辅助生殖技术中的代谢组学测定的制作方法

专利名称：辅助生殖技术中的代谢组学测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过分析液体培养基中的代谢产物来测定与液体培养基交换代谢产物的细胞 的状态，及其应用。
背景技术：
代谢组学
随着人类基因组序列测定的完成，对于复杂的生物体系，很显然，仅遗传信息是不能提 供其生物化学和细胞功能的综合特性的。因此，很多生物学研究的焦点正在转向蛋白质组学 和代谢组学，在广义上，蛋白质组学和代谢组学定义为对生理环境中的蛋白质和小分子的系
统分析，其中，生理环境是指，例如生物样品、细胞、组织，或生物体；小分子是指，例如 多肽、激素和神经传递素(及其代谢产物)。由于蛋白质和代谢产物比基因更为数众多、互异、 和脆弱，对其发现、鉴定、和定量的现有手段不能满足研究和临床的需要。
蛋白质组学的一个重要方面是对发生了遗传突变或表达水平改变的蛋白质的鉴定。蛋白 质和代谢产物的水平随时间或在群体中的差别可以与疾病的状况、药物群、或代谢的改变相 关联。已确定的分子种可以用作疾病或该疾病症状的生物学标志物(生物标志物)，由此可建 立新的诊断、预后和疾病治疗的方法，或针对病人作更适合的修改。为了找到上述的生物学标志物，精确测得不同类型样品之间有关蛋白质和代谢产物水平的差别是有帮助的，此过程 称为差示表型分析。
体外受精(IVF)治疗法
包括IVF的辅助生殖技术(ART)领域，无论是用于人或动物，现在都还是不甚精湛的科 学或技术。评估精子(精子细胞)、卵子(卵细胞)和胚胎的发育能力主要是在显微镜下通过 观察其可见的外观来完成的。在很多情况下，这些细胞的可见外观与其发育能力并不是很好 地相关。有关这些细胞中发生了什么，没有其它的信息可提供给ART专家来指导该过程。整 个程序是抱着一种期望来实行的选择能发育的配子，然后这些能发育的配子会产生能发育 的胚胎，这些胚胎又会成功地植入到子宫内，接着产生健康的后代。尽管通过提取一个细胞 对胚胎进行遗传检验，有可能至少测得一些发育能力的因子，但这种"侵入式"的步骤会对 胚胎产生有害的影响。目前，没有一种现有技术能使胚胎学家和其它ART专家去有效地评估 ART程序中这些细胞的发育能力。
IVF已被证明是最适用于不孕配偶的选择，而且正逐渐被公认为优于其它治疗方案的"最 优良"的程序。
IVF过程可分为6个主要的程序步骤1)用生育激素药物刺激雌性生物以产生大量同期 的卵子群；2)收取卵子；3)收集并处理雄性配子，随后是卵子的受精；4)在生长培养基中 培养所产生的受精卵/胚胎；5)胚胎的选择；以及最后是6)胚胎的移植。 一般，不把包括 胚胎植入和妊娠的关键过程考虑作为IVF过程的一部分，因为它们不受程序本身的控制。在 当前的IVF实施中，主要根据主观的形态学的标准和发育的模式(在胚胎的情况下)，设想选 择用于程序中的卵子和胚胎是能发育的或是健康的；没有生物学的量度标准可有助于这种非 常严格的选择过程。未使用的胚胎通常将其深低温保藏。
现在，ART服务业使其还可能为下述的患者提供治疗的方案这些患者自觉不是不能生 育的，但他们希望推回或控制其生物钟，以增强和/或保持他们的生殖功能(或生育力)(生 育力的保持)。另一方面，ART服务业应用于正常的、能生育的人群已产生了新的保持生育力 的治疗范式。对于控制生育推迟的需要可以进一步得到理解，例如，如果一个患者正在进化学治疗，在治疗中，其生殖功能可能会受到干扰。
目前还没有实用的生物学标准或分析方法使卵子、精子、或胚胎的选择能够保证IVF程 序的有效和安全。因此，在IVF程序的前端，由于缺乏可靠地评估卵子能力的分析方法学， 胚胎学家们采用了主观的和非标准的胚胎发育标准和形态学作为胚胎质量的标志，并由此推 断起始的卵子质量。

发明内容
在两门科学的学科汇合的基础上，确立了一个新颖的技术平台(l)活组织分光镜检査， 这是不同形式的分光镜检查分析在人类生物学方面的应用，它可用于确定、定量以及证实蛋 白组学和分子诊断的生物标志物；(2)代谢组学，它是对生物样品中(在体液和在固体的组 织中)的多个小分子生物标志物之间的动态相互作用进行检査和集合的一门科学，用以了解 复杂的生物过程和功能。代谢组学可以用于研究在组织和/或细胞型式中代谢量变曲线的改 变。
在此使用术语"基于活组织分光镜检査的代谢组学(BSM)"，以描述该技术平台。这里使 用BSM平台来分析样品的蛋白质组和分子生物标志物的组成，然后它又利用信息学将数据转 换为独特的"代谢组的量变曲线"。每条量变曲线又转变为独特的"指印"或"识别特征"， 该"指印"或"识别特征"确定了目的样品的代谢状态，从而也就确定了样品来源的患者的 状态。"代谢组的量变曲线"可以用来系统地区分通常很微小的差别，该差别可区别正常的生 理状态与疾病的开始或发展，或个体对药物治疗的反应。
因此，BSM可以广泛地应用于人类和动物的健康中而对本发明的范围没有限制。这种BSM 技术平台的广泛应用包括但不限于(1)非侵入式的分子诊断和预后的评估，例如在老年痴 呆症(AD)、胎-母健康监测、体外受精方法学中的评估；以及(2)利用代谢组的量变曲线鉴 定有效和安全的替代标志物,用于制定发现和开发药物的基于药物诊断法的策略。上述这些应 用利用了在BSM技术中重点应用的基于生物标志物的代谢组量变曲线。
各种不同形式的活组织分光镜检查分析都表明对数种组织、器官和体液的非侵入式体内监测是有用的。固体的组织、单个细胞和生物体液的体外分析也采用这种方法来完成。
活组织分光镜检査有很多优点，包括简单、精确和专一性、使用容易、分析快速、低成 本的检测设备、可同时测定单个样品中的多种被分析物，以及通过即时检验或远程分析进行 连续的实时监测的优点。现在，利用BSM平台，人们可以用小型的设备，对少至20ri的液体 样品，在少于l分钟的时间内进行高速、复杂的代谢组分析。
代谢组学是日趋了解基因与蛋白的相互作用后的很有价值的延伸。现在，医学和I4学界 已认识到基因组学、转录组学和蛋白质组学只是体内平衡的一小部分。基因组代表可能是什 么，蛋白质组则明确表达了什么，代谢组表示细胞、组织、器官或个体有关健康和疾病方面 的实时功能状态。表达的蛋白质和修饰后蛋白质的这些所有"下游后果"的累积影响表现在 一个反映细胞的功能状态的小分子库中。描绘这种分子库(代谢组)的量变曲线提供了细胞 的健康、疾病、年龄以及药物和在其周围的宾主共栖生物的影响之间的关联。因此，获取这 种信息的能力促进了跨几个学科的分子诊断、预后和药物的发现的技术的进展。它为专业人 员提供了宝贵的在多种临床环境中的决策能力。
生殖健康的范围包括正常生殖功能以及生殖力衰退和不孕。对于在生殖健康领域中，更 具体的是在辅助生殖技术(ART)中，生物标志物的代谢组量变曲线尚未进行探索。现已发现，
