丙基氧基化合物和亚磷酸酯等。典型的试剂是烯丙基季戊四醇、烯丙基蔗糖、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、1，6-已二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷二烯丙基醚、季戊四醇三丙烯酸酯、二甲基丙烯酸四亚甲酯、二丙烯酸亚乙酯、二甲基丙烯酸亚乙酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯等。烯丙基季戊四醇、三羟甲基丙烷二烯丙基醚和烯丙基蔗糖提供合适的聚合物。当存在交联剂时，聚合物混合物通常包括基于羧酸单体的总重含量为约0.01至20重量百分比之间(如1％、5％或10％或更多)的交联单体、以及其他单体。
在本发明的更详细方面，通过以缓慢释放或酶促或生理保护性载体或运载体的方式保留该生物活性剂(例如水凝胶保护该活性剂不受降解酶的作用)，来增强葡萄糖调节肽、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂的粘膜递送。在某些实施方案中，该活性剂通过化学方式结合至该载体或运载体，其中其他试剂如酶抑制剂、细胞因子等也可以混合或结合至所述载体或运载体。该活性剂可通过在该载体或运载体(例如聚合物基质)内充分的物理捕获而选择性地固定。
有用于本发明的聚合物如水凝胶可以结合官能连接剂如糖苷，所述官能连接剂化学结合至聚合物以提高随其配制的活性剂的鼻内生物利用度。这些糖苷的例子有葡萄糖苷、果糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷、甘露糖苷及它们烷基取代的衍生物和天然糖苷如熊果苷、根皮苷、苦杏仁苷、毛地黄皂苷、皂角苷和靛苷。典型的糖苷可有数种方式结合至聚合物。例如，糖苷或其他类似的碳水化合物的羟基的氢原子可被水凝胶聚合物的烷基代替而形成醚。同时，糖苷的羟基可以反应使聚合物水凝胶的羧基酯化以形成原位聚合物酯。另一种方法是在马来酸的共聚物上使用乙酰溴葡萄糖与胆甾基-5-烯-3β-醇的缩合。N-取代的聚丙烯酰胺能通过活化的聚合物与γ-氨基烷基糖苷的反应合成(1)(碳水化合物-间隔基)(n)-聚丙烯酰胺、假多糖；(2)(碳水化合物间隔基)(n)-磷脂酰乙醇胺(m)-聚丙烯酰胺、新糖脂、磷脂酰乙醇胺的衍生物；和(3)(碳水化合物-间隔基)(n)-生物素(m)-聚丙烯酰胺。这些生物素化的衍生物可粘附至在粘膜表面的凝集素以促进生物活性剂的吸收，例如聚合物包封的葡萄糖调节肽。
在本发明的更详细方面，一种或多种葡萄糖调节肽、类似物和模拟物、和/或本文公开的其他生物活性剂(任选地包括次级(secondary)活性剂如蛋白酶抑制剂、细胞因子、细胞间连接生理学的其他调控剂等)被修饰且结合至聚合物载体或基质。例如，这通过化学结合肽或蛋白质活性剂和其他任选的试剂于交联的聚合物网络中而实现。分别用相互反应的试剂如包括糖苷的分子也可能化学修饰聚合物。在某些方面，生物活性剂和任选的次级活性剂可被官能化，即其中适当的反应基团被识别或化学加至活性剂。大多数时候加入烯基可聚合的基团，继而使用标准的聚合方法如溶液聚合(通常是水)、乳化、悬浮或分散聚合将该官能化的活性剂与单体和交联剂共聚。通常，所述官能化的活性剂提供充分高浓度的官能或可聚合的基团，以确保在活性剂的一些位点官能化。例如，含有16个氨基位点的多肽中，通常希望将至少2个、4个、5个、7个和多达8个或更多个的位点官能化。
官能化后，该官能化的活性剂与单体和包括形成感兴趣的聚合物的试剂的交联剂混合。然后在这种媒介中诱导聚合以生成含有结合的活性剂的聚合物。随后该聚合物用水或其他适当的溶剂洗涤(ish)，另外纯化以去除微量的未反应杂质，且如有必要，通过物理方式如搅拌、推压使其通过筛孔、超声或其他合适的方式磨碎或破坏该聚合物至希望的颗粒大小。然后以使该活性剂不变性或者另外不降解的方式去除溶剂(通常是水)。一个希望的方法是冻干(冷冻干燥)，但是其他方法(例如真空干燥、空气干燥、喷雾干燥等)是可获得且可使用的。
为将可聚合的基团引入至肽、蛋白质和本发明的其他活性剂，将可用的氨基、羟基、硫醇和其他反应性基团与含有未饱和基团的亲电试剂反应是可能的。例如，未饱和单体包括含有N-羟基琥珀酰亚胺基团、活性碳酸酯(如对硝基苯基碳酸酯、三氯苯基碳酸酯)、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、氧基羰基咪唑、环氧化物、异氰酸酯和醛的未饱和单体、以及属于这类试剂的未饱和的羧甲基叠氮化物和未饱和的邻位吡啶基-二硫化物。未饱和试剂的说明性例子是烯丙基缩水甘油基醚、烯丙基氯化物、烯丙基溴化物、烯丙基碘化物、丙烯酰氯化物、烯丙基异氰酸酯、烯丙基磺酰氯、马来酸酐、马来酸酐与烯丙基醚的共聚物等。
如果局部的环境使这些基团的亲核性增加，那么所有这些赖氨酸活性衍生物(除醛之外)通常能与其他氨基酸如组氨酸的咪唑基和酪氨酸的羟基和半胱氨酸的巯基反应。含有醛官能化的试剂对赖氨酸有特异性。与赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的可用基团反应的这些类型已广泛地记载于文献中，且是本领域技术人员已知的。
在包括氨基的生物活性剂的情况下，这种基团与烯酰(acyloyl)氯化物如丙烯酰氯化物反应以及将可聚合的丙烯酰基引入至该反应的试剂是很方便的。然后在制备聚合物期间如在丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物的交联期间，该官能化的活性剂通过丙烯基连接至聚合物并结合至那里。
在本发明的其他方面，生物活性剂(包括肽、蛋白质、核苷酸和体内有生物活性的其他分子)通过将一种或多种活性剂共价键合至聚合物而共轭稳定，所述聚合物含有作为其整体部分的两个部分亲水性部分(例如直链聚亚烷基二醇)和亲脂性部分(参见如美国专利第5,681,811号)。在一个方面，生物活性剂与含有下述部分的聚合物共价耦合(i)直链聚亚烷基二醇部分、和(ii)亲脂性部分，其中该活性剂、直链聚亚烷基二醇部分和亲脂性部分彼此相关地构象排列以使活性治疗剂增加对酶降解(即，与它在类似的条件下以避免聚合物耦合在那里的未共轭的形式的能力有关)在体内的抵抗。在另一个方面，共轭稳定的制剂有包括生物活性剂与聚山梨酯络合物共价耦合的三维构象，所述聚山梨酯络合物包括(i)直链聚亚烷基二醇部分、和(ii)亲脂性部分，其中该活性剂、直链聚亚烷基二醇部分和亲脂性部分彼此相关地构象排列以使(a)该亲脂性部分从外部可用于该三维构象、和(b)在该组合物中的活性剂增加对酶降解在体内的抵抗。
在另一个相关的方面，提供了多配体共轭的络合物，其包括与甘油三酯骨架部分共价耦合的生物活性剂(这是通过聚亚烷基二醇间隔基基团键合在甘油三酯骨架部分的碳原子上)和至少一种的脂肪酸部分，所述脂肪酸部分直接共价连接在甘油三酯骨架部分的碳原子上或通过聚亚烷基二醇间隔基部分共价结合(参见例如美国专利第5,681,811号)。在这样一个多配体共轭的治疗剂络合物中，该甘油三酯生物活性部分的α’位和β位碳原子可含有脂肪酸部分，该脂肪酸部分通过直接共价键合在甘油三酯生物活性部分或通过聚亚烷基二醇间隔基部分间接共价键合在甘油三酯生物活性部分而连接。或者，脂肪酸部分可直接或通过聚亚烷基二醇间隔基部分与甘油三酯骨架部分的α和α’碳共价连接，其中生物活性治疗剂与甘油三酯骨架部分的γ碳共价耦合，其耦合是直接共价键合至其中或通过聚亚烷基间隔基部分间接键合至其中。应认识到，在本发明的范围内，对于包括该甘油三酯骨架部分的多配体共轭的治疗剂络合物，各种结构的、组合物的、和构象的形式是可能的。进一步认识到，在本发明的范围内，这样的多配体共轭治疗剂络合物中，生物活性剂通过烷基间隔基基团或者其他可接受的间隔基基团，有利地与甘油三酯修饰的骨架部分共价耦合。如在本文所用，该间隔基基团的可接受性是指的空间、组合物的和最终使用的具体可接受性特征。
在本发明的其他方面，提供了共轭稳定的络合物，其包括含有聚山梨酯部分的聚山梨酯络合物，所述聚山梨酯部分包括含有共价耦合至其α、α’和β碳原子的官能化基团的甘油三酯骨架，所述官能化基团包括(i)脂肪酸基团；和(ii)含有生物活性剂或共价键合在那里的部分的聚乙二醇基团，例如键合至该聚乙二醇基团适当的官能度。这种共价键合可直接例如至该聚乙二醇基团的羟基末端官能度，或者这种共价键合可间接例如通过反应性地用末端羧基官能度间隔基基团封端该聚乙二醇基团的羟基末端，以使形成的经封端的聚乙二醇基团含有末端羧基官能度，其中该生物活性剂或部分可共价键合至所述末端羧基官能度。
在本发明的另一个方面，提供了稳定的、水溶性的、共轭稳定的络合物，其包括共价耦合至生理上相容的聚乙二醇(PEG)修饰的糖脂部分的一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、和/或本文公开的其他生物活性剂。在这种络合物中，该生物活性剂可通过在该活性剂的游离氨基酸基团上不稳定的共价键，共价耦合至该生理上相容的PEG修饰的糖脂部分，其中所述不稳定的共价键通过生物化学水解和/或蛋白水解在体内可切断的。该生理上相容的PEG修饰的糖脂部分有利地包括聚山梨酯聚合物，例如包括脂肪酸酯基团的聚山梨酯聚合物，所述的脂肪酸酯基团选自单棕榈酸酯、二棕榈酸酯、单月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、单油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、单硬脂酸酯、二硬脂酸酯和三硬脂酸酯组成的组。在这种络合物中，该生理上相容的PEG修饰的糖脂部分可合适地包括选自脂肪酸聚乙二醇醚和脂肪酸聚乙二醇酯组成的组的聚合物，其中所述脂肪酸例如包括选自月桂酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸组成的组的脂肪酸。
材料的贮存和制备 在本发明的某些方面，本文的组合制剂和/或协同施用方法结合有效量的肽和蛋白质，所述肽和蛋白质可粘附至荷电玻璃上因而减少在容器中的有效浓度。硅烷化容器如硅烷化玻璃容器用于贮存制成品以减少多肽或蛋白质吸收至玻璃容器。
在本发明的其他方面，用于治疗哺乳动物受治疗者的试剂盒包括一种或多种为哺乳动物受治疗者粘膜递送而配制的葡萄糖调节肽化合物的稳定的药物组合物，其中所述组合物有效地减轻在所述受治疗者中下述的一种或多种症状而没有不可接受的不良副作用肥胖、癌症或营养不良或与癌症相关的isting。这种试剂盒进一步包括含有一种或多种葡萄糖调节肽化合物的药物试剂瓶。该药物试剂瓶由药物级别的聚合物、玻璃或其他合适的材料构成。例如，该药物试剂瓶是硅烷化的玻璃瓶。该试剂盒进一步包括用于递送组合物至受治疗者鼻粘膜表面的孔。该递送孔由药物级别的聚合物、玻璃或其他合适的材料构成。该递送孔是，例如硅烷化玻璃。硅烷化技术结合专用的表面清洁技术以硅烷化方法于低压下硅烷化。该硅烷在气相中并在升高温度的表面硅烷化。该方法提供可再生的表面，所述表面具有稳定的、均匀的和功能化的硅烷层，其中所述硅烷层具有单层的特征。该硅烷化的表面防止多肽或本发明的粘膜递送增强剂与玻璃的结合。
该程序有用于制备容纳本发明葡萄糖调节肽组合物的硅烷化的药物试剂瓶。玻璃盘在使用之前通过用双蒸水(ddH2O)漂洗而清洁。然后硅烷盘用95％乙醇漂洗，且丙酮盘用丙酮漂洗。药物试剂瓶在丙酮中声处理10分钟。经丙酮声处理后，试剂瓶在ddH2O盘至少洗涤两次。试剂瓶在0.1M NaOH中声处理10分钟。当该试剂瓶在NaOH中声处理时，在罩(hood)下制备硅烷溶液(硅烷溶液800mL 95％乙醇；96L冰乙酸；25mL缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷)。经NaOH声处理后，试剂瓶在ddH2O盘至少洗涤两次。该试剂瓶在硅烷溶液中声处理3-5分钟。该试剂瓶在100％EtOH盘中洗涤(ished)。该试剂瓶用预纯化N2气干燥，并在使用前于100℃烘箱贮存至少2小时。
鼻喷雾剂产品生产过程可包括制备鼻喷雾剂的稀释液，该稀释液包括约85％的水和鼻喷雾剂组分而没有葡萄糖调节肽。然后测量该稀释液的pH，如有必要用氢氧化钠或盐酸调整至pH 4.0±0.3。该鼻喷雾剂通过非无菌转移该稀释液约85％的最终目标体积至螺帽瓶而制备。加入适当量的葡萄糖调节肽并混合直至完全溶解。测量pH，如有必要用氢氧化钠或盐酸调整至pH 7.0±0.3。加入足够量的稀释液以达到最终目标体积。填充螺帽瓶并固定帽。上文描述的生产过程提出了用于制备初始临床批次的药物产品的方法。这种方法可在优化生产过程的开发过程期间调整。
目前上市的可注射葡萄糖调节肽需要依从FDA法规的无菌生产条件。肠道外施用(包括注射用或输注用胰岛素)需要无菌的(无菌)生产过程。无菌药物生产的现行药品优良生产规范(GMP)包括设计和构建特征的标准(21 CFR§211.42(2005年4月1日))；试验和批准或注射组分、药物产品容器和闭合(closures)的标准(§211.84)；控制微生物污染的标准(§211.113)；以及其他专门的试验要求(§211.167)。非肠道外(非无菌)产品如本发明的鼻内产品，不需要这些专门的无菌生产条件。如应理解，无菌生产过程的要求基本上比那些需要非无菌的产品生产过程更高，并且相应地花费更多。这些花费包括更多的设备资金费用以及更多的生产费用无菌生产的额外设备包括额外的厂房和通风；与无菌生产有关的额外费用包括更多的人力、广泛的质量控制和质量保证、以及行政支持。因此，鼻内葡萄糖调节肽产品的生产费用，如本发明的鼻内葡萄糖调节肽产品的费用，远远少于肠道外施用的葡萄糖调节肽产品的费用。本发明满足葡萄糖调节肽的非无菌生产过程的需要。
