专利名称：一种预防和治疗cea阳性肿瘤的效应细胞及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤是人类健康的最大杀手。肿瘤的手术治疗，虽能有效去除肉眼可见的肿瘤，但对术后的复发和转移尚无有效的治疗方法。放疗和化疗除具有严重的毒副作用外，由于许多肿瘤细胞对其不敏感，其疗效也不理想。肿瘤的免疫生物治疗是肿瘤防治的新模式，主要是通过特定的技术方法增强肿瘤抗原的免疫性，诱导机体产生抗肿瘤特异性的杀伤细胞和体液免疫反应，以杀伤肿瘤细胞。
癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原。在人体上皮细胞恶性肿瘤、90％的胃肠道肿瘤、胰腺癌、80％以上的非小细胞肺癌和50％左右的乳腺癌中，都有CEA的高表达，即上述肿瘤呈CEA阳性。但由于CEA的抗原性很弱，不能有效地激活机体的特异性免疫反应，使得肿瘤细胞能够逃避免疫杀伤，导致这类肿瘤患者的死亡率较高。
为解决CEA抗原性很弱导致肿瘤细胞能够逃避免疫杀伤的问题，现有技术中将CEA基因与痘苗病毒基因重组，得到CEA重组基因痘苗(CEA-recombinant Vaccinia Virus，CEA-rV)，它既有CEA抗原的高表达，又可刺激机体产生CEA抗体，对实验性CEA阳性肿瘤有一定的预防和治疗作用，但临床应用显示，单纯地注射CEA-rV，其疗效还不够理想。
树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞，它能显著刺激初始T细胞的繁殖，在肿瘤的生物治疗中起着重要作用。现有技术中有将CEA-rV负载用脐带血制备的DC细胞，再用CEA-rV+DC去诱导从脐带血制备的CD3AK细胞，制备出CEA-rV+DC+CD3AK效应细胞，即荷有CEA-rV的DC诱导的CD3AK细胞。实验室的基础理论研究表明它对CEA阳性肿瘤有明显的杀伤效果，但尚未用于临床应用。而且，由于DC细胞以及CD3AK细胞都是由脐带血制备，而脐带血是异体来源，临床应用必须检测各种传染病，如艾滋病、梅毒、肝炎等。另外，异体细胞临床用于病人，还要HLA配型，否则可能会产生移植物抗宿主排异反应，故其临床推广应用尚不成熟，还有很大的局限性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞。
本发明的另一目的在于提供所述效应细胞的制备方法。
本发明的又一目的在于提供所述预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞在制备预防和治疗CEA阳性肿瘤药物中的应用。
本发明提供的一种预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞是荷有CEA-rV的DC所诱导的CIK细胞(CEA-rV+DC+CIK细胞)。优选地，所述CIK细胞是在LAK细胞的基础上，用IL-2、CD3单克隆抗体、IL-1和IFN-γ四种细胞因子诱导培养而制备的。在本发明的一个实施例中，所述DC和CIK细胞是从外周血制备而来的。
本发明还提供一种制备本发明的效应细胞的方法，包括如下步骤(1)提供CEA-rV；(2)DC的制备无菌条件下采集外周静脉血，常规分离出单个核细胞，预培养后，收集悬浮细胞备用；重悬贴壁细胞，常规培养，制得DC；(3)CIK细胞的制备将步骤(2)中所收集的悬浮细胞常规培养，制得CIK细胞；(4)荷有CEA-rV的DC诱导的CIK细胞制备在DC中加入CEA-rV，常规培养制备荷有CEA-rV的DC(CEA-rV+DC)；荷有CEA-rV的DC和CIK细胞混合培养制得CEA-rV+DC+CIK细胞。
上述预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞的制备方法，荷有CEA-rV的DC和CIK细胞是按1∶10的比例混合培养制得CEA-rV+DC+CIK细胞的。
本发明还提供荷有CEA-rV的DC诱导的CIK细胞在制备治疗和预防CEA阳性肿瘤药物中的应用。
CIK细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine Induced Killer Cells)的简称。LAK细胞是淋巴因子激活的杀伤细胞(Limphokine Activated Killer Cells)的简称。