生物标志物量变曲线可以可靠地用于鉴定能发育的、生物学上合格的卵子、精子、和胚胎， 以提高体外受精程序(IVF)的治疗成功率(怀孕)，同时，通过允许审慎地预选出少一些， 但只要是能发育的胚胎用于移植，可以降低一胎多生的风险。
因此，通过用光学法测定体液和IVF实验室程序中所用的配子或胚胎的培养基，提供一 种测定样品的代谢组量变曲线的方法，用于确定，例如卵子、精子或胚胎的发育能力，从而 可确定进一步在体外受精程序和相关方法中的成功可能性，这对于该技术是很重大的贡献。
非常希望提供下述的一种方法，该方法通过分析液体培养基中的代谢产物来测定与液体 培养基交换代谢产物的细胞的状态。所述的细胞可以是在合适的培养基中生长的细胞，例如 胚胎或干细胞。该细胞可以是子宫壁的细胞，所说的液体培养基可以是子宫内膜的液体。
本发明提供一种方法，该方法通过分析液体培养基中的代谢产物来确定与液体培养基交换代谢产物的细胞的状态。
本发明还提供一种测定样品的代谢组量变曲线的体系和方法，通过用光学法测定体液和 IVF实验室程序中所用的配子或胚胎的培养基，来确定，例如，在体外受精程序和相关方法 中的成功可能性。
本发明另外还提供的是关联液体中代谢产物的波谱的方法和仪器，例如包括荧光的单波 长光谱、多波长的光吸收光谱、拉曼散射光谱、或磁共振谱；所说的液体例如是体液、配子 或胚胎的培养基，其中这些波谱显示至少一种细胞的状态，包括胚胎中的配子和多个细胞。
在一些实施方案中，提供了一种辅助生殖技术(ART)的方法。这种方法包括在体外使 至少一个胚胎在培养基中生长；在该胚胎生长的期间，不时地分析检验所述的至少一个胚胎
的培养基，以确定该胚胎的状态，并利用该胚胎的状态来确定下述时机中的至少一种 将胚胎移植到子宫的时机；
使胚胎经过短时期的贮藏，以供此后移植到子宫内的时机； 使胚胎经过深低温冷藏，以供此后移植到子宫内的时机； 调整培养基，使胚胎继续生长；以及
将胚胎移植到替换的培养基中，使该胚胎继续生长的时机。
在一些实施方案中，上述的方法还包括通过分别分析检验卵泡液、精液桨和子宫内液， 确定卵子、精子和子宫的发育能力，当卵子、精子和子宫的发育能力表明胚胎移植的植入或 怀孕成功的或然率高时，即可将单个的胚胎移植。
胚胎可以通过用精子使至少一个卵子在体外受精而得到。 在一些实施方案中，在胚胎生长的过程，对培养基的调整反复进确测定。 在常规的IVF中，没有可靠的有关胚胎发育能力的信息，致使有时移植会延误，因为生 存至第3、 4或5天的胚胎预期是更能发育的。但是，人们还是希望将已知是(或表明有较大 的可能性是)能发育的胚胎尽早移植。随着胚胎发育至成熟期的某一点，如第2天，该胚胎 的发育能力的状态会提高，但是，胚胎在体外成熟时，对于某些胚胎，其发育能力可能不会 明显地提高更多。因此，在一些实施方案中，胚胎移植的时机确定在最早的时刻，在该时刻胚胎达到植入成功高或然率的起点。
本发明可以不受限制地应用于哺乳类动物，例如人类、牛科动物、马科动物、猫^f动物、 犬科动物、羊科动物和鲸类。
当一些卵子受精，并有若干胚胎长成时，至少可以利用所确定的状态选择供移植的胚胎。
分析检验可以包括获得培养基的波谱。在一些实施方案中，对波谱进行校正，确定一些 胚胎的培养基的波谱记录与使用这些胚胎怀孕成功的记录之间实际的相互关系，然后在此波 谱上运用该相互关系来确定胚胎的状态。在一些实施方案中，该波谱是一种光谱。所说的波 谱可以含有与培养基的氧化压力组分有关的信息。
当胚胎被深低温冷藏时，可以定期地获得该深低温冷藏的培养基的光谱，由该深低温冷 藏的培养基的光谱可确定胚胎的状态，用于在深低温冷藏期间对深低温冷藏的胚胎进行监测。
在一些实施方案中，提供了一种辅助生殖技术(ART)的方法。
这种方法包括在卵子的卵泡液中提取多个卵子，分析检验每个卵子的卵泡液，以确定该 卵子的状态，并依据状态选择深低温冷藏或受精。卵泡液的分析检验基本上与培养基的相同。
在一些实施方案中，提供了一种方法，该方法可产生生殖健康程序在患者中获得成功结 果的或然率数据。该方法包括，使用所选择的分析模式，获得至少一种与液体培养基交换代
谢产物的细胞在液体培养基中的至少一种代谢产物的波谱，该细胞选自卵子、精子、和胚胎； 然后，利用所获得的波谱，以及针对患者群体已建立的生殖健康程序的成功结果与用所选择 的分析模式得到的液体培养基中的代谢产物的波谱之间的相互关系，产生所说的至少一种细 胞的成功或然率数据。这些液体培养基的分析检验基本上是相同的。
上述的分析模式可以是单波长或多波长的光吸收、拉曼散射或光学荧光。该光谱可以在 短波长的近红外线范围内。所选择的分析模式也可以是醒R。
生殖健康程序可以涉及先兆子痫、IAI或羊膜内炎、早产、反复流产、胚胎植入、性别 决定、环境污染/传染、异位妊娠、正常妊娠、子宫内膜异位症。
在其他的实施方案中，本发明提供了一种辅助生殖技术(ART)的方法。该方法包括提供 含有一个或多个精子的精子浆液样品，分析检验该精子浆液以确定该精子的状态，然后依据该状态选择该精子进行深低温冷藏或受精。
在其他的实施方案中，本发明提供了一种辅助生殖技术(ART)的方法。该方法包括分析 检验患者的子宫内膜液，以确定该子宫对植入胚胎的发育能力，并依据该发育能力确定植入 胚胎的时机。例如，如果该发育能力较弱，则重复进行检验，在发育能力较强的时候确定为 植入的时机。例如，至少可对患者提供饮食、休息/运动、和医疗介入的其中之一种干预，以 增强其发育能力。
子宫内膜液可用光学法在原位测定，然后该分析检验可获得一份光谱。
在一些实施方案中，提供了一种确定与液体培养基交换代谢产物的细胞的状态的方法。 该方法包括，使用所选择的分析模式，获得至少一种细胞在液体培养基中的至少一种代谢产 物的光谱，并利用所获得的光谱，以及针对细胞群体所建立的至少一种细胞的状态与用所选 择的分析模式得到的液体培养基中的代谢产物的光谱之间的相互关系，产生所说的至少一种 细胞的成功或然率数据。
在一些实施方案中，分析的模式是光学光谱法，例如，光的拉曼散射、光吸收或光 学荧光。在一些实施方案中，所说的光谱提供了有关液体培养基的氧化压的信息。
在其他的实施方案中，提供了在培养基中使一个或多个细胞维持或生长的方法。该方法 包括，根据由选择的分析模式得到的培养基的光谱所确定的细胞状态，对该培养基进行调整。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种仪器，用来对体外在培养基中生长的一个或多 个细胞的培养进行控制。这种仪器包括光谱获得装置，用来获得培养基的光谱；将光谱数 据与细胞的状态关联的相关数据的数据库；确定状态的信息处理系统，该系统利用相关数据 和光谱产生表示细胞状态的数据；培养基控制器，它可产生控制信号，以实现在培养基中对 表示细胞状态的数据应答的调整。上述的控制器可以是全自动的，用来改变培养基参数的阀 门或开关也是全自动的，或者它能够向技术员报告，让技术员去操作所需要的调整。在一些 实施方案中，所说的光谱包含培养基中至少一种组分的有关氧化压力的信息。
