专利名称：灰毡毛忍冬次皂苷乙的制备方法及其治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体为灰毡毛忍冬次皂苷乙的制备方法，及其在医药领域中的用途，尤其是在制备预防和治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌药物方面的应用。
背景技术：
肿瘤是一大类严重威胁人民生命和健康的多发病及常见病，全世界每年有700万人发生肿瘤，500万人被肿瘤夺去生命，现有肿瘤患者在1000万人以上。在我国肿瘤越来越成为严重的健康卫生问题，解放初期，肿瘤仅占人口死因的第九位或第十位，到70年代，已上升到第三位，目前估计，全国每年肿瘤发病人数约160万，全国每年死于肿瘤病的人数已达130万人，并且仍有上升趋势，其正在超过心血管疾病而成为人口死亡的第一原因。因此，世界各国都高度重视肿瘤的防治研究。当今，手术治疗、放射治疗、化学药物治疗仍然是最常用最重要的肿瘤治疗手段。但是化学药物治疗存在着很大的缺点，这主要是现有的抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性抑制不强、全身用药毒性较大、且大部分具有免疫抑制作用，这在一定程度上限制了它的使用。随着青蒿素、紫杉醇等一系列具有良好活性天然产物的发现和成功应用，世界各国越来越将目光转向在天然植物中寻找新的药物来源。通过多年的努力亦成功发现了一些抗癌活性成分，为进一步开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定了基础。但目前发现的天然抗癌活性成分，均因在植物体中为微量成分，故成药价格高，难以普及应用，如何开发高效价廉的抗肿瘤药物仍是一项极为紧迫而重要的全球性课题。
灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.为忍冬科Caprifoliaceae忍冬属植物，2005版中华人民共和国药典收载，列入山银花项下。忍冬属植物含有大量的皂苷，主要为常春藤型和齐墩果酸型皂苷。现代药理研究证明，常春藤型皂苷皂苷具有保肝、抗癌活性。从其中分离得到的灰毡毛忍冬次皂苷含量较大，药理作用明确，具有极好的开发利用前景。
发明内容
本发明者致力于从天然产物中寻找更安全更有效的天然肿瘤抑制剂，经过活性筛选，初步选定灰毡毛忍冬总皂苷活性提取物部位，申报了发明专利，后在此基础上，进一步筛选其中抗癌活性最高的化合物，发现灰毡毛忍冬次皂苷乙抗肿瘤活性最高，从而完成了本发明。本发明的目的是要提供具有抑制肿瘤功能的灰毡毛忍冬次皂苷的制备方法，为研制开发抗肿瘤新药提供新的天然活性物质来源。
本发明所采用的技术方案如下
本发明涉及一种灰毡毛忍冬次皂苷乙的制备方法及其治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌的应用a.总皂苷制备灰毡毛忍冬花及花蕾，用浓度为40％-90％的乙醇提取3次，合并提取液，用0.1-5％的药用活性碳脱色，过滤，回收乙醇后，将药液拌样或直接上大孔树脂柱(HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300)或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再用30％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至浓浸膏，得总皂苷；b.总皂苷降解总皂苷浓浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，在50-100℃下降解2-4小时，加1-10％盐酸或硫酸调节PH值到7，放冷后滤取不溶物，用60-95％乙醇或甲醇溶解后加0.1-5％的药用活性碳脱色，过滤，减压回收溶剂，放置，析晶，过滤，干燥，即得灰毡毛忍冬次皂苷乙。
c..以a和b制备方法所得到的灰毡毛忍冬次皂苷乙，可在制备预防与治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌药物中应用。
本发明所述的灰毡毛忍冬次皂苷乙，经药理学、药效学和大量的动物实验研究证明，具有抗肿瘤作用；在体外实验中，显著抑制肿瘤MDA-MB-231、Hela、HepG2、IA-9、MCF-7、U-87-MG、CAKI-1、PC-3、KB、KB-VIN、A-549、SK-OV-3、SK-MEL-2、HCT-15细胞增殖；在体内实验中，对小鼠肝H22实体瘤、小鼠乳腺癌MA737、U14荷瘤小鼠肿瘤、Lewis肺癌，能抑制肿瘤的生长，增长荷瘤小鼠免疫力及生存期。
本发明灰毡毛忍冬次皂苷乙可以制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、散剂、丸剂、口服液、糖浆剂、混悬剂、喷雾剂和注射剂等。在上述制剂中，有效剂量的本发明提取物可以单独或与药学尚可接受的载体赋形剂、崩解剂、润滑剂、着色剂等组成混合物。
灰毡毛忍冬次皂苷乙的结构见下式具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。实验用灰毡毛忍冬Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.的花及花蕾，2003年6月采集于湖南省隆回县。
