专利名称：：稳定型阿霉素类脂质体及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种阿霉素类脂质体，同时还涉及及制备方法，属于制药
技术领域：
。技术背景阿霉素是一种对多种癌症均有治疗效果的抗癌药品，抗肿瘤之详细机理仍未确知，但相信其细胞毒性能抑制DNA、RNA及蛋白质的合成有关，可能是由于它会插入DNA双螺旋结构中邻近的两个盐基对之间，使其不能分开而无法复制，它可以干扰DNA双股的分离和螺旋的活性，导致自由基的形成和脂质的过氧化反应，藉由这些作用来毒杀细胞。除了一般常见的化疗副作用如呕吐、恶心、黏膜组织发炎和脱发外，由于心肌对氢氧自由基的伤害特别敏感，使阿霉素容易对心脏产生累积性的伤害，通常是不可逆的反应，且死亡率会增加因而限制了阿霉素是的多次使用。而藉由脂质体的包覆，脂质体阿霉素制剂在药物动力学的特性上有了彻底改变，因而改善了许多阿霉素的副作用。脂质体(Liposome)是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中(参见图一)，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的(BanghamA.，等，/.M/,13,238(1965))。磷脂分散在水中自然形成微观的三维多层嚢泡，每层均为脂质的双分子层；嚢泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4纳米。后来这种具有类似生物膜结构的双分子小嚢被称之为脂质体。Bangham和他的同事呈述有关脂质体科学领域的发现和定义并将脂质体作为药物载体投入实践中。如今脂质体广泛应用于系统抗癌疗法以及提高表面麻醉和基因药物的靶向传递。通常脂质体是由磷脂和胆固醇等为膜材包合而成。这两种成分不但是形成脂质体双分子层的基础物质，而且磷脂本身也具有极为重要的生理功能。脂质体若要达到实用，大量生产的方法是不可欠缺的。在实验室内制备方法其原理均可用于量产制备概念。工业化的量产方法中粒径均一度控制较理想的是用挤压器之挤压法及用微流床之高压喷射乳化法。前者釆用高压将磷脂质混合液通过孔径均一之聚碳酸酯高分子滤膜压出，而后者则是将磷脂质混合液在高压下通过特殊的交互作用及强力的冲击下微粒化。脂质体包括胶质的不稳定性为工业化生产的主要问题，困难在于工业化生产中，脂质体制作和消毒工艺中，批量产品之间的差异太大。由于在典型的脂质体制作中，有机溶液蒸发随之介入挤压或颗粒匀化的过程将脂质体置于极端高压、高温和高磨擦状态均可导致脂质体中所含成分的降解和不稳定的结果。除此之外，脂质体悬浮液在存贝i中可能产生聚集和溶化的现象以及各种添加剂而造成胶质的稳定性问题。这些不稳定因素将增加药物从脂质体泄漏的可能性。检索发现申请号为200410014638.7的中国专利申请公开了一种盐酸阿霉素脂质体制剂及其制备方法，该脂质体制剂主要由阿霉素、大豆卵磷脂、胆固醇、维生素E、柠檬酸等配制而成。申请号为\200410041104.3的另一中国专利申请公开了阿霉素或盐酸阿霉素脂质体注射剂及其制备工艺，该注射剂由阿霉素或盐酸阿霉素、中性磷脂、负电荷磷脂、胆固醇、抗氧化剂、有机酸、碱、糖、緩沖剂、注射用水组成。以上两专利申请的技术方案并非针对阿霉素脂质体稳定性的问题。因此，如何避免阿霉素类药物从脂质体泄漏，从而可以在基本为常温的情况下长期保存，一直是工业化生产的一大难题。
发明内容本发明的目的在于运用具有较好热力学稳定性的成分制备脂质体，提出一种稳定型阿霉素类脂质体，同时给出其制备方法，从而解决其工业化生产的上述难题。经过深入研究，申请人认识到，本发明采用的类脂体化合物必须满足以下条件或具有以下特征首先，该类脂体化合物构成必须具有允许脂质体的形成的包裹参量。其次，该类脂体化合物的未端取代基上必须有包括聚乙二醇或对脂质体具有立体稳定作用的高分子有机聚合物。第三，该类脂体化合物在其融化温度的条件下可以液体形式与水溶液混合。本发明的稳定型阿霉素类脂质体可以用下表表达，包括组分mg/10Ml阿霉素类药物活性组分10-40聚乙二醇二酸甘油脂1-150磷脂0-80大豆甾醇糖苷0-50硫酸铵0-30胆固醇0-50蔗糖0-940盐酸肉毒碱0-50左旋乙酰肉石咸0-50组胺酸0-31维生素C0-35注射用水其余必要时，加入盐酸等量氢氧化钾等量以上"等量"即平衡量，指调节pH值至5.5-6.5所需量。