一种治疗股骨头缺血性坏死的生物分装剂的制作方法

专利名称：：一种治疗股骨头缺血性坏死的生物分装剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于治疗的配制品，具体涉及治疗早期股骨头缺血性坏死的医用配制品。
背景技术：
：骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)是一种由骨髓中分离获得的具有多种分化潜能的间质干细胞，取材方便、对机体损伤小，分离和扩增容易，同时还能分泌大量的促细胞和血管生长因子；另外，BMSCs成分中含有骨祖细胞，具有良好的向成骨细胞分化的潜能，在体外经地塞米松、p-甘油磷酸钠、维生素C、骨形态发生蛋白等的诱导，可以向成骨细胞分化；在体内主要的分化环境为骨髓及松质骨骨小梁，在局部"成骨微环境"下，能够进行增殖，并经骨原细胞、前成骨细胞最终分化为成骨细胞，被认为是骨组织工程近阶段最有希望应用于临床的种子细胞。目前，用自体BMSCs治疗早期(Ficatl、II期)股骨头缺血性坏死(ANFH)已显示出诱人的应用前景。2006年，王五洲等采用髓芯减压加自体BMSCs移植治疗了19例I-III期ANFH患者，术后随访12个月，MRI复査显示，平均股骨头坏死体积由31.89%縮小至13.18%,其中I-II期改善更为明显，患者髋关节疼痛在3周即有缓解，肢体功能在6个月开始恢复，髋关节Harris评分由58.74升至75.54，达到良好标准，证实了自体BMSCs治疗ANFH的有效性和安全性(文献王五洲，刑更彦，张可超，麻立刚，白晓东，李冰.髓芯减压并自体干细胞移植治疗早期股骨头坏死的疗效观察，中国医师杂志，2006，8(4):436-438)。但是，移植区低灌注、细胞成活率低是削弱其治疗效果的重要因素；而且ANFH的根本原因是血供障碍，并且病程的发展会造成进一步的血供障碍，引发ANFH的加重，是—个恶性循环的发病过程，只有诱导新血管生成并建立新的侧枝循环，才是打破治股骨头坏死病理恶性循环最有效的手段，单纯BMSCs移植难以实现这一目标。而且ANFH骨内压高，如果直接将转HGF基因的BMSCs经髓芯减压隧道植入坏死区，细胞会随骨内压的释放而流失。《骨髓间质干细胞与纤维蛋白胶生物相容性的实验研究》一文公开了BMSCs和纤维蛋白胶复合的方法(彭松林，方煌，陈安民.骨髓间质干细胞与纤维蛋白胶生物相容性的实验研究.生物骨科材料与临床研究，2004.11(3):34-37)，该方法是利用纤维蛋白胶在凝血酶的作用下形成网状凝胶将BMSCs包裹在内，在患者体内形成一种缓释体系控制BMSCs的释放，防止细i随骨内压的释放而流失。
发明内容本发明要解决的技术问题是进一步提髙用BMSCs移植治疗早期ANFH的生物治疗效率。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂，该生物分装剂由以下试剂组成-试剂I:纤维蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纤维蛋白原的含量为60100mg/mL，抑肽酶的含量为10003000KIU/mL，最佳是纤维蛋白原80mg/mL、抑肽酶2000KIU/mL;试剂II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250~500IU/mL，CaCl2的含量是40mmol/mL，最佳是凝血酶400IU/mL;试剂m:转基因骨髓基质干细胞，其中所含的外源基因是编码人肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)的基因。本发明试剂I是将纤维蛋白原和抑肽酶按配比与水混合得到:试剂II是将凝血酶和CaCl2按配比与水混合得到。试剂m中所述的骨髓基质干细胞为同种异体骨髓基质干细胞或自体骨髓基质干细胞。所述的人肝细胞生长因子基因的结构记载于《MolecularcloningandsequenceanalysisofcDNAforhumanhepatocytegrowthfactor》(MiyazawaJfC.，Tsubouchi，H"NakaJ).，Takahashi,K.,Okigaki，M"Arakaki，N.，Nakayama^H"Hirono，S.，Sakiyama^O"Gohda3"DaikuharajY.andKitamur^N.Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，163(2):967-973)。本发明试剂ffl中所述的骨髓基质干细胞的制备方法由以下步骤组成(1)利用AdMax系统，制备重组腺病毒Ad-HGF:将人HGF基因插入到穿梭质粒载体pDC316构建穿梭质粒pDC316/HGF，将pDC316/HGF与包装质粒pBHGloxAEl，3Cre共转染293细胞，得重组腺病毒Ad-HGF;(2)扩增重组腺病毒Ad-HGF，采用HPLC色谱层析纯化；(3)髂骨穿刺抽取同种异体或自体骨髓，分离、纯化BMSCs，体外培养至第二代，按腺病毒感染复数量(MOI)=300取厶<1-110转染第二代8]^8€5，即可。上述方法中所述的穿梭质粒pDC316/HGF可用酶切方法鉴定将pDC316/HGF经SacI+&/1双酶切后将得到大小分别为2，200bp和3,913bp的片段。