与现有技术相比，本发明制备出了对CEA阳性肿瘤细胞的特异杀伤活性明显提高的效应细胞，为临床CEA阳性肿瘤的特异免疫治疗提供了一个更新的技术方法，克服了单用CEA-rV临床疗效不理想的弊端。
用CEA-rV作为特异抗原解决了抗原难得的问题。本发明用CEA-rV做为特异抗原负荷DC解决了大部分CEA阳性肿瘤病人无法得到自体肿瘤抗原的困难，使该类患者增加了一个预防和治疗方法，增加了一个战胜肿瘤的希望。又因CEA-rV可在实验室大量制备，使用安全，故有推广应用的优越条件。
采用患者自身外周血细胞制备DC和CIK，克服了脐血的传染病和“移植物抗宿主”反应的隐患，确保了临床使用的安全性，又提高了治疗CEA阳性肿瘤的有效性，更有利于该项目的临床推广应用。
本发明用CIK细胞制备CEA-rV+DC+CIK效应细胞与用CD3AK细胞制备CEA-rV+DC+CD3AK相比有明显的优点CIK细胞是T细胞在IL-2、IL-1、IFN-Y和CD3单克隆抗体4种因子诱导下产生的效应细胞，具有明显的CD3+CD56+双阳性标记。CD3AK细胞是T细胞在IL-2和CD3单克隆抗体两种因子诱导而产生，没有明显的CD3+CD56+双阳性标志。
CIK细胞比CD3AK和LAK细胞增殖速度更快，大约快100倍。
CIK细胞比CD3AK和LAK细胞的杀伤作用更强，大约强10倍。
CIK细胞的杀瘤谱比CD3AK和LAK细胞的更广，而且对多药耐药的肿瘤杀伤作用更强.
CIK细胞和CD3AK和LAK细胞相比，受免疫抑制影响较小。
也就是说，我们利用CIK细胞制备的CEA-rV+DC+CIK效应细胞和用CD3AK细胞制备的CEA-rV+DC+CD3AK效应细胞相比，在本质上有明显差别；在功能上有更明显的优点。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一、CEA-rV+DC+CIK细胞制备。
1、逆转录病毒质粒PLXSN-CEA的构建及CEA-rV及W-VV(野生型痘苗病毒)的制备逆转录病毒质粒PLXSN-CEA的构建，参照文献[生物化学杂志，1997，第八次全国生物化学与分子生物学学术会议专刊257-259]进行，CEA-rV及W-VV的大量制备及滴度测定参照文献[中国生物化学与分子生物学，1999，15(1)54-58]进行。
2、自体外周血DC的制备和鉴定无菌条件下采集外周静脉血50-100ml。常规分离出单个核细胞(PBMC)，用RPMI-1640培养基调节细胞浓度为1×106/ml，加入24孔板，每孔2ml，37℃，5％CO2条件下培养3h，收集悬浮细胞制备CIK细胞。重悬贴壁细胞制备DC用含GM-CSF(50ng/ml)，IL-4(10ng/ml)，TNF-α(50ng/ml)的RPMI-1640完全培养基，调节细胞浓度为2×105/ml，每孔1ml接种于24孔板，常规培养3d，以后隔天半量换液。在光镜下连续观察DC发育过程中的形态变化，透射电镜观察DC细胞形态，流式细胞仪检测DC细胞表型。
3.自体外周血CIK细胞的制备用含IL-2(1000u/ml)，CD3Ab(5ug/ml)，IL-1(100u/ml)，IFN-γ(1000u/ml)和人AB血清(5％)的RPMI-1640完全培养基或含有IL-2(1000u/ml)，CD3Ab(5ug/ml)，IL-1(100u/ml)，IFN-γ(1000u/ml)的RPMI-1640无血清培养基调上法收集的悬浮PBMC浓度到5×106/ml。常规培养制备CIK细胞；用流式细胞仪分别测定PBMC和CIK细胞的CD3，CD4等分子表型。
4.CEA-rV+DC+CIK细胞制备在上法制备的DC培养3d时，加入CEA-rV 104PFU/ml，常规培养制备CEA-rV+DC。在上法制备的CIK细胞培养8d时，把CEA-rV+DC和CIK细胞按1∶10的比例混合培养得CEA-rV+DC+CIK细胞。
实施例二、CEA-rV+DC+CIK细胞的应用方法当CEA-rV+DC+CIK细胞数目扩增到1×109-1010时，开始收集细胞，静脉回输病人。CEA-rV+DC+CIK细胞悬液的使用方法和正常输血相同，回输速度为50-60滴/分钟。回输过程中每5-10分钟轻轻振摇细胞悬液一次。回输后继续输入50mL的生理盐水冲洗回输管。每逢3-5天一次，6次一疗程。