可通过将活性化合物以需要的量在适当的溶剂中与上文列举的一种成分或成分的组合结合，来制备无菌溶液。通常，通过结合活性化合物至无菌运载体来制备分散体，所述无菌运载体包括碱性的分散媒介物和从上文列举的成分中需要的其他成分。在无菌粉末的情况下，制备的方法包括真空干燥和冻干，所述冻干产生活性成分和来自最初其无菌过滤的溶液中任何其他希望的成分的粉末。预防微生物的作用可通过不同的抗细菌和抗真菌剂来实现，例如尼泊金酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。
根据本发明粘膜施用允许患者进行治疗的有效自我施用，只要有充分的保障来适当控制和监控给药及副作用。粘膜施用也克服其他施用形式的某些缺点，例如注射剂是疼痛的并使患者接触可能的感染、以及可能存在药物生物利用度的问题。
生物粘附的递送运载体和方法 在本发明的某些方面，本文的组合制剂和/或协同施用方法结合有效量的非毒性生物粘附剂作为辅助的化合物或载体以增强一种或多种生物活性剂的粘膜递送。本文的生物粘附剂显示对靶粘膜的一种或多种组分或表面有一般或特异性的粘附。该生物粘附使所述生物活性剂以希望的浓度梯度保持进入或跨过粘膜以确保甚至大分子(如肽和蛋白质)的渗透进入或通过该粘膜上皮细胞。通常，在本发明的方法和组合物中使用生物粘附剂使肽和蛋白质进入或通过该粘膜上皮细胞的渗透性增强两倍至五倍、通常五倍至十倍。这种上皮细胞渗透的增强通常允许大分子有效的跨粘膜递送，例如递送至鼻上皮细胞的基部或进入邻近的细胞外室或血浆或CNS组织或流体。
这种增强的递送大大提高了生物活性肽、蛋白质和其他大分子治疗药物类递送的有效性。这些结果将部分取决于化合物的亲水性，因而与水不溶性化合物相比亲水性药物类将实现更多的渗透。除这些作用之外，使用生物粘附剂以增强药物在粘膜表面的持久性(persistence)能得出延长的药物递送的蓄积(reservoir)机理，因而一旦在表面的材料耗尽，则化合物不仅能渗透跨过粘膜组织而且可反扩散至粘膜表面。
各种用于本发明的新型方法和组合物的合适的口服施用生物粘附剂在本领域中公开，美国专利第3,972,995、4,259,314、4,680,323、4,740,365、4,573,996、4,292,299、4,715,369、4,876,092、4,855,142、4,250,163、4,226,848、4,948,580号和美国再公告专利第33,093号。通过检测它们保留和释放葡萄糖调节肽的能力以及通过它们在结合本文活性剂后与粘膜表面相互作用的能力，能容易地评价本发明的方法和组合物中不同生物粘附聚合物作为粘膜(如鼻)递送平台的潜力。此外，应用公众已知的方法以检测在粘膜施用的位点上所选的聚合物与组织的生物相容性。当靶粘膜被粘液覆盖时(即在没有粘液溶解或粘液清除处理时)，其能用作连接至底层粘膜上皮细胞的连接物(connecting)。因此，本文所用的术语“生物粘附剂”也包括用于增强本发明的生物活性剂粘膜递送的粘膜粘附化合物。然而，通过在粘液层和底层组织(特别在发生快速粘液清除的鼻表面上)之间不完全或短暂的粘着，可以限制通过对粘液凝胶层的粘附介导的与粘膜组织的接触粘附。在这个方面，连续地分泌粘液糖蛋白，且它们从细胞或腺体释放后，立即形成粘弹性的凝胶。然而，通过机械的、酶促的和/或纤毛作用连续地溶蚀该粘附凝胶层的腔表面。在这些添加剂更突出或希望更长粘附时间的地方，本发明的协同施用方法和组合制剂方法可进一步结合上文公开的粘液溶解剂和/或纤毛停滞方法或纤毛停滞剂。
通常，用于本发明的粘膜粘附聚合物是天然或合成的大分子，其通过络合物机理但是非特异性地粘附在润湿的粘膜组织表面。除这些粘膜粘附聚合物之外，本发明也提供结合生物粘附剂的方法和组合物，所述生物粘附剂借助于特异性的包括受体介导的相互作用直接粘附在细胞表面而不是粘液。以这种特异性方式起作用的生物粘附剂的一个例子是已知为凝集素的化合物的组。这些糖蛋白具有特异性识别并结合至糖分子(例如糖蛋白或糖脂)的能力，所述糖分子形成鼻内上皮细胞膜的部分，且可被认为是“凝集素受体”。
在本发明的某些方面，用于增强生物活性剂鼻内递送的生物粘附材料包括亲水性基质，例如能粘附在润湿的粘液表面的水溶性或溶胀性的聚合物或聚合物混合物。这些粘附剂可以配制成软膏、水凝胶(参见上文)薄膜、和其他应用形式。经常，这些粘附剂与生物活性剂一起混合以实现该活性剂缓慢释放或局部递送。一些与其他成分配制以促进该活性剂通过鼻粘膜的渗透，例如进入个体的循环系统。
不同的聚合物(天然和合成的聚合物)在生理的条件下显示有效地结合至粘液和/或粘膜上皮细胞表面。通过机械杆或剪切试验能容易地测量这种相互作用的强度。当用于润湿的粘膜表面时，很多干燥的材料自发地粘附，至少轻微地。这种最初的接触后，一些亲水性材料开始通过吸收、溶胀或毛细力(capillary force)吸引水，且如果从底层的底物或聚合物组织界面吸收水，那么这种粘附可充分地实现增强生物活性剂的粘膜吸收的目的。这种“通过水合的粘附作用”非常坚牢，但适于使用这种机理的制剂必须解决当该剂型转变为水合粘液时所继续的溶胀。这是为很多有用于本发明的水状胶体特别是一些纤维素衍生物设计的，所述水状胶体当其用于预水合的状态时通常为非粘附的。然而，当这种材料以干聚合物粉末、微球或膜类型递送的形式应用时，粘膜施用的生物粘附药物递送系统在本发明中是有效的。
其他聚合物粘附于粘膜表面，不仅在其以干燥状态而且在其以完全水合的状态，以及在过量水存在下时。粘膜粘附剂的选择因此需要考虑这些条件(生理以及物理-化学的)，在所述的条件下与组织的接触将形成并保持。特别是，通常存在于预期粘附位点的水分或水的量以及主要(prevailing)的pH值已知将严重影响不同聚合物的粘膜粘附的结合强度。
在过去的20年间已建立并研究一些聚合物生物粘附药物递送系统，但并不是总成功。然而，目前用于临床应用的各种载体涉及牙科、骨科、眼科和外科用途。例如，基于丙烯酸的水凝胶已广泛地用于生物粘附装置。由于在部分溶胀态下柔性和非研磨的特征(这将减少对接触的组织引起损害的磨损)，基于丙烯酸的水凝胶很好地适用于生物粘附。此外，它们在溶胀态中的高渗透性使未反应的单体、未交联的聚合物链和引发剂在聚合后从基质洗出(washed out)，这是一个选择用于本发明的生物粘附材料重要的特征。基于丙烯酸的聚合物装置显示非常高的粘附键合强度。为控制肽和蛋白质药物的粘膜递送，本发明的方法和组合物任选地包括载体(例如起部分保护生物活性剂不受蛋白水解破坏作用的聚合物递送运载体)的使用，而同时提供增强肽或蛋白质渗透进入或通过该鼻粘膜。在本文中，生物粘附的聚合物证实有增强口服药物递送的巨大潜力。例如，对大鼠与粘膜粘附聚(丙烯酸)衍生物聚卡波菲的1％(w/v)盐水分散体一起十二指肠施用的9-脱甘氨酰胺、8-精氨酸加压素(DGAVP)的生物利用度，与不括这种聚合物的肽类药物的水溶液相比增加3-5倍。
聚(丙烯酸)类型的粘膜粘附聚合物是一些肠蛋白酶的强效抑制剂。通过这类聚合物对二价阳离子(如钙离子或锌离子)的强亲和性来解释这种酶抑制的机理，所述二价阳离子是金属蛋白酶(如胰蛋白酶和靡蛋白酶)的必要的辅助因子。据报道，聚(丙烯酸)使蛋白酶失去其辅助因子，这诱导该酶蛋白的不可逆转的结构变化，所述酶蛋白伴有酶活性的丧失。同时，其他粘膜粘附聚合物(例如一些纤维素衍生物和壳聚糖)在某些条件下不会抑制蛋白水解酶。与包括的用于本发明的其他酶抑制剂(都是相对较小的分子，例如抑肽酶、抑氨肽酶B素)对比，根据这些分子的大小抑制性聚合物的经鼻吸收有可能很少，因而消除可能的不良副作用。因此，粘膜粘附聚合物特别是聚(丙烯酸)类型可用作吸收促进粘附剂和酶保护剂以增强肽和蛋白质药物的控制递送，特别当考虑到安全性时。
除保护不受酶降解之外，用于本发明的生物粘附剂和其他聚合或非聚合吸收促进剂可直接增强粘膜对生物活性剂的渗透性。为促进大的亲水性分子(例如肽和蛋白质)的转运跨过鼻上皮细胞屏障，已假设粘膜粘附聚合物和其他试剂产生增强渗透的作用，超过通过延长递送系统粘膜前停留时间而产生的渗透作用。据报道药物血浆浓度的时程表明生物粘附微球引起胰岛素跨过鼻粘膜的渗透性有个急但短暂的增加。据报道，用于本发明的其他粘膜粘附聚合物(例如壳聚糖)甚至当其用作水溶液或凝胶时，增强某些粘膜上皮细胞的渗透性。报道的另一个直接影响上皮细胞渗透性的粘膜粘附聚合物是透明质酸和其酯衍生物。在本发明的协同施用和/或组合制剂方法和组合物中特别有用的生物粘附剂是壳聚糖、以及它的类似物和衍生物。壳聚糖是非毒性、生物相容的和生物可降解的聚合物，由于它的低毒和良好的生物相容性这些有利的性质，可广泛地用于药物和医疗用途。壳聚糖是用碱将甲壳素N-脱乙酰化制备的天然聚氨基醣。如在本发明的方法和组合物中使用的，壳聚糖延长了葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及本文公开的其他生物活性剂在应用的粘膜位点的停留。这种施用的方式也能提高患者顺从性和接受性。如本文进一步提供，本发明的方法和组合物将任选地包括新型壳聚糖衍生物或壳聚糖化学修饰的形式。一种用于本发明的新型衍生物称为β-[1→4]-2-胍基-2-脱氧-D-葡萄糖聚合物(聚-GuD)。壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰化产物，该天然存在的聚合物已经广泛地用于制备口服和鼻内制剂的微球。也已建议将该壳聚糖聚合物用作肠道外药物递送的可溶性载体。在本发明的一个方面，环-甲基异脲用于将壳聚糖胺转化为它的胍盐部分。例如，通过在pH高于8.0时壳聚糖和环-甲基异脲的平衡-标准溶液之间的反应制备该胍盐化合物。
分类为用于本发明的生物粘附剂的其他化合物通过介导特异性的相互作用而作用，且通常分类为在生物粘附化合物和粘膜上皮细胞表面的组分的互补结构之间的“受体-配体相互作用”。很多天然的例子说明这种特异性结合的生物粘附的形式，例如通过凝集素-糖相互作用举例说明。凝集素是与多糖或复合糖结合的非免疫来源的(糖)蛋白。
已研究一些植物凝集素作为可能的药物吸收促进剂。一个植物凝集素 -菜豆血凝素(Phaseolus vulgaris hemagglutinin)(PHA)显示在对大鼠喂食后高口服生物利用度超过10％。番茄(Lycopersicon esculeutum)凝集素(TL)显示对不同方式的施用是安全的。
总之，上述的生物粘附剂在本发明的组合制剂和协同施用方法中是有用的，其任选地结合有效量和形式的生物粘附剂以延长持久性或另外增强一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、以及其他生物活性剂的粘膜吸收。该生物粘附剂可在本发明的组合制剂中作为辅助的化合物或添加剂协同施用。在某些实施方案中，该生物粘附剂用作“药物胶(glue)”，而在其他实施方案中该生物粘附剂的辅助递送或组合配制有助于增强该生物活性剂与鼻粘膜的接触，在一些例子中通过促进与上皮细胞“受体”的特异性受体-配体相互作用，以及在其他例子中通过增强上皮细胞的渗透性以显著增加在递送的靶位点(例如肝、血浆或CNS组织或流体)测量的药物浓度梯度。用于本发明的其他生物粘附剂用作酶(例如蛋白酶)抑制剂以增强粘膜施用的生物治疗药物的稳定性，所述生物治疗药物协同或在与该生物粘附剂组合的制剂中递送。
脂质体和胶束递送运载体 本发明的协同施用方法和组合制剂任选地结合有效的基于脂质或脂肪酸的载体、处理剂或递送运载体，以提供用于葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物以及其他生物活性剂的粘膜递送的改进制剂。例如，提供用于粘膜递送的各种制剂和方法，其包括一种或多种这些活性剂(例如肽或蛋白质)，所述活性剂通过(或与其协同施用)脂质体、混合的胶束载体或乳剂而进行混合或包封，以提高化学和物理的稳定性和延长通过粘膜递送的该生物活性剂的半衰期(例如通过减少对蛋白水解、化学修饰和/变性的敏感性)。
在本发明的某些方面，用于生物活性剂的专门递送系统包括称为脂质体的小的脂质运载体。这些脂质体通常由天然的、生物可降解的、非毒性的和非免疫原性的脂质分子制备，且能有效地捕获或结合药物分子(包括肽和蛋白质)进入它们的膜或在膜的上面。通过下述事实增加脂质体作为本发明的肽和蛋白质递送系统的吸引力-包封的蛋白质可在囊泡(vesicles)内它们优选的水环境中保持，同时所述脂质体膜保护它们不受蛋白水解和其他影响稳定性因素的干扰。尽管并不是所有已知的脂质体制备方法在肽和蛋白质的包封中可行(由于它们独特的物理和化学性质)，但是一些方法允许这些大分子的包封，而该大分子基本上没有失活。
各种方法可用于制备用于本发明的脂质体，美国专利第4,235,871、4,501,728和4,837,028号。为在脂质体递送中使用，该生物活性剂通常可被捕获至该脂质体中或脂质体囊泡中、或结合至该囊泡的外部。
像脂质体一样，未饱和的长链脂肪酸也具有增强粘膜吸收的活性，且能形成闭合的具有双层样结构的囊泡(所谓的“ufasomes”)。例如，使用油酸捕获用于本发明粘膜(例如鼻内)递送的生物活性肽和蛋白质，可以形成这些囊泡。