所述的重组腺病毒Ad-HGF可用PCR方法鉴定引物为上游引物5'-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3'(SEQNO.l)，下游引物5'-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3'(SEQNO.2);反应体系为取50fil毒种上清液，加入2ia1蛋白酶K，56"C温育，煮沸10min，冰浴冷却，取lnl作为模板，10pM上游引物1^1、10fiM下游引物lpl、10mMdNTPlnl、2.5U/filTaq酶1^1、10XPCRBuffer5pl、ddH2O40nl，反应体系为50nl;反应程序为95'C预变性5min，然后95°C30s，58'C30s，72°C2min，共30个循环，最后72'C延伸10min，扩增产物为一长2，200bp的DNA片断。上述的转基因骨髓基质干细胞可通过RT-PCR、原位杂交方法检测HGFmRNA的表达、免疫组化方法检测HGF蛋白的表达、ELISA方法检测HGF蛋白的分泌。本发明生物分装剂用于治疗早期ANFH的方法是先根据不同患者对试剂在人体内形成的凝胶的降解速度的实际需要，选择试剂I与试剂II的按1:19;l比例，然后将试剂I加入试剂ni中混合均匀，使得试剂n在体内混合后细胞终浓度为1(^个/mi，将试剂i和m混合液与试剂n在ct引导下行髓芯减压术时，用双联注射器经减压隧道注入股骨头坏死区。本发明试剂m中的转基因骨髓基质干细胞在移植到体内后分泌HGF，HGF能诱导新血管生成，改善股骨头血供；HGF对BMSCs有趋化作用，局部高分泌的HGF可使BMSCs"停留"在坏死区局部，利于其向成骨细胞分化；HGF能抑制BMSCs凋亡、其诱生的血管可改善移植细胞的生存环境，提高BMSCs移植存活率，进而提高治疗效果。本发明试剂I和II注入体内，试剂i中的纤维蛋白原在试剂n中的凝血酶作用下快速形成立体网状结构凝胶，所形成的凝胶结构犹如一个海绵状的药物储存库，防止移植的转基因骨髓基质干细胞流失，且转基因骨髓基质干细胞分泌的HGF从中持续缓慢地释放，从而维持其局部有效的作用浓度，其治疗ANFH的效果比在手术中单纯使用转HGF基因骨髓基质干细胞显著提高。此胶一般在体内2周完全降解，通过调整试剂I中的纤维蛋白原浓度或抑肽酶的量，可以改变凝胶降解的速度和时间。图1是穿梭质粒pDC316/HGF的酶切鉴定电泳图，其中1为pDC316/HGF经&cl单酶切结果，2为pDC316/HGF经&cI+SWI双酶切结果，3为pDC316经双酶切结果，4为DL15000marker。图2是Ad-HGF的PCR鉴定，其中1以正常293细胞上清为模板，2以产毒293细胞上清为模板，3以PDC316/HGF质粒为模板，4为DL2000marker。图3是本发明试剂m的转基因兔BMSCs中HGFmRNA表达的RT-PCR分析，其中1为DL15000marker,2为未转染的BMSCs阴性对照，3为本发明试剂m的转基因骨髓基质干细胞。图4是转基因兔BMSCs中HGF表达的原位杂交分析，其中图4-A为未转染的BMSCs阴性对照，图4-B为本发明试剂m的转基因BMSCs组。图5是转基因兔BMSCs中HGF表达的免疫组化分析，其中图5-A为未转染的BMSCs阴性对照，图5-B为本发明试剂m的转基因BMSCs组。图6是转基因兔BMSCs中的HGF表达的ELISA分析图7是对兔早期激素性ANFH治疗的DR检査图，其中图7-A为正常组，图7-B为造模组，图7-C为转HGF基因骨髓基质干细胞治疗组，图7-D为本发明生物分装剂治疗组。图8是对兔早期激素性ANFH治疗的MRI检査图，其中图8-A为正常组，图8-B为造模组，图8-C为转HGF基因骨髓基质干细胞治疗组，图8-D为本发明生物分装剂治疗组。图9是对兔早期激素性ANFH治疗的常规CT检査图，其中图9-A为正常组，图9-B为造模组，图9-C为转HGF基因骨髓基质干细胞治疗组，图9-D为本发明生物分装剂治疗组。图10对兔早期激素性ANFH治疗的CT灌注检査(血容量BV图)，其中图IO-A为正常组，图10-B为造模组，图10-C为转HGF基因骨髓基质干细胞+髓芯减压治疗组，图10-D为单纯髓芯减压治疗组，图10-E为本发明生物分装剂治疗组。图11是对兔早期激素性ANFH治疗的墨汁灌注造影(X10),其中图ll-A为正常组，图ll-B为模型组，图ll-C为单纯髓芯减压治疗组，图11-D为转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组，图11-E为本发明生物分装剂治疗组。图12是对兔早期激素性ANFH治疗的病理组织学HE染色图(X200)，其中图12-A为正常组，图12-B为模型组，图12-C为单纯髓芯减压治疗组，图12-D为转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组，图12-E为本发明生物分装剂治疗组。图13是对兔早期激素性ANFH治疗的病理组织学观察(VEGF免疫组化观察，X400)，其中图13-A为正常组，图13-B为模型组，图13-C为单纯髓芯减压治疗组，图13-D为转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组，图13-E为本发明生物分装剂治疗组。具体实施例方式下面将以新西兰大白兔为例通过实施例和实验证明本发明具有的优点。制备例1:本实施例的生物分装剂的组成如下(1)试剂I:纤维蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纤维蛋白原的含量为80mg/mL，抑肽酶的含量为2000KIU/mL;(2)试剂II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是400IU/mL，CaCl2的含量是40mmol/mL;(3)试剂m:转基因骨髓基质干细胞，其中所含的外源基因是编码人肝细胞生长因子的基因。