作为实施例，上述对培养基的调整可以是对环境温度、或气体组分，如溶解氧方面的调 整。同样，例如，该调整也可以是在培养基中加入某种物质去改变PH，或加入蛋白。在其他场合，合适的调整是替换培养基。
上述的仪器能够利用所说的状态作为反馈信息而进行操作来使培养基改变。通过一次调 整使状态产生可测量的变化所需的时间通常就确定了反馈环的循环时间。当然，当调整立刻 影响培养基的光谱时，可紧随调整再获得光谱，那么，调整后立即测得的以及在随后的某一 时间测得的状态的改变，便可用来评估该调整是否有利于细胞的维持或生长。
为了本发明的目的，下面的术语定义如下
术语"体液"是指全血、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、羊膜液、脑脊髓液(CSF)、 乳液、阴道液、子宫液、精液。
术语"培养基"是指营养物和盐溶液的任何一种混合物，它可用来维持在实验室中体外 培养的活细胞，包括配子和胚胎。对于某些分析模式，例如光学光谱法，分析的培养基可以 是冰冻的形式而不会影响其获得有用的光谱的能力。
术语"患者"是指调查、观察、监测或研究的对象，无论是人或动物。
术语"非侵入的"是指透皮的或经皮的光谱学分析，该分析是在原位，或是在患者的体 内操作，是最低限度的侵入，例如通过取出小量体积的体液。
术语"与氧化压力有关的疾病"是指引起氧化压力或由氧化压力引起或依赖于氧化压力 的疾病。
术语"氧化压力组分"是指对体液培养基或其它的研究样品中的某种生物化学组分的亲 氧化剂/抗氧化剂平衡的干扰，对前者有利时，可能会导致对组织的损害。同样，"氧化压力 组分"是指对体液培养基或其它的研究样品中的多种生物化学组分的亲氧化剂/抗氧化剂平衡 的干扰，对前者有利时，可能会导致对组织的损害。
术语"氧化还原的识别标志"是指来自多波长光吸收光谱学分析或NMR光谱学分析的氧 化压力成分或0S生物学副产物的集合体。
术语"抗体"是指实质上由一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的 多肽。己认可的免疫球蛋白基因包括k、 X、 a、 Y、 S、 e和u恒定区域内的基因以及 许多免疫球蛋白可变区域的基因。轻链归为k或A类。重链归为Y、 y、 a、 S或e类，这反过来又确定了免疫球蛋白的分类，分别为lgG、 lgM、 lgA、 lgD和lgE。
术语"生物标志物"或"靶标志物"是指与特定的程序或医学症状或所研究的疾病，如
体外受精或老年痴呆症有关联的蛋白质、酶、肽、小分子、氧化压力化合物、或其它生 物化合物的量变曲线。与特定的生物标志物的构成有关的数据被转换为新的"代谢组量变曲 线"或"指印"。每条量变曲线通常是采用专有的信息学进行分析，该信息学可将上述数据与 临床症状或结果相关联。代谢组的量变曲线可以用来系统地辨认出通常很微小的差别，该差 别是正常的生理状态与疾病开始或发展状态间的，或个体对治疗药物的反应之间的差别。这 种技术可以应用到跨几个科学的学科和应用的领域。
术语"胚胎质量"定义为在随后的程序中使用的合格胚胎的质量表示，并反映出胚胎用 于涉及胚胎的选择和移植的程序中的发育能力，这些程序例如是体外受精、以及植入以达到 怀孕的目的、短期贮藏、长期贮藏，包括深低温冷藏。短期贮藏定义为从约3天至约5年的 贮藏。长期贮藏定义为长于5年至无限期的贮藏。
术语"卵子质量"定义为在随后的程序中使用的合格卵子的质量表示，并反映出卵子用 于涉及卵子的选择和移植的程序中的发育能力，这些程序例如是体外受精、以及植入以达到 怀孕的目的、短期贮藏、长期贮藏，包括深低温冷藏。短期贮藏定义为约3天至约5年的贮 藏。长期贮藏定义为长于5年至无限期的贮藏。
术语"精子质量"定义为在随后的程序中使用的合格精子的质量表示，并反映出精子用 于涉及精子的选择和移植的程序中的发育能力力，这些程序例如是体外受精、以及植入以达 到怀孕的目的、短期贮藏、长期贮藏，包括深低温冷藏。短期贮藏定义为从约3天至约5年 的贮藏。长期贮藏定义为长于5年至无限期的贮藏。
术语"HLA-G"是指人体白细胞抗原G，并包括可溶的和不可溶的两种形式，除非另有说 明。该术语在相应的上下文中是指抗原或基因座。
术语"整连蛋白、泛蛋白、选凝素、生长因子、抑制素和其它激素、其它酶、小分子和 肽"是有代表性的生物标志物，这些生物标志物具有其不同的公认的科学含义。
术语"免疫分析"是一种分析方法或方法论，它利用抗体来与被分析物特异结合。免疫分析的特征是利用至少一种抗体的特异结合性质来分离、靶向或定量被分析物。
术语"分离的"、"纯化的"、或"生物纯的"是指实质上或基本上不含在天然状态下通常 与其伴随存在的组分的材料。
术语"标记物"在由以下方法可检测的合成物中使用光谱法、光化学法、生物化学法、 免疫化学法、或化学法。例如，有用的标记物包括荧光染料、电子致密试剂、量热剂、酶， 例如ELISA中常用的酶、生物素、地高辛、或已有抗血清或单克隆抗体因而可检测的半抗原 和蛋白质。
此处涉及的所有参考文献特此引入作为参考。


由以下的详述并结合附图，本发明更多的特征和优点将会更显而易见，其中-
图1是光学氧化压力测定装置的示意图，包括一个光径为lcm长的5(￥1样品池，由宽带 的鸨卤素灯通过第一条光纤供光， 一台短波长近红外分光光度计(SWNIR)通过第二条光纤连 接在样品池的另一端，用于检测600nm-1100nm范围的CW强度，还有一台与该分光光度计连 接的计算机，用于光谱的记录和分析。
图2表明不同种类的各种分子种在600nm-1000nm波长范围的吸收水平。
图3表明20个IVF胚胎培养基样品的拉曼光谱。
图4表明带有标准偏差的拉曼光谱。
图5表明能发育的样品的光谱。
图6表明交叉验证。
图7是发育中胚胎的代谢组学识别特征，用带有紫外光检测的毛细管电泳获得，该检测 可确定培养基中的营养物和代谢产物的级分。
注意，所有附图中，相同的特征用相同的参照数字确认。
具体实施例方式
本发明提供一种用于关联波谱的方法和仪器，所说的波谱例如是培养基或体液的多波长 光吸收、拉曼散射光谱、或磁共振谱，其中的体液例如是，取自与氧化压力有关疾病患者的 体液。
氧化压力测定现在尚未作为诊断或预见病症开始的一种方法而在临床中使用。本发明提 供了一种能迅速测定氧化压力的适用于临床环境的方法。
为了更好地研究症状的时间过程，从而能够千预和改正氧化压力的水平，从这观点来看， 以前还没有纵向地(全过程)对氧化压力进行过测定。本发明提供了一种仪器，该仪器能够 非侵入地以适合用于任何患者的方式快速测定氧化压力。
