水痘减毒活疫苗的制作方法

专利名称：：水痘减毒活疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及疱疹病毒科的医用微生物，具体为一种水痘减毒活疫苗。技术背景水痘是由水痘-带状疱疹病毒(vzv)引起的髙度接触传播的常见呼吸道传染病，水痘病毒是一种人a-疱疹病毒，能导致两种人类疾病:.初次感染好发年龄为10岁以下儿童，导致儿童水痘，此后病毒变为潜伏并常常重激活(通常几十年后)产生带状疱疹。原发感染可致患者不同程度的典型疾病，尤其对免疫功能低下及接触免疫抑制剂治疗者，后果更为严重。患水痘时，病毒透入外周神经系统并潜伏直至以痛苦的带状疱疹形式重激活。由于病毒是潜伏的，大部分病毒基因的表达被抑制。VZV感染具有存在最小量的自由病毒的特征，在潜伏状态和重激活时，病毒主要在细胞内。相应的，甚至使用高浓度中和抗体和依赖于细胞介导免疫的病毒控制也不能预防复发疾病。目前对水痘的治疗并无专用有效药物及治疗方法，常规以预防为主，通过接诊水痘疫苗的方法预防感染水痘-带状疱疹病毒(VZV),因此用安全有效的水痘疫苗对高危人群进行免疫已日益受到人们的重视。在国内由于国家对预防的日益重视，水痘疫苗市场的增长速度呈快速增长态势。虽然目前中国水痘疫苗市场还处于萌芽状态，但市场潜力巨大。我国每年出生婴儿超过1500万，存在着巨大的儿童免疫接种市场；同时随着人民生活水平的进一步提高，由消费者自己负担的成人有价免疫市场也将会有大幅度的提高。依据有关资料显示，国内水痘疫苗市场增长率将达到15%，远远高于全球10%的增长率。我国拥有将近13亿的人口，根据全国人口和经济实力，可以将市场定位于城f^人口，按中小学生和儿童以及老年人的数量计算，应在l亿以t，按其中的20%的人进行预防接种，全国的潜在市场应为2000万人份左右，同时随着人民生活水平的提高和市场宣传的深化，最新疫苗技术的创新及人们对免疫和病原体抵抗力认识的进展，市场将逐步扩大。要获得安全有效的水痘疫苗，需解决的主要关键技术及试验内容有1.病毒培养包括细胞培养的条件，病毒的接种量，病毒的培养条件和收获条件以及细胞培养液和病毒培养液的成分等。2.病毒纯化包括病毒超声的时间、频率等。3.冻干方法比较在不同的冻干工艺下生成的疫苗产品的质量。4.疫苗稳定剂的配方比较不同配方的疫苗稳定剂对疫苗的质量及其稳定性情况的影响。
发明内容为了克服现有预防水痘手段的不足，提供一种安全有效的预防水痘的手段，本发明公开了一种水痘减毒活疫苗。本发明通过如下技术手段达到发明目的一种水痘减毒活疫苗，按如下方法制备而成(1)将MRC-5细胞在细胞瓶中连续传代不超过33代；(2)至细胞生长至一定规模后，将毒种接种至细胞中，进行两次连续感染，M.O.I分别为0.0010.002和0.010.03;(3)加入含23。/。胎牛血清的MEM培养液，置于3537X:培养；(4)当MRC-5细胞病变程度达到++~+++时，倒去培养液，以PBS洗液洗涤细胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05n/。的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在48r下以1800ipm离心5分钟，弃上清，加入含有稳定剂的疫苗液，混匀，收集，吸样做单瓶无菌检测，-sox:冻存；(6)将单瓶无菌检测合格者，移入超声瓶中进行超声破碎，超声波频率30KHz，0.10.2秒/ml，以lOOOrpm离心10分钟，收集上清，即为病毒原液；(7)将病毒原液合并、稀释成半成品，吸样进行无菌检测，并立即进行分装、冻干，即得到水痘减毒活疫苗。所述的水痘减毒活疫苗，制备方法第(5)〗j;中所加入的稳定剂配方如下序号组分重量份数<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>将以上各组分均溶于重量份数为IOOO的去离子水中，即得稳定剂。本发明选用唯一被WHO推荐用于生产水痘活疫苗的减毒株Oka水痘减毒株和MRC-5细胞，Oka水痘减毒株是1974年由日本大阪大学微生物病研究会(BKEN)髙桥理明博士研究成功的，经过15年的临床试验，证明该病毒株具有很好的有效性和安全性，是最为理想的活疫苗株。