其中，试剂I是将纤维蛋白原和抑肽酶按配比与水混合得到；试剂II是将凝血酶和CaCl2按配比与水混合得到；试剂ni的制备方法是1、利用AdMax系统，制备重组腺病毒Ad-HGF(1)构建穿梭质粒pDC316/HGF，具体方法是①目的塞因的扩增上游引物5'-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3',引入S"cI位点；下游引物5'-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3'，引入S"/I位点。提取共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞的总RNA，以OligdT为引物进行逆转录，然后加入上、下游引物进行PCR扩增95。C预变性5min，然后95°C30s，30s，2min,共30个循环，最后72"C延伸10min②穿梭质粒的构建将PCR产物插入pGEM-T载体，转化感受态菌DH5a。提取质粒，DNA测序正确后，以SflcI及SG/I双酶切，回收2,200bp片段，插入穿梭载体pDC316的相同位点，以连接产物转化DH5a感受态菌，提取质粒pDC316/HGF，酶切鉴定如图1所示。(2)pDC316/HGF与包装质粒pBHGloxAEl，3Cre共转染293细胞，具体方法是①转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5X105个细胞，培养基为DMEM+10%Hyclone胎牛血清，置37'C含5%C02的培养箱中培养过夜。②转染当天换液，用新鲜的含10。/c胎牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90%时，取骨架质粒包装质粒pBHGloxAEl,3Cre和穿梭质粒pDC316/HGF，用Lipofectamine2000脂质体进行转染。具体步骤为1)每个转染孔取骨架质粒pBHGloxAEl，3Cre4吗，穿梭质粒pDC316/HGFl吗，混和均匀。2)质粒用300W的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。3)取lOjil的脂质体用300fil的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。4)将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到细胞中。③转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cn^细胞培养瓶中，密切观察有无出毒迹象。④结果在第八天时，发现细胞有出毒迹象，细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。第11天时，细胞大部分病变并从底部脱落。⑤收毒。将出毒的细胞培养瓶先后置于液氮和37"C水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液离心，3000rpm,收集含病毒的上清液，弃掉细胞碎片沉淀。该病毒上清即为第一代毒种(Pl)，命名为Ad-HGF，作为随后大量病毒扩增的毒种。⑥毒种鉴定在25cn^细胞瓶中培养293细胞，待细胞生长至90%满时，取上述第一代毒种500)li1接种于细胞上，待细胞完全病变时按前述方法冻融细胞三次，离心收集病毒上清液，此即为第二代毒种(P2)。取50^1P2毒种上清液，加入2^il蛋白酶K(10mg/ml)，55。C消化lh，煮沸10min，立即放入冰浴5min，取1^1作为模板，用HGF上、下游引物进行PCR鉴定，扩增条件同上。若能够特异地扩增出2，200bp条带，证明该重组腺病毒携带目的片段。2、扩增病毒，采用HPLC色谱层析纯化，具体方法是(1)在1个750112方瓶中接种4乂106293细胞，培养过夜，待细胞生长至90%满时，取2mlP2代毒种接种培养瓶内，24h，显微镜下观察发现有60%细胞病变，44h后细胞完全病变。(2)收获病变细胞混悬液后，冻融三次，离心，取上清，按同样方法接种于另外4个75ci^方瓶中，44h完全出毒，收获病毒，用于接种转瓶。(3)在每个转瓶中接种1.8X1()S个293细胞，共接种4个转瓶，等细胞生长至90%融合时，按10ml/转瓶(MOI约为1)接种第2步收获的病毒上清，染毒后70h收获病变细胞混悬液。(4)混悬液3000rpm离心，弃上清，细胞沉淀用Tris缓冲液重悬，反复冻融三次，6000rpm离心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45nm的滤膜过滤，然后利用Waters600EHPLC进行纯化，具体步骤如下①先用含25%甘油的50mmol/LTris(pH7.5)缓冲液将样品稀释至5xl()Uvp/ml;②使用20(HU定量环(即上样1.0xl0"vp)。使用lmlResourceQ柱(6.4x30mm),置于30'C下使用；③洗脱梯度从50mmol/LTris(pH7.5)到50mmoi;LTris，lmol/LNaCl(pH7.5),洗脱时间30min,流速lml/min;使用260nm和280nm两个紫外波长进行检测，依据腺病毒特征吸收U60/280=1.25±0.08，收集腺病毒峰；将纯化后的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用0.22拜一次性滤器过滤除菌，分装保存于-70'C冰箱。(5)纯化后Ad-HGF质量检定测病毒OD260值，按公式v.p,/mlOD260X1.1X稀释倍数X1012，计算得到每ml制品中的病毒颗粒数，即物理滴度；用TCID50检测病毒的感染性滴度。