专利名称：：聚合物/重组人促红素偶联物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组人促红素的偶联物，特别是涉及一种聚合物/重组人促红素偶联物、含有该偶联物的药物以及该偶联物在制备药物方面的应用，本发明还涉及聚合物/重组人促红素偶联物的制备方法。
背景技术：
：红细胞生成(Erythropoiesis)是指血红细胞的生成，以补偿红细胞的损失。红血球生成是一种受控的生理机制，它提供足够的血红细胞用于组织供氧。人体中的人促红素(Erythropoietin,简称EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。天然的EPO刺激骨髓中定向红细胞祖细胞的分裂和分化，并且通过结合到红细胞前体的受体上来发挥其生物学活性(Krantz,BS(1991)Blood77:419)。人促红素已经通过使用重组DNA技术被生产出来(Egrie，JC，Strickland,TW，Lane，Jetal.(1986)Immunobio1.72:213-224)，它是人EPO基因克隆插入中国仓鼠卵巢组织细胞(CHO细胞)并在其中表达的产物。EPO是一种糖蛋白激素，血浆中存在的EPO由165个氨基酸组成，糖基化程度很高。没有糖部分的EPO多肽链的分子量为18,236Da。在完整的EPO分子中，碳水化合物基团占分子量的大约40%，此碳水化合物基团在蛋白的糖基化位点处将蛋白糖基化(Sasaki,H，Bothner,B,Dell,AandFukuda,M(1987)J.Biol.Chem.262:12059)。由于人促红素在红细胞生成中非常重要，因此这种激素可被用于以低或缺乏红细胞生成为特征的血液病症的治疗中。在临床上，EPO可用于治疗慢性肾功能衰竭患者(CRF)中的贫血(Eschbach,JW,Egri,JC,Downing,MRetal.(1987)NEJM316:73-78;Eschbach,JW，Abdulhadi,MH,Browne,JKetal.(1989)Ann.Intern.Med.111:992;Egrie,JC,Eschbach,JW,McGuire,T,Adamson,JW(1988)KidneyIntl.33:262;Lim,VS,Degowin，RL,Zavala,Detal.(1989)Ann.Intern.Med.110:108-114)和AIDS以及接受化疗的癌症患者的治疗(Dana，RP,Rudnick，SA,Abels，RIIn:MB,Garnick，ed.ErythropoietininClinicalApplications-AnInternationalPerspective.NewYork:N.Y.:MarcelDekker;1990:P.301-324)。目前，市面上已有很多可商购的EPO蛋白制剂，但由于血浆半衰期很短且在体内易被降解，EPO的生物利用度受到很大局限。聚乙二醇化技术是一种改善治疗性蛋白质在体内运输的有效方法。聚乙二醇化改变了药物的药物动力学特性，进而对药效学产生影响。聚乙二醇化能降低肾脏对药物的清除，并且使某些药物在皮下给药后能维持更稳定的吸收以及达到限制性分布的目的。这些药物动力学的改变可带来持续与稳定的血浆药物浓度，进而能提高与血药浓度相关的临床疗效。此外，聚乙二醇化还能减少由于频繁给药造成的峰一谷血药浓度所带来的不良反应，同时还能降低蛋白的免疫原性。聚乙二醇化后降低了药物的空间障碍，从而避免了免疫识别，降低了蛋白质药物的免疫原性。目前己有文献报道聚乙二醇化a—干扰素，通过对不同聚乙二醇化ci一干扰素进行仔细评估后发现，不同的聚乙二醇化药物在药物动力学上存在着差异，不同聚乙二醇(PEG)偶联物具有不同的作用特点，由此带来相关药效学的不同。由于聚乙二醇化部分的大小、构象以及与药物的结合部位对这些特性会产生关键性的影响，因此，必须对不同蛋白质逐个进行个体化的聚乙二醇化设计，才可能达到希望的治疗效果。每种聚乙二醇(PEG)分子的长度和形状在决定对药动学和药效学性质的影响方面是很重要的。而且由于蛋白质各不相同，必须为靶治疗用蛋白质分子选择合适或最佳的PEG分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够有效促进红细胞生成、极大提高在体内存留时间的重组人促红素的偶联物、包含该偶联物的药物组合物以及该偶联物在制备药物方面的应用。