作为实施例，本发明提供了一种利用光学分析方法来测定体液中一种或多种氧化压力组 分的一种手段。按照本发明，所分析的体液可以是全血、血浆、血清、尿液、唾液、泪液和 脑脊髓液(CSF)、羊膜液、乳液、阴道液或子宫液中的任意一种或其混合物。另一方面，本 发明提供了一种测定培养基中一种或多种氧化压力组分的方法，以确定卵子的质量、胚胎的 质量、精子的质量等。光学分析可用光谱中不同范围的波长来完成，例如NIR、 S丽IR和THz 范围。除了吸收光谱以外，拉曼光谱、荧光光谱也可以用作分析。
本发明还提供一种方法和仪器，用来测定与氧化压力有关的症状在患者或样品中存在的 或然率数据。针对患者群或样品群，建立与氧化压力有关的疾病和用选择的分析模式获得的 体液的波谱之间的相互关系。对于要测定其或然率数据的患者，用选择的分析模式获得体液 的波谱。利用所获得的谱和已建立的相互关系，产生该患者的或然率数据。
本发明还提供了测定胚胎质量的方法，以便其在随后的程序中使用，该质量包括精子的 发育能力。这些方法包括通过对胚胎发育能力的生物标志物的代谢组量变曲线的评估，利 用体外受精和胚胎移植(IVF/ET)以及输卵管胚胎移植(TET)技术将胚胎移植到子宫。
BSM技术平台可以应用于许多不同的诊断、预后和监测显示中，包括体外受精程序(IVF)。 研究表明，BSM可以容易地以非侵入的方式实施，并且具有高度的灵敏度和专一性。小型的 设备可很容易适用于商业单位的大规模生产。大多数针对代谢组学的方法都依赖下述的技术作为其核心技术例如质谱术、NMR、 HPLC、 电泳和很多基于蛋白组学的分析检验方法，包括微矩阵和免疫分析等。虽然这些技术对于一 些应用，例如在研究、服务或临床参考实验室中的应用，都是有用的方法，但是这些方法是 费钱和复杂的。相反，BSM是用小型、方便使用和便携的现场使用设备来实施的，该设备甚 至可用于筛选的目的。
有关化学和生物样品中组分的相对定量的信息可以由光谱通过使光谱标准化，产生峰的 强度值而得到，该强度值精确地反映了相应的化学物质的浓度。由固有组分的峰强度计算出 标准化的因子，这些固有组分的浓度在一系列样品中是保持恒定的。 一种组分在不同样品中 的相对浓度可以由标准化的峰强度判断。与常规的方法不同，它不需要内标准和添加试剂。 在蛋白质组学和代谢组学的研究中，该方法对差示表型分析尤为有用，在该分析中，确认了 其浓度在不同样品中变化的分子。这些被确认的分子种可以用作疾病或对治疗应答的生物标 志物。
自由基是在其外层轨道含有不配对电子的原子或分子。它们的电子形态使得这些化学物 质与膜脂、蛋白、核酸和其他细胞基质具有高的反应活性。自由基可以来自环境的来源，或 可以在组织内再产生。
过氧化物阴离子(02—)、过氧化氢(HA)、单纯氧、次氯酸(H0C1)、过亚硝酸盐(ONOO-)、 羟基自由基(0H*)是内源产生的反应性氧类物质(ROS)的例子。过渡金属，例如亚铁离子 (Fe2+)或亚铜的铜(Cu1+)，在细胞的氧化还原化学中，通过将仏02还原为高细胞毒性的OH* 自由基(芬顿催化)而起重要的作用。在哺乳类动物的组织中，进化保守的抗氧化酶(例如 过氧化物岐化酶、过氧化氢酶、甘肽过氧化物酶以及各种氧化还原酶)与许多非酶的低分子 量的抗氧化剂化合物(例如GSH、硫氧还蛋白、抗坏血酸、生育酚、尿酸、退黑激素、胆红 素)协同起作用，以维持氧化还原反应在体内的平衡。通过将过渡金属维持在相对低的氧化 还原状态，金属结合蛋白，例如铁蛋白、运铁蛋白、乳铁蛋白、金属硫蛋白、血浆铜蓝蛋白， 基本上成为组织和体液中的抗氧化剂蛋白。
氧化压力(0s)被定义为"在亲氧化剂/抗氧化剂平衡中的干扰，对前者有利时，导致可能的[组织]损伤"。这种平衡可以与体液中的一种或多种生物化学组分有关。氧化压力被牵 连为细胞机能障碍和死亡的重要常见途径，而且可能是很多人类内科疾病的治疗目标，这些 疾病包括癌症、糖尿病、阻塞性肺疾患、炎性的肠道疾病、心脏缺血、肾小球肾炎、斑疹变 性以及各种神经变性的疾患。
由此，目前已知道采用色谱技术和质谱仪来测定血浆和脑瘠液(CSF)中的氧化压力。这 种分析技术很费时，而且要获得相当大量的体液来取得氧化压力的测定结果。
本发明所用的生物标志物包括炎症标志物、氧化压力标志物、和细胞损伤标志物，或它 们的结合。炎症标志物包括但不限于细胞因子、或其它促进白细胞或炎症细胞的吸引力的 炎症介质。炎症标志物可以，但不是必须由炎症细胞释放。症标志物包括但不限于8-异前 列烷(8-isoprostane)、髓过氧化物酶、IL-6和C-活性蛋白。氧化压力标志物显示出由氧化 剂或自由基引起的细胞损伤。氧化压力标志物包括到达其各自的目标，例如脂、蛋白或DNA 的自由基和氧化剂，以及由自由基和氧化剂引起的损伤的间接标志物。氧化压力标志物包括 但不限于游离铁、8-异前列烷、髓过氧化物酶、谷甘胱肽过氧化物酶、脂质氢过氧化物酶、 双酪氨酸、和8-羟基喹啉。细胞损伤标志物包括生物分子(例如酶)，其中该生物分子的释 放与坏死或损伤的细胞有关。细胞损伤标志物包括但不限于:肌酸激酶和乳酸脱氢酶。 一些 生物标志物可以归类于一种以上的标志物类型。例如，8-异前列烷可归为炎症标志物和氧化 压力标志物两类。
本发明提供了一种处理波谱数据的方法，其中的波谱包含有峰强度的峰。由多个化学样 品，例如含有代谢产物、蛋白或肽的生物样品，获得了一组波谱。该波谱可以是由下述方法 得到的质谱例如，电子喷射离子化(EST)、基质促进的激光解吸离子化(MALDI),或电子 撞击离子化(EI)。每个波谱的峰强度通过标准化因子换算，产生与对应组分的浓度成比例的 峰强度。根据换算的峰强度，可以估计特定样品中组分的相对浓度。标准化因子根据化学样 品中的组分计算得出，该组分的浓度在其各个化学样品中的浓度基本上是不变的。在一个实 施方案中，这些组分未预先确定，而且是化学样品中的固有组分，在另一个实施方案中，标 准化因子由所说的一组波谱中的两个(例如第一和第二个)波谱的峰强度之间的比率计算而得，而且是非参量性的测定，例如是中值。 包括体外受精的辅助生殖技术(ART)
本发明的方法可用于确定体外受精的成功时机。目前，在体外受精(IVF)实验室中，对 前胚胎的选择只能根据其在受精后的前48-72小时期间的形态和体外的卵裂速率来进行。这 些标准是有用的，但是，作为发育潜力的指标，这些标准不总是好的。在大多数情况下，根 据这些相对粗糙的指标选择3或4个胚胎，然后移植到子宫腔中。如果在生物化学、遗传、 发育参数的基础上，另外提供更严格的前胚胎选择的标准，则有可能移植一个或两个成活可 能性最大的健康胚胎，而不会使患者处于因反复发生的胚胎植入的失败、自然流产、多次IVF 试验或多次妊娠的风险所引起的心理创伤之中。因此，为了成功的植入，医学上需要一种更 有预见性的检验标准。
生殖健康(IVF)
目前，商业上还没有诊断的检验方法去评估卵子、精子或胚胎的能力。现在，胚胎的选 择是在任意的形态、速率的尺度的基础上进行的。着床前胚胎遗传学诊断(PGD)是一种检验 有限数量的遗传疾病，但不能用于预见胚胎的能力的程序，PGD是有高度侵入性的标准化的 程序，它仅在美国的很少几个专业化的实验室中使用。再者，该程序很费钱、费时，而且很 有争议。这种技术在生殖健康和产科医学方面的其它应用包括对下述方面的评估先兆子痫、 IAI或羊膜内炎、早产、反复流产、胚胎植入、性别决定、环境污染、传染、异位妊娠、正 常妊娠、子宫内膜异位症等。