结果显示纯化的Ad-HGF物理滴度1.0xlOl2v.p./ml，感染性滴度2.6xl01QTCID50/ml，HPLC鉴定纯度98X，PCR鉴定目的基因如图2所示。3、兔BMSCs的分离和培养取4-8周龄健康新西兰大白兔，麻醉后，以髂后上棘为穿刺点，用16号髂骨穿刺针抽吸骨髓3ml，混入含肝素钠的DMEM培养基中反复抽吸吹打，800g离心5min，弃上清，用5ml含10。/。FCS、100u青霉素、100ug链霉素的完全DMEM培养液重悬细胞，接种入25cn^培养瓶中，置37'C、5。/。C02孵箱中培养，4d时换液去除未贴壁细胞，其后每3d换液l次，待细胞汇合成单层，用0.125W胰蛋白酶/0.0P/。EDTA消化，传代细胞以1-2><105/孔密度接种于6孔板，培养至第二代备用。按MOI-300，将Ad-HGF转染第二代兔BMSCs，具体的过程为(1)待传代细胞贴壁生长至60-70%融合时，吸去培养基，用PBS洗1次。(2)加无血清DMEM培养液，置37°C、5%C02孵箱孵育20min。(3)按感染复数(MOIp300加入病毒液，置37'C、5%0)2孵箱孵育45min后，补加完全DMEM培养液使体系中血清浓度为5%。(4)置37。C、5。/。C02孵箱孵育4h后换为完全DMEM培养液，48h后检测指标。4.RT-PCR检测转染后BMSCs的HGFmRNA表达(1)从培养的BMSCs中提取样本总RNA①在25cr^细胞培养瓶(约lxl(^个细胞)中加入400^1TRKLysisBuffer裂解细胞；②倒置显微镜观察，细胞完全裂解后，吸出细胞裂解液，转入套在2ml收集管上的HomogenizationSpin柱子中，室温14，000g离心lmin;③将收集的滤过液转移至一新的2ml收集管中，加入4(KHd70y。乙醇，涡旋混匀；将HiBindRNASpin柱子套在2ml收集管中，并将上述溶液(包括沉淀)转移至柱子上，室温10,000g离心lmin，弃滤过液；⑤将柱子套回收集管，加入300nlWashBufferI至柱子上，按上述条件离心，弃滤过液；⑥将柱子套回收集管，加DNase酶消化处理；⑦加入500|JRNAWashBufferI至柱子上，放置5min，室温lO,OOOg离心lmin，弃滤过液；⑧将柱子套回收集管，加入500fi1RNAWashBufferII(已用无水乙醇稀释)，室温lO，OOOg离心lmin，弃滤过液。重复该步骤1次；⑨将柱子套回收集管，室温10,000g离心lmin;⑩将柱子转移至新的1.5ml的Eppendorf管中，加入30jUDEPC水至柱子的膜中央，放置lmin，室温10，000g离心lmin;(2)测定总RNA的纯度和浓度测260mn和280nm值，计算纯度(260nm/280nm)和浓度(RNAng/ml=A260x40x稀释倍数)。(3)One-StepRT-PCR扩增HGF基因①cDNA反应总体系为50^1,取约l吗总RNA为模板，分别加入2xReactionMix25ji1，IOiliM上下游引物各ljil，RT/PlatinumT叫HiFiMix2nl，补充DEPC水至50fil，轻轻混匀。②cDNA合成反应条件为55°C30min，94°C2min，1个循环；③PCR扩增反应条件为94"C15s，60。C30s，68。C1.5min，35个循环；72。C延伸10min。取PCR产物5nl经l。/。琼脂糖凝胶电泳，20min，溴化乙锭染色后采用凝胶成像系统照相，剩余产物-2(TC保存备用。检测结果RT-PCR扩增出2，200bp条带，表明转染后BMSCs有HGFmRNA表达，结果如图3所示。5.原位杂交检测转染后BMSCs的HGFmRNA表达(1)消化BMSCs，以1.5xl0"孔的浓度接种于6孔板中，在37'C，5%C02，饱和湿度培养箱中培养24h。(2)按照前述方法，将Ad-HGF病毒以MOI=300转染细胞。(3)48h后胰酶消化细胞，计数。以0.51.0xl()S/200nl的浓度滴加于经紫外照射消毒的硅化玻片上，置于湿盒中，在37。C、5^C02饱和湿度培养箱中培养过夜。(4)取出玻片，0.1MPBS(pH7.4)洗涤2minx3次后，置于4。C丙酮中固定30min。蒸馏水充分洗涤，干燥后置于-2(TC冰箱备用，或直接进行检测。(5)30%H2021份+纯甲醇50份混合，室温处理30min。蒸馏水洗涤3次。(6)暴露mRNA片段玻片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(lml3。/。柠檬酸加2滴浓縮型胃蛋白酶，混匀)，室温消化10s。0.1MPBS洗涤5minx3次。蒸馏水洗涤1次。(7)预杂交湿盒的准备---干的杂交盒底部加20o/。甘油20ml以保持湿度。按每张切片20nl加预杂交液。恒温箱38-42'C孵育2-4h。吸取多余液体，不洗。(8)杂交按每张玻片2(^1杂交液，加在切片上。恒温箱38-42t:杂交过夜。(9)杂交后洗涤37。C左右水温的2xSSC洗涤5minx2次；37'C0.5xSSC洗涤15minxl次；37°C0.2xSSC洗涤15minxl次。(10)滴加封闭液37°C30min。甩去多余液体，不洗。(11)滴加生物素化鼠抗地高辛37°C60min或室温120min，原位杂交用PBS洗涤5minx4次0(12)滴加SABC:37°C20min或室温30min，原位杂交用PBS洗涤5minx3次。(13)滴加生物素化过氧化物酶:37°C20min或室温30min，原位杂交用PBS洗涤5minx3次。