本发明的另一目的在于提供所述偶联物的制备方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种聚合物/重组人促红素偶联物，所述偶联物具有以下通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)其中，T为选自以下的糖类靶向齐IJ:葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、果糖或其寡糖及衍生物；P为选自以下的亲水性聚合物聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或者它们的共聚物，且P的分子量为18,000~50，000道尔顿；EPO为重组人促红素。所述偶联物的结合位点为EPO氨基酸序列上赖氨酸侧链的e氨基或N一末端组氨酸a氨基或咪唑基上的亚氨基。优选的，P为聚乙二醇，且P的分子量为30,00040，000道尔顿。在本发明优选的实施方式中，所述偶联物具有以下式(II)所示的结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中P为聚乙二醇，且P的分子量为35,000±3500道尔顿。在本发明具体的实施方式中，所述EPO为利用中国仓鼠卵巢细胞系通过重组DNA技术制备得到的重组人促红素。在本发明的优选的实施方式中，所述EPO采用包含以下步骤的方法制备得到构建包含有重组人EPO基因的中国仓鼠卵巢细胞系并进行细胞培养，从细胞培养物中纯化EPO蛋白。本发明还公开了包含上述聚合物/重组人促红素偶联物的药物组合物。本发明进一步公开了上述聚合物/重组人促红素偶联物在制备用于治疗红细胞生成缺陷疾病的药物中的应用。本发明还公开了一种具有式(II)所示的结构的聚合物虔组人促红素偶联物的制备方法，所述方法包括，将具有下式(III)所示结构的聚乙二醇衍生物与重组人促红素混合，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，P为聚乙二醇，且P的分子量为35,000士3500道尔顿；反应时间为至少2小时，反应pH值为7.07.5，所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为2025:1。优选的，反应时间为2.5小时，反应pH值为7.2，所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为25:1，反应温度为室温。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明通过制备具有特定结构的单取代型EPO的偶联物，特别是通过制备具有特定结构的单取代型聚乙二醇化EPO(PEG—EPO)，能有效促进红细胞生长，极大地提高了EPO在体内的存留时间，使得这些偶联物(如PEG—EPO)制备成的药物制剂，在保证治疗效果的前提下，其用药频率大大降低，如皮下注射频率可降低至至少每两周注射一次，甚至优选每四周注射一次。经聚乙二醇衍生物修饰EPO蛋白后，蛋白分子量与空间位阻增加，热和酸碱稳定性得到提高；且本发明的单取代聚乙二醇化EPO分子具有严格组织分布，仅能通过肾和肝被代谢，半衰期延长，可降低服药剂量；经聚乙二醇化的EPO蛋白周围能够形成一层特殊的"壳"，可以减少免疫反应和毒副作用，降低体内降解作用，同时又保留原有生物学活性。图1为本发明实施例1制得到的PEG—EPO产物的GFC检测结果图。图2为本发明实施例1制备得到的PEG—EPO产物的SDS—PAGE检测结果图。图3为本发明实施例3的网织红细胞百分数曲线图。图4为本发明实施例3的RET图。图5为本发明实施例3的RBC图。图6为本发明实施例4的HCT图(手工毛细血管法)。图7为本发明实施例4的HCT图(sysmex)。图8为本发明实施例4的HGB图(sysmex)。图9为本发明实施例4的RET图(sysmex)。图10为本发明实施例4的RBC图(sysmex)。具体实施例方式本发明通过制备聚合物/重组人促红素偶联物，一方面能有效促进红细胞生长，另一方面制备得到的偶联物在体内能维持较长的代谢时间。特别地，本发明通过选用特定的聚合物，使其与重组人促红素结合后得到的偶联物相比较现有技术中的重组人促红素偶联物，在体内存活时间能进一步延长，因此使用药频率变得更低。本发明的聚合物/重组人促红素偶联物，是指具有以下结构的偶联物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，T为选自以下的糖类耙向剂葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、果糖或其寡糖及衍生物；P为选自以下的亲水性聚合物聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或者它们的共聚物，且P的分子量为18，000~50，000道尔顿；EPO为重组人促红素。