用于本发明的其他递送系统将聚合物和脂质体组合使用以联合运载体(如包封在该天然聚合物纤维蛋白中)有利的性质。此外，通过使用共价交联剂和将抗纤维蛋白溶解剂加至该纤维蛋白聚合物，来控制生物治疗化合物从这种递送系统的释放。
用于本发明的更简单化的递送系统包括使用阳离子脂质作为递送运载体或载体，其能有效地使用以提供在该脂质载体和荷电的生物活性剂(如蛋白质和聚阴离子核酸)之间的静电相互作用。这允许将药物有效地包装成某种形式，所述形式适于粘膜施用和/或随后递送至系统性的室。
用于本发明的其他递送运载体包括长链和中链脂肪酸，以及表面活性剂与脂肪酸相混合的胶束。考虑到它们自己转运跨过粘膜表面，大多数天然的以酯形式存在的脂质具有重要的意义。已证实连接有极性基团的游离脂肪酸和它们的单甘油酯以混合胶束的形式在肠内的屏障上用作渗透增强剂。游离脂肪酸(具有链长从12至20个碳原子的羧酸)和其极性衍生物的屏障修饰作用的这个发现已激发对这些物质作为粘膜吸收增强剂的应用的广泛研究。
为在本发明的方法中使用，长链脂肪酸特别是膜融合(fusogenic)脂质(未饱和脂肪酸和单甘油酯如油酸、亚油酸、亚油酸、甘油单油酸酯等)提供有用的载体以增强葡萄糖调节肽、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂的粘膜递送。也已显示中链脂肪酸(C6至C12)和单甘油酯具有增强药物在肠内吸收的活性，且其能适用于本发明粘膜递送制剂和方法。而且，中链和长链脂肪酸的钠盐是有效的递送运载体和用于本发明生物活性剂粘膜递送的吸收增强剂。因此，脂肪酸可以用于钠盐的可溶形式或通过添加非毒性的表面活性剂(例如聚氧乙烯氢化蓖麻油、牛磺胆酸钠等)使用。在本发明中有用的其他脂肪酸和混合的胶束制品包括但不限于辛酸钠(C8)、癸酸钠(C10)、月桂酸钠(C12)或油酸钠(C18)，任选地与胆汁盐如甘胆酸盐和牛磺胆酸盐组合。
聚乙二醇化 本发明提供的其他方法和组合物涉及通过共价连接聚合物材料(例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸)而化学修饰生物活性肽和蛋白质。所得的共轭肽和蛋白质保持它们粘膜施用的生物活性和溶解度。在选择性的实施方案中，葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、以及其他生物活性肽和蛋白质共轭至聚亚烷基氧化物聚合物，特别是聚乙二醇(PEG)。美国专利第4,179,337号。
用于本发明的胺类反应性PEG聚合物包括具有2000、5000、10000、12000和20000分子量的SC-PEG；U-PEG-10000、NHS-PEG-3400-生物素；T-PEG-5000、T-PEG-12000和TPC-PEG-5000。生物活性肽和蛋白质PEG化可通过羧基位点(例如除羧基末端之外的天冬氨酸或谷氨酸基团)的修饰来实现。已描述PEG-酰肼用于在酸性条件下选择性地修饰碳二亚胺活化的蛋白质羧基。或者，可以使用生物活性肽和蛋白质的双官能PEG修饰。在一些程序中，荷电的氨基酸残基(包括赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)具有在蛋白质表面成为溶剂可接近的显著性趋向。
活性剂的其他稳定性修饰 除PEG化之外，通过经由共轭至其他已知的保护化合物或稳定化合物(例如通过用连接至一种或多种载体蛋白质(如一种或多种免疫球蛋白链)的活性肽、蛋白质、类似物或模拟物创建融合蛋白)保护该活性剂，可以修饰用于本发明的生物活性剂如肽和蛋白质以增加循环半衰期。
制剂和施用 本发明的粘膜递送制剂包括通常与一种或多种药学上可接受的载体和任选的其他治疗成分一起组合的葡萄糖调节肽、类似物和模拟物。该载体必须是“药学上可接受的”，是指与该制剂的其他成分可相容的且对受治疗者没有引起不可接受的有害的作用。这种载体如上文所描述，或者另外为药理学领域的技术人员众所周知。希望，该制剂不应该包括例如酶或氧化剂的物质，所述物质与待施用的生物活性剂已知为不相容的。该制剂可通过药学领域众所周知的任何方法来制备。
在本发明的组合物和方法中，通过各种粘膜施用方式(包括口服、直肠、阴道、鼻内、肺内或透皮递送)，或通过局部递送至眼睛、耳朵、皮肤或其他粘膜表面，可以对受治疗者施用葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂。任选地，通过非粘膜路径(包括肌内、皮下、静脉内、房内、骨关节内、腹腔内或胃肠外路径)，葡萄糖调节肽蛋白质、类似物和模拟物、以及本文公开的其他生物活性剂可协同施用或辅助施用。在其他选择性的实施方案中，通过直接与来源于哺乳动物受治疗者的细胞、组织或器官相接触(例如作为活体外组织或器官治疗制剂的组分，所述制剂包括在合适的、液体或固体载体中的生物活性剂)，该生物活性剂可在活体外施用。
可在水溶液中作为鼻或肺喷雾施用根据本发明的组合物，且可以喷雾的形式通过各种本领域技术人员已知的方法分散所述组合物。用于分散液体作为鼻喷雾的优选的系统在美国专利第4,511,069号中公开。该制剂可存在于多剂量容器中，例如在美国专利第4,511,069号公开的密封的分散系统中。其他气溶胶递送形式可包括例如压缩空气喷雾器、射流喷雾器、超声喷雾器、压电喷雾器，其递送溶解或悬浮于药物溶剂(例如水、乙醇或其混合物)的生物活性剂。本发明的气溶胶制剂可具有直径为1至700微米大小的液滴。
本发明的组合物和制剂可具有从50至350mOsm/L，或从50至300mOsm/L的同渗浓度。张力调节剂(tonicifier)可用于调整制剂的同渗浓度、渗透压或张力。
本发明的鼻和肺喷雾溶液通常包括药物或待递送的药物，其任选地与表面活性剂如非离子表面活性剂(如聚山梨酯-80)和一种或多种缓冲剂一起配制。在本发明的一些实施方案中，鼻喷雾溶液进一步包括推进剂。该鼻喷雾溶液的pH任选地介于约pH 3.0到9之间，优选为7.0±0.5。用于这些组合物的合适的缓冲剂如上文所述、或以其他方式为本领域已知。其他组分可加入以提高或保持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体。合适的防腐剂包括但不限于苯酚、尼泊金甲酯、尼泊金酯、间甲酚、硫柳汞、氯代丁醇、苯扎氯铵(benzylalkonimum chloride)、苯甲酸钠等。合适的表面活性剂包括但不限于油酸、脱水山梨醇三油酸酯、聚山梨酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱以及各种长链二甘油酯和磷脂。合适的分散剂包括但不限于乙二胺四乙酸等。合适的气体包括但不限于氮气、氦气、括氯氟烃(CFC)、氢氟烷(HFC)、二氧化碳、空气等。
在选择性的实施方案中，将粘膜制剂作为干粉制剂施用，所述干粉制剂包括以适当颗粒大小或者在适当的颗粒大小范围内的干燥(通常冻干)的形式用于鼻内递送的生物活性剂。适于在鼻或肺通道中沉积的最小颗粒大小经常为约0.5μ质量中位当量气动直径(mass median equivalentaerodynamic diameter)(MMEAD)，通常为约1μMMEAD，更通常为约2μMMEAD。适于在鼻通道中沉积的最大颗粒大小经常为约10μMMEAD，通常为约8μMMEAD，更通常为约4μMMEAD。在这些大小范围中的鼻内可呼吸的粉末可通过各种常规技术例如气流粉碎、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界流体冷凝等制备。这些适当MMEAD的干燥粉末可以经由常规的干燥粉末吸入器(DPI)对患者施用，所述干燥粉末吸入器依赖于该患者的呼吸(经肺或鼻吸入)以分散该粉末至雾化的量。或者，经由使用外部电源分散该粉末至雾化量的空气辅助装置例如柱塞泵，可施用该干燥粉末。
干燥粉末装置通常需要在从约1mg至20mg范围内的粉末量以产生单一雾化剂量(“喷”)。如果生物活性剂需要或希望的剂量低于所述量，则粉末状活性剂通常与药物干燥增量剂粉末组合以提供需要的总粉末量。优选的干燥增量剂粉末包括蔗糖、乳糖、右旋糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、人血清白蛋白(HSA)和淀粉。其他合适的干燥增量剂粉末包括纤维二糖、葡聚糖、麦芽三糖、果胶、柠檬酸钠、抗坏血酸钠等。
为配制用于本发明的粘膜递送组合物，生物活性剂可以与不同药学上可接受的添加剂组合，以及用于该活性剂分散的基质或载体。希望的添加剂包括但不限于pH控制剂如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸、乙酸等。而且，可以包括局部麻醉剂(例如苯甲醇)、等渗剂(例如氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸收抑制剂(例如吐温80)、增溶剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物是液体时，该制剂的张力(与所用的0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力测量一致)通常可调整至一定值，在所述值时没有实质上不可逆转的组织损害在施用位点的鼻粘膜中发生。通常，该溶液的张力被调整至为约1/3至3的值，更通常为1/2至2，且最通常为3/4至1.7。
生物活性剂可分散于基质或运载体中，所述基质或运载体包括具有分散该活性剂和任何希望的添加剂的能力的亲水性化合物。该基质可选自范围广泛的合适载体，包括但不限于聚羧酸的共聚物或其盐、含有其他单体(例如甲基(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸等)的羧酸酐(如马来酸酐)、亲水性乙烯基聚合物(如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮)、纤维素衍生物(如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等)和天然聚合物(如壳聚糖、胶原、海藻酸钠、明胶、透明质酸和其非毒性金属盐)。通常，生物可降解聚合物选择作为基质或载体，例如聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚羟丁酸、聚(羟基丁酸-羟基乙酸)共聚物和其混合物。可选地或此外，合成的脂肪酸酯如聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯等可以用作载体。亲水性聚合物和其他载体可单独或组合使用，且增强的结构整体性可通过部分结晶、离子键合、交联等赋予该载体。所述载体可以各种形式提供，包括直接应用至鼻粘膜的流体或粘性溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球和膜。所选的载体在本文中的使用可导致促进该生物活性剂的吸收。
该生物活性剂可根据各种方法与基质或载体组合，且该活性剂的释放可通过扩散、载体的崩解、水通道的相关制剂。在一些环境下，该活性剂分散于由合适的聚合物如2-氰基丙烯酸异丁酯制备的微囊(微球)或纳米胶囊(纳米球)中，并分散于应用至该鼻粘膜的生物相容性分散介质中，所述分散介质在延长的时间内产生持续的递送和生物活性。
为进一步增强本发明药物制剂的粘膜递送，包括该活性剂的制剂也可包括亲水性低分子量化合物作为基质或赋形剂。这种亲水性低分子量化合物提供通道介质，通过所述通道介质水溶性活性剂如生理活性肽或蛋白质可通过该基质扩散至吸收该活性剂的身体表面。该亲水性低分子量化合物任选地从粘膜或施用环境中吸收水分且溶解该水溶性活性肽。亲水性低分子量化合物的分子量通常不超过10000，且优选不超过3000。示例性的亲水性低分子量化合物包括多元醇化合物，例如低聚糖、二糖和单糖如蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖(gentibiose)、丙三醇和聚乙二醇。用作本发明载体的亲水性低分子量化合物的其他例子包括N-甲基吡咯烷酮和醇(如低聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)。这些亲水性低分子量化合物可以单独使用、或与另一种或鼻内制剂的其他活性或惰性组分组合使用。
本发明的组合物可选择性地包括药学上可接受的如达到近似生理条件所需的载体物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。对固体组合物来说，可以使用常规的非毒性药学上可接受载体，包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
施用生物活性剂的治疗组合物也可以配制成溶液、微乳或其他适于高浓度活性成分的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)、以及其合适的混合物。例如通过使用包衣料如卵磷脂、通过保持在分散制剂的例子中希望的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂，可以保持溶液适当的流动性。在很多例子中，期望在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。该生物活性剂的延长吸收可以通过在该组合物中包括延缓吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶来实现。