以上聚乙二醇-酸甘油脂的结构为由2个长链脂肪酸及聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)与甘油形成的二酸甘油脂，表达如下取代基Rl和R2或R3可以是同种或二种不同的脂肪酸，包括饱和或非饱和脂肪酸。其中的单脂肪酸分子中含有8到25个碳分子，包括棕榈酸(Palmiticacid),月桂酸(Lauricacid)，肉豆蔻酸(Myristicacid),油酉臾(OleicAcid)和石更脂酉臾(Stearicacid)。中间位取代基R2或R3为含有6到45个碳分子的聚乙二醇。用于本发明脂质体的脂质成分从各种脂类化合物、尤其包括PEG修饰的类脂化合物中筛选，典型的包括聚乙二醇-二酸甘油脂、磷脂、豆糖苷和甾醇。上述发明的一个重要特点是脂质体的组成成分可以为完全不含磷脂或部分磷脂与聚乙二醇-酸甘油脂的混合体。由于聚乙二醇-二酸甘油脂的参与，可显著降低脂质体形成时产生的内部热能，从而增加脂质体的稳定性。本发明的脂质体同时具有合适的流动性及伸展力度，因此有利于脂质体的稳定性和控制被包裹药物在血液中的释放速度。从实践的角度出发，流动性高的脂质成分更容易通过挤压方法产生尺寸相对均一的微脂体。由于本发明的脂质体是可以由完全不含磷脂或部分磷脂与聚乙二醇-二酸甘油脂的混合体形成，胆固醇的含量对脂质体形成及药物释放速度的影响不大，因此胆固醇的使用范围内将在0-30个摩尔百分比之间。根据本发明的特点，磷脂可按表一选用，与聚乙二醇-二酸甘油脂的种类和混合比例可以变化调整而稳定脂质体的形成和增加对各种药物的包裹率。以阿霉素，表阿霉素和柔红霉素为例，增加含聚乙二醇-二酸甘油脂的比例可增加增加阿霉素，表阿霉素和柔红霉素的包裹率。表一表1.本发明选用于顺铂和草酸铂脂质体脂质体的磷脂种类<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实际使用时，亦包括表列中经聚乙二醇(PEG)修饰后的磷脂化合物(分子量可从500到5000)。例如聚乙二醇二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺(PEG-DSPE)或单甲氧基聚乙二醇二硬脂酰甘油磷脂-乙醇胺(mPEG-DSPE)。形成本发明的脂质体使用的磷脂约占脂质总量的0-50摩尔百分数之间，聚乙二醇-二酸甘油脂约占脂质总量的10-1OO摩尔百分数之间，各种脂质体(磷脂或聚乙二醇-二酸甘油脂)的分子量约在300道尔顿(Daltons)和5000道尔顿(Daltons)之间。本发明的稳定型阿霉素类脂质体基本制备步骤如下步骤一、制备复层脂质体(1)溶解脂质化合物一一称量所需脂质化合物和胆固醇或大豆甾醇糖苷，混合在一起后加入三氯甲烷或三氯曱烷甲醇中溶解。通常l毫升溶剂可溶解大约50-200毫克脂质化合物。(2)蒸发去除溶剂一一待脂质化合物全部溶解并充分混匀后，采用恒温37-45度在氮气气流中緩慢蒸发去除溶剂，溶剂蒸发后的胶凝体被转换成脂质体。(3)表面水合处理一一将以上胶凝体转换成的脂质体溶解于选择PH条件(pH5-8)的緩冲液(例如硫酸铵，磷酸钠等)得到复层脂质体水溶液，再将复层脂质体水溶液加热到超过其所含脂肪成分的最高溶化温度并持续搅拌，使其充分水合作用，形成复层脂质体悬浮液。步骤二、制备单层脂质体(4)将以上复层脂质体悬浮液在400-600psi适度压力下通过O.05-O.l微米过滤材料，挤压后产生的所需粒径尺寸(通常在O.1微米左右)单层脂质体悬浮液。步骤三、建立脂质体的离子梯度(5)准备上柱一一选用干床长度50-150m和球状蛋白质分子量离范围1500-30，000道尔顿的葡聚糖G-50胶柱，将氮气通入单层脂质体悬浮液置换出溶液中的空气。(6)洗柱一_待单层脂质体悬浮液上柱后，用0.l到1摩尔浓度的磷酸二钾洗柱，形成内酸外碱的离子梯度。步骤四药物包裹(7)衡温加热一一将所选药物成分与形成离子梯度后的脂质体分别按预定衡温加热；(8)搅拌包裹一一将达到预定温度的药物成分和脂质体搅拌混合，使药物成分填加到准备好的脂质体内，过滤除去未包裹的药物，即得到本发明的稳定型阿霉素类脂质体。