在本发明优选的实施方式中，EPO优选用深圳赛保尔生物药业有限公司生产的EPO原液。该EPO原液的制备主要分为细胞株构建、细胞培养和蛋白纯化等步骤。深圳赛保尔生物药业有限公司所生产的EPO是一种重组人蛋白，通过在中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycell、CHO)细胞系中，通过重组DNA技术来制备(EP-B0148605和EP-P0209539)。EPO分子的克隆和表达方法为本领域技术人员所熟知，被公开在专利EP-B0148605、EP-P0209539，将每个文献的内容在此加入做为参考。细胞培养是将一小瓶来源于产生EPO的CHO细胞系的工作细胞库从液氮灌中取出，转移至方瓶中，并被培养在湿润的二氧化碳培养箱中的碳酸氢盐缓冲的培养基中。检测细胞密度到一定数量后将细胞转移至玻璃转瓶中扩增，在最初的生长期后，将细胞培养物用新鲜的培养基进行稀释，达到最初的细胞密度后，接种到细胞培养罐中，灌流培养，流加的方式收获含有表达EPO的细胞培养物。EPO分子的细胞培养方法为本领域技术人员所熟知，在无血清培养基中表达和制备EPO的方法描述于WO96/35718和欧洲专利申请NO.513738,另外含有EPO基因的重组CHO细胞的无血清发酵方法描述于EP-A0513738、EP-A0267678。蛋白纯化是依次用蓝色琼脂糖层析、DEAE离子交换层析、反相HPLC、分子筛等方法从含有表达EPO的细胞培养物纯化出EPO。本领域技术人员熟知EPO的制备和纯化方法，在EP-A0267678中描述了一种在S琼脂糖上的离子交换层析，一种在C8柱上的制备型反相HPLC和一种凝胶过滤层析用于无血清培养中制备的EPO在透析后进行纯化。在这一方面，凝胶过滤层析步骤可被快流S琼脂糖上的离子交换层析替换。也可在离子交换层析之前进行在蓝色Trisacryl柱上的染料层析。在本发明优选的实施方式中，本发明的聚合物/重组人促红素偶联物优选具有以下结构-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(II)并且P为聚乙二醇(PEG)，且P的分子量为35,000士3500道尔顿。。上述优选的聚合物/重组人促红素偶联物可被称为单取代聚乙二醇化EPO分子(PEG—EPO)。在本发明优选的实施方式中，通过选用特定结构的聚乙二醇衍生物对EPO进行聚乙二醇化，进而得到单取代聚乙二醇化EPO分子(PEG—EPO)。相比较单独的EPO分子，这些单取代聚乙二醇化EPO分子具有较长的体内停留时间。用这些PEG—EPO做成的药物制剂，皮下注射的频率应该至少为每两周注射一次，甚至每四周注射一次。所制备的单取代聚乙二醇化EPO在体内(如小鼠或其他动物模型)能有效促进红细胞生成，并维持较长的代谢时间，以达到减少用药频率的目的。PEG及衍生物具有以下特性水溶性很强，低毒和不会引起的免疫反应，体内易于清除。经聚乙二醇衍生物修饰EPO蛋白后，蛋白分子量与空间位阻增加，热和酸碱稳定性得到提高；且本发明的单取代聚乙二醇化EPO分子具有严格组织分布，仅能通过肾和肝被代谢，半衰期延长，可降低服药剂量；经聚乙二醇化的EPO蛋白周围能够形成一层特殊的"壳"，可以减少免疫反应和毒副作用，降低体内降解作用，同时又保留原有生物学活性。本发明的PEG—EPO是通过将具有式(III)结构的聚乙二醇衍生物与EPO反应制备得到。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(ni)其中，P为聚乙二醇，且P的分子量为30,00040,000道尔顿，进一步优选为35,000±3500。在本发明中，该聚乙二醇衍生物称为GLUC—NHS—35K，其是以聚乙二醇为起始原料制备得到，其制备方法可参照专利号为02818455.6的中国发明专利中所记载，并且该专利以全文引用的方式并入本发明。采用GLUC—NHS—35K与EPO反应制备得到的样品，在本发明中称为G—PEG—EPO或者PEG—EPO。制备本发明的G—PEG—EPO的反应条件为在室温下，且pH值为7.07.5时反应至少2小时，并且所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为2025:1。在本发明优选的实施方式中，反应条件为在pH为7.2时，于室温下将两者混合后振荡反应2.5小时，且所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为25:1。本发明的另一方面涉及包含聚合物/重组人促红素偶联物的药物组合物。本发明的聚合物/重组人促红素偶联物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似用途的试剂进行。