专利名称：重组人促红素-ctp融合蛋白生产工艺及应用的制作方法
重组人促红素-CTP融合蛋白生产工艺及应用技术领域
本发明属于生物制药工艺领域。其具体涉及一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽的融合蛋白的一种生产工艺方法，包括该融合蛋白的重组工程细胞株的获得、细胞培养及蛋白纯化工艺方法以及重组人促红素-CTP融合蛋白在猴药代实验和对大鼠肾性贫血治疗上的应用。
背景技术：
EPO是一种主要由肾脏产生的糖蛋白，分子量约为35KD，是人体内调节红系造血的主要激素，在红系祖细胞的增殖、分化和成熟中起着重要的调控作用。目前我国对EPO需求量逐年递增，但是普通EPO存在体内半衰期短，患者给药次数频繁等问题。因此如何延长其体内半衰期，以降低给药频次，成为当前EPO药物的研究热点。目前常用的技术手段有三种，一是使EPO进行PEG化(专利号200880021159. 4)，二是通过氨基酸突变增加糖化位点(美国安进公司的Aranesp，已上市)，三是使其与一些大分子蛋白或高糖化片段相连形成融合蛋白，目前已有文献报道有EPO-FC (见专利申请号200880005733. 7)、EPO-HAS (见专利申请号 200410053319. 7)和 EP0-CTP 文献报道(((Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin)))等。
本发明所述的融合蛋白是参考上述专利及文献基础设计的，在EPO的羧基末端增加一段带有人绒毛膜促性腺激素β亚基的肽链。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素，由两个不同的亚基α、β以非共价键连接组成，CTP短肽是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽。人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽能够增加唾液酸含量，增加分子量，延长半衰期而不影响EPO蛋白活性，已有文献 艮道(《Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin)))支持其可使 EPO 半衰期延长 2-3 倍。
由于EPO为高糖化蛋白，其分子量的40%为糖，融合CTP短肽后其糖基化程度更高，因此EPO-CTP融合蛋白的生产也必须选用糖化修饰较完善的哺乳动物细胞表达系统。 重组糖蛋白类药物的生产目 前较成熟的生产表达系统为哺乳动物细胞表达系统，最常用的细胞系为中华仓鼠卵巢细胞(CHO)。目前哺乳动物细胞大规模培养方法可以分为贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由于细胞固定于表面，不需要复杂的细胞截流装置，便于采用灌注培养。悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要适用于非贴壁依赖性细胞培养。固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的一种方法。
本发明中EPO-CTP融合蛋白的生产可采用两种细胞培养方式，即微载体贴附灌注培养和悬浮流加培养方式。其特点是采用剪切力小，传氧效果好的，混合方式为摇动式混合的激流式细胞生物反应器。第一种培养方式采用微载体贴附悬浮灌注培养，微载体可支持细胞高密度、长时间生长，且微载体悬浮于培养液内，可实现较高的传质传氧效率，此种培养方式可不断补充新鲜培养液、排出代谢废物、延长细胞表达时间，并且利用悬浮培养营养物质、溶解氧混合均匀的特点，从而提高重组蛋白产量，为一种新型实用的生产高糖化重组蛋白的方法。第二种培养方式为悬浮流加培养，主要是用于可以通过悬浮驯化并适应悬浮培养的细胞。悬浮流加培养工艺操作简单、可靠灵活，特别是利用激流式细胞生物反应器传氧效果好，一次性反应袋操作方便，可大大缩短培养周期，易于放大培养规模，通过工艺的简单控制，即可满足EPO-CTP生产需求。
本发明对利用此种生产方法生产的融合蛋白在动物体内的应用进行了研究，融合蛋白在食蟹猴体内的药代实验数据显示出优于普通EPO的半衰期。在大鼠肾性贫血治疗上，融合蛋白可达到一周给药一次的长效作用。发明内容
本发明所要解决的问题主要在于优化形成了一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，包括生产重组人促红素-CTP融合蛋白的重组工程细胞株的构建，并采用载体贴附灌注培养工艺或悬浮流加工艺及优化的蛋白分离纯化方法获得高活性、高纯度融合蛋白，经实验证明该融合蛋白在治疗过程中可达到减少给药频率的效果。