药物活性成分的加载可以参考以下表二表二，阿霍素，表阿莓素和柔红霉素的装栽<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>试验证明，本发明的稳定型阿霉素类脂质体稳定性显著提高，在常温下即可长期保存，因此解决了工业化生产的一大难题。下面结合附图对本发明作进一步的具体说明。图1为阿霉素脂质体结构示意图，图中l是类脂体，2是阿霉素水溶液，3是嚢泡层。图2为阿霉素磷脂脂质体与含非磷脂混合成分的脂质体在小鼠体内的药物释放速度比较图。具体实施方式实施例一本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达表三，阿霉素等脂质体配方(i)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素'产品水溶液的pH为5.5实施例二本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达表四、阿霉素等脂质体配方(2)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2产品水溶液的pH为5.5实施例三本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达表五、阿霉素等脂质体配方(3)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2产品水溶液的pH为5.5实施例四本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达表六、阿霉素等脂质体配方(4)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2产品水溶液的pH为5.5实施例五本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2或使用22.5毫克盐酸左旋乙酰肉碱取代3产品水溶液的pH为5.5实施例六本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>盐酸3等量氢氧化钾等量1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2或使用22.5毫克盐酸左旋乙酰肉石威取代3产品水溶液的pH为6.0实施例七本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达表九、阿霉素等脂质体配方(7)组分mg/10mL盐酸阿霉素'20双油酸聚乙二醇甘油酯100氢化大豆卵磷脂25大豆甾醇糖苷11.6硫酸铵20蔗糖940盐酸肉毒碱220.2注射用水等量盐酸3等量氢氧化钾等量1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2或使用22.5毫克盐酸左旋乙酰肉碱取代3产品水溶液的pH为6.4实施例八本实施例的阿霉素类脂质体配比如下表表达表十、阿霉素等脂质体配方(8)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素2产品水溶液的pH为6.0实施例九本实施例的阿霉素类脂质体注射液配比如下表表达表十一、阿霉素等脂质体配方(9)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>药物活性组分亦可为盐酸表阿霉素或盐酸柔红霉素或使用22.5毫克盐酸左旋乙酰肉碱取代产品水溶液的pH为6.0由于含磷脂组分减少，通过以上配方制作的脂质体具有药物包裹率高及稳定性强的特点(参见图二)，分析结果表明，在室温下25。C存放3个月后与4"C下保存的样品相比无差异或变化。试验表明，阿霉素磷脂脂质体与含非磷脂混合成分的脂质体相比，两者在小鼠体内的药物释放速度十分相似。图二中的小鼠血清浓度(1)阿霉素和(2)阿霉素脂质体，静脉注射量为20毫克/公斤。以上实施例的阿霉素类脂质体均可以参照以下步骤制备步骤一、制备复层脂质体(1)溶解脂质化合物一一称量所需脂质化合物和胆固醇或大豆甾醇糖苷，混合在一起后加入三氯曱烷或三氯甲烷曱醇中溶解。通常l毫升溶剂可溶解大约50-200毫克脂质化合物。(2)蒸发去除溶剂一一待脂质化合物全部溶解并充分混匀后，采用恒温37-45度在氮气气流中緩慢蒸发去除溶剂，溶剂蒸发后的胶凝体被转换成脂质体。