采用的给药形式可选择通过口、鼻内、直肠、透皮或注射给药方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。本发明的药物组合物可包含常规药用载体或赋形剂和做为活性成分的本发明的聚合物/重组人促红素偶联物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂。本发明优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的偶联物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂，例如使用约0.5至约50%的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。实施例lG—PEG—EPO的制备及检测取2mLEPO原液(EPO含量5mg，深圳赛保尔生物药业有限公司，批号)，加入3mLpH7.2的20mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为lmg/mL。用Sartorius天平准确称量109.4mgGLUC-NHS-35K，加入1094"L2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。将GLUC-NHS-35K溶液全部加入EPO溶液中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合物放置振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，可通过阴离子交换层析纯化反应产物离子交换柱2X5mLDEAEFF流动相Al:50mMBistrispH8.0流动相A3:50mMBistrispH8.0，1MNaCl。流速10.0mL/min样品量反应混合物(EPO含量5mg)加去离子水稀释至lOOmL后上样。收集组分27-50反应完毕后，产物保存于冰箱，同时取5yL产物，加25yL水稀释进行GFC检测。GFC检测色谱柱WatersUltrahydrogelTM500,7.8X300mm，PartNo.WAT011530流速0.5mL/min柱温室温运行时间30分钟UV检测器波长280mn样品量20uLGFC检测结果如图1所示，结果显示GLUC-NHS-35K与EPO的反应产物中没有双PEG取代EPO及游离的EPO。进一步采用SDS—PAGE检测产物的纯度，结果如图2所示。结果显示GLUC-NHS-35K与EPO的反应产物中没有双PEG取代EPO及游离的EPO。实施例2G—PEG—EPO的体外活性检测采用ELISA双抗体夹心法检测实施例1制得的G—PEG—EPO的体外活性为4481IU/mL，体外比活为8821IU/mg。而同时，检测所用的EPO原液的体外活性为531480IU/mL，体外比活为1.6X105IU/mg。结果说明实施例1制得G—PEG—EPO中EPO的大部分抗原表位位电被修饰连接的G—PEG覆盖，导致采用ELISA双抗体夹心法检测的EPO体外活性约为原来的1/20。实施例3G—PEG—EPO体内活性测定试验目的测定G—PEG—EPO是否有效和是否长效方法网织红细胞法(RET)和血细胞比容(HCT)实验动物SPF级雌性BALB/C小鼠(体重1820g，雌性)1、网织红细胞法(RET)试验1.1网织红细胞法(RET)试验分组<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所用的G-PEG-EPO为实施例1中制备得到的G-PEG-EPO。1.2采血时间点注射后第1天到第15天共15天1.3试验动物数目空白对照组组动物数为10只，EPO原液组动物数为10只，G-PEG-EPO样品组动物数为10只共30只1.4注射和采样空白对照组皮下注射生理盐水，EPO原液组及G—PEG—EPO样品组分别以0.08ug/只的剂量皮下注射。于用药后每日取小鼠尾经脉血，按常规测定各小鼠的网织红细胞百分数。，1.5结果如图35所示。正常血红细胞小鼠生物测试是本领域公知的，是以小鼠网织红细胞平行线法来测定的。从图35所示可以看出，通过对每只小鼠注射同剂量的样品后，G—PEG—EPO具有明显增加的网织红细胞和红细胞，表明G—PEG—EPO有较高的体内活性和明显延长的体内半衰期。