本发明公开了一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽的融合蛋白的核甘酸序列及氨基酸序列。
SEQ ID NO I 是 EP0-CTP 核甘酸序列
CCG GAA iTC '丨 CCACC GGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCT CTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACAGATCTTCCTCTTCAAAGGCCCCTCCACCTAGCCTTCCATCTCCATCTCGACTCCCTGGGCCTTCTGACACCCCTATCCTCCCACAA |tgataa|( ja;C/C X 'Ge AAAAGGAAAA
(方框为起始密码子和终止密码子；阴影斜体为EcoRI和Not I酶切位点)
SEQ ID NO 2 是 EP0-CTP 氨基酸序列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAffKRMEVGQQAVEVffQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAI SPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTCDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
SEQ ID NO 3是EPO氨基酸序列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAffKRMEVGQQAVEVffQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAI SPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTCDR
SEQ ID NO 4是CTP氨基酸序列
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
本发明融合蛋白中，CTP是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端28肽，位置在融合蛋白的C末端。
本发明提供了融合蛋白进行动物细胞大规模、高密度、载体贴附灌注培养工艺或悬浮流加工艺，其主要步骤包括
(I)细胞接种阶段；
(2)细胞生长阶段；
(3)细胞生产阶段；
本发明提供了动物细胞大规模培养后的纯化工艺，具体工艺包括
(I)前处理；
(2)亲和层析；
(3)离子交换；
(4)凝胶过滤；本发明获得的融合蛋白，经治疗肾性贫血大鼠实验证明，该融合蛋白具有和EPO 一样的生物功效，且能达到一周给药一次的药效效果。
本发明还提供了 EPO-CTP食蟹猴药代实验数据，证明融合蛋白的半衰期优于普通ΕΡ0，平均末端半衰期为12. 65h，市售进口药物利血宝(普通ΕΡ0)说明书中半衰期为 5. 9-7. 5h。清除率 EPO-CTP O. 01ml/h/kg 明显优于利血宝 8. 62ml/h/kg，说明 EP0-CTP 在体内清除速度慢于市售利血宝。平均滞留时间(MRT)EPO-CTP 70. 77h，利血宝8. 18h，可以看出EPO-CTP是有一定的长效作用。
图1是pMD18-T-EP0-CTP质粒酶切鉴定
图2是EPO-CTP融合蛋白结构
图3是EPO-CTP表达质粒酶切鉴定
图4是纯化的EPO-CTP融合蛋白电泳
图5是EPO-CTP融合蛋白免疫印迹分析
图6是EPO-CTP融合蛋白平均血清药物浓度-时间曲线
图7是EPO-CTP融合蛋白治疗大鼠药物损伤致肾性贫血体内药效学试验
图8是EPO-CTP融合蛋白治疗大鼠肾切除损伤致肾性贫血体内药效学试验
具体实例
实施例1表达菌株构建方法
将连接到PMD18-T载体上的EPO-CTP融合蛋白基因，利用Not I和EcoR I双酶切鉴定阳性克隆(图1)，测序。获得正确序列的阳性克隆后，将融合基因连接到PcDNA真核表达载体上，构建好的表达菌株提取质粒后可以进行转染CHO细胞。EPO-CTP融合蛋白结构示意图见图2。
取EPO-CTP融合基因的质粒，使用Not I和EcoR I进行双酶切(图3)，回收小片段，同时取PcDNA真核表达载体，使用Not I和EcoR I进行双酶切回收大片段，将回收的两个片段利用T4连接酶连接，转化进大肠杆菌DH5CI中，筛选阳性重组子。经双酶切鉴定和序列测序分析确定后将其命名为pcDNA-EPO-CTP。该质粒可进行CHO细胞的转染。
实施例2EP0-CTP融合蛋白转染CHOKl细胞系