最好将脂质体尽快转移到加有真空泵的容器中并保持压力在76cmHg几小时，进一步清除可能的残留溶剂。因为残留的三氯曱烷曱醇会导致游离的胆固醇等分子重结晶而破坏脂质体的均一性及表面水合作用并且打乱脂质体的保留离子梯度或包裹能力。(3)表面水合处理一一将以上胶凝体转换成的脂质体溶解于选择PH条件(pH5-8)的緩冲液得到复层脂质体水溶液，再将复层脂质体水溶液加热到超过其所含脂肪成分的最高溶化温度并持续搅拌，使其充分水合作用，形成复层脂质体悬浮液。经此处理后的复层脂质体为大小不均一的微粒体，范围可从几个微米到500毫微米。由于緩沖溶质不均相地分布在脂质体的含水核心和外表面之间，因此复层脂质体脂端的冻干循环失水和再水化可协助緩冲溶质的分布并增加含水核心的容量而无需改变脂质体嚢泡大小的分布。再水化可通过结冰-解冻循环的过程实现将复层脂质体置于低温冷冻瓶中浸入并保持在液氮中5分钟，然后转移到热水浴后，保留在超过其所含脂肪成分的最高溶化温度大约5度左右(如65°C)5分钟。结水和解冻循环过程可多次重覆(4-5次)。将再水化处理后的复层脂质体储存于-20。C。步骤二、制备单层脂质体(4)将以上复层脂质体悬浮液在400-600psi适度压力下通过O.05-0.l微米聚碳酸酯纤维膜或O.l微米陶瓷过滤器挤压，重复二次，挤压后产生的所需粒径尺寸(通常在O.1微米左右)单层脂质体悬浮液。通过挤压过程产生的单层脂质体具有比较均一的粒度，和较复层脂质体更加透明的乳白色。单层脂质体根据其在緩冲液酸石成度中的稳定性的，一般可在4。C下存放l-2个星期。但最好在48小时内使用。步骤三、建立脂质体的离子梯度脂质体的水合处理过程中所使用的緩冲液而产生脂质体的核心与外表面一致的离子强度将不利于药物从脂质体的核心向外释放，因而需要建立一个离子梯度。离子梯度可通过对脂质体外部环境的变化创造一个横跨膜层的离子梯度；即内酸外碱的梯度。过程为(5)准备上柱一一选用干床长度50-15Om和球状蛋白质分子量离范围1500-30，OOO道尔顿的葡聚糖G-50胶柱，将氮气通入单层脂质体悬浮液置换出溶液中的空气。凝胶柱大d、可根据产品量大小而定则一般为柱体积的0.5%到5o/o。(6)洗柱一一待单层脂质体悬浮液上柱后，用0.l到1摩尔浓度的磷酸二钾作为洗提液洗柱，形成内酸外碱的离子梯度。洗提液容量约为二到三倍的柱体积。步骤四药物包裹(7)衡温加热一一将所选药物成分与形成离子梯度后的脂质体分别按预定衡温加热，最佳选择温度选择为在30分钟内通过药物与脂质体的混合而达到95%以上药物填入于脂质体内。(8)搅拌包裹一一将达到预定温度的药物成分和脂质体搅拌混合，使药物成分填加到准备好的脂质体内，过滤除去未包裹的药物，即得到本发明的稳定型阿霉素类脂质体。因为一旦脂质体和药物到达了特定温度，在衡温下并通过间歇搅拌，阿霉素等活性成分可迅速地填加到准备好的脂质体内，最后的产品宜通过凝胶分子筛子色谱法除去未包裹的药物并通过O.45微米深度滤清过滤器对产品进行消毒处理。以下表A、B、C分别反映本发明脂质体阿霉素、脂质体表阿霉素和脂质体柔红霉素稳定性实验的情况。不难看出，采用本发明后，可以实现常温保存，与现有技术相比，彻底解决了稳定性难题。表A:脂质体阿霉素稳定性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表B:脂质体表阿霉素稳定性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表C:脂质体柔红霉素稳定性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。权利要求1.一种稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于由以下配比的组分组成组分mg/10mL阿霉素类药物活性组分10-40聚乙二醇二酸甘油脂1-150磷脂0-80大豆甾醇糖苷0-50硫酸铵0-30胆固醇0-50蔗糖0-940盐酸肉毒碱0-50左旋乙酰肉碱0-50组胺酸0-31维生素C0-35注射用水其余2.根据权利要求l所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述阿霉素类药物活性组分为阿霉素、表阿霉素、柔红霉素及其盐酸盐中的至少一种。3.