卵子
直至最近，人们还是假定卵子一般是"正常"或合格的。它们不被看成可能是在IVF中 造成障碍的来源，除非在观察到形态发生严重变异，或如果该卵细胞是不成熟的(主要用大 小度量)明显情况下。在上述的情况下，有缺陷的卵细胞会被丢弃，并继续被丢弃。然而， 增长的科学証据正在改变这种见解，正如几份新的报告(最近，2005年的ASRM年会)已证 明的，在年轻的女性(21-31岁)中，所有卵子的50%至高达75%是不正常的(非整倍体的)， 而且，该数字随着年龄而显著地上升。 一般来说，由于对人类卵子缺乏在任何水平，如基因组学、蛋白质组学或代谢组学水平上的调査研究，因此，就没有令人满意的用于卵子选择的 程序。
基因组学检验
一些基因组学检验技术只是最近(不到2年)才使其适用于嚐试评估卵子的能力中(例 如，比较基因组杂交)。这些技术尚处在其发展的初期，还未标准化或被承认，而且离开成为 IVF试验室中实用的、有普通席位的程序还相差很远。目前，这些程序是很费钱、费力的， 而且对卵子的侵入性程度很高，因为需要做卵细胞的切片。这种切片的作用，即使有，也是 未知的。
新近，着床前胚胎遗传学诊断(PGD)已通过评估胚胎中非整倍体的发生率，间接地用于 卵子质量的研究，其中所说的胚胎如没有非整倍体的发生，则是在健康、形态方面合格的胚 胎。在这些研究中，甚至取自年轻女性的卵子都发现其染色体异常的发生率都很高；根据推 断，该非正常的胚胎来源于非正常的卵子。令人信服地，用CGH或PGD程序在卵子中检测得 到的非整倍体发生率是很相似的，约为50%。
胚胎
从历史的事实看，为了监测和预见IVF的成功，胚胎作为干预的目标更为引人注目。IVF 的"圣杯(holygrail)"是为了了解哪些胚胎是能发育的、合格的胚胎以及哪些不是。其前 题是有一种程序一贯地只鉴定并选择出高质量的胚胎，即具有引起妊娠的最大可能性的胚 胎，这种胚胎可以常规地进行选择来用于移植。其本身又可期望提高妊娠率而降低一胎多生 的几率，因为如果预知这些胚胎是能发育的，就只需移植较少的胚胎。
形态的评估
现今，在IVF实验室中，基于+卜+4分级系统的胚胎形态的评估是确定胚胎发育能力的 主要方法。胚胎通常用"分级胚胎记分(GES)"进行评价。GES系统在受精后的前72小时期 间进行评价。对每个胚胎，按最大为100分进行记分。GES分大于70的胚胎有最大的可能发 育成为能发育的胚泡，该胚泡在胚胎移植(ET)后，接着植入子宫内层(或内膜)中并产生能 发育的妊娠。这样，GES建立了一套完整的标准，为ET在有关选择胚胎方面向患者提出建议。对于培养过程中的胚胎发育模式(例如，卵裂速率、裂殖、包涵体、内细胞群等)也进 行了评价，但是，就这些量度的使用而言，胚胎学家之间甚至很少一致。由于缺乏国家的或 国际的标准所带来的明显困难，形态的评估遭受到麻烦。内部和外部的观测者与生俱来的易 变倾向与分级系统的主观性，以及缺乏任何有关的生物学的量度结合起来，阻止了该方法的 发展。此外，该分级系统的基本科学缺陷是因下述的原则而引起的形态分析不能被认可为 是生物学功能的测定。这种方法的局限性在最近的ASRM年会上再次受到热烈的关注。然而， 由于还没有产生替代的方法，胚胎学家们仍必须依赖于这种分级系统。
通过分析生长的细胞和胚胎的代谢组学的光谱量变曲线，可评估对营养物、补给品、PH 和代谢产物的调整。这样可以连续监测细胞和胚胎的生长，并使其最佳化。例如，对确定的 氧化压力水平可以进行测定，或通过补充化学物质，如氧化剂来抵消。更具体地说，根据对 培养基的监测，较弱的胚胎可以补充更多的氧，或改良其生长培养基，以提高该胚胎的发育 能力，例如更改培养基的pH、除去代谢产物、在培养基中补充营养物。根据本发明的对培养 基的监测，在第3天的培养基中生长的弱胚胎可以转移到第5天的培养基中生长。
子宫的评估
子宫对胚胎植入的发育能力可以与子宫内膜液，即子宫壁的内层液体的分析光谱组分相关。
该方法论可应用于测定子宫颈粘液和子宫内层内膜的代谢组量变曲线，以确定该内膜对 胚胎植入的生物接受能力。虽然不同子宫的内膜内层可以用采用光纤的不同光谱法非侵入式 地进行检査，该方法将光纤通过子宫颈直接插入子宫，但是，作为一种生物液体，子宫颈粘 液可以通过不同的光谱法进行分析，以确定表明有接受能力的内膜特征的代谢组学量变曲线。 子宫内膜的代谢组测定将会导致胚胎植入成功率的提高，因而妊娠率也提高。
着床前遗传学诊断和基因组学检验
胚胎的基因组学检验(即，CGR)受到与上面提及的卵子同样的限制，而且到目前为止， 胚胎的CGR还未受到科学界可信任的关心。然而，目前ART领域却得益于着床前遗传学诊断 的程序，该程序可用于对发育中的胚胎筛査其有限的几种特殊的遗传病和非整倍体，非整倍体使23对可能受到影响的染色体中的9对受到影响。PGD是一种费力的程序，它与另一种称 为荧光原位杂交(FISH)的程序联合使用。遗憾的是，PGD/FISH为IVF程序鉴定卵子和胚胎 的总体发育能力时，缺乏灵敏性和专一性。虽然PGD在检测能影响胚胎的发育能力的非整倍 体中是有用的，但这不能证明在总体评估胚胎的发育能力中有用。PGD被认为是有争议的程序，因为它需要做早期胚胎的单细胞切片检査，而且该过程本 身所固有的对健康风险也是未知的。尽管切片是在IVF实验室中完成，但该切片必须送到另 一远处的遗传实验室去做染色体分析。PGD也被FDA和ASRM看成是一种试验程序，而且，由 于从试验所得的遗传信息性质的原因，已对其提出了生物伦理道德的问题。作为IVF的常规、 主流的试验，PGD的费用也是过高的。直至最近，该领域被PGD的占领，很有可能阻止了科 学家们继续从事其它基因组的方法学或蛋白质组学和代谢组学的研究。与本发明的代谢组量变曲线相比，PGD是很费钱和对胚胎有侵入性的程序，因此未知风 险的程度很高；对遗传疾病的试验有限制；而且费时。此外，除了非整倍体的基因组学评估 之外，尚未证明PGD是测定胚胎的发育能力的有用方法。因为它是一种复杂和费钱的程序， 它不可能成为常规的胚胎评估中的主流方案。由于许多科学的、社会政治的理由，PGD仍被 考虑为一种试验程序。因此，代谢组量变曲线作为卵子和精子总体能力检验的引进，在技术 上是很大的进步。胚胎生物标志物至少己对一种胚胎发育能力的分子生物标志物已经稍严格地进行了检査，即一种称为可 溶的人白细胞抗原(sHLAG)的分子。这种蛋白是通过免疫分析法测定的，因此比较麻烦，周 期长(数小时)，而且运转起来费钱。由于体积的限制(培养基样品的体积)，该测定不能按 重复测两份样品的方式进行，所以计算的精确度会有所降低。