将重组表达质粒转入哺乳动物宿主细胞系，以表达EPO-CTP融合蛋白。为了高水平的稳定表达，优选的宿主细胞系是CH0K1。本发明采用电转化，150 μ g线性化的DNA加入5μ I鲑鱼精DNA，CHOKl宿主细胞5X 106个，混匀后，180V电击两次，将电转后细胞悬液铺入带有培养基的平皿中。待平皿中出现克隆簇，挑取单克隆扩大培养，在经过3次克隆筛选，获得相对稳定高表达细胞株。
实施例3动物细胞大规模、高密度、载体贴附灌注培养
动物细胞微载体贴附灌注培养方法，主要包括细胞的接种，起始生长阶段，改变培养条件，后续生长阶段和监测培养条件，具体步骤如下
1、细胞的接种。
细胞库中复苏一支表达EPO-CTP细胞株，用DMEM培养基加10%胎牛血清在Τ25方瓶中传代三次，调整细胞状态。当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，并添加10%胎牛血清的DMEM培养基进行种子链扩增，细胞扩增按着Τ25-Τ75-Τ150方瓶-2L转瓶的顺序逐级传代。用转瓶消化的细胞接种带有微载体的生物反应器。接种后细胞密度为3Χ 105个细胞/毫升，
2、起始生长阶段。
细胞接入生产用反应器后，设定各项培养参数，温度37°C、PH6. 9-7. 2、D040_70%、 转速40- 70转/min，每天无菌取样，检测葡萄糖和乳酸含量。
3、改变培养条件
当葡萄糖含量低于lg/L时更换培养液为无血清培养液，进入表达期，并进行灌注式培养，灌注量为保持葡萄糖含量2g/L左右。
4、后续生产阶段
当培养周期达到30-40天，或者葡萄糖消耗量24小时低于O. 5g/L，可以终止培养。
5、监测培养条件
培养过程中需要检测的指标有温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、铵盐浓度、谷氨酰胺浓度、摩尔渗透压浓度、表达多肽或蛋白质浓度。
实施例4纯化工艺
本发明通过深入而广泛的研究，通过对EPO-CTP蛋白的理化性质的分析，纯化工艺条件的摸索，从而实现了 EPO-CTP的高效纯化工艺。由于本发明的EPO-CTP的表达存在于发酵上清，所以发酵液通过离心、过滤获得发酵上清。本发明的优点在于确定了较佳的工艺路线，纯化工艺流程简单；能获得高纯度高活性的EPO-CTP融合蛋白，每升发酵罐培养液可获得至少15mg、唾液酸大于16mol/mol、比活性大于1. 6X 105IU/mg、纯度大于95%的 EPO-CTP融合蛋白。纯化工艺具体步骤如下
1、纯化前处理
取细胞培养丰收液30L，先4500rpm，15min，4°C离心，然后采用O. 22 μ m格式滤芯过滤，过滤压力< O. 5bar，最后选择的膜包截留孔径为IOkD超滤浓缩，超滤条件控制为进口端压力<1. 5bar,出口端压力< O. 5bar，浓缩倍数控制在5_10倍之间。
2、EPO-CTP Blue-FF 纯化
Blue Sepharose 6 Fast Flow 介质用 20mM Tris, IOOmM NaCl, ρΗ7· 0±0· 5 ;平衡缓冲液平衡3倍柱体积(CV)，上样完毕再用20mM Tris,200mM NaCl，pH7. 0±0. 5 ;平衡缓冲液平衡5CV，洗掉不能吸附的杂质蛋白。最后采用20mMTris，1. 2M NaCl，pH7. 0±0. 5洗脱液洗脱，收集洗脱蛋白峰，将收集的蛋白溶液按10倍体积计算超滤除盐，置换缓冲液采用 20mM Tris, ρΗ7· 5±0· 5。
3、EPO-CTP DEAE-FF 层析纯化
DEAE Sepharose 6 Fast Flow 介质用 20mM Tris, ρΗ7· 5±0· 5 平衡缓冲液平衡 3CV，上样完毕再用20mM Tris, pH7. 5±0. 5平衡缓冲液平衡3CV，洗掉不能吸附的杂质蛋白，然后依次用 20mM Tris,50mM NaCl (ρΗ7. 5±0· 5)和 6Μ尿素+ImM 甘氨酸(ρΗ4· 1_ρΗ4· 3) 分别洗脱5CV，去除活性低的及其它杂质蛋白。最后采用采用20mM Tris, 150mMNaCl, pH7. 5±0. 5洗脱液洗脱，收集洗脱蛋白峰。
4、EP0_CTP S-200 层析纯化
S-200 介质用 20mM 磷酸缓冲液 +IOOmM NaCl，pH6. 8 ±O. 2 平衡 3CV，取 DEAE Sepharose 6 Fast Flow纯化后的样品上样，上样完毕再用20mM磷酸缓冲液pH6. 8±0. 2平衡并洗脱，收集洗脱蛋白峰。将洗脱后的蛋白用O. 22um滤膜除菌过滤。通过以上方法，可以获得特异性(图5)纯度大于95% (图4)的重组人促红素-CTP融合蛋白。
实施例5猴体内生物活性动力学研究