在本发明的某些实施方案中，以择时释放的制剂施用该生物活性剂，例如在包括缓慢释放的聚合物的组合物中。该活性剂可以与保护抵抗快速释放的载体一起制备，例如控释运载体如聚合物、微囊化递送系统或生物粘附凝胶。在本发明的不同组合物中，该活性剂的延长递送可以通过在该组合物中包括延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝水凝胶和明胶来实现。当需要该生物活性剂的控释制剂时，适合根据本发明使用的控释粘合剂包括任何对该活性剂惰性且能结合该生物活性剂的生物相容性控释材料。很多这种材料在本领域是已知的。有用的控释粘合剂是在经鼻内递送后的生理条件下(例如在鼻粘膜表面或经粘膜递送后在体液的存在下)缓慢代谢的材料。适当的粘合剂包括但不限于最初在本领域的持续释放制剂中使用的生物相容性聚合物和共聚物。这种生物相容性化合物是非毒性且对周围组织惰性，并不会触发显著的不良副作用如鼻刺激性、免疫反应、发炎等。它们代谢成也是生物相容的且易从体内清除的代谢产物。
示例性的用于本文的聚合物材料包括但不限于由具有可水解的酯键的共聚和均聚的聚酯获得的聚合物基质。很多这些聚合物是本领域已知的生物可降解的且生成没有毒性或低毒的降解产物。示例性的聚合物包括聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)、聚(DL-乳酸-羟基乙酸)共聚物(DLPLGA)、聚(D-乳酸-羟基乙酸)共聚物(D PLGA)和聚(L-乳酸-羟基乙酸)共聚物(L PLGA)。其他有用的生物可降解或生物可溶蚀的聚合物包括但不限于这类聚合物如聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯(aprolactone)-乳酸)共聚物、聚(ε-己内酯(aprolactone)-羟基乙酸)共聚物、聚(β-羟丁酸)、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯(acrilate))；水凝胶(如聚(甲基丙烯酸羟乙酯))、聚酰胺、聚(氨基酸)(即L-亮氨酸、谷氨酸、L-天冬氨酸等)、聚(酯脲)、聚(2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚缩醛聚合物、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚马来酰亚胺、多糖和其共聚物。制备这种制剂的很多方法通常是本领域技术人员已知的。其他有用的制剂包括控释组合物，例如微囊，美国专利第4,652,441和4,917,893号；在制备微囊和其他制剂中有用的乳酸-羟基乙酸共聚物，美国专利第4,677,191和4,728,721号；水溶性肽的持续释放组合物，美国专利第4,675,189号。
对于鼻和肺递送，用于控制治疗性液体的气溶胶分散为喷雾的系统是公众已知的。在一个实施方案中，借助专门构建的机械泵阀门递送计量剂量的活性剂，美国专利第4,511,069号。
剂量 出于预防和治疗的目的，本文公开的生物活性剂可以单一推注(bolus)递送对受治疗者施用，在延长的时间期间经由连续的递送(例如连续的透皮、粘膜或静脉内递送)，或在重复施用的方案中(例如通过每小时、每天、每周的重复施用方案)。在本文中，葡萄糖调节肽的有效治疗量可以包括在延长的预防或治疗方案中的重复剂量，所述方案能产生临床有效的结果以减缓与如上文列出的靶疾病或病症相关的一种或多种症状或可检测的病症。检测本文中有效的剂量通常基于动物模型研究(后进行人临床试验)，并通过检测能显著减少受治疗者的靶疾病症状或病症的发生率或严重性的有效剂量和施用方案来指导。在这个方面，合适的模型包括例如小鼠、大鼠、猪、猫、非人灵长类以及本领域已知的其他可接受的动物模型受治疗者。或者，有效的剂量可以使用体外模型来检测(例如免疫学分析测定和组织病理学分析测定)。使用这些模型，通常仅需要普通的计算和调整来检测施用治疗有效量(例如，鼻内有效、透皮有效、静脉内有效、或肌内有效以引起希望的反映的量)的生物活性剂的适当浓度和剂量。
在选择性的实施方案中，本发明提供用于葡萄糖调节肽鼻内递送的组合物和方法，其中通过鼻内有效的剂量方案重复施用所述葡萄糖调节肽化合物，所述剂量方案涉及在每天或每周时间表期间对受治疗者的多次施用该葡萄糖调节肽，以保持在延长的给药期间葡萄糖调节肽治疗性有效升高的和降低的脉动(pulsatile)水平。该组合物和方法提供葡萄糖调节肽化合物，其中受治疗者每天1至6次自己施用在鼻制剂中的所述葡萄糖调节肽化合物，以保持在8小时至24小时延长的给药期间葡萄糖调节肽治疗有效升高的和降低的脉动水平。
试剂盒 本发明也包括试剂盒、包装和多容器单元，其中包括用于预防和治疗哺乳动物受治疗者的疾病和其他病症的上述药物组合物、活性成分、和/或其施用的工具。简要来说，这些试剂盒包括容器或制剂，其含有与本文公开的粘膜递送增强剂组合配制在用于粘膜递送的药物制品中的一种或多种葡萄糖调节肽蛋白质、类似物或模拟物和/或其他生物活性剂。
本发明的鼻内制剂可以使用任何喷雾瓶或注射器、或通过滴注而施用。鼻喷雾瓶的一个例子是“Nasal Spray Pump w/Safety Clip(有安全夹的鼻喷雾泵w)”Pfeiffer SAP # 60548，其每次喷射(squirt)递送0.1mL的剂量且其汲取管(diptube)长度为36.05mm。这从美国Princeton，NJ.的Pfeiffer公司购得。
气溶胶鼻施用葡萄糖调节肽 我们已发现使用鼻喷雾剂或气溶胶可以鼻内施用GRP。令人惊奇的是，因为已显示由于在制备该喷雾剂或气溶胶中致动器(actuator)产生的机械力，很多蛋白质和肽被剪切或变性。在这个领域中下述的定义是有用的。
1.气溶胶-在压力下包装且包含通过启动(activation)适当的阀门系统而释放的治疗活性成分的产品。
2.计量气溶胶-由计量剂量阀门构成的加压剂型，所述计量剂量阀门通过每次启动可递送均匀量喷雾。
3.粉末气溶胶-在压力下包装且包含粉末形式的治疗活性成分的产品，所述粉末通过启动适当的阀门系统释放。
4.喷雾气溶胶-利用压缩的气体作为推进剂以提供将产品作为湿喷雾驱出所需的力量的产品；它通常应用于在含水溶剂中的药物溶液。
5.喷雾剂-通过空气或流的喷射精细分开的液体。鼻喷雾药物产品包含溶解或悬浮于非加压分配器的赋形剂溶液或混合物中的治疗活性成分。
6.计量喷雾剂-由通过每次启动可分配特定量喷雾的阀门组成的非加压剂型。
7.悬浮喷雾剂-包含以过程(course)液滴或作为精细分开固体的形式分散于液体运载体中的固体颗粒的液体制品。
通过将计量的鼻喷雾泵作为药物递送装置(“DDD”)来表达气溶胶喷雾的流体动力学特征。喷雾特征是美国食品药物管理局“FDA”批准新型和已有的鼻喷雾泵的研究和开发、质量确保和稳定性试验程序的规章所要求递交的主要部分。
已发现该喷雾的几何结构的完全表征是鼻喷雾泵的全面性能最好的指标。特别是，该喷雾离开装置时的发散角测量值(柱几何形状)；该喷雾的横截面椭圆率、均匀性和颗粒/液滴分布(喷流型(spray pattern))；已发现显示喷雾的时间进展是在鼻喷雾泵的表征中最具代表性的性能量。在质量保证和稳定性试验期间，柱几何形状和喷流型测量值是用于验证与批准的鼻喷雾泵数据标准一致性和均匀性的主要指标。
定义 柱高-从该致动器顶端至柱角度成为非线性(因破坏线性流)所在的点的测量值。基于数字图像的视觉检测，以及为建立与喷流型的最远测量点一致的宽度的测量点，本研究限定30mm的高度。
长轴-在以基础单位(mm)跨过COMw的拟合喷流型中可拉出的最大的弦。
短轴-在以基础单位(mm)跨过COMw的拟合喷流型中可拉出的最小的弦。
椭圆率-长轴与短轴的比率，优选在1.0和1.5之间，更优选在1.0和1.3之间。
D10-样品总液体体积的10％由更小直径(μm)液滴组成的液滴的直径。
D50-样品总液体体积的50％由更小直径(μm)液滴组成的液滴的直径，也称为质量中位直径。
D90-样品总液体体积的90％由更小直径(μm)液滴组成的液滴的直径。
跨径-分布宽度的测量值，该数值越小，分布的范围越窄。跨径计算如下(D90-D10)/D50。
％RSD-百分比相对标准偏差，标准偏差除以该系列的平均值再乘以100，也称为％CV。
容积-通过每次启动由递送装置排出的液体或粉末的体积，优选在0.01mL和约2.5mL之间，最优选0.02mL和0.25mL之间。
由此通过引用分别将本文引证的所有公开物、参考文献、专利、专利公开物和专利申请的全部内容具体地结合至本文。
尽管本发明已就某些实施方案进行了描述，并且为示例的目的列出了很多细节，但是对技术人员来说显而易见的是，本发明包括其他的实施方案，并且在没有偏离本发明的情况下本文描述的一些细节可有相当大的改变。本发明包括这种其他的实施方案、调整和等同物。特别地，本发明包括不同示例性的组分和实施例的特征、术语或要素的任何组合。
本文术语“一种”、“这种”以及类似的术语在描述本发明和在权利要求中的使用可解释为包括单数和复数。术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”可解释为开放式的术语，其是指，例如“包括但不限于”。本发明数值范围的引用是单独地指每个离散数值落在该范围内(如果它在本文单独地引用)，不管在该范围中一些数值是否清楚地引用。本文使用的具体数值应理解为示例性的，并不是限制本发明的范围。
本文所给出的实施例以及本文所用的示例性语言只是用于说明的目的，并不是用来限制本发明的范围。
实施例 实施例1 门冬胰岛素制剂 表1描述12种门冬胰岛素制剂，在体外使用用于跨上皮电阻测定(TER)、细胞存活率测定(MTT)、乳酸脱氢酶细胞死亡测定(LDH)和组织渗透测定的EpiAirway Model System进行测试。结果用于确定哪种制剂能达到最大程度的组织渗透和TER减少，而没有显著的细胞毒性。
门冬胰岛素是胰岛素类似物，其与常规人胰岛素同源，除在B28位点门冬氨酸单取代脯氨酸之外。NovoLog(NovoLogTM；Novo NordiskPharmaceuticals)是无菌的、水性、澄清的且无色的溶液，其包含门冬胰岛素(B28门冬常规人胰岛素类似物)100单位/mL、甘油16mg/mL、苯酚1.50mg/mL、间甲酚1.72mg/mL、锌19.6μg/mL、二水合磷酸氢二钠1.25mg/mL和氯化钠0.58mg/mL。NovoLog pH为7.2-7.6。产生新型门冬胰岛素制剂。所制造的每个制剂的总体积为0.5mL。该制剂包含不同浓度的门冬胰岛素、NovoLog稀释液和赋形剂甲基-β-环糊精M-β-CD)、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱以及依地酸二钠(EDTA)，单独或其组合。不含赋形剂的对照也包括在本研究中。如有必要，将少量2N HCl或NaOH加至该制剂中直至达到期望的pH。用于制备制剂的试剂如表2所示。
表1体外研究的门冬胰岛素制剂 表2门冬胰岛素制剂试剂 实施例2 鼻粘膜递送-渗透动力学和细胞毒性 下述的方法通常用于评价在本发明制剂和方法中的胰岛素鼻粘膜递送参数、动力学和副作用，以及测定本文公开的用于与门冬胰岛素组合制剂或协同施用的不同粘膜递送增强剂的效力和特征。在一个示例性的实验方案中，证明了如上文公开的与生物活性治疗剂(以门冬胰岛素为例)组合的鼻内递送增强剂的渗透动力学和不具备不可接受的细胞毒性。
细胞培养 MatTek公司(Ashland，MA)开发了作为衬砌呼吸道的假复层上皮模型的EpiAirway系统。该上皮细胞在多孔膜底的细胞培养插入物(cell cultureinsert)上在气-液表面生长，这导致细胞分化至高度极化的形态。顶面(apicalsurface)是具有微绒毛的超微结构的纤毛，且该上皮细胞产生粘液(通过免疫印迹法已经证实粘蛋白的存在)。该插入物直径为0.875cm，其表面积为0.6cm2。在运送(shipping)前大约3个星期在制造场所将所述细胞平铺在插入物上。
试验开始的前一天收到EpiAirwayTM培养膜。它们在不含酚红和氢化可的松的Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基(DMEM)中输送。将每个组织插入物(tissue insert)放至含有0.9mL不含血清的DMEM的6孔板的孔中。然后将该膜在37℃/5％CO2下培养24小时使组织达到平衡。供给插入物(insert)用于每天的回收。基于DMEM的培养基不含血清，但补充表皮生长因子和其他因子。测试培养基中被认为用于鼻内递送的任何细胞因子或生长因子的内源性水平，培养基不含所有研究至今的细胞因子和因子，除胰岛素之外。该体积足够提供与它们支架上单元底部的接触，但是上皮细胞的顶面被允许保持与空气的直接接触。在这个步骤中和所有随后涉及将单元转移至含有液体的孔的步骤中使用无菌的镊子，以确保在单元的底部和培养基之间没有空气包埋。