实施例1取灰毡毛忍冬干燥花蕾1公斤，40％乙醇回流提取3次，合并提取液，用0.1％的药用活性碳脱色，过滤，回收乙醇后，将药液直接上于大孔树脂柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再依次用30％、60％、90％乙醇洗脱，减压回收乙醇，加入1％NaOH溶液，在100℃下降解2小时，加1％盐酸调节PH值到7，放冷后滤取不溶物，用60％乙醇溶解后加5％的药用活性碳脱色，过滤，减压回收溶剂，放置，析晶，过滤，干燥，即得灰毡毛忍冬次皂苷乙。
实施例2灰毡毛忍冬干燥花蕾1公斤，80％乙醇回流提取3次，合并提取液，用3％的药用活性碳脱色，过滤，回收乙醇后，将药液直接上于大孔树脂柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再依次用30％、60％、90％乙醇洗脱，减压回收乙醇，加入5％NaOH溶液，在80℃下降解3小时，加5％硫酸调节PH值到7，放冷后滤取不溶物，用80％甲醇溶解后加3％的药用活性碳脱色，过滤，减压回收溶剂，放置，析晶，过滤，干燥，即得灰毡毛忍冬次皂苷乙。
实施例3灰毡毛忍冬干燥花1公斤，90％乙醇回流提取3次，合并提取液，用5％的药用活性碳脱色，过滤，回收乙醇后，将药液直接上于聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再依次用30％、60％、90％乙醇洗脱，减压回收乙醇，加入10％NaOH溶液，在50℃下降解4小时，加10％盐酸调节PH值到7，放冷后滤取不溶物，用95％乙醇溶解后加0.1％的药用活性碳脱色，过滤，减压回收溶剂，放置，析晶，过滤，干燥，即得灰毡毛忍冬次皂苷乙。
实施例4灰毡毛忍冬次皂苷乙的体内外抗肿瘤活性评价实验1.体外抗肿瘤实验1.1目的研究灰毡毛忍冬次皂苷乙对肿瘤细胞抑制作用。
1.2材料四甲基唑氮蓝(MTT)；灰毡毛忍冬次皂苷乙。
1.3方法与结果试验方法为国际通用的MTT法将处于对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞按定量接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药量，细胞在37℃、5％CO2条件下继续培养48小时后，加入5mg/ml的MTT液20M1，再继续培养4小时，加入DMSO溶解后迅速用酶标仪在570nm处测定OD值，计算细胞生长抑制率，实验结果见表1。
生长抑制率(％)＝(1-加药孔平均A值/空白对照孔平均A值)×100％
表1.1体外细胞毒实验结果
表1.2体外细胞毒实验结果
用不同浓度的灰毡毛忍冬次皂苷乙处理各肿瘤细胞，可见癌细胞的生长均受到抑制，且呈浓度和时间依赖性。结果表明，灰毡毛忍冬次皂苷乙对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用。
2.体内抗肿瘤实验2.1灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠肝癌H22的抑制作用2.1.1目的研究灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠肝癌H22的抑制作用。
2.1.2材料昆明种雄性小鼠40只，体重(20±2g)；5-氟尿嘧啶，上海旭东海普药业产品；灰毡毛忍冬次皂苷乙临用前用生理盐水配成相应浓度。实验室温度20±3℃，相对湿度75％。
2.1.3方法与结果无菌条件下剥取传代10天的肝癌H22癌块，制成匀浆，用生理盐水1∶3稀释，计数调整细胞浓度为2×106L-1，每只0.2ml，接种于小鼠右腋部皮下，24小时后随机分为5组，即阴性对照组(生理盐水)、药物大剂量组、药物中剂量组、药物小剂量组及阳性对照组(5-氟尿嘧啶)，每组均灌胃相应浓度药物或生理盐水，每天一次，十天后称重处死，肿瘤块称重计算肿瘤生长抑制率，结果见表2。
肿瘤生长抑制率抑制率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
表2灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠抑瘤率的影响
灰毡毛忍冬次皂苷乙对H22荷瘤小鼠生存期的影响结果见表3。
表3灰毡毛忍冬次皂苷乙对H22荷瘤小鼠生存期的影响
结果表明样品组与阴性对照组比较小鼠生存期显著增长，有非常显著差异，p＜0.01。
2.2灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠乳腺癌MA737的抑制作用2.2.1目的研究灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠乳腺癌MA737的抑制作用。
2.2.2材料昆明种小鼠，体重(20±2g)，雌雄各半；灰毡毛忍冬次皂苷乙临用前用生理盐水配成相应浓度。实验室温度20±3℃，相对湿度75％。
2.2.3方法与结果按常规方法于无菌条件下每鼠右前肢腋部皮下注入生长7d的含1×107个细胞/ml的细胞悬液0.1ml，然后随机分为三组。肿瘤移植次日开始灌胃。按文献报导及预实验结果确定灌胃的量，阴性对照组灌胃生理盐水。第9日处死全部小鼠，分离瘤块，称量肿瘤块重量，计算肿瘤生长抑制率，见表2。
肿瘤生长抑制率抑制率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％2.3灰毡毛忍冬次皂苷乙对U14荷瘤小鼠的抑制作用2.3.1目的研究灰毡毛忍冬次皂苷乙对U14荷瘤小鼠的抑制作用。
2.3.2材料昆明种小鼠，体重(20±2g)，雌雄各半；灰毡毛忍冬次皂苷乙临用前用生理盐水配成相应浓度。实验室温度20±3℃，相对湿度75％。