采用自行研制的不含明胶的稳定剂，生产出具有较髙病毒滴度和良好安全性的水痘疫苗，有效解决了部分注射人群的过敏性问题。以前的水痘疫苗稳定剂配方中多含有明胶，由于明胶是一种潜在的过敏原，大多数对水痘疫苗的接种过敏反应是由疫苗中作为稳定剂的明胶所致。在曾经统计过的30例水痘疫苗过敏反应的儿童中，7例反应严重，7例轻微，14例全身皮肤反应，30人中有27人具有抗明胶IgE抗体。经统计，严重过敏反应的发生率为每100万剂10.3例。因此，开发不含明胶的水痘疫苗稳定剂，可以避免部分注射人群的过敏性问题，己经成为水痘疫苗的一个发展方向。经过长达2年的稳定性研究表明，利用本发明的稳定剂生产的水痘减毒活疫苗具有良好的稳定性，在28C放置2年以上仍然具有较髙的病毒滴度。在生产水痘疫苗的过程中，经过试验，最终选用的毒株为世界公认的Oka水痘减毒株，细胞基质为由国家药品管理当局认可的MRC-5细胞，从而保证了生产出来的水痘疫苗具有良好的安全性和免疫原性。以本发明为试验疫苗，并选用上海生物制品研究所生产的水痘疫苗为对照疫苗，开始水痘减毒活疫苗的临床试验研究。研究釆用随机、盲法试验。研究对象为112岁人群，分为两个年龄段入组，1~5岁和6~12岁各300人，以随机方式接种1针试验疫苗或1针对照疫苗，采集免前和免后4-6周血样评估免疫原性效果，以主动随访和受试者自动报告方式进行安全性观察。1.安全性观察通过对400名接种试验疫苗和200名接种对照疫苗的受试者进行注射后至10天内精细观察以及30天内不良事件收集试验组和对照组总反应率为31.75%和35.0%，中度以上反应率8.5%和10.5%;试验组和对照组局部反应率为2.25%和1.50%;试验组全身反应率29.5%,中度以上反应率8.5%;对照组全身反应率33.5%，中度以上反应率10.0%。两组间总反应率、局部和全身反应率比较均无统计学差异。2.免疫原性效果受试者免疫后经血清学试验结果表明试验组和对照组受试者免疫后抗体阳转率分别为100.0%和98.74°/0，4倍增长率为89.66%和卯.91%，阳性率为诉.30%和97.79%。试验组和对照组抗体阳性率比较无统计学差异(t=0.1659，P=0.6832)。试验组免后抗体GMT为57.90，较免疫前平均增长约21倍；对照组免后抗体GMT为46.79，较免疫前平均增长约18倍。试验组与对照组的抗体GMT比较差异有显著统计学意义(t=3.5329,P=0.0004)，但免疫前后抗体增长倍数无差异(t=1.3892，P=0.0827)。具体实施方式以下通过实施例进一步说明本发明实施例l一种水痘减毒活疫苗，按如下方法制备而成(1)将MRC-5细胞在细胞瓶中连续传代20代；(2)至细胞生长至一定规模后，将毒种接种至细胞中，进行两次连续感染，M.O.I分别为0.001和0.01,以扩大病鸟液的收获量；(3)加入含2%胎牛血清的MEM培养液，置于35X:培养；(4)3皿05细胞病变朽:度达到+++++时，倒去培养液，以PBS洗液洗涤细胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在4r下以1800rpm离心5分钟，弃上清，加入含有稳定剂的疫苗液，混匀，收集，吸样做单瓶无菌检测，-sox:冻存；其中，稳定剂配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>将以上各组分均溶于重量份数为1000的去离子水中，即得稳定剂。(6)将单瓶无菌检测合格者，移入超声瓶中进行超声破碎，超声波频率30KHz,0.1秒/ml，以1000rpm离心10分钟，收集上清，即为病毒原液；(7)将病毒原液合并、稀释成半成品，吸样进行无菌检测，并立即进行分装、冻干，即得到水痘减毒活疫苗。实施例2一种水痘减毒活疫苗，按如下方法制备而成(1)将MRC-5细胞在细胞瓶中连续传代不超过25代；(2)至细胞生长至一定规模后，将毒种接种至细胞中，进行两次连续感染，M.O.I分别为0.0015和0.02，以扩大病毒液的收获量；(3)加入含2.5。/。胎牛血清的MEM培养液，置于36"C培养；(4)当MRC-5细胞病变程度达到+++++时，倒去培养液，以PBS洗液洗涤细胞表面，洗去牛血清(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在6'C下以1800rpm离心5分钟，弃上清，加入含有稳定剂的疫苗液，混3,收集，吸样做单瓶无菌检测，-sox:冻存;其中，稳定剂配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将以上各组分均溶于重量份数为iooo的去离子水中，即得稳定剂。