EpiAirwayTM模型系统用于评价每个含有NovoLog制剂的对TER、细胞存活率(MTT)、细胞毒性(LDH)和渗透率的影响。这些测定下面将详细描述。在所有的试验中，将待研究的鼻粘膜递送制剂应用于每个单元的顶面，体积为100μL，其足够覆盖整个顶面。留出适当体积的具有应用于顶面的浓度的测试制剂(通常需要的不超过100μL)，用于随后通过ELISA或其他指定的测定法测定活性物质的浓度。
跨上皮电阻(TER) 通过使用与具有电极的上皮Voltohmeter连接的组织电阻测量室(Tissue Resistance Measurement Chamber(都由World Precision Instruments提供)读取TER测量值。首先，在试验开始的那天读取每个插入物的背景TER。在读取TER后，将1mL新鲜的培养基放置于6孔板中每个孔的底部。插入物由纸巾纸吸干，且放入具有新鲜培养基的新孔中，同时保持编号的插入物以与背景TER测量值相互关联。向每个插入物中加入100μL试验制剂。在37℃将插入物在振荡的培养箱中以100rpm放置1小时。
在检查校正之前关掉电源，在新鲜培养基中平衡电极和组织培养空白插入物至少20分钟。用在Endohm组织室中的1.5mL培养基和在空白Millicell-CM插入物中的300μL培养基测量背景电阻。调整上电极以使其浸没于培养基中，但是没有与插入物膜的上表面相接触。空白插入物的背景电阻为5-20ohms。对于每次TER测定，向插入物中加入300μL培养基，然后在放置于Endohm室中读取TER之前于室温下培养20分钟。电阻表示为(测得的电阻-空白)x0.6cm2。所有TER值报道记录为组织表面积的函数。
TER按下述计算TER＝(R1-Rb)xA 其中R1为具有膜的插入物的电阻，Rb为该空白插入物的电阻，A为该膜的面积(0.6cm2)。相对于对照值(对照＝约1000ohms-cm2，标准化为100)TER值的减少表明细胞膜电阻的减少和粘膜上皮细胞渗透率的增加。完成1小时培养后，将组织插入物从培养箱中移去。将200μL新鲜的培养基置于24孔板的各孔中，并将组织插入物转移至24孔板中。将200μL新鲜的培养基小心地加至每个组织插入物。再次测量每个插入物的TER。
在将组织培养插入物从6孔板转移至24孔板后，将基础培养基细分成三个部分，并贮存于微量离心管中。所有三个细分部分放置于-80℃直至使用。
乳酸脱氢酶(LDH)测定 通过使用CytoTox 96细胞毒性测定试剂盒(得自Promega公司)测量LDH从细胞的释放来测定细胞死亡的量。研究中的每个组织培养插入物进行三份样品的测定。在96孔板中添加50μL收获的培养基(在4℃贮存)，共三份。使用新鲜的、无细胞的培养基作为空白。将50μL底物溶液(根据试剂盒制备，将12mL分析缓冲液加至新鲜的混合底物的瓶中)加至每个孔中，所述板于室温下避光孵育30分钟。孵育后，将50μL终止溶液加至每个孔中，且使用KCJr软件于490nm在μQuant光密度平板读数仪上读取所述板。
MTT测定 通过测试线粒体还原酶活性的MTT测定(MTT-100、MatTek试剂盒)来测试每个组织培养插入物的细胞存活率。这种试剂盒测量四唑盐的吸收和转化为甲蜡染料。将MTT浓缩物融化并使用培养基以2mL MTT∶8mL培养基的比率进行且稀释。吸取稀释的MTT浓缩物(300μL)至24孔板。小心地干燥组织插入物，将其放置在该板上的孔中，于37℃避光孵育3小时。孵育后，从该板上移去每个插入物，小心地进行印迹，放置在24孔萃取板中。然后将该细胞培养插入物浸没于每孔2.0mL萃取溶液中(完全覆盖样品)。该萃取板被覆盖且被密封以减少萃取剂的蒸发。在室温下避光过夜孵育后，将每个插入物中的液体倒回至所取自的孔中，弃去插入物。吸取每个孔的萃取溶液(50μL)三份至96孔微孔板中，与萃取空白一起，并加入150μL新鲜的萃取剂溶液进行稀释。使用KCJr软件于550nm在μQuant光密度平板读数仪上测量该样品的光密度。
TER结果 将试验制剂于37℃孵育1小时之前或之后的TER测量值(ohms x cm2)与对照组比较。结果显示除#7和#8之外含有增强剂的制剂在孵育1小时后TER显著减少。
MTT结果 与对照组比较，几乎所有制剂都显示从正常到良好的细胞存活率。大多数制剂的％MTT都高于80％(除#1、#6和#12之外)。
LDH结果 大多数测试制剂几乎没有显示LDH，这表示细胞毒性很低。
总结 TER、MTT和LDH测定的结果表明制剂#2、#6、#9、#10和#11都显示TER显著地减少，而毒性没有增加。
实施例3 门冬胰岛素渗透率 ELISA用于定量渗透过插入物顶端至底外侧的胰岛素或胰岛素类似物的量。胰岛素存在于MaTtek培养基中，故通过从所有其他样品中减去存在于培养基样品的平均浓度来校正原始数据。
同工胰岛素ELISA试剂盒购自Alpco Diagnostics，(Windham，NH，目录号#08-10-1128-01)。样品用随该试剂盒提供的测定缓冲液稀释。通过小心地颠倒，将稀释液混合至具有Teflon涂布覆盖物的透明硅烷化的HPLC瓶中。使用KCJr软件于450nm(如实验方案中所示)在μQuant光密度平板读数仪上测量样品的光密度。
每个插入物的负载容积(loading volume)为100μL且渗透样品时间为60分钟。使用n＝3的插入物测试每个制剂以及对照。本研究的对照包括MatTek基础培养基和9％Triton X-100。将每个组织插入物放置于含有0.95mL MatTek基础培养基的单个孔中。在该插入物的顶面上，根据研究设计，应用100μL测试制剂，且将样品放置于振荡器(～100rpm)在37℃下1小时。在孵育期间的最后阶段，将50μL约20,000KIUnits的aprotnin加至每个基础培养基样品中，且在2-8℃贮存用于ELISA分析。
表3显示通过ELISA测定的底外侧样品的渗透率结果。通过从试验样品中减去单独存在于培养基的胰岛素的平均量来校正平均值。
表3测试门冬胰岛素制剂的％渗透率结果
这些渗透率结果显示通过鼻内制剂可以使用渗透增强剂来递送门冬胰岛素。含有增强剂的所有制剂与不含增强剂的制剂比较至少产生9％(～9-21％)的渗透，后者渗透最多为～1-2％。渗透率增加最多的样品包括#1、#2、#9、#10、#11和#12。当其与TER、MTT、和LDH结果联系在一起时，样品#2(5U/mL门冬胰岛素、45mg/mL Me-β-CD、1mg/mLDDPC、1mg/mL EDTA、5％Novolog稀释液、pH 4)；#9(20U/mL门冬胰岛素45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、20％Novolog稀释液、pH 4)；#10(20U/mL门冬胰岛素、45mg/mL Me-β-CD、1mg/mLDDPC、1mg/mL EDTA、20％Novolog稀释液、pH 3)；和#11(5U/mL门冬胰岛素、0mg/mL Me-β-CD、0mg/mL DDPC、10mg/mL EDTA、5％Novolog稀释液、pH 4)渗透率增加最多，且细胞毒性最小。
实施例4 NPG和PN159对胰岛素渗透率的作用 进行体外试验评价小分子和基于肽的渗透增强剂对胰岛素渗透率的作用。在37℃下将7个不同的处理组应用于EpiAirway 96孔板1小时，将0.1U胰岛素应用于顶侧上。标准曲线和高的低对照如希望一样，在底外侧培养基中的胰岛素尖峰(spike)显示回收率接近100％。处理包括PBS+胰岛素0.1U；25μM PN159+胰岛素0.1U；50μM PN159+胰岛素0.1U；PDF+胰岛素0.1U；PBS+胰岛素0.1U+NPG 150mM；25uM PN159+胰岛素0.1U+NPG 150mM和PDF+胰岛素0.1U+NPG 150mM。
用于本研究的胰岛素是Sigma重组(酵母获得)人胰岛素天然序列。这种重组人胰岛素从胰岛素原(pro-insulin)获得，且化学上、物理上和生物上等同于胰腺人胰岛素。PBS是磷酸缓冲盐。PDF是由45mg/mL甲基-β-环糊精、1mg/mL乙二胺四乙酸盐、1mg/mL二癸酰基磷脂酰胆碱和10mM乙酸盐组成的混合物，pH 5.5。单体(monmomeric)稳定剂(NPG)是N-特戊酰氨基葡萄糖。PN159是肽，如在共同待决的美国专利申请第11/233,239号中描述。这些结果如表4所示，如下 表4含有PDF、PN159和NPG制剂的渗透率结果 PN159增加胰岛素的渗透率25μM PN159产生0.8％渗透率、而50μMPN159增加渗透率至2.5％。与NPG组合，25μM PN159产生1.8％渗透率。该结果显示PDF单独产生3％渗透率，比PBS单独大约12倍。当PDF与NPG组合时，渗透率增加至7.6％，比PBS增加30倍。
进行进一步的研究以测试如表5所示，包括含有PN159的制剂的TER、LDH、MTT以及渗透率。用n＝3的插入物在EpiAirway模型中测试所有制剂。常规胰岛素约为28U/mg(即200U/mL＝～7.14mg/mL)。
表5制剂
缩略语Arg＝精氨酸、Me-β-CD＝甲基-β-环糊精、EDTA＝依地酸二钠、NACl＝氯化钠、MP＝尼泊金甲酯钠、PP＝尼泊金丙酯钠、PG＝丙二醇 将试验制剂在37℃下孵育1小时之前和之后的TER测量值(ohms xcm2)与对照比较。结果显示含有增强剂的制剂在孵育1小时后TER显著地减少。制剂#5、#6和#8显示细胞存活率，所有制剂(除#7之外)具有最小的细胞毒性，与PBS对照相类似。渗透率结果如表6所示。
表6渗透结果 制剂#1(4.47％)和#7(4.66％)具有最高的渗透率百分数。这些数据显示在体外加入PN159并没有相对于PDF(Me-β-CD、DDPC和EDTA)制剂显著增强胰岛素的渗透。
实施例5 选择性缓冲液对胰岛素渗透率的影响 进行渗透率研究以比较与PDF制剂(Me-β-CD、DDPC和EDTA)组合的选择性缓冲液。通过ELISA(得自LINCO Research，Inc.目录#EZHI-14K)在60分钟孵育和使用50μL负载容积后，产生这些渗透率数据。在表7中列出的所有制剂具有良好的细胞存活率和低细胞毒性，如通过MTT和LDH测定所测量的。
表7选择性缓冲液的渗透率结果
精氨酸缓冲液是表现适度的缓冲液，其胰岛素的百分比渗透率为3％至6％。乙酸盐缓冲液制剂获得的％渗透率为7％至12％。磷酸盐缓冲液制剂的％渗透率范围为5％至28％。用10mM磷酸盐缓冲液、45mg/mLMe-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、280U/mL胰岛素在pH 7(#4)获得最高的％渗透率28％。
实施例6 最佳的鼻内胰岛素制剂的体外筛选研究 以不同的组分浓度和pH范围对280U/mL和840U/mL胰岛素制剂进行了初步的体外筛选。基础1X PDF制剂包括45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM乙酸盐、10mM磷酸酶和220mOsm/kg NaCl。体外研究1的制剂组分如表8中所示。
表8 体外研究1的制剂组分
第一次体外试验的测试时间过程包括30、60以及120分钟孵育。在含有Ca++和Mg++的PBS中完成所述孵育。测定条件包括在37℃下以100rpm旋转以及应用50μL测试制剂。所有制剂中都观察到TER显著地减少。MTT测定观察高毒性，LDH测定观察低细胞存活率。
在30和60分钟记录280U/mL胰岛素浓度的渗透率数据，并与1XPDF、pH 3；2X PDF、pH 3；1X PDF、pH 4和0.5X PDF、pH 3比较。1XPDF、pH 3；1X PDF、pH 4和0.5X PDF、pH 3在60分钟获得约10％渗透率。2X PDF、pH 3产生2％渗透率。不含增强剂的对照组则显示少于1％渗透率。
在2X PDF、pH3制剂中于30和60分钟比较280U/mL胰岛素和840U/mL胰岛素浓度的渗透率数据。由于在高胰岛素浓度下沉淀可能导致高变异性，没有观察到显著的渗透率差异。
将在1X PDF、pH 3中于30和60分钟记录的280U/mL胰岛素浓度的渗透率数据与1X PDF、pH 7比较。结果显示制剂在pH7时表现好于pH 3。1X PDF、pH 3的％渗透率为10％，而1X PDF、pH 7的渗透率为35％。
体外研究1的总结 在PBS(含有Ca++和Mg++)中30、60和120分钟孵育的渗透率研究产生高的细胞毒性和低的细胞存活率。1X和0.5X PDF产生比2X PDF更好的渗透率。PDF能增溶10mg/mL(即280U/mL)但是不能增溶30mg/mL(即840U/mL)。pH 7的百分比渗透率结果高于pH 3。
使用1X PDF(45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM乙酸盐、10mM磷酸酶和220mOsm/kg NaCl)作为基础制剂进行第二项研究。体外研究2制剂组分如表9所示。
表9 体外研究2的制剂组分
第二项体外试验的时间过程包括60分钟孵育。在含有Ca++和Mg++的PBS中完成孵育。测定条件包括在37℃以100rpm旋转并应用50μL测试制剂。所有制剂中都观察到TER显著地减少。用MTT测定观察高毒性，并用LDH测定，甚至不含增溶剂观察低细胞存活率。
在60分钟记录280U/mL胰岛素浓度的渗透率数据，并与1X PDF、pH 3.5；1X PDF、pH 7；1X PDF+0.5％CEL、pH 3.5；1X PDF+1％CEL、pH 3.5；1X PDF+0.1％吐温80、pH 3.5和1X PDF+1％吐温80、pH 3.5比较。所有制剂在pH 3.5时获得至少10％渗透率。制剂在pH 7时渗透率增加可与pH 3.5相比较。