通过皮下注射，EPO-CTP融合蛋白给药剂量为150IU/Kg注射食蟹猴。分别在用药前和用药后 O. 5h、2h、5 h、9h、24h (Dl)、48 (D2)、72(D3)、96 (D4)、120 (D5)、144 (D6)、168(D7)、 192 (D8)、240 (DlO)在猴的前肢或后肢皮下静脉取全血约1ml。采用ELISA方法对样品进行测定，将样品稀释至标准曲线线性区间内测定。食蟹猴给予EPO-CTP后，药后5h吸收达到峰值，其药物平均末端半衰期12. 65h(图6)。
实施例6治疗大鼠药物损伤致肾性贫血体内药效学试验
本实验以腺嘌呤250mg/kg每天精确灌胃大鼠3周，建立大鼠药物损伤肾性贫血模型。成模动物按HGB水平随机分为5组，分别为模型对照组、阳性(普通ΕΡ0)对照组、供试品低剂量组、供试品中剂量组和供试品高剂量组，剂量分别为普通EPO为1350IU/kg，供试品低、中和高剂量分别为150、450和1350IU/kg。并设正常对照组。实验总共6组，每组7 只，共42只。供试品组每周给药I次，阳性对照组每2天给药I次，连续4周。给药期间每天观察动物一般临床症状，每周监测其血液学、血生化相关指标，给药结束对动物进行大体解剖观察，行病理组织学检查。试验显示(图7)在贫血的治疗方面，重组人促红素-CTP融合蛋白中、高剂量组及阳性对照组有改善贫血的作用，其升高RBC、HGB、HCT作用，与给药剂量有相关性。重组人促红素-CTP融合蛋白每周给药一次，与阳性对照组每两天给药一次相比，具有长效的特点，降低给药次数，提高治疗的顺应性。
实施例7治疗大鼠肾切除损伤致肾性贫血体内药效学试验
本实验采用5/6肾切除法建立大鼠肾切除损伤肾性贫血模型。成模动物按HGB水平随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性(普通ΕΡ0)对照组、供试品低剂量组、供试品中剂量组和供试品高剂量组。其中，正常对照组5只动物，其余各组均为6只。剂量分别为普通EPO为450IU/kg，供试品低、中和高剂量分别为150、450和1350IU/kg。供试品和阴性对照均为I次/周，阳性对照品为I次/2天，连续注射4周。给药期间每天观察动物一般临床症状；造模结束、D8、D15、D22药前及给药结束监测血液学指标；造模结束及给药结束监测血生化相关指标。实验结果(图8)证明供试品重组人促红素-CTP融合蛋白 450IU/kg、1350IU/kg及阳性对照药利血宝450IU/kg有改善贫血的作用，呈剂量依赖性。供试品重组人促红素-CTP融合蛋白每周给药一次，与阳性对照药利血宝每两天给药一次相比，具有长效的特点，其降低了给药次数，提高了治疗的顺应性。权利要求
1.一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，其具体步骤包括将含有编码重组人促红素-CTP融合蛋白基因的表达载体，采用适当的转化方法转化宿主细胞，通过优化筛选获得重组工程细胞株，并采用微载体悬浮灌注或无血清悬浮流加培养工艺方法进行细胞培养并收获细胞培养液，通过经过优化的纯化工艺流程来分离获得高纯度、高活性的重组人促红素-CTP融合蛋白。
2.权利要求1所述重组人促红素-CTP融合蛋白是指将重组人促红素蛋白的C端与人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽(CTP) 28个氨基酸的N端相连所构成的融合蛋白。
3.权利要求1所述的表达载体是指哺乳动物细胞表达载体，优选PcDNA载体系列。
4.权利要求1所述的宿主细胞指哺乳动物细胞系，优选CHO细胞系。
5.权利要求1所述的转化方法是指电转化、脂质体转化、原生质融合等方法，优选电转化法。
6.权利要求1所述的微载体悬浮灌注培养工艺方法，其特征在于细胞生长在微载体上，微载体悬浮培养于细胞反应器内，通过持续不断收获培养液来实现重组蛋白的生产。其具体培养过程包括细胞接种阶段、细胞生长阶段及细胞生产阶段，并在培养过程中定期监测培养条件以保证培养过程实现精准、稳定控制。
7.权利要求6所述的细胞接种阶段，其起始细胞接种密度为2X 104 5 X 105个/毫升，最优为(3 X 105个/毫升)，接种体积为工作体积的1/3-1/2，搅拌速度为40-41转/分钟，时间为12-16小时。
8.权利要求6所述细胞生长阶段，是指细胞在有血清培养基扩增阶段，各项指标的控制水平为温度37°C，pH为7. 0-7. 3、溶解氧为40% -60%，搅拌转数42-44转/分钟，培养时间是5_7天。
9.权利要求6所述的细胞生产阶段，指当细胞生长每天消耗的葡萄糖浓度达到最大，进入稳定期通过添加丁酸钠使细胞培养物完成代谢转变，其中优选丁酸钠浓度为O. 5mM/L至1. OmM/L,维持至整个细胞生产阶段，并且生产阶段灌注量为反应器工作体积的1-1. 2倍，搅拌速度为45-47转/分钟，温度37°C，pH为6. 9-7.1、溶解氧为40% -70%，培养时间为27天-34天)。