(6)将单瓶无菌检测合格者，移入超声瓶中进行超声破碎，超声波频率30KHz，0.1秒/ml，以lOOOrpm离心10分钟，收集上清，即为病毒原液；(7)将病毒原液合并、稀释成半成品，吸样进行无菌检测，并立即进行分装、冻干，即得到水痘减毒活疫苗。实施例1一种水痘减毒活疫苗，按如下方法制备而成(1)将MRC-5细胞在细胞瓶中连续传代不超过33代；(2)至细胞生长至一定规模后，将毒种接种至细胞中，进行两次连续感染，M.O.I分别为0.002和0.03，以扩大病毒液的收获量；(3)加入含3。/。胎牛血清的MEM培养液，置于37X:培养；(4)当MRC-5细胞病变程度达到++~+++时，倒去培养液，以PBS洗液洗涤细胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在8'C下以1800rpm离心5分钟，弃上清，加入含有稳定剂的疫瞎液，混匀，收集，吸样做单瓶无菌检测，-SO'C冻存；其中，稳定剂配方如下序号组分重量份数1NaCl32KC10,13KH2P040.24Na2HP0412H203.3蔗糖506谷氨酸钠0.47卡那霉素(100单位/ml)0.18红霉素(30单位/ml)0.03将以上各组分均溶于重量份数为IOOO的去离子水中，即得稳定剂。(6)将单瓶无菌检测合格者，移入超声瓶中进行超声破碎，超声波频率30KHz，0.2秒/ml，以lOOOrpm离心10分钟，收集上清，即为病毒原液；(7)将病毒原液合并、稀释成半成品，吸样进行无菌检测，并立即进行分装、冻干，即得到水痘减毒活疫苗。权利要求1.一种水痘减毒活疫苗，按如下方法制备而成(1)将MRC-5细胞在细胞瓶中连续传代不超过33代；(2)至细胞生长至一定规模后，将毒种接种至细胞中，进行两次连续感染，M.O.I分别为0.001～0.002和0.01～0.03；(3)加入含2～3％胎牛血清的MEM培养液，置于35～37℃培养；(4)当MRC-5细胞病变程度达到++～+++时，倒去培养液，以PBS洗液洗涤细胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05％的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在4～8℃下以1800rpm离心5分钟，弃上清，加入含有稳定剂的疫苗液，混匀，收集，吸样做单瓶无菌检测，-80℃冻存；(6)将单瓶无菌检测合格者，移入超声瓶中进行超声破碎，超声波频率30KHz，0.1～0.2秒/ml，以1000rpm离心10分钟，收集上清，即为病毒原液；(7)将病毒原液合并、稀释成半成品，吸样进行无菌检测，并立即进行分装、冻干，即得到水痘减毒活疫苗。2.如权利要求1所述的水痘减毒活疫苗，其特征在于制备方法第(5)步中所加入的稳定剂配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>将以上各组分均溶于重量份数为IOOO的去离子水中，即得稳定剂。全文摘要本发明涉及疱疹病毒科的医用微生物，具体为一种水痘减毒活疫苗。本发明通过如下方法制备而成(1)将MRC-5细胞连续传代；(2)接种至细胞并连续感染；(3)加入培养液；(4)洗涤细胞表面；(5)洗脱感染细胞，离心分离，加入含稳定剂的疫苗液冻存；(6)超声破碎并离心分离得病毒原液；(7)合并稀释，并立即进行分装、冻干，即得到水痘减毒活疫苗。稳定剂是将NaCl、KCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、蔗糖、谷氨酸钠、卡那霉素、红霉素和去离子水以重量比3∶0.1∶0.2∶3.3∶50∶0.4∶0.1∶0.03∶1000溶于水制得。本发明具有良好的安全性和免疫原性的优点。文档编号A61K39/275GK101161286SQ20071004565公开日2008年4月16日申请日期2007年9月6日优先权日2007年9月6日发明者朱绍荣申请人:上海荣盛生物技术有限公司