(14)DAB显色使用DAB显色试剂盒--1ml双蒸水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上，显微镜下观察至出现明显的特异性染色，充分水洗。(15)苏木素复染苏木素染色5min，充分水洗后，1%盐酸-乙醇分化23，充分水洗，玻片浸于水中反蓝至适当的程度。(16)系列浓度的酒精脱水，二甲苯透明，封片。(17)显微镜观察照相。检测结果Ad-HGF转染的BMSCs胞浆中有棕黄色阳性染色颗粒，表明转染后BMSCs有HGFmRNA表达，结果如图4所示。6.免疫组化检测HGF蛋白的表达①消化BMSCs，以1.5xl()5/孔的浓度接种于6孔板中，在37"C，5%C02，饱和湿度培养箱中培养24h。②按照前述方法，将Ad-HGF病毒以MOI-300转染细胞。③48h后胰酶消化细胞，计数。以O.51.0xl0V20Onl的浓度滴加于经紫外照射消毒的硅化玻片上，置于湿盒中，在37'C，5%(202饱和湿度培养箱中培养过夜。④取出玻片，0.1MPBS(pH7.4)洗涤2minx3次后，置于4。C丙酮中固定30min。蒸馏水充分洗涤，干燥后置于-2(TC冰箱备用，或直接进行检测。⑤每张玻片上滴加适量0.01%胰酶消化细胞5min以暴露抗原，充分水洗。⑥每张玻片上滴加1滴或50nl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育lOmin，0.02MPBS冲洗3minx3次。⑦除去PBS液，每张玻片上滴加1滴或封闭液，室温下孵育10min。⑧除去多余的封闭液，每张玻片上滴加1滴或50planti-hHGF单克隆抗体(用10。/。BSA-PBS做1:IOO倍稀释)，4'C过夜。⑨0.02MPBS冲洗5minx3次。除去PBS液，每张玻片上滴加1滴或50^1生物素标记的第二抗体，室温下孵育10min。0.02MPBS冲洗3minx3次。⑩除去PBS液，每张玻片上滴加1滴或50[U链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min，0.02MPBS冲洗3minx3次。(11)除去PBS液，每张玻片上滴加2滴或100nl新鲜配制的DAB溶液(lml双蒸水加显色剂A、B、C各l滴，混匀)，显微镜下观察至出现明显的特异性染色，充分水洗。(12)苏木素复染苏木素染色5min，充分水洗后，1%盐酸-乙醇分化28，充分水洗，玻片浸于水中反蓝至适当的程度。(13)系列浓度的酒精脱水，二甲苯透明，封片。(14)显微镜观察照相。检测结果Ad-HGF转染的BMSCs胞浆中有棕黄色阳性染色颗粒，表明转染后BMSCs有HGF蛋白表达，结果如图5所示。7.ELISA检测HGF蛋白的分泌(1)将ELISA检测试剂盒平衡至室温(20-25°C)后取出反应板，并于临用前15min配制工作液。(2)将浓縮洗涤液(40x)用双蒸水稀释成lx(至1000ml)。(3)稀释标准品和待测样品①用样品稀释液稀释标准品标准品用lml标准品稀释液复溶，得到16000pg/ml的高浓度标准品。将之稀释成一组标准品，BP:8000、4000、2000、1000、500、250、125、Opg/ml。②用样品稀释液稀释待测样品将各个待测样品从-80C冰箱中取出，室温融化后分别用标准品稀释液首先5倍稀释，然后倍比稀释成一组样品。(4)加100^1标准品、100^1待测样品于相应反应板孔中。(5)轻轻混匀30s，封住板孔，37'C温育60min。(6)洗板甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入35(HU洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次。(7)临用前15min配制1xBiotin:—支BiotineantiHGF加入6mlBiotin稀释液，混匀。每孔加入100^1lxBiotin。轻轻混匀30s，封住板孔，37X:温育60min。(8)洗板甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350^1洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次。(9)临用前15min配制lxHRP:—支HRP加入6m酶联物稀释液，混匀。每孔加入100WlxHRP。轻轻混匀30s，封住板孔，37'C温育30min。(10)洗板甩尽板内液体，用洗漆液洗涤反应板(每孔内加入350^1洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次。(11)每孔加入100^1TMB显色液。轻轻混匀10s，37'C暗处温育I5±10min。(12)每孔加入l(KHil终止液(StopSolution)。轻轻混匀30s;30min内在450nrn处读OD值。(13)以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上査出其浓度。检测结果转染后BMSCs表达的HGF蛋白分泌到培养上清中，表达高峰在转染后48h,表达量为103ng/ml，表达持续至少2周以上，结果如图6所示。8.流式细胞术检测细胞周期(1)取第2代BMSCs，用0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA室温消化后制成单细胞悬液，PBS漂洗3次。(2)收集大约lxl(^个细胞，用预冷至4X:的70n/。乙醇固定30min;预冷的PBS漂洗3次。(3)50mg/LRNA酶0.3ml37°C处理30min。(4)将细胞悬液移入流式细胞仪专用试管，加入50mg/L的PI0.4ml，避光染色30min后上机检测。