，2、血细胞比容(HCT)试验2.1血细胞比容(HCT)试验分组试验组注射剂量(ug/每鼠)每周注射次数每周注射剂量(ug/每鼠)空白对照组a等体积生理盐水10扁空白对照组b等体积生理盐水30.000EPO原液组a0細(12IU)1o扁EPO原液组b0.027(4IU)3o扁G-PEG-EPO组aO扁1o細G匿PEG-EPO组b0.0273o細2.2采血时间点第四周末2.3试验动物数目空白对照组a动物数为10只，空白对照组b动物数为10只，EPO原液组a每周一次注射动物数为10只，EPO原液组b每周三次注射动物数为10只，G-PEG-EPO组a每周一次注射动物数为10只，G-PEG-EPO组b每周三次注射动物数为10只，共60只2.4注射和采样皮下注射用药4周，毛细管眼眶静脉采血，按离心法测定各样本的血细胞比容(HCT)或用全自动血液分析仪分析(上海sysmex公司全自动血球分析仪XT2000iV或XT1800IV)2.5结果如下表及图610所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>我们选择了临床上用以评价rhEPO治疗贫血效果的指标一红细胞比容、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白，来反映G—PEG—rhEPO和riiEPO的作用效果。从图410所示可以看出，通过对每只小鼠注射同剂量的样品后，G—PEG—rhEPO的治疗效果明显优于rhEPO，相比较已发表的现有技术中制备的重组人促红素偶联物，在体内存活时间进一步延长，使用药频率变得更低。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。权利要求1.一种聚合物/重组人促红素偶联物，其特征在于所述偶联物具有以下通式其中，T为选自以下的糖类靶向剂葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、果糖或其寡糖及衍生物；P为选自以下的亲水性聚合物聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或者它们的共聚物，且P的分子量为18,000～50,000道尔顿；EPO为重组人促红素。2、根据权利要求1所述的一种聚合物/重组人促红素偶联物，其特征在于所述偶联物的结合位点为EPO氨基酸序列上赖氨酸侧链的e氨基或N—末端组氨酸a氨基或咪唑基上的亚氨基。3、根据权利要求1或2所述的一种聚合物/重组人促红素偶联物，其特征在于P为聚乙二醇，且P的分子量为30,00040,000道尔顿。4、根据权利要求3所述的一种聚合物/重组人促红素偶联物，其特征在于所述偶联物具有以下式(n)所示的结构，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>且P的分子量为35，000±3500道尔顿。5、根据权利要求1所述的一种聚合物/重组人促红素偶联物，其特征在于所述EPO为利用中国仓鼠卵巢细胞系通过重组DNA技术制备得到的重组人促红素。6、根据权利要求5所述的一种聚合物/重组人促红素偶联物，其特征在于所述EPO采用包含以下步骤的方法制备得到构建包含有重组人EPO基因的中国仓鼠卵巢细胞系并进行细胞培养，从细胞培养物中纯化EPO蛋白。7、一种药物组合物，其包含权利要求16任意一项所述的聚合物/重组人促红素偶联物。8、权利要求16任意一项所述的聚合物/重组人促红素偶联物在制备用于治疗红细胞生成缺陷疾病的药物中的应用。9、权利要求4所述的聚合物/重组人促红素偶联物的制备方法，所述方法包括，将具有下式(III)所示结构的聚乙二醇衍生物与重组人促红素混合，其中，P为聚乙二醇，且P的分子量为35,000士3500道尔顿；反应时间为至少2小时，反应pH值为7.07.5，所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为2025:1。10、根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于反应时间为2.5小时，反应pH值为7.2，所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为25:1，反应温度为室温。全文摘要本发明公开了一种聚合物/重组人促红素偶联物，其中，聚合物为选自以下的亲水性聚合物的衍生物聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉以及它们的共聚物，且P的分子量为18,000～50,000道尔顿。本发明还公开了包含该偶联物的药物组合物、偶联物的应用及制备方法。文档编号A61P7/06GK101381412SQ20071012368公开日2009年3月11日申请日期2007年9月30日优先权日2007年9月30日发明者张向荣,张涤平,王庆彬,盛光阳,宣赵,郭立宏申请人:深圳赛保尔生物药业有限公司