2.3.3方法与结果按常规方法于无菌条件下每鼠右前肢腋部皮下注入生长7d的含3×106～4×106个细胞/ml的细胞悬液0.2ml，然后随机分为三组。肿瘤移植次日开始灌胃。按文献报导及预实验结果确定灌胃的量，阴性对照组灌胃生理盐水。第16日处死全部小鼠，分离瘤块，称量肿瘤块重量，计算肿瘤生长抑制率，见表2。
肿瘤生长抑制率抑制率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％2.4灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠Lewis肺癌的抑制作用2.4.1目的研究灰毡毛忍冬次皂苷乙对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。
2.4.2材料昆明种雄性小鼠32只，体重(20±2g)；灰毡毛忍冬次皂苷乙临用前用生理盐水配成相应浓度。实验室温度20±3℃，相对湿度75％。
2.4.3方法与结果无菌条件下剥取传代10天的Lewis肺癌癌块，制成匀浆，用生理盐水1∶3稀释，计数调整细胞浓度为1×107ml-1，每只0.2ml，接种于小鼠右腋部皮下，24小时后随机分为5组，即阴性对照组(生理盐水)、药物大剂量组、药物中剂量组及药物小剂量组，每组均灌胃相应浓度药物或生理盐水，每天一次，十天后称重处死。称量肿瘤块重量，计算肿瘤生长抑制率，见表2。
肿瘤生长抑制率抑制率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％结果表明灰毡毛忍冬次皂苷乙能显著抑制小鼠肝H22实体瘤、小鼠乳腺癌MA737、U14荷瘤小鼠肿瘤，具有抗癌活性。
实施例5胶囊剂的制备取灰毡毛忍冬次皂苷乙，加药用辅料淀粉适量，充分混匀后装入胶囊，制成每粒含灰毡毛忍冬次皂苷乙10mg的胶囊剂供口服使用。
实施例6注射剂的制备取灰毡毛忍冬次皂苷乙，加注射用纯净水及聚山梨酯80适量，制成每250ml含20mg的灰毡毛忍冬次皂苷乙的注射液供静脉点滴使用。
权利要求
1.一种灰毡毛忍冬次皂苷乙的制备方法及其治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌的应用，其特征在于a.总皂苷制备灰毡毛忍冬花及花蕾，用浓度为40％-90％的乙醇提取3次，合并提取液，用0.1-5％的药用活性炭脱色，过滤，回收乙醇后，将药液上大孔树脂柱或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再用30％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至浓浸膏，得总皂苷；b.总皂苷降解总皂苷浓浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，在50-100℃下降解2-4小时，加1-10％盐酸或硫酸调节PH值到7，放冷后滤取不溶物，用60-95％乙醇或甲醇溶解后加0.1-5％的药用活性炭脱色，过滤，减压回收溶剂，放置，结晶，过滤，干燥，即得灰毡毛忍冬次皂苷乙。c..以a和b制备方法所得到的灰毡毛忍冬次皂苷乙，可在制备预防与治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌药物中应用。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是将提取脱色后的药液，拌样或直接上大孔树脂柱，型号包括HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300或聚酰胺柱吸附洗脱。
3.根据权利要求1所述的灰毡毛忍冬次皂苷乙，其特征在于对肿瘤细胞株MDA-MB-231、Hela、HepG2、IA-9、MCF-7、U-87-MG、CAKI-1、PC-3、KB、KB-VIN的细胞毒活性。
4.根据权利要求1所述的灰毡毛忍冬次皂苷乙，其特征在于对小鼠肝H22实体瘤、小鼠乳腺癌MA737、U14荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用。
5.权利要求1所述的灰毡毛忍冬次皂苷乙，其药物有效量与药学上可接受的载体组成的药物组合物及其制剂。
6.根据权力要求5所述的制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、散剂、丸剂、口服液、糖浆剂、混悬剂、喷雾剂和注射剂。
全文摘要
本发明涉及灰毡毛忍冬次皂苷乙的制备方法及其治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌的应用的用途。制备方法包括灰毡毛忍冬花及花蕾用乙醇提取，活性炭脱色，大孔树脂柱或聚酰胺柱分段，乙醇洗脱，碱水解，活性炭二次脱色，放置，结晶，得到灰毡毛忍冬次皂苷乙。本发明的提取工艺及方法获得的有效成分得率及纯度高，可达98％以上，特别适合大量制备灰毡毛忍冬次皂苷乙，可满足制药工业的要求。本发明获得的灰毡毛忍冬次皂苷乙的有效剂量对体外培养癌细胞株有细胞毒活性，对小鼠肝癌H
文档编号A61K36/355GK101085804SQ20071002324
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月18日 优先权日2007年6月18日
发明者冯煦, 赵兴增, 王鸣, 贾晓东, 董云发, 陈雨 申请人:江苏省中国科学院植物研究所