检测结果Ad-HGF转染对BMSCs的细胞周期无影响。结果如表1所示，衣1:T问组别细胞周期流式细胞仪分析结果(％)(x±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>制备例2本实施例的生物分装剂的组成如下-(1)试剂I:纤维蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纤维蛋白原的含量为60mg/mL，抑肽酶的含量为1000KIU/mL;(2)试剂II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250IU/mL，CaCl2的含量是40mmol/mL;(3)试剂m:转基因骨髓基质干细胞，其中所含的外源基因是编码人肝细胞生长因子的基因。其中，试剂in的制备方法与实施例1相同；试剂I是将纤维蛋白原和抑肽酶按配比与水混合得到；试剂II是将凝血酶和CaCl2按配比与水混合得到。制备例3本实施例的生物分装剂的组成如下(1)试剂I:纤维蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纤维蛋白原的含量为100mg/mL，抑肽酶的含量为3000KIU/mL;(2)试剂II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是500IU/mL，CaCl2的含量是CaCl240mmol/mL;(3)试剂m:转基因骨髓基质干细胞，其中所含的外源基因是编码人肝细胞生长因子的基因。其中，试剂m的制备方法与实施例1相同；试剂I是将纤维蛋白原和抑肽酶按配比与水混合得到；试剂II是将凝血酶和CaCl2按配比与水混合得到。应用例1、制作兔早期激素性ANFH模型采用新西兰大白兔，平均体重3kg，经耳缘静脉注射10ml/kg马血清，间隔二周后，按5ml/kg连续2天以相同方法注射马血清；2周后，腹腔注射7.5mg/kg醋酸泼尼松龙，每周二次，共4次，制造兔激素性ANFH模型，于注射激素第5周末进行影像学和病理组织学检査，确定ANFH分期，选择I、II期进行治疗。模型组动物随机分3组进行治疗本发明生物分装剂治疗组、转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组、单纯髓芯减压治疗组，每组IO只，其中转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组中的转HGF基因的BMSCs制备方法见制备例l。2、实验方法以下效果实验所用的本发明生物分装剂的组成和制备方法见实施例1。①试剂in以0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化，低速度离心800gX5min，收集细胞沉淀，PBS洗涤三次、无血清DMEM培养基洗涤一次，在计数板上计数，调整细胞密度为107个/1111，取100nl低速度离心800gX5min，收集细胞沉淀；②用试剂I90^1悬浮步骤①所得的细胞沉淀；③将I、II期股骨头坏死的兔麻醉后，在CT引导下行髓芯减压术，取悬浮细胞的试剂I9(^1和试剂II通过双联注射器经减压隧道移植入兔股骨头坏死区。-术后4周，采用DR数字放射成像、MRI、CT、CT灌注、动脉墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫组化等方法对疗效进行综合评价。3、实验结果(1)对兔早期激素性ANFH治疗的DR检査(见图7):具体实验过程兔麻醉后采用仰卧位，固定双侧髋关节，摄包括双侧髋关节后前位片。照射条件75KV，250mA，16ms/4mAs。检査结果A.正常组股骨头边界清楚，表面光滑，骨骺线清晰。B.造模组造模5周时开始出现双侧股骨头密度增高，骺线不清楚，骨纹理不清晰，关节间隙正常，股骨头无变形；未见股骨头塌陷。C.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组实验动物右侧为转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压侧，密度稍增高，纹理较清楚；实验动物左侧为单纯髓芯减压侧，股骨头密度明显增高硬化，纹理不清楚。D.本发明生物分装剂治疗组双侧股骨头密度低于治疗组，边界清楚，纹理清晰。(2)对兔早期激素性ANFH治疗的MRI检查(见图8)①实验兔麻醉方法将兽用速眠新II注射液1支(1.5ml)与硫酸阿托品注射液1支(lml)混匀，臀肌注射，首次剂量按体重0.7-0.8ml/kg，30-40min后半量追加。②采用头部正交线圈，将线圈中心定于髋关节位置。扫描序列选用快速自旋回波序列(fastspinecho,FSE)，丁2加权像(T2weightedimaging,T2WI)TR/TE4500ms/96ms，T!加权像(Tiweightedimaging,乃WI)TR/TE550ms/20ms,以及T2WI脂肪抑制像(FS-T2WI)，均为2次采集，冠状位，层厚3mm，层间隔0.3mm，扫描野(FieldofView，FOV)100xl00mm2。检查结果A.正常组正常股骨头双侧对称，FS-T2WI股骨头皮质下高信号脂肪、髋臼高信号脂肪均明显被抑制呈低信号B.造模组关节腔积液增多；FS-T2WI干骺端高信号，提示骨髓水肿，股骨头松质骨出现小点/线状不均匀高信号影，提示囊变坏死。C.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组实验动物右侧为转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压侧，左侧为单纯髓芯减压侧，MRIFS-T2WI可见右侧关节腔积液较前减少，股骨头点线状高信号影左较治疗侧明显，提示右侧骨坏死囊变轻。