将60分钟时的280U/mL和840U/mL胰岛素浓度的渗透率数据与1XPDF、pH 7；1X PDF+0.5％CEL、pH 3.5；1X PDF+0.5％CEL、pH 7；1X PDF+1％CEL、pH 3.5；1X PDF+0.1％吐温80、pH 3.5和1X PDF+1％吐温80、pH 3.5的制剂相比较。当含有增溶剂时，840U/mL胰岛素制剂在视觉上在插入物表面上是可溶的。所有制剂具有类似的渗透率，除了pH 7的制剂比pH 3.5的制剂具有更高的渗透率。
体外研究2的总结 在另外的表面活性剂(即吐温或Cremophor)存在的情况下，成功地稳定了高浓度胰岛素制剂(840U/mL)(和增溶)。甚至在60分钟孵育时，在体外观察到所有制剂细胞毒性增加及细胞活性减少。
进行第三项研究以测定使用280U/mL和840U/mL 1X PDF在pH 7时，三种不同表面活性剂(吐温80、吐温20和普朗尼克F68)对渗透的体外影响。体外研究3的制剂组分如表10所示。
表10 体外研究3的制剂组分
第三项体外试验的时间过程包括60分钟孵育。在含有Ca++和Mg++的PBS中完成孵育。测定条件包括在37℃下以100rpm旋转并且应用50μL测试制剂。所有制剂中都观察到TER显著地减少。用MTT测定观察高毒性，用LDH测定观察低细胞存活率。
在60分钟记录280U/mL和840U/mL胰岛素浓度的渗透率数据，并与1X PDF+1％吐温80、pH 7；1X PDF+0.01％普朗尼克F68、pH 7和1XPDF+0.1％普朗尼克F68、pH 7制剂比较。数据显示普朗尼克F68没有有效地增溶胰岛素而提高渗透率。
测试在1X PDF制剂(胰岛素浓度280U/mL和840U/mL)中吐温80和吐温20对胰岛素渗透率的影响。将1X PDF+1％吐温80、pH 7；1XPDF+0.1％吐温80、pH 7；1X PDF(不含DDPC)+1％吐温80、pH 7；1X PDF(不含DDPC)+0.1％吐温80、pH 7；1X PDF+1％吐温20、pH 7；1X PDF+0.1％吐温20、pH 7和1X PDF+1％吐温80、pH 7(低渗)的制剂中在60分钟时的百分比渗透率数据进行比较。结果显示1％吐温(吐温80和吐温20)比0.1％吐温提供了更高的渗透率。吐温20的渗透率结果与吐温80相同。除去DDPC对这些制剂的％渗透率没有影响。
测试吐温80的增加量(0.01％、0.1％、0.5％和1％)对pH 7的1X PDF制剂中的280U/mL胰岛素渗透率的影响。在该制剂中吐温80的量影响了％渗透率。渗透率随吐温80浓度的增加而增加。在含有1％、2％和5％吐温80的1X PDF制剂中进一步测定吐温浓度对渗透率的影响。另外，使用1％和2％吐温80测试2X PDF制剂的渗透率。结果显示当1X PDF或2XPDF制剂中吐温80浓度高于1％时，体外渗透率没有进一步的增加。
使用含有0.1％吐温和1％吐温的制剂(含有1mg/mL和10mg/mLEDTA)测试去除Me-β-CD对渗透率的影响。从制剂中去除Me-β-CD导致渗透率的急剧降低。280U/mL和840U/mL的制剂中都观察到该结果。
体外研究3的总结 吐温80和吐温20当与1X PDF制剂组合使用时，在体外都产生良好的渗透率。普朗尼克F68并没有增加渗透率。在体外吐温80或吐温20单独并不足以获得胰岛素渗透率的增加。从制剂中去除Me-β-CD引起胰岛素渗透率的显著降低。增加吐温不超过1％能增加渗透率，但高于1％没有观察到其他的益处。1％吐温制剂的渗透率比一些已上市的含有吐温的鼻用产品的渗透率要低。
实施例7 胰岛素制剂稳定性数据 对1X PDF(45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM乙酸盐、10mM磷酸酶和220mOsm/kg NaCl)胰岛素喷雾制剂于5℃、25℃、40℃、50℃下进行高达28天的使用稳定性研究。使用HPLC测定％肽回收率。研究中评价的制剂参数如表11所示。
表11 初步胰岛素稳定性研究的制剂参数
1X PDF胰岛素喷雾制剂较仅含有盐和缓冲液的胰岛素保持得更稳定。吐温的存在没有影响1X PDF制剂的稳定性。pH 7.0的制剂比pH 3.5的制剂稳定性更好。在5℃、25℃、40℃和50℃下高达28天，1X PDF中的贮存胰岛素的稳定性非常良好，且280U/mL和840U/mL胰岛素浓度都观察到约100％的标称回收率(label claim recovery)。
进行进一步的使用测定(单位剂量和8天)以评价1X PDF胰岛素喷雾制剂的稳定性。使用“单位剂量”评价在起动(priming)和一次启动后胰岛素喷雾剂的稳定性。8天使用研究的条件包括8天、每天3次(TID)启动，在5℃和30℃下贮存。研究测定了肽的含量。使用的肽含量研究的结果显示PDF胰岛素喷雾制剂对于单位剂量和8天使用均显示良好的稳定性。在本研究中，贮存温度30℃时的稳定性似乎与5℃贮存温度的稳定性一样稳定。
实施例8 在兔子中鼻内施用胰岛素的药物动力学结果 在特定的时间点至高达240分钟测量胰岛素治疗的新西兰白兔的药物动力学(PK；即胰岛素测量)值。产生生物利用度数据的这项研究中包括4个鼻内(IN)组、一个皮下(SC)组和一个(静脉内)组。每组包括5只雄兔。所有数据计算进行剂量标准化，且PK数据是基线校正的。PK研究1的治疗和剂量详情如表12所示。
表12 兔子PK(和PD)研究1的治疗和剂量详情 PK研究1的结果如表13和图1所示。IN施用胰岛素比常规SC胰岛素导致更快的Tmax。含有1％吐温的IN1X PDF制剂(剂量6IU/kg)，#3显示鼻内制剂的最大峰值。对于含有1％吐温的IN 1X PDF制剂，#2和#3，胰岛素的百分比生物利用度(BA)都为～3-5％(相对于SC)。SC的绝对％BA为30％，而IN为1％。基于AUC，IN的％CV为50％，而SC为20％。
表13 兔子PK研究1结果 进行第二个PK研究来比较鼻内PDF+吐温制剂与Novolog速效制剂(Novolog稀释液由16mg/mL甘油、1.5mg/mL苯酚、1.72mg/mL间甲酚、19.6μg/mL锌、1.25mg/mL二水合磷酸氢二钠和0.58mg/mL NaCl组成，pH 7.2-7.6)。PK研究2的参数如表14所示。
表14 PK(和PD)研究2的制剂参数
表15所示的是相对于减去PK基线的研究2的SC-Novolog结果的Tmax、％Cmax、AUClast、AUCinf和％BA；也包括IN/1X PDF 1％吐温(#3)和SC-常规(#5)制剂的研究1结果。PK研究2结果如图2所示。研究2的PK曲线与研究1的曲线类似，显示IN/1X PDF产生速效的PK特征。在一些IN治疗的动物中观察到胰岛素的第二个峰值。
表15 兔子PK研究2结果 *PK研究1的结果 PK研究2的结果显示IN/1X PDF 2％吐温具有测试鼻内制剂中最高的％BA、Cmax和AUClast。当去除DDPC时，％BA、Cmax和AUClast减少。研究2的IN/1X PDF 1％吐温结果与研究1的结果一致。SC-常规、SC-Novolog和SC-PDF胰岛素产生类似的生物利用度。对于％BA，鼻内制剂产生约2-5％生物利用度。IN/1X PDF 2％吐温显示最高的生物利用度为5％。
实施例9 兔子中鼻内施用胰岛素的药效学数据 在特定的时间点至高达240分钟测量胰岛素治疗的新西兰白兔的药效学(PD；即葡萄糖测量)值。用Glucometer(One-Touch Ultra)在每个时间点测量葡萄糖两次。PD研究1的结果(测试组如上述实施例8、表12中所示)在表16和图3中显示。所有数据计算进行剂量标准化，且％BA基于测试制品的标称的测定值。
表16 PD研究1结果 在研究1中，IN/PDF-吐温(#2和#3)、SC(#5)和IV(#6)胰岛素制剂的％Cmin约为40％。IN/PDF-吐温(30-45分钟)比SC(120分钟)Tmin更快。含1％吐温的IN/PDF的BA葡萄糖为～8％(相对于SC)。
进行第二个PD研究来比较鼻内PDF制剂与Novolog速效制剂(Novolog稀释液由16mg/mL甘油、1.5mg/mL苯酚、1.72mg/mL间甲酚、19.6μg/mL锌、1.25mg/mL二水合磷酸氢二钠、0.58mg/mL NaCl组成，pH 7.2-7.6)。PD研究2的参数在上述实施例8、表14显示。PD研究2的Cmin和Tmin结果在表17中显示。
表17 PD研究2的Cmin和Tmin结果 *PK研究1的结果 图4中，将研究2的PD结果与研究1比较。IN/1X PDF 5％吐温、IN/2XPDF 1％吐温、SC NOvolog的Tmin约为30分钟。SC-常规*的Tmin约为40分钟。其他制剂的Tmin约为45分钟。PD研究2的结果显示在所有鼻内制剂中2X PDF 1％吐温对PD有最大的影响。在制剂中存在DDPC不影响PD的结果。
在IN施用的兔子中不存在或没有记载到鼻内刺激。所述的PD数据支持递送胰岛素具有速效特征的鼻内制剂。表现最好的制剂包含增溶剂和表面活性剂。对进一步体内施用的IN胰岛素制剂的描述在表18中显示。
表18 体内研究的制剂 实施例10 临床前研究3对兔子静脉内、皮下和鼻内 施用胰岛素后的PK和PD结果 表19显示研究3中的剂量组。使用下述的缩略语PDF＝加入45mg/mLMe-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM精氨酸pH 7.0与NaCl达到约220mOsm/kg；2X PDF＝90mg/mL Me-β-CD、2mg/mL DDPC、2mg/mL EDTA(其他组分与PDF中保持一样)；防腐剂(Pre)，在该情况下是10mg/mL丙二醇、0.33mg/mL尼泊金甲酯和0.17mg/mL尼泊金丙酯的组合。将聚山梨酯80(吐温)以所示的1％或2％(10或20mg/mL)加至不同的制剂。给药两个SC组，一个组用不含增强剂的常规胰岛素，而另一个组用存在PDF的常规胰岛素。
表19 临床前研究3中给药组的描述 临床前研究3中给药组的PD数据在表20和图5显示。
表20 临床前研究3中给药组的PD数据 所有鼻内组呈现大约相同的PD效应(Tmin和％Cmin)。皮下递送的常规胰岛素在没有PDF和有PDF的情况下，具有相同的PD效应(更慢的Tmin和更高的％Cmin，如同所预期的)。数据显示在PDF制剂(SC为45分钟；鼻内为30分钟)中常规胰岛素与对照制剂比较(SC为60分钟)起效更快(通过Tmin显示)。数据显示在鼻内PDF制剂中常规胰岛素与速效胰岛素特征一致。
临床前研究3中给药组的PK数据在图6和表21、表22、表23显示。
表21 临床前研究3中给药组的PK参数 表22 临床前研究3中给药组的PK数据(生物利用度) 表23 临床前研究3中给药组的PK参数的％CV 不同组的不同PK参数的％CV类似。含有吐温的制剂与SC常规胰岛素对照组比较，PDF的％F(相对于SC对照组的生物利用度)约为2-6％，Tmax在12-36分钟的范围内。具有最高％生物利用度的IN制剂是不含DDPC的1X PDF/2％吐温(5.8％)。这些PD数据提示PDF制剂中的DDPC对于达到提高的生物利用度并不是必需的。
实施例11 临床前研究4对兔子口服和鼻内施用胰岛素后的PK和PD结果 表24描述了研究4中的剂量组。使用下述的缩略语PDF＝加入45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/rnL EDTA、10mM精氨酸pH 7.0与NaCl达到约220mOsm/kg；2X PDF＝90mg/mL Me-β-CD、2mg/mLDDPC、2mg/mL EDTA(其他组分与PDF中保持一样)；TDM＝2.5mg/mL四癸基麦芽糖苷。将聚山梨酯80(吐温)以所示的1％(10mg/mL)加至不同的制剂。将丙二醇(PG)以1％或2.5％(10或25mg/mL)加至不同的制剂。测试0.2％明胶对IN制剂的影响。给药三个口服组，一个组用不含增强剂的常规胰岛素(#8)，一个用存在PDF的常规胰岛素(#9)，另一个组用存在PDF而不含DDPC的常规胰岛素(#7)。
表24 临床前研究4中给药组的描述 临床前研究4中给药组的PD数据在图7显示。所有鼻内制剂之间PD数据都类似，但SC施用较鼻内有延长的PD效应。口服给药组没有观察到PD效应。在没有PDF和PDF存在的情况下，皮下递送常规胰岛素具有类似的PD效应(更慢的Tmin和更高的％Cmin，如同预期)。这些数据显示在PDF制剂中常规胰岛素起效更快(通过Tmin显示)。
临床前研究4中给药组的PK数据在图8和表25、表26、表27中显示。
表25 临床前研究4中给药组的PK参数 表26 临床前研究4中给药组的PK数据(生物利用度) 表27 临床前研究4中给药组PK参数的％CV 对于有或没有PG的含有PDF的鼻内组以及含有TDM的组，PK数据类似，且％F(与SC常规胰岛素比较的生物利用度)在约5.4-10.6％，Tmax在18-59分钟的范围内。含有1％吐温存在0.2％明胶的1X PDF生物利用度增加，约为14.9％。对于有或没有PG的含有PDF的鼻内组以及含有TDM的组，Cmax和AUC的％CV在50-200％之间。相反，对于含有1％吐温存在0.2％明胶的1X PDF，Cmax和AUC分别减少21.3％和35.3％。需要注意的是，含有1％吐温存在0.2％明胶的1X PDF制剂的Cmax和AUC的％CV低于SC注射观察到的那些。