其它的蛋白组生物标志物(如 整连蛋白e、遍在蛋白、HCG、其他)近来也被提出用于胚胎；但是，这些标记物尚未被广 泛地研究，而且，它们作为胚胎发育能力的标志，其作用，如果有，还需要进一步研究。实现单个胚胎的移植树立信心，以单个胚胎移植过程作为一种手段，减少一胎多生而又不降低妊娠率，是IVF从事者的目标，同样也是ASRM和保险提供者的目标。遗憾的是，迄今已证明这是个难以达到 的目标。人们预期到了代谢组量变曲线的可利用性，它可给予该从事者在IVF的临床实践中 选择多个胚胎移植或单个胚胎移植的机会。因此可以领会到代谢组学检验的益处，它包括 (i)提高治疗的效果(即妊娠率)同时降低一胎多生(三胞胎或更多)的几率；(ii)降低对母 亲和后代的医疗风险；(iii)减少对多个早产婴儿提供医疗健康看护的费用；(iv)对IVF的较 宽的保险覆盖范围；(v)给予寻求不育治疗的患者更强的信心。人们也预期到代谢组量变曲线 为ART业界实现的其它益处的开发，包括l)冷冻的供体卵细胞库，它仅为未来的接受者提 供预选的，能发育的卵细胞，以及2)"卵子营救"，该过程是收集合格的但多余的卵细胞， 用于深低温冷藏，随后在将来的下一轮IVF中受精。 sHLAG生物标记物测定sHLAG单个生物标记物的测定目前正在IVF程序中使用。所用的试剂盒另外还包含实施 本发明方法的说明书。 干细胞通过分析培养基，本发明同样可以应用于测定培养基中一个或多个干细胞的发育能力。按照本发明，为了使干细胞分化为e细胞或分化的细胞类型的分化达到最大化，必须对干细胞的生长培养基进行评估，以测定这些干细胞的氧化压力。利用干细胞生长培养基，例如蛋 白或其他代谢产物的监测光谱，可以对分化因子进行鉴定。参照以下的实施例，将会更容易理解本发明，给出的实施例是用来说明该发明而不是限 制其范围的。实施例l由短波长远红外(SWNIR)光谱分析测定血浆中的OS取样方法分析前，将样品融化l小时以达到室温，然后离心30分钟。为了清洁和预处理样品池， 该样品池先用200W的0. 1M NaOH淋洗，然后用3X200W的纯水淋洗。短波长远红外(SWNIR)光谱分析记录第三次淋洗水的SWNIR光谱用作对照。随即，将75W样品注入样品池，并用图l所 示的仪器记录样品的光谱。由所制备的样品按下述的方案获得短波长近红外光谱。该测定是使用美国全像摄影近红 外分光光度计完成的。该分光光度计配备了一个双路径的入口，这样，参照可以与样品同时 测量。所得的光谱覆盖了 580-1100nm的范围。该检测仪器完成测定的时间是100微秒。所有 的样品都测定50次，将结果平均以减少光谱的噪音。用印pendorff移液管将样品送入内径 为10mm的样品池中。大约使用的样品。得到光谱数据后，样品池先用200W的0. 1MNaOH， 然后用3倍体积的200W纯水清洗。在每次的样品测定后，另外获取第三次淋洗水的参照光 谱。这样可以监测样品池的污染或光学系统组合的变化。每个样品的光谱都以连续流动的水 样品为参照，用于后面的程序。 IVF取样卵子在卵子收集的期间， 一旦确认了卵子，并将其移至支持培养基中之后，即从培养 皿中回收一份约含通常要丢弃的卵泡液。胚胎在IVF培养过程(丛受精至分裂为囊泡)的每个阶段的结束，收集通常要丢弃的 用过的培养基，用BSM进行分析。单个胚胎培养是该程序中制备胚胎的最好方法，但不是必 须要使用的方法。另一方面，PGD丢弃的培养基、辅助孵化技术和其他有关的ART程序也都 可以按类似的方式分析。样品可以直接用BSM分析，或冰冻保藏后，在将来进行分析。卵子 和胚胎的选择是根据在各自样品中的生物标志物的独特代谢量变曲线来确定的。 液体样品可以经冰冻后直接使用，以得到光谱，或以后经融化后再获得光谱。分析方法学 事先选择波长S丽IR光谱包含各种的分子种的吸收。为了选出血浆中主要的分子种类，如图2所示， 确认了与血红素(700nm)、 CH(830nm)、 R0H(940nm)、 H20 (960nm)、 0H(980nm)和NH(1020nm) 组分有联系的波长范围(15nm宽)。然后将这六个范围组合在一起的吸收用于下面描述的回归模型中。Haar小波变换Haar变换(HT)是最古老也是最简单的小波变换。与傅立叶变换相似，Haar变换将数据(例 如近红外光谱)映射到一个给定的基组。与傅立叶变换不同的是，傅立叶变换使用正弦函数和 余弦函数作为基组，而HT使用Haar小波作为基组。在本研究中，离散的小波变换(DWT)是 从连续的小波变换或者小波包变换中挑选出来的，用以使计算的简单程度和速度最大化。对 定义在0 < ;c < 1范围内的数据，对于DWT的Haar小波类由以下公式给出1 ifOsx<l0其余范围(1)1 ifOsx<% -1 if^sx<l0其余范围(2)屮n,k, (x)=屮(2"x — k), 0 s k s 2n — 1(3)实现Haar变换包含将光谱分解为0，平，和甲 ，4,的加权和数，其中的权重为"小波 系数"。为了获得父小波^的系数，对整个数据窗口上的信号求积分。母小波甲的权重由第一 半数据点积分后减去第二半数据点的总和得到。子小波是母小波的縮小和平移的形式。符号 甲w,表示标度，k表示平移。由此，为了找到子小波的系数，即使是数据中再小的区域都进 行求和，直到数据的最小单位尺寸。因此，子小波更像是高通量滤波器，而父小波的功能类 似于低通量滤波器。总的来说，所获得的小波系数的数目与原始数据组中点的数目相同。根据以上描述，显而易见，Haar小波是简单的结构，因为它们只有三个不同的取值+1， -l或0，而且很可能通过引入父小波的縮小和平移的形式来将它们进一步简化，父小波的缩 小和平移的形式称为标度函数或"son"小波<formula>formula see original document page 26</formula>母小波也可以重写为因此，使用2z-1个仅由1和0组成的小波，可以在具有z个点的光谱上实现"son"小 波的Haar变换。该小波变换的基组为非直角的，因为高代的"son"小波是低代"son"小波 的子集。然而，"son"小波具有单向性的优势，亦即，它们只能取正。因此，与子小波不同 的是son小波在数据处理中并不会固有地执行一阶导数。Haar变换特别适合于光谱分析。所获得的小波系数包含频率和波长信息(这里"频率" 并不是通常意义上的所指，而是指小波是否描述为小标度或大标度的特征)。由于波长信息的 保持力，比起傅立叶变换的结果，Haar小波变换的结果更容易理解光谱的含义。而且，有可 能不仅研究分离波长的重要性，而且研究不同尺寸光谱特征。这一特性的通常应用于通过 删除高频率小波系数来使数据平滑。或者，在数据集块中很大的倾向，例如倾斜的基线，可 以通过除去低频率小波的方法来修正。Haar变换的另一个重要特征是将大量的信息压縮成很小数目的变量的能力。子小波在 数据压縮中是有效的，并且这一特性在现有的研究中巳经被用以寻找最精简的模型来评价样 本的特性。