D.本发明生物分装剂治疗组双侧股骨头对称，关节腔积液进一步减少，股骨头点线状高信号影较治疗组弱。(3)对兔早期激素性ANFH治疗的常规CT检査(见图9)①实验兔麻醉方法将兽用速眠新II注射液1支(1.51111)与硫酸阿托品注射液1支(lml)混匀，臀肌注射，首次剂量按体重0.7-0.8ml/kg，30-40min后半量追加。②常规CT扫描实验兔麻醉后仰卧固定于自制木板架上，双髋关节呈外展位，尽量使双侧髋关节对称。行包括髋关节上下缘的常规横断面扫描，扫描参数电压100KV，电流220mA，探测器组合16x0.625mm，螺距0.625:1(床速5.62mm/r),重建层厚1.25mm，FOV直径9.6cm。检査结果A.正常组双侧股骨头对称，关节面清晰，皮质光滑、清晰、完整，骨质密度正常，骨松质纹理正常，骺线清楚。B.造模组股骨头点状低密度影，示囊变区，干薪端密度增高，有骨硬化，股骨头皮质模糊，关节受损，骨皮质变薄、密度减低。双侧股骨头基本对称。C.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组实验动物右侧为转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压侧，左侧为单纯髓芯减压侧，治疗侧股骨头点状低密度影较单纯髓芯减压组数量减少，提示治疗组骨坏死轻；D.本发明生物分装剂治疗组:股骨头点状低密度影少于转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组，提示坏死程度更轻。(4)对兔早期激素性ANFH治疗的CT灌注检査(见图10)具体实验过程根据常规扫描图像，定位选择包括双侧股骨头在内的lcm范围内的层面，进行同层动态增强扫描。选择轴扫(axial)模式，层厚2.5mmx4，lsl次，间隔ls，电压、电流、FOV同上。碘海醇注射液4ml(约相当于1.5ml/kg)，用CT压力注射器自耳缘静脉自动推注，注射速度1.51111/3，注射后延迟0s开始扫描，共扫描45次，产生180帖图像(每次4帖)，监控时间90s。检査结果A.正常组双侧股骨头基本对称，BV较高呈红色；B.造模组双侧股骨头基本对称，血容量较正常组明显减少，呈兰色；C.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组实验动物右侧，血容量明显恢复，BV较高呈红色；D.单纯髓芯减压治疗组实验动物左侧，血容量较治疗组少，红色/绿色区增多；E.本发明生物分装剂治疗组双侧血容量接近正常组，BV较高呈红色。(5)对兔早期激素性ANFH治疗的墨汁灌注造影(见图ll)具体实验过程动物麻醉后，静脉注射肝素1万IU，切开腹部，暴露腹主动脉，用带12号针头的聚乙烯管离心方向插入，生理盐水加压灌洗约3000ml，最后用墨水(上海墨水厂出品214型)和右旋糖酐(上海富民制药厂)以7:3的比例混合注入血管约100ml，至双侧下肢皮肤、甲床变为均匀黑色。尸体放4'C冰箱过夜，第二天取材，置于4%多聚甲醛溶液固定3天；10%EDTA-PBS缓冲液脱钙(将EDTA溶于0.02M,PH7.4的PBS缓冲液中制成)，每3天更换脱钙液一次，观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度，直到满意为止。取材逐级脱水，二甲苯透明，水杨酸酯钠透明，切成50阿的切片，立体显微镜下观察股骨头形态结构和血管分布和生长情况。检査结果A.正常组血管分布均匀丰富；B.模型组血管闭塞，血管稀少，股骨头浅层血管几乎消失；C.单纯髓芯减压治疗组血管部分恢复，仍有明显栓塞；D.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组软骨下血管重建，干薪端大血管恢复。E.本发明生物分装剂治疗组血管重建，软管下和干骺端血管较均匀丰富。(6)对兔早期激素性ANFH治疗的病理组织学观察(HE染色，见图12)实验兔以空气注射法处死，剖取双侧股骨头连同干骺端及股骨，肉眼观察后，置于4%多聚甲醛溶液固定3天；10%EDTA-PBS缓冲液脱鈣(将EDTA溶于0.02M,PH7.4的PBS缓冲液中制成)，每3天更换脱钙液一次，观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度，直到满意为止。取材逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，然后行苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察骨膜、软骨组织、骨小梁、造血组织的变化。检查结果A.正常组股骨头关节面表面光滑，软骨细胞排列整齐，骨小梁结构清晰，骨髓造血组织丰富；B.模型组股骨头关节面不规整，部分软骨细胞坏死脱落，结构紊乱，骨小梁变细，结构紊乱，骨细胞消失，骨髓中造血组织明显减少或消失。C.单纯髓芯减压治疗组造血组织部分恢复，但较为稀少，以脂肪细胞为主，可见空陷窝和血栓；干骺端成骨细胞增殖旺盛，有新骨生成。D.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组:骨小梁排列基本规则,骨基质量增多；仍可见少量空骨陷窝，边缘有大量成骨细胞，骨髓中造血组织基本恢复。E.本发明治疗组骨小梁排列基本规则，明显有新骨生成，骨小梁骨板上可见新生毛细血管，骨髓中造血组织丰富，可见新生血管扩张。