这些数据显示PDF制剂中的常规胰岛素比SC制剂起效更快(通过Tmin显示)，因此该胰岛素具有速效胰岛素的特征。加入明胶增强了PDF制剂的PD和PK(相对于SC对照组14.9％生物利用度)影响。
实施例12 含有增粘剂的制剂的PK和PD结果 评价使用含有不同增粘剂的鼻内胰岛素制剂给药的兔子的PK和PD。增粘剂包括明胶、HPMC、MC和卡波姆。卡波姆是称为“

的聚合物家族的通用名称。选取的时间点在5、10、15、20、25、30、45、60、120和240分钟。在每个时间点用Glucometer(One-Touch Ultra)测量葡萄糖。将少量2N HCl或NaOH加至所述制剂中，当需要获得期望的pH时。用于本研究的胰岛素浓度约为28U/mg。表28显示用于本研究的制剂。
表28 包含增粘剂的胰岛素制剂 缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精、EDTA＝依地酸二钠、HPMC＝羟丙基甲基纤维素(100cps)、MC＝甲基纤维素(15cps)、CMC＝羧甲基纤维素钠(低粘度)、MP＝尼泊金甲酯钠、PP＝尼泊金丙酯钠、PG＝丙二醇、NaCl＝氯化钠 制备每种制剂15mL，贮存在3cc透明的非硅烷化的玻璃瓶中。所有测试的胰岛素制剂贮存于2-8℃。所有制剂以6.0IU/kg给药。表29描述了用于本研究的剂量组。
表29 增粘剂剂量组 初始％葡萄糖的PD结果在图9显示。图9显示在测试的8个组中％葡萄糖随时间的平均变化。组6(1X PDF/1％吐温/(0.25％卡波普))与所有其他组相比显示由初始％葡萄糖减少最多。8个组的葡萄糖波谷发生在90分钟以内，如图9所示。组8(含有张度剂)与其他明胶制剂比较，由初始％葡萄糖减少最多。含有卡波姆(0.25％卡波普)和CMC的制剂与其他非明胶制剂比较，由初始％葡萄糖减少最多。
每个时间点平均数据的PK结果在图10中显示。在图10中，显示测试的8个组的胰岛素随时间的平均浓度(μlU/mL)。与其他制剂比较，图10显示组6，1XPDF/1％吐温/(0.25％卡波普)的Cmax最大。8个组的峰值血清胰岛素水平发生在60分钟以内，如图10所示。PK参数总结于表30中。
表30 兔子中的增粘剂PK参数 ％CV结果如表31所示。
表31 兔子中的增粘剂的％CV结果 ％F(生物利用度)结果显示于表32中。
表32 兔子中的增粘剂的％F结果 总结 PK和PD结果显示测试的鼻内胰岛素制剂有速效胰岛素的特征，其中峰值血清胰岛素水平在60分钟以内，波谷在90分钟以内。当增粘剂加至PDF鼻内胰岛素制剂中时，生物利用度增加。增加的张力提高了含有明胶的制剂中的生物利用度。含有明胶的制剂显示将等渗条件(组#8包括NaCl的0.2％明胶)与低渗条件(组#2不含NaCl的0.2％明胶)比较，性能得到改进。对于鼻内胰岛素制剂，含有卡波姆和CMC的制剂显示PK和PD结果的最大增加。卡波姆和CMC通过％F所示的生物利用度分别为19.7％和17.8％。将增粘剂如卡波姆和CMC加到鼻内胰岛素制剂中，改善了由初始％葡萄糖所示的PD效应。
兔子的PK和PD数据证实了在体外，在制剂增强剂存在的情况下，透过鼻内上皮细胞的胰岛素增加的结果。对于鼻内胰岛素制剂，体外药物渗透数据和体内PK兔子数据显示明显的相关性。使用代表性的鼻内制剂，X-轴为AUClast(min*μU/mL)和Y-轴为％渗透率的XY图分析显示R2＝0.8994、y＝0.0007x+0.4191。
实施例13 AET研究1-8抗微生物效力测试(AET) AET研究1 进行AET研究1以确定具有尼泊金甲酯钠、尼泊金丙酯钠和丙二醇的胰岛素鼻内喷雾安慰剂的抗微生物效力(AET)。此外，AET研究1检测了单独增加EDTA的AET。AET研究1中评价的制剂显示于表33。每种制剂制备约120mL，测试两次(每个样品n＝2分析)。
表33 AET研究1中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精、DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱、EDTA＝依地酸二钠、MP＝尼泊金甲酯钠、PP＝尼泊金丙酯钠、PG＝丙二醇、NaCl＝氯化钠 所使用的AET方法遵照美国药典(USP)和欧洲药典(EP)AET的要求，分别在表34和35中进行了描述。同时测试所述制剂的pH(每SOP403)、外观(视觉)和同渗浓度(每SOP 4000)。
表34 USP AET要求(USP<51>)
表35 EP AET要求(EP<51.3>)
0.33mg/mL尼泊金甲酯钠、0.17mg/mL尼泊金丙酯钠和至少25mg/mL丙二醇的组合是有效的防腐剂组合，且符合USP标准。这些制剂全部通过USP要求，但没有通过EP(对于金黄色葡萄糖球菌和黑霉菌)。单独增加EDTA看来对USP或EP要求无效。
AET研究2 进行AET研究2以确定当尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠用作防腐剂时，保湿剂(丙二醇)是否改善了抗微生物效力。还评价了其他的防腐剂，如苯扎氯铵(BAK)、苯甲醇和苯甲酸钠。测试了500U/mL或1000U/mL水平的两个胰岛素组。AET研究2中评价的制剂列于表36。
表36 AET研究2中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱 EDTA＝依地酸二钠 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 BAK＝苯扎氯铵 NaCl＝氯化钠 如AET研究1所述，实施AET研究2的方法。此外，包括阳性对照(含有5mg/mL苯甲酸钠的PBS)和阴性对照(PBS单独)。AET研究2的结果显示在制剂中不含保湿剂(如丙二醇)时，尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠并不是有效的防腐剂。就USP和EP抗微生物效力测试而论，苯扎氯铵是优良的防腐剂，但是发现其与胰岛素不相容(即，它在制剂中存在导致胰岛素的沉淀)。苯扎氯铵和苯甲酸钠在中性pH时也不是有效的防腐剂，因此也不适合用于胰岛素鼻内喷雾制剂。
AET研究3 AET研究3的目的是评价其他防腐剂，如苯扎氯铵(BAK)、苯甲醇和苯甲酸钠。测试了500U/mL或1000U/mL水平的两个含有胰岛素的组。AET研究3的制剂列于表37。
表37 AET研究3中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱 EDTA＝依地酸二钠 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 BAK＝苯扎氯铵 NaCl＝氯化钠 如AET研究1所述，进行AET研究3的分析。AET研究3结果显示苯扎氯铵与胰岛素不相容(引起沉淀)，但是保持最好的抗微生物性能。本研究中苯甲醇和苯甲醇/尼泊金甲酯钠/尼泊金丙酯钠作为抗菌试剂是无效的。
AET研究4 AET研究4的目的是确定当与尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠一起使用时，低浓度的保湿剂(丙二醇)能否获得符合要求的USP和EP AET结果。此外，评价了选择性的防腐剂间甲酚和苯甲醇。AET研究4的制剂列于表38。
表38 AET研究4中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精 EDTA＝依地酸二钠 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 PG＝丙二醇 如AET研究1所述，实施AET研究4的方法。含有尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠与低浓度的保湿剂(即丙二醇)的制剂不能获得抗微生物效力。对于含有丙二醇的尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠，最佳浓度是1-25mg/mL之间的丙二醇。此外，苯甲醇和间甲酚对于胰岛素鼻内喷雾制剂并不是有效的防腐剂。
AET研究5 AET研究5的目的是进行胰岛素喷雾制剂(安慰剂和活性剂)的抗微生物效力测试(AET)以确定对最佳的防腐剂效力是否需要尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠二者，以及是否一个比另一个更有效。此外，评价了尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠增加的水平以确定是否增加它们在制剂中的含量就能增加抗微生物效力。AET研究5使用的制剂列于表39。
表39 AET研究5中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱 EDTA＝依地酸二钠 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化钠 如AET研究1所述，实施AET研究5的方法。AET研究5的结果显示增加尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠水平达到0.33mg/mL尼泊金甲酯钠和0.17mg/mL尼泊金丙酯钠的至少10倍能增加抗微生物效力。此外，明显可得出单独0.33mg/mL尼泊金甲酯钠与单独0.17mg/mL尼泊金丙酯钠有相同的抗微生物效力，其中该组合也有相同的抗微生物效力。
AET研究6 AET研究6的目的是进行胰岛素喷雾制剂(安慰剂)的抗微生物效力测试(AET)以确定与尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠一起使用需要的丙二醇最佳浓度。此外，使用固定浓度的丙二醇评价尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠增加的水平以确定是否增加它们在制剂中的含量就能增加抗微生物效力。最后，也评价了作为潜在防腐剂的乙醇。AET研究6中评价的制剂列于表40。
表40 AET研究6中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱 EDTA＝依地酸二钠 EtOH＝乙醇 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化钠 如AET研究1所述，实施AET研究6的方法。AET研究6的结果显示丙二醇的最佳浓度为10mg/mL。含有10、15、20和25mg/mL丙二醇的胰岛素鼻内喷雾制剂的AET结果非常类似；但是当丙二醇水平少于10mg/mL时，AET结果不太理想。所有制剂都通过了USP AET要求，除绿脓杆菌要求之外。相对于这个种类，这些制剂都是抑菌的(即没有微生物生长的迹象)。对于每种要求的生物的最早时间点，所有制剂都未达到EP要求。单独乙醇(在1％或2％时)看来具有与尼泊金甲酯钠/尼泊金丙酯钠/丙二醇有类似的抗微生物活性。
AET研究7 AET研究7的目的是进行含有20mg/mL吐温80的胰岛素喷雾制剂(安慰剂)的抗微生物效力测试(AET)。体内药物动力学研究表明吐温80含量增至20mg/mL可有助于增加生物利用度，但是同时已知吐温80胶束与防腐剂(特别与尼泊金酯)相互作用。另外，进行AET研究7以确定与尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠一起使用需要的丙二醇最佳水平。固定丙二醇的水平评价了尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠增加的水平以确定是否增加它们在制剂中的含量就能增加抗微生物效力。最后，还评价了作为潜在防腐剂的乙醇。AET研究7中评价的制剂列于表41。
表41 AET研究7中评价的制剂
缩略语Mc-β-CD＝甲基-β-环糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱 EDTA＝依地酸二钠 EtoH＝乙醇 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化钠 如AET研究1所述，实施AET研究7的方法。AET研究7的结果显示吐温80含量从10mg/mL增至20mg/mL使抗微生物活性减少，甚至当加入丙二醇的最高水平(即25mg/mL)。当与20mg/mL吐温80组合使用时，乙醇并不是有效的防腐剂(在1％时)。
AET研究8 进行AET研究8以测试含有1、5、10和25mg/mL丙二醇配方的胰岛素喷雾制剂(活性剂)的抗微生物效力测试(AET)。此外，测试了胰岛素鼻内喷雾剂的三种浓度250、500和1000U/mL。AET研究8中评价的制剂列于表42中。
表42 AET研究8中评价的制剂