比较起来，由于son Haar变换是部分多余的，因此son Haar变换在数据压縮中 做得并不是很好，但它可使相邻的波长的完全去耦。因此这一基组在特征选择上能够有更大 的自由。此外用son小波建立的模型更易于说明。因为《^只有两种不连续的取值， 一个波长 区域要么被最优化算法选取，要么不被选取。基于所选择的son小波，很可能构建起一个简 单化的使用峡缝或过滤器进行样品分析的仪器。子小波Haar变换和son小波Haar变换均用Matlab (Mathworks公司，MA， Natick)中 所写的程序来进行计算。对于子小波Haar变换，基于Mallat的金字塔算法的快速Haar变换 程序，通过执行一系列的递归和与递归差来决定小波系数。对于son小波Haar变换，使用 简单的和。由于算法需要输入的数据长度为2的乘方，为了达到最接近的2n，实验的光谱使用最后的数据值来填补。小波系数被确定，并由宽的小波至更密的小波依次排列(^，甲，A,o'…，l乂或0，《o...，《k)。 遗传算法用于评估目的级别的最精简变量(方法1的波长或方法2的小波)子集，由反向最小二 乘(ILS)回归法确定。当包含很少的波长时，如方法l，对所有可能的结合均进行模拟。当 许多小波都包含在分级系统中时，(即方法2)，使用遗传算法(GA)最优化来决定小波的最 佳选择。使用诸如交配、交叉和突变的原理对许多模型进行了评价。对于每种变量的结合， 样本级别根据如下公式评估-7="。 + c !Xj + or2X2 +----h anXn ( 6 )其中，Y为因变量(神经学上的分级，艮P， O代表正常，1代表AD)， X,， X2，……，Xn 是自变量(即，给定波长或小波系数的强度)，"。，",，……，A是系数，由一组校正的X's 确定。遗传算法最优化的完整描述先前已在别处给出，因此，这里只给出该方法的概要。使用遗传算法的方法寻找包含1至15个变量的拟合最好(最佳)的模型。通过用二进制 对选定的变量编码，并按照词典编纂的方式将它们堆成单个个体(如模型)的群体。对于2a 变量的预处理光谱，二进制编码使用n位。群体数量设置为IOOO，使用每个个体与一组校正 值按照公式6建立一个模型。相应的选择校正标准误差(SEC)的计算基于测试组。根据其 SEC确认拟合最好的两个个体，并且不进行突变地保留到下一代。余下的新群体通过以1的 交叉几率和0.02的突变率使个体间随机交配来进行拟合。随着该群体突破2000代之后，该 算法逐渐趋近一个稳定的解。对1至15个变量组成的模型进行了同样的研究，它们的SEC用于获得预报残差平方和 (PRESS)的图。令h代表带有最小PRESS值的模型中小波的数目。最精简的模型就是具有 最少小波数目的模型，这样，该模型的PRESS值不会很明显地大于具有h个小波(f-测试， 99%的置信水平)的模型的PRESS值。评估的级值不是0就是1。然而，上述的回归确定为连续的实数值。级别间的间隔用大 于0.5的值，如1级，和小于0.5的值，如O级来确定。对于每个模型，确定其灵敏度和特异性，并作为模型选择的标准。正如对本领域技术人员来说，是显而易见的，我们知道，本发明能够在光谱中不同范围 的波长下工作得很好，例如在NIR、 S丽IR和THz范围。除了吸收光谱之外，拉曼光谱和荧光 光谱也可以类似地进行分析。同样对本领域技术人员来说是显而易见的是，在核磁共振情况 下，分析技术会被修改，用以确认氧化压力组分和/或与疾病或症状相关。我们还知道，除了提供一个或多个氧化压力的值之外，本发明可以用于将光谱与疾病或 症状相关。在后面的这种情况下，本发明提供一个处理器，该处理器可以产生一个值，该值 代表多个氧化压力组分的值的加权平均，这样，该加权平均就提供了表明该病人氧化压力程 度的值。实施例2实施例1的示范方法可以用于IVF程序和胎-母健康监领!l。该方法也可以应用于获得卵子、 精子和胚胎，以及卵子、精子和胚胎的深低温冷藏。这些方法也被考虑用于体外受精程序中。实施例3利用鉴定培养基中营养物和代谢产物级分的分析分离技术，也可以得到氧化压力组分的 代谢组识别特征。图7给出的是利用带有紫外光监测的毛细管电泳进行分离的实施例。与胚 胎发育有关的组分已被鉴定出来，而且与胚胎的发育能力有正的和负的相关。具体是， 一种 在900秒的营养物级分与胚胎的发育能力负相关，而两种代谢产物的级分(1000-1100秒) 与胚胎的发育能力正相关。结合上述两组组分的信息，可以将能导致妊娠的胚胎和不能导致 妊娠的胚胎分开，其灵敏度为80%，特异性为100%。利用相同的方法论建立的分离技术，例 如，其它电动分离技术、液相和气相色谱分析法也可以用来分离这些从发育的细胞至发育能 力评估的代谢组识别特征。对于本发明，虽然己经结合了其具体的实施方案进行了描述，但应该认识到，该发明是可以作进一步修改的，而且，本专利申请意欲覆盖本发明的任何变更体、用途或改编本，一般来说，这些变更体、用途或改编本遵循本发明的原则，又包含偏离本发明所公开的内容， 例如在本发明所属技术领域内公知的或常规的操作规程，和可以适用于上文所述的基本特征 的内容，以及下面所附的权利要求范围内的内容。参考书目Sies和H.在1991年发表于纽约Elsevier的"Oxidative Stress, Oxidants and Antioxidants."《氧化压力、氧化剂和抗氧化剂》第507页；Hailiwell， B.和J.M.C.Gutteridge在1999年发表于"Oxford University Press Inc." 《牛津大学出版公司》第三期的"Free Radicals in Biology and Medicine."《生物学和医学中 的自由基》第736页；Albuszies， G.和U.B.Bruckner在2003年发表于"Intensive Care Med."《强化治疗》29巻第10 期的"Antioxidant therapy in sepsis."《脓毒病的抗氧化剂治疗》1632页至1636页；Abu-Zidan， RM.， L.D. 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权利要求
1.一种辅助生殖技术(ART)方法，该方法包括在体外使至少一个胚胎在培养基中生长；在所说的胚胎生长期间，不时地分析检验所说的至少一个胚胎的培养基，以确定该胚胎的状态；利用所说的胚胎的状态确定下述的时机中的至少之一将胚胎移植到子宫中的时机；将胚胎短期贮藏以供此后移植到子宫中的时机；将胚胎深低温冷藏以供此后移植到子宫中的时机；调整所说的培养基，以便使所说的胚胎继续生长的时机；以及将胚胎移植到替换的培养基中，以便使所说的胚胎继续生长的时机。
2. 权利要求1所述的方法，其中所说的胚胎是通过用精子使至少一个卵子在体外受精而获得的。
3. 权利要求1所述的方法，其中所说的利用所说的胚胎的状态包括反复地确定对所说的培养基的调整。