(7)对兔早期激素性ANFH治疗的病理组织学观察(VEGF免疫组化观察，见图13)实验兔以空气注射法处死，剖取双侧股骨头连同干骺端及股骨，肉眼观察后，置于4%多聚甲醛溶液固定3天；10%EDTA-PBS缓冲液脱f5(将EDTA溶于0.02M，PH7.4的PBS缓冲液中制成)，每3天更换脱钙液一次，观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱铐程度，直到满意为止。取材逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。①病理切片经二甲苯和系列浓度的乙醇逐级脱蜡后，按前述方法行免疫组化检测VEGF蛋白的表达。浸于双蒸水中备用。②每张玻片上滴加适量0.01%胰酶消化细胞5min以暴露抗原。充分水洗。③每张玻片上滴加1滴或50nl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10min。0.02MPBS冲洗3minx3次。除去PBS液，每张玻片上滴加1滴或50jxl封闭液，室温下孵育10min。◎除去多余的封闭液，每张玻片上滴加1滴或50filanti-hVEGF单克隆抗体(用10。/oBSA-PBS做l:100倍稀释)。4'C过夜。⑥0.02MPBS冲洗5minx3次。除去PBS液，每张玻片上滴加1滴或生物素标记的第二抗体，室温下孵育l0min。0.02MPBS冲洗3minx3次。⑦除去PBS液，每张玻片上滴加l滴或50^1链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min。0.02MPBS冲洗3minx3次。⑧除去PBS液，每张玻片上滴加2滴或lOOjd新鲜配制的DAB溶液(lml蒸馏水加显色剂A、B、C各l滴，混匀)，显微镜下观察至出现明显的特异性染色。充分水洗。⑨苏木素复染苏木素染色5min，充分水洗后，1%盐酸-乙醇分化23，充分水洗。玻片浸于水中反蓝至适当的程度。⑩系列浓度的酒精脱水，二甲苯透明，封片。显微镜观察照相。A.正常组软骨细胞和血管内膜上可见淡黄色颗粒，有较低水平的VEGF表达。B.模型组血管内膜VEGF表达缺失，骨髓腔中不见破骨细胞，少见成骨细胞。C.单纯减压治疗组血管内皮细胞和骨小梁表面的成骨细胞可见淡染黄色颗粒，VEGF表达水平较D治疗组低。D.转HGF基因的BMSCs移植+髓芯减压治疗组VEGF表达上升。血管内皮细胞和骨小梁表面的成骨细胞可见深染黄色颗粒，成骨细胞和破骨细胞功能活跃。E.本发明分装剂治疗组VEGF表达显著上升。成骨细胞成多层粘贴在骨小梁表面，并成批演化为骨细胞。髓腔中骨小梁之间破骨细胞增多，紧贴于坏死骨小梁的表面，功能活跃。阳性软骨细胞显著上升，软骨下阳性血管明显增多。结果表明，本发明生物分装剂用于髓芯减压术能有效促进坏死区血管再生和骨质重建，并且效果优于的转HGF基因的BMSCs联合髓芯减压治疗组和单纯髓芯减压治疗组。SEQUENCELISTING<110>南方医科大学<120>—种治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>1tagagctcatgtgggtgaccaaactcct28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>2tagtcgacctatgactgtggtaccttat28权利要求1、一种治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂，该生物分装剂由以下试剂组成试剂I纤维蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纤维蛋白原的含量为60～100mg/mL，抑肽酶的含量为1000～3000KIU/mL；试剂II凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250～500IU/mL，CaCl2的含量是CaCl240mmol/mL；试剂III转基因骨髓基质干细胞，其中所含的外源基因是编码人肝细胞生长因子的基因；所述的骨髓基质干细胞为同种异体骨髓基质干细胞或自体骨髓基质干细胞。2、根据权利要求1所述的治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂，其特征在于所述的试剂I中各组分的含量为纤维蛋白原80mg/mL，抑肽酶2000KIU/mL。3、根据权利要求1所述的治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂，其特征在于所述的试剂II中凝血酶的含量为400IU/mL。4、根据权利要求l、2或3所述的治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂，其特征在于所述的试剂I中各组分的含量为纤维蛋白原80mg/mL，抑肽酶2000KIU/mL;所述的试剂II中凝血酶的含量为400IU/mL。全文摘要本发明提供了一种治疗早期股骨头缺血性坏死的生物分装剂，该生物分装剂主要由纤维蛋白原、凝血酶和转HGF基因骨髓基质干细胞组成。该生物分装剂中的试剂是在行髓芯减压术以双联注射器经减压隧道注入兔股骨头坏死区，纤维蛋白胶在凝血酶的作用下形成立体网状结构凝胶作为转HGF基因骨髓基质干细胞的支架，并控制细胞分泌的HGF缓慢释放，达到防止移植的转基因骨髓基质干细胞流失，维持HGF局部有效的作用浓度的目的，进而促进坏死区血管再生和骨质重建。文档编号A61K38/48GK101108253SQ20071002841公开日2008年1月23日申请日期2007年6月5日优先权日2007年6月5日发明者骊马申请人:南方医科大学