10.根据权利要求6所述，监测培养条件是指在整个培养周期每天监测温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、铵盐浓度、谷氨酰胺浓度和摩尔渗透压浓度。
11.权利要求1所述的无血清悬浮流加培养工艺方法是指利用激流式生物反应器和一次性细胞培养袋使细胞悬浮生长在无血清培养液中，通过控制各项参数和培养条件定时流加浓缩培养液使细胞密度进一步提升并更多的累积目的产物的培养过程。整个培养过程可分 为细胞接种阶段、体积扩增阶段和流加浓缩培养液降温表达阶段。
12.权利要求11所述的无血清悬浮流加培养工艺方法所用的细胞株为经过悬浮驯化后可以适应悬浮培养的重组工程细胞株。
13.权利要求11所述的生物反应器是指可以用于悬浮培养的激流式细胞反应器和一次性无菌塑料培养袋。
14.权利要求11所述的无血清培养液可以是商品化或经过自主优化的无血清基础培养液及浓缩流加培养液。
15.权利要求11所述的细胞接种阶段，其接种体积为工作体积的1/5 1/10，摇床转速为30转/分 50转/分，控制参数PH值6. 9 7. 2、溶解氧40 70%、温度36 37°C范围。
16.权利要求11所述体积扩增阶段，是指每天取样测定细胞密度和细胞活率，并且根据细胞密度进行扩增，使细胞密度保持在2 8X 106个/ml范围内。
17.权利要求11所述流加浓缩培养液降温表达阶段是指当细胞体积扩增到工作体积的1/2 2/3时，并且根据细胞培养液葡萄糖含量补加浓缩培养液。
18.权利要求17所述浓缩培养液添加量按细胞培养液测定葡萄糖含量低于2g/L时,一次性补加浓缩培养液使葡萄糖浓度达到3 5g/L。葡萄糖含量测定每天一次。
19.权利要求17所述流加浓缩培养液降温表达阶段控制参数PH值6.8 7. O、溶解氧20 60%、温度30 35°C范围。
20.权利要求11所述每天取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖含量、乳酸含量、渗透压。
21.权利要求11所述培养收获标准是细胞活率低于70%即可终止培养。
22.权利要求1所述的经过优化的纯化工作流程，是指收获的含有EPO-CTP融合蛋白的细胞培养液依次经过前处理、亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析四个工艺步骤。
23.权利要求22所述的含有EPO-CTP融合蛋白的细胞培养液可以为微载体悬浮灌注培养工艺方法获得的，也可以为无血清悬浮流加培养工艺方法获得的。
24.根据权利要求22所述的前处理方式为过滤、超滤、离心等方式。
25.根据权利要求22所述，亲和层析中，平衡条件为Tris· HCl · NaCl缓冲盐溶液，优选10mM-50mM Tris -HCUSOmM-1OOmM NaCl缓冲盐溶液；洗脱条件采用高盐洗脱方式，优选盐浓度O. 5M-1. 5M NaCl缓冲盐溶液。
26.根据权利要求22所述，离子交换层析中，平衡条件为Tris· HCl缓冲溶液，优选10mM-50mM Tris-HCl缓冲溶液；预洗条件采用尿素-甘氨酸缓冲溶液，优选尿素的浓度为3M-8M、缓冲液pH值优选pH4. 0-pH4. 5 ;洗脱条件采用盐洗脱方式，优选盐浓度30mM-300mMNaCl缓冲盐溶液。
27.根据权利要求22所述，凝胶过滤层析中，采用磷酸盐缓冲盐溶液进行平衡和洗脱，优选缓冲体系为10mM-50mM PB、50mM-100mM NaCl缓冲盐溶液。
28.一种重组人促红素-CTP融合蛋白的应用，其特征在于重组人促红素-CTP融合蛋白其在猴体内半衰期为重组人促红素的1. 5-3倍，在治疗大鼠肾性贫血上表现出长效作用。
全文摘要
本发明公开了一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，其特点是重组工程细胞株的培养方式采用微载体悬浮灌注培养技术或无血清悬浮流加培养技术。本发明还公开了重组人促红素-CTP融合蛋白的纯化工艺，通过优化，获得简单工艺流程，以获得高纯度、高活性的重组人促红素-CTP融合蛋白。本发明还涉及重组人促红素-CTP融合蛋白在猴体内的代谢动力学研究以及在治疗大鼠肾性贫血上的应用。
文档编号C12N15/62GK102994547SQ201110265828
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者王锐, 张秀芹, 孟庆勇, 董敏, 刘铁成, 梁秋波, 李会成 申请人:哈药集团技术中心