根据权利要求2所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述聚乙二醇二酸甘油脂的结构为由2个长链脂肪酸及聚乙二醇与甘油形成的二酸甘油脂，表达式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4.根据权利要求3所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述表达式中的取代基R1和R2为同种或二种不同的脂肪酸，包括饱和脂肪酸和非饱和脂肪酸，取代基R2或R3为含有6到45个碳分子的聚乙二醇。5.根据权利要求3或4所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述聚乙二醇二酸甘油脂中的单脂肪酸分子中含有8到25个碳分子。6.根据权利要求5所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述脂肪酸为包括棕榈酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸中的至少一种。7.根据权利要求5所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述磷脂为l,2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1，2-二油酰磷脂酰乙醇胺、1，2-月桂锡甘油-3-卵磷脂、1,2-二油酰磷脂酰胆碱、1,2-冠锡甘油-3-卵磷脂、1，2-棕榈锡甘油-3-卵磷脂、1，2-二硬脂锡甘油-3-卵磷脂、1，2-二硬脂酰磷酸甘油中的至少一种。8.根据权利要求6所述的稳定型阿霉素类脂质体，其特征在于所述磷脂为经聚乙二醇修饰后的磷脂化合物聚乙二醇二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺或单曱氧基聚乙二醇二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺。9.根据权利要求l所述的稳定型阿霉素类脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤步骤一、制备复层脂质体(1)溶解脂质化合物一一称量所需脂质化合物和胆固醇或大豆甾醇糖苷，混合在一起后加入三氯曱烷或三氯曱烷曱醇中溶解；(2)蒸发去除溶剂一一待脂质化合物全部溶解并充分混匀后，采用恒温37-45度在氮气气流中緩慢蒸发去除溶剂，溶剂蒸发后的胶凝体被转换成脂质体；(3)表面水合处理一一将以上胶凝体转换成的脂质体溶解于选择PH5-8的缓沖液得到复层脂质体水溶液，再将复层脂质体水溶液加热到超过其所含脂肪成分的最高溶化温度并持续搅拌，使其充分水合作用，形成复层脂质体悬浮液；步骤二、制备单层脂质体(4)将以上复层脂质体悬浮液在400-600psi适度压力下通过0.05-0.l微米过滤材料，挤压后产生所需粒径尺寸的单层脂质体悬浮液；步骤三、建立脂质体的离子梯度(5)准备上柱一一选用干床长度50-150m和球状蛋白质分子量离范围1500-30000道尔顿的葡聚糖G-50胶柱，将氮气通入单层脂质体悬浮液置换出溶液中的空气；(6)洗柱一一待单层脂质体悬浮液上柱后，用0.l到1摩尔浓度的磷酸二钾洗柱，形成内酸外碱的离子梯度；步骤四药物包裹(7)衡温加热一一将所选药物成分与形成离子梯度后的脂质体分别按预定衡温加热；(8)搅拌包裹一一将达到预定温度的药物成分和脂质体搅拌混合，使药物成分填加到准备好的脂质体内，过滤除去未包裹的药物，即得到本发明的稳定型阿霉素类脂质体。全文摘要本发明涉及一种阿霉素类脂质体，同时还涉及及制备方法，属于制药
技术领域：
。本发明的脂质体组成成分可以为完全不含磷脂或部分磷脂与聚乙二醇-二酸甘油脂的混合体。由于聚乙二醇-二酸甘油脂的参与，可显著降低脂质体形成时产生的内部热能，从而增加脂质体的稳定性。因此，本发明阿霉素类脂质体的稳定性显著提高，在常温下即可长期保存，其工业化生产切实可行。文档编号A61K31/7048GK101244038SQ200710134029公开日2008年8月20日申请日期2007年10月26日优先权日2007年10月26日发明者念吴,王二新申请人:吴念;王二新