缩略语Me-β-CD＝甲基-β-环糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰胆碱 EDTA＝依地酸二钠 MP＝尼泊金甲酯钠 PP＝尼泊金丙酯钠 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化钠 分析使用的方法如AET研究1所述。AET研究8的结果显示将胰岛素加至制剂能提高AET的性能。此外，当丙二醇水平高时(即25mg/mL或10mg/mL)，具有尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠的含有胰岛素的制剂通过USP AET的要求。但是，不符合EP的要求。
AET研究1-8总结 研究1-8的数据显示就AET而言，尼泊金甲酯钠、尼泊金丙酯钠和保湿剂丙二醇的组合与单独的尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠比较，可使防腐剂效力增加。此外，在这些研究的过程，评价了一些其他的防腐剂，如苯扎氯铵、苯甲酸钠、苯甲醇、乙醇、增加的EDTA、苄索氯铵和间甲酚；然而，用尼泊金甲酯钠/尼泊金丙酯钠/丙二醇获得最好的结果。每种其他防腐剂或是与胰岛素不相容(如苯扎氯铵的例子，其导致胰岛素沉淀)，或是因与甲基-β-环糊精和/或聚山梨酯80的相互作用而可能致此无效。虽然尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠也与甲基-β-环糊精和/或聚山梨酯80相互作用，但是保湿剂丙二醇的加入阻碍了这种相互作用，因而使尼泊金酯抗微生物活性更有效。这些结果显示将10mg/mL保温剂加至0.17mg/mL尼泊金丙酯钠和0.33mg/mL尼泊金甲酯钠制剂中产生良好的抗微生物活性。
本文中本发明的一个方面包含用于胰岛素鼻内喷雾制剂的防腐剂组合，所述防腐剂组合当按美国药典和欧洲药典抗微生物效力测试(AET)处理时，提供抑菌效应。AET表现最好的制剂包含水、增溶剂、表面活性剂、缓冲液、螯合剂、张力调节剂和防腐剂。优选的增溶剂是Me-β-CD。优选的表面活性剂是DDPC和聚山梨酯(例如吐温80)的组合或单独的聚山梨酯。优选的螯合剂是EDTA。优选的张力调节剂是氯化钠。优选的防腐剂是尼泊金甲酯钠和尼泊金丙酯钠。该制剂也包含保湿剂如丙二醇，提供最优的AET性能。
实施例14 胰岛素制剂稳定性 通过在5℃/环境湿度(常规贮存)、25℃/60％RH(加速贮存)、伴有搅拌的加速贮存、以及与每天三次(TID)气雾剂化(模拟患者使用)组合的常规或加速贮存，测试鼻内胰岛素制剂的稳定性。贮存三个月(84天)后，HPLC结果显示在5℃/环境湿度(99.2％胰岛素回收率)时胰岛素含量没有显著的变化，并且在25℃/60％RH(96.3％胰岛素回收率)时观察到胰岛素含量有微小的损失。当用含有250U/mL、500U/mL或1000U/mL的制剂，TID气雾剂化短暂孵育时间(11天)时，胰岛素没有显著的损失。在加速温度100rpm下搅拌24小时后，没有观察到稳定性的显著减少，相反，市售的胰岛素产品在相同的条件下显示胰岛素含量至少减少20％。
实施例15 人PD临床研究 在鼻内施用含有增强剂的胰岛素制剂后，测量药效学(PD)数据，与施用目前上市的葡萄糖调节药物，Novolog和Exubera的数据比较，完成人研究。Glucometer用于测量葡萄糖水平。每个治疗组葡萄糖百分比减少的总结显示于表43。每个治疗组葡萄糖百分比减少30％、20％和10％的发生率显示于表44。
表43 治疗组的葡萄糖百分比减少 表44 人受治疗者葡萄糖减少30％、20％和10％的发生率

初始PD研究的结果显示鼻内施用胰岛素有效减少患者葡萄糖百分比。鼻内施用50IU和100IU产生与Exubera(目前上市的葡萄糖调节药物)类似的葡萄糖减少。
虽然为了清楚地理解已经通过实施例对本发明前述进行了详细描述，但是对技术人员来说显而易见的是，某些变化和修改为本文公开内容所包括，并且在所附权利要求的范围内无需过度试验即可实施，提出其的目的是为了解释而不是限制。
权利要求
1.一种用于对患者鼻内递送胰岛素的药物制剂，其包括单体胰岛素、增溶剂和表面活性剂的含水混合物。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述胰岛素是人胰岛素。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中所述胰岛素是速效人胰岛素。
4.根据权利要求1所述的制剂，其中所述胰岛素选自由天然人胰岛素、人胰岛素(LysB3、GluB29)、人胰岛素(LysB3、IleB28)、人胰岛素(GlyA21、HisB31、HisB32)、人胰岛素(AspB28)、人胰岛素(AspB10)、人胰岛素(LysB28、ProB29)及其混合物组成的组。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述胰岛素是人胰岛素(AspB28)。
6.根据权利要求1所述的制剂，其中所述增溶剂选自由环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、甲基-β-环糊精及其混合物组成的组。
7.根据权利要求6所述的制剂，其中所述增溶剂是甲基-β-环糊精。
8.根据权利要求1所述的制剂，其中所述表面活性剂选自由非离子型聚氧乙烯醚、梭链孢酸及其衍生物、牛磺二氢梭链孢酸钠、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱、聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚乙二醇、十六醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羊毛脂醇、脱水山梨糖醇单油酸酯及其混合物组成的组。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中所述表面活性剂是二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱。
10.根据权利要求8所述的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨酯80。
11.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括螯合剂，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸及其混合物组成的组。
12.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括一种或多种多元醇。
13.根据权利要求12所述的制剂，其中所述多元醇选自由蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、丙三醇、聚乙二醇及其混合物组成的组。
14.根据权利要求12所述的制剂，其中所述多元醇是乳糖和山梨醇。
15.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括防腐剂。
16.根据权利要求15所述的制剂，其中所述防腐剂选自由氯代丁醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸钠、山梨酸、苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚及其混合物组成的组。
17.根据权利要求15所述的制剂，其中所述防腐剂是尼泊金甲酯和尼泊金丙酯。
18.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括具有直径为1微米至700微米大小的液滴的气溶胶。
19.根据权利要求17所述的制剂，其进一步包括保湿剂。
20.根据权利要求19所述的制剂，其中所述保湿剂选自由丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、多元醇、聚合多元醇、乳酸、脲及其混合物组成的组。
21.根据权利要求20所述的制剂，其中所述保湿剂是丙二醇。
22.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括缓冲剂。
23.根据权利要求22所述的制剂，其中所述缓冲剂选自由谷氨酸盐、乙酸盐、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、乳酸盐、甲酸盐、乙醇酸盐及其混合物组成的组。
24.根据权利要求23所述的制剂，其中所述缓冲剂是精氨酸。
25.根据权利要求22所述的制剂，其中所述缓冲剂pKa为5至9。
26.根据权利要求22所述的制剂，其中所述缓冲剂pKa为6至8。
27.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括增粘剂。
28.根据权利要求27所述的制剂，其中所述增粘剂选自由明胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、卡波姆、羧甲基纤维素及其混合物组成的组。
29.根据权利要求28所述的制剂，其中所述增粘剂是卡波姆。
30.根据权利要求28所述的制剂，其中所述增粘剂是羧甲基纤维素。
31.根据权利要求28所述的制剂，其中所述增粘剂是明胶。
32.根据权利要求1所述的制剂，其pH为7.0±0.5。
33.根据权利要求1所述的制剂，其进一步包括张力调节剂。
34.根据权利要求1所述的制剂，其同渗浓度为50mOsm/L至350mOsm/L。
35.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于生物利用度大于约15％。
36.一种药物制剂，其包括人胰岛素、甲基-β-环糊精、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱、依地酸二钠、聚山梨酯80、精氨酸缓冲剂和卡波姆的含水溶液。
37.根据权利要求36所述的制剂，其中所述人胰岛素是速效人胰岛素。
38.根据权利要求36所述的制剂，其中所述人胰岛素是人胰岛素(AspB28)。
39.前述任一项权利要求所述的制剂在制备治疗人疾病或病症的体征和症状的药物中的用途，所述的疾病或病症包括糖尿病、高血糖、血脂异常、诱导个体的饱腹感、促进个体的体重减轻、肥胖症、癌症、结肠癌和前列腺癌。
40.包括单体胰岛素、增溶剂和表面活性剂的含水混合物的药物制剂在制备治疗人疾病或病症的体征或症状的药物中的用途，所述的疾病或病症包括糖尿病、高血糖、血脂异常、诱导个体的饱腹感、促进个体的体重减轻、肥胖症、癌症、结肠癌和前列腺癌。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述胰岛素选自由天然人胰岛素、人胰岛素(LysB3、GluB29)、人胰岛素(LysB3、IleB28)、人胰岛素(GlyA21、HisB31、HisB32)、人胰岛素(AspB28)、人胰岛素(AspB10)、人胰岛素(LysB28、ProB29)及其混合物组成的组。
42.根据权利要求40所述的用途，其中所述胰岛素是人胰岛素(AspB28)。
43.根据权利要求40所述的用途，其中所述疾病是糖尿病。
44.根据权利要求40所述的用途，其中所述疾病是糖尿病，且所述药物作为具有直径为1微米至700微米大小的液滴的气溶胶施用。
45.根据权利要求40所述的用途，其中所述增溶剂是甲基-β-环糊精，且所述表面活性剂是二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱。
46.根据权利要求40所述的用途，其中所述药物制剂进一步包括增粘剂、防腐剂、缓冲剂和张力调节剂。
47.根据权利要求40所述的用途，其中所述药物提高了施用后至少约6小时人体中胰岛素的血液水平。
48.根据权利要求40所述的用途，其中所述药物使人体中葡萄糖百分比减少超过约10％。
49.根据权利要求40所述的用途，其中所述药物作为具有直径为1微米至700微米大小的液滴的气溶胶施用。
50.包括人胰岛素、甲基-β-环糊精、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱、依地酸二钠和聚山梨酯80的含水溶液的药物组合物在制备治疗人糖尿病或高血糖的药物中的用途。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述人胰岛素是速效人胰岛素。
52.根据权利要求50所述的用途，其中所述人胰岛素是人胰岛素(AspB28)。
全文摘要
本文公开了用于对患者鼻内递送胰岛素药物的药物组合物、制剂和其用途，所述药物包括人胰岛素、增溶剂和表面活性剂的含水混合物，其中人胰岛素可以是速效胰岛素。
文档编号A61K9/00GK101340893SQ200680047851
公开日2009年1月7日 申请日期2006年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者史蒂文·C·夸伊, 安玛丽·史都德特·科恩, 亨利·R·康斯坦丁诺, 书奇·陈·夸伊, 安东尼·P·西来诺, M·S·克勒佩 申请人:纳斯泰克制药公司