4. 权利要求l所述的方法，其中所说的状态是胚胎对植入的发育能力，所说的胚胎移植的时机确定在最早的时刻，在该时刻，胚胎达到其植入成功高或然率的起点。
5. 权利要求l-4所述的方法，其中所说的子宫是哺乳动物的子宫，所说的哺乳动物选自人类、牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、羊科动物和鲸类。
6. 权利要求2所述的方法，该方法还包括通过分别分析检验卵泡液、精液浆和子宫内层液，确定所说的卵子、精子和子宫的发育能力，当该卵子、精子和子宫的发育能力表明胚胎移植的植入或怀孕成功的或然率高时，即将其中所说的单个胚胎移植。
7. 权利要求2所述的方法，其中一些所说的卵子受精并长成若干所说的胚胎，其中可以利用至少所说的状态选择所说的胚胎进行移植。
8. 权利要求6所述的方法，其中一些所说的卵子受精并长成若干所说的胚胎，其中可以利用至少部分所说的状态选择所说的胚胎进行移植。
9. 权利要求l所述的方法，其中所说的分析检验包括获得培养基的波谱。
10. 权利要求9所述的方法，该方法还包括通过下述的方式，校正所说的波谱确定若干胚胎培养基的记录波谱与使用所说的若干胚胎的妊娠成功记录之间的有效相互关系；其中所说的状态是通过用所说的相互关系在所说的波谱上进行运算而确定的。
11. 权利要求10所述的方法，其中所说的波谱是一种光谱。
12. 权利要求11所述的方法，其中所说的光谱包含所说培养基中与氧化压力有关的组分的信息。
13. 权利要求ll所述的方法，其中的胚胎是深低温冷藏的，该方法还包括定期地获得该深低温冷藏的培养基的光谱，并由该深低温冷藏的培养基的光谱确定所说胚胎的状态，以便在深低温冷藏期间对该深低温冷藏的胚胎进行监测。
14. 权利要求10所述的方法，其中一些所说的卵子受精并长成若干所说的胚胎，其中至少可以利用所说的状态选择所说的胚胎进行移植。
15. —种辅助生殖技术(ART)的方法，包括在卵子本身的卵泡液中提取多个卵子；分析检验每个所说卵子的卵泡液，以确定该卵子的状态；利用所说的状态选择卵子进行深低温冷藏或受精。
16. 权利要求15所述的方法，其中所说的分析检验包括获得卵泡液的波谱。
17. 权利要求16所述的方法，该方法还包括通过下述的方式，对所说的波谱进行校正确定一些卵子的卵泡液的记录光谱与使用所说的一些卵子的受精和/或妊娠成功记录之间的有效相互关系；其中所说的状态是通过用所说的相互关系在所说的波谱上进行运算而确定的。
18. 权利要求17所述的方法，其中所说的波谱是一种光谱。
19. 一种可产生生殖健康程序在患者中获得成功结果的或然率的数据，该方法包括使用所选择的分模形式，获得至少一种与液体培养基交换代谢产物的细胞的至少一种在该液体培养基中的代谢产物的波谱，该细胞选自卵子、精子、和胚胎；利用所获得的波谱，以及在患者群体中所建立的生殖健康程序的成功结果与用所选择的分析模式得到的液体培养基中的代谢产物的波谱之间的相互关系，产生针对所说的至少一种细胞的或然率数据。
20. 权利要求19所述的方法，其中所说的分析模式是多波长光吸收。权利要求19所述的方法，其中所说的分析模式是光的拉曼散射和光学荧光中的一种。权利要求20所述的方法，其中所说的光谱是短波长近红外光谱。权利要求21所述的方法，其中所说的光谱是近红外光谱。权利要求19所述的方法，其中所说的选择的分析模式是醒R。权利要求19-24之任意一项所述的方法，其中所说的至少一种细胞是卵子。
21.
22.
23.
24.
25.
26.权利要求19-24之任意一项所述的方法,
27. 权利要求19-24之任意一项所述的方法,
28. 权利要求19-24之任意一项所述的方法:
29. 权利要求19-24之任意一项所述的方法:症。
30.
31.
32.
33.
34.权利要求19-24之任意一项所述的方法，权利要求19-24之任意一项所述的方法，权利要求19-24之任意一项所述的方法，权利要求19-24之任意一项所述的方法，权利要求19-24之任意一项所述的方法，
35. 权利要求19-24之任意一项所述的方法，
36. 权利要求19-24之任意一项所述的方法，其中所说的至少一种细胞是胚胎。其中所说的生殖健康程序是体外受精。其中所说的生殖健康程序涉及先兆子痫。其中所说的生殖健康程序涉及IAI或羊膜内炎其中所说的生殖健康程序涉及早产/分娩。其中所说的生殖健康程序涉及反复流产。其中所说的生殖健康程序涉及胚胎植入。其中所说的生殖健康程序涉及性别确定。其中所说的生殖健康程序涉及环境污染/传染。其中所说的生殖健康程序涉及异位妊娠。其中所说的生殖健康程序涉及正常妊娠。
37.权利要求19-24之任意一项所述的方法，其中所说的生殖健康程序涉及子宫内膜异位症。
38. —种辅助生殖技术(ART)的方法，该方法包括提供含有一个或多个精子的精子浆液样品，分析检验该精子浆液，以确定该精子的状态;以及利用该状态对选择所说的精子进行深低温冷藏或受精。
39. 权利要求38所述的方法，其中所说的分析检验包括获得该浆液的波谱。
40. 权利要求39所述的方法，该方法还包括通过下述的方式，校正所说的波谱-确定一些精子的精液的记录光谱与使用所说的一些精子的受精和/或妊娠成功记录之间的有效相互关系；其中所说的状态是通过用所说的相互关系在所说的波谱上进行运算而确定的。
41. 权利要求40所述的方法，其中所说的波谱是一种光谱。
42. —种辅助生殖技术(ART)的方法，该方法包括分析检验患者子宫的内膜液，以确定该子宫对胚胎植入的发育能力；以及利用所说的发育能力确定植入的时机。
43. 权利要求42所述的方法，其中，如果该发育能力弱，则重复进行检验，在发育能力较强的时候确定为植入的时机。
44. 权利要求43所述的方法，其中，至少可对患者提供饮食、休息/运动、和医疗介入的其中之一种干预，以增强该发育能力。
45. 权利要求44所述的方法，其中所说的内膜液用光学法在原位测定，所说的分析检验包括波谱的获得。
46. 权利要求45所述的方法，该方法还包括通过下述的方式，校正所说的波谱确定一些患者体液的记录光谱与所说的一些患者的妊娠成功记录之间的有效相互关系；其中所说的状态是通过用所说的相互关系在所说的波谱上进行运算而确定的。
47. 权利要求l-46所述的方法，其中所说的培养基是冰冻的。
全文摘要
本发明涉及一种确定包括体外受精的生殖健康程序中的理想时机及其结果的方法。该方法包括，针对患者群体，建立所说程序的成功结果与用选择的分析模式所得的体液的光谱之间的相互关系；针对某个患者，用所说的分析模式获得该患者体液的光谱。
文档编号A61B17/435GK101600396SQ200680050781
公开日2009年12月9日 申请日期2006年8月31日 优先权日2006年1月9日
发明者戴维·休·伯恩 申请人:麦吉尔大学