实施例三、CEA-rV+DC+CD3AK和CEA-rV+DC+CIK对肿瘤细胞的特异杀伤作用比较1.实验材料靶细胞分4组红白血病细胞株K562，由广州医学院临床肿瘤研究中心提供，为CEA阴性细胞株；肝癌细胞株细胞株BeL-7402，由广州医学院临床肿瘤研究中心提供，为CEA阴性细胞株；结肠癌细胞株LOVO，由中山大学提供，为CEA阳性细胞株；肺癌细胞株A549，由中山大学提供，为CEA阳性细胞株。
效应细胞分3组CIK细胞组、CEA-rV+DC+CD3AK细胞组和CEA-rV+DC+CIK细胞组，自制，浓度都为10×109PFU/ml。
2.实验方法用MTT法测定各组效应细胞对4种靶细胞的杀伤活性。
用SPP11.0统计学软件处理数据。各效应细胞的杀伤率用单因素方差分析法。
3.实验数据处理实验数据如表1所示，各组数据均为10次实验平均值。
表1各种效应细胞对靶细胞的杀伤率(X±S) 4.结果与讨论从表中可以看出3种效应细胞CIK、CEA-rV+DC+CD3AK和CEA-rV+DC+CIK对4种靶细胞均有明显杀伤力。CEA-rV+DC+CD3AK和CIK组比较，虽然CEA-rV+DC+CD3AK对各靶细胞的杀伤率较CIK组有所提高，但无统计学意义(P＞0.05)，说明CEA-rV和DC无明显提高CD3AK杀伤活性的作用。
CEA-rV+DC+CIK和CEA-rV+DC+CD3AK相比，对CEA阴性肿瘤细胞K562和BEL-7402的杀伤作用没有明显变化(P＞0.05)，但是对CEA阳性肿瘤细胞LOVO和A549的特异杀伤作用确有明显提高(P＜0.01)。说明CEA-rV+DC+CIK对CEA阳性肿瘤细胞的特异杀伤作用比CEA-rV+DC+-CD3AK更为明显，效果更优越。
权利要求
1.一种预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞，其特征在于，所述效应细胞是荷有CEA-rV的DC诱导的CIK细胞。
2.如权利要求1所述的效应细胞，其特征在于所述CIK细胞是在LAK细胞的基础上，用IL-2、CD3单克隆抗体、IL-1和IFN-Y四种细胞因子诱导培养制备而成的。
3.如权利要求1所述的效应细胞，其特征在于所述DC和CIK细胞是从外周血中提取制备而来的。
4.一种制备如权利要求1所述的预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞方法，包括如下步骤(1)提供CEA-rV；(2)DC的制备无菌条件下采集外周静脉血，常规分离出单个核细胞，预培养后，收集悬浮细胞备用；重悬贴壁细胞，常规培养，制得DC；(3)CIK细胞的制备将步骤(2)中所收集的悬浮细胞常规培养，制得CIK细胞；(4)荷有CEA-rV的DC诱导的CIK细胞制备在DC中加入CEA-rV，常规培养制备荷CEA-rV的DC；荷有CEA-rV的DC和CIK细胞混合培养制得荷有CEA-rV的DC诱导的CIK细胞。
5.如权利要求4所述的预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞的制备方法，荷有CEA-rV的DC和CIK细胞是按1∶10的比例混合培养制得荷有CEA-rV的DC诱导的CIK细胞的。
6.如权利要求1或权利要求4所述的预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞在制备预防和治疗CEA阳性肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种预防和治疗CEA阳性肿瘤的效应细胞以及该效应细胞的制备方法和应用。该效应细胞是荷有CEA－rV的DC来诱导共培养CIK细胞制备而成的。本发明用CEA－rV做为特异抗原负荷DC解决了大部分CEA阳性肿瘤病人无法得到自体肿瘤抗原的困难，又因CEA－rV可在实验室大量制备，使用安全，故有推广应用的优越条件；采用患者自身外周血细胞制备DC和CIK，克服了脐血的传染病和“移植物抗宿主”反应的隐患，确保了临床使用的安全性，又提高了治疗CEA阳性肿瘤的有效性；本发明的CIK细胞增殖速度更快，杀伤作用更强，受免疫抑制影响较小，所以本发明的效应细胞效果更好。
文档编号A61K35/12GK101037670SQ20071002686